CN102918160A - 产生发酵产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生发酵产物的方法，其包括：用α-淀粉酶在GH61多肽的存在下将含淀粉材料液化为糊精；用葡糖淀粉酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物发酵所述糖。

Description

产生发酵产物的方法
技术领域
本发明涉及使用一种或多种发酵生物从植物材料产生发酵产物的方法。
发明背景
大量难以合成产生的商品如今可通过发酵生物产生。此类产品包括醇(例如丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如乙酸、柠檬酸、葡糖酸盐/酯、葡糖酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。发酵亦常用于可消费的醇(例如啤酒和葡萄酒)，奶制品(例如产生酸奶和奶酪方面)，皮革，和烟草工业。
本领域中已知大量通过发酵由含淀粉材料的降解提供的糖而产生发酵产物如乙醇的方法。
然而，从此类植物材料产生发酵产物如乙醇仍然过于昂贵。因此，存在提供增加发酵产物的收率并由此减少生产成本的方法的需要。
本发明的目的是提供改善的产生发酵产物的方法。
发明内容
本发明涉及产生发酵产物的方法，其包括：用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同工艺产生的发酵量相比产生更多量的发酵产物。
本发明亦涉及组合物，其包含(a)GH61多肽，(b)葡糖淀粉酶和(c)α-淀粉酶。
发明详述
定义
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)是催化淀粉和其它直链和支化的1,4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。
片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端具有一个或多个(几个)氨基酸的缺失的多肽；其中所述片段具有酶活性。
家族61多肽：术语“家族61多肽”意指根据Henrissat B.,1991,Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.,和Bairoch A.,1996,Updating thesequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。
葡糖淀粉酶(葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶，EC 3.2.1.3)是催化(1→4)-连接的α-D-葡萄糖残基从链的非还原端连续水解并释放β-D-葡萄糖的酶。
分离的：术语“分离的”和“纯化的”意指从预期天然结合的至少一种组分分离的多肽或多核苷酸。举例而言，变体如SDS-PAGE确定，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯，而多核苷酸如琼脂糖电泳确定，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等之后的最终形式的多肽。
亲本酶：术语“亲本”意指接受改变以产生变体的酶。亲本可为天然存在的(野生型)的多肽或其变体。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含改变即取代、插入和/或缺失的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指邻接占据某位置的氨基酸添加1-5个氨基酸。
野生型酶：术语“野生型”酶意指由天然存在的微生物如在自然界发现的细菌、酵母或丝状真菌表达的酶。
自未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法
本发明涉及从未经糊化(常称作“未经烹制”)的含淀粉材料产生发酵产物的方法。在一个实施方案中，该方法包括在起始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖原生成酶(糖化酶)的存在下对(例如经磨制的)含淀粉材料糖化以产生糖类，所述糖类可由合适的发酵生物发酵成发酵产物，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同方法产生的发酵量相比产生更多量的发酵产物。
因此，本发明的该方面涉及产生发酵产物的方法，其包括：用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖。
术语“起始糊化温度”意指淀粉发生糊化的最低温度。一般而言，在水中加热的淀粉在50℃至75℃开始糊化；糊化的准确温度取决于特定的淀粉，并可方便的由本领域技术人员确定。从而，起始糊化温度可根据植物物种，植物物种的特定品种以及生长条件而改变。给定含淀粉材料的起始糊化温度可确定为使用由Gorinstein和Lii,1992,
Figure BDA00002499608500031
44(12):461-466描述的方法5%的淀粉颗粒丧失双折射的温度。
本发明的方法可进一步包括例如通过蒸馏回收所述发酵产物。
所述发酵产物可为浆料，如可制备粒状淀粉，其具有10-55wt%含淀粉材料的干固体(DS)，优选25-45wt%干固体，更优选30-40wt%干固体。浆料可包含水分和/或工艺水(process water)，例如釜馏物(逆流(backset))、洗涤水(scrubberwater)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或来自其它发酵产物设备(plant)的工艺水。由于该工艺在糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含1至70vol%，优选15-60vol%，特别为30至50vol%包含水分和/或工艺水，例如釜馏物(逆流)、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水或来自其它发酵产物设备的工艺水，或其组合等。
可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0.05至3.0mm，优选0.1至0.5mm来制备含淀粉材料。在进行本发明的方法后，含淀粉材料中至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%的淀粉转化为可溶的淀粉水解物。
本发明该方面的方法在低于起始糊化温度的温度进行。例如，在24-40℃范围的温度，如25-40℃，29-35℃，30-34℃，如32℃左右。本领域技术人员可容易地确定合适的工艺条件。
本发明的方法可在3至7的pH，例如3.5至6或4至5的pH进行。
在一个实施方案中，进行该方法从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如6wt%以下，3wt%以下，2wt%以下，1wt%以下，0.5wt%以下或0.25wt%以下，或0.1wt%以下。所述低水平的糖可通过简单的使用经调整量的酶和发酵生物来实现。本领域技术人员可方便地确定使用的发酵生物和酶的剂量/量。发酵生物和酶的使用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为0.5wt%以下，如0.2wt%以下。
含淀粉材料
在本发明的方法中，可使用任何合适的含淀粉的起始材料。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明工艺的含淀粉的起始材料的实例包括大麦、豆(bean)、木薯、谷类、玉米、买罗高粱、豌豆(pea)、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯、小麦、和全谷粒，或它们的组合。所述含淀粉材料亦可为蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指包括使用发酵生物发酵的方法生成的产物。根据本发明所包括的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即，可饮用的中性酒)；或工业乙醇或用于可饮用醇类工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的产物。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porters)、陈贮啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麦芽酒(malt liquors)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。
发酵生物
术语“发酵生物”指适于产生所需发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物如丝状真菌。根据本发明合适的发酵生物能够将可发酵的糖，如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖和/或木糖直接或间接发酵即转化为所需的发酵产物。
发酵生物的实例包括真菌生物如酵母。优选的酵母包括酵母属，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，特别是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)，特别是阿糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、Candidasonorensis，热带假丝酵母(Candida tropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。其它发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的菌株；克鲁维酵母(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的菌株；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。
优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是酪酸梭菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的菌株，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77:61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、Thermoanaerobacter mathrani或热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)的菌株。还想到的是乳杆菌属(Lactobacillus)以及谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)，热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。
在一个实施方案中，所述发酵生物是C6糖发酵生物，例如，酿酒酵母的菌株。
在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培养基中活的发酵生物如酵母计数为105至1012，优选107至1010的范围内，特别是约5x107。
对于乙醇发酵，酵母是优选的发酵生物。优选酵母属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种的菌株，优选对高水平的乙醇，即高至例如10，12，15或20vol%或更高的乙醇具有抗性的菌株。
商业上可获得的酵母包括，例如LNF SA 1，LNF BG 1，LNF PE 2和LNFCAT 1(可从LNF Brazil获得)，RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre,USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast,USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从Ethanol Technology,WI,USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American BioproductsCorporation,GA,USA获得)，GERT STRAND(可从Gert Strand AB,Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。
根据本发明，能够从可发酵的糖产生所需的发酵产物的发酵生物优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将所述发酵生物导入/添加入所述发酵培养基时，接种的发酵生物经过许多阶段。起初，生长并未发生。该期间称为“迟滞期”，且可视为适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长速率逐渐增加。经过一段最大生长的时间，生长速率停止，且所述发酵生物进入“稳定期”。又一段时间后所述发酵生物进入“死亡期”，此时活细胞数减少。
发酵
发酵条件基于例如，植物材料的种类、可用的可发酵糖类、发酵生物和/或期望的发酵产物来确定。本领域技术人员可容易地确定合适的发酵条件。根据本发明的发酵可在通常使用的条件下进行。优选的发酵方法为厌氧方法。
举例而言，发酵可在高至75℃的温度，例如40-70℃，如50-60℃进行。然而，具有显著较低至室温左右(20℃左右)的最适温度的细菌也是已知的。合适的发酵生物的实例可见于上文“发酵生物”部分。
对于使用酵母的乙醇产生，发酵可进行24至96小时，特别是35至60小时。在一个实施方案中，发酵在20至40℃，优选26至34℃，特别是32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，pH为3至6，优选为pH 4至5左右。
其它发酵产物可在本领域技术人员已知适于所讨论的发酵生物的温度进行发酵。
发酵通常在3至7范围的pH，优选在pH 3.5至6，如pH 5左右进行。发酵通常持续6-96小时。
本发明的方法可作为分批或连续过程进行。发酵可在超滤系统中进行，其中在固体、水和发酵生物存在下保持渗余物的循环，而其中渗透物为含有所期望的发酵产物的液体。同样涵盖的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法/工艺，其中在固体、水和发酵生物存在下保持渗余物的循环，而其中渗透物为含有所期望的发酵产物的液体。
在发酵后，发酵生物可自发酵浆料分离并再循环。
发酵培养基
发酵培养基("Fermentation media"或"fermentation medium")指其中进行发酵的环境，并包括发酵底物，即由发酵生物代谢的糖源。
发酵培养基可包含对于发酵生物的其它营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物广泛用于发酵领域，并包括氮源如氨；维生素和矿物质，或其组合。
回收
在发酵之后，可将发酵产物从发酵培养基分离。可蒸馏发酵培养基以提取所需发酵产物，或可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取所需发酵产物。或者，发酵产物可通过汽提来回收。回收的方法在本领域是公知的。
酶
下述酶在本发明的方法中应以“有效量”使用。
GH61多肽
在本发明的方法中，可使用任何GH61多肽。
在一个方面，所述GH61多肽包含下述基序：
[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[FW]-[TF]-K-[AIV]，
其中X为任意氨基酸，X(4,5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而X(4)是在4个连续位置的任意氨基酸。
包含上述所示的基序的GH61多肽可进一步包含：
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，
其中X为任意氨基酸，X(1,2)为在1个位置或2个连续位置的任意氨基酸，X(3)为3个连续位置的任意氨基酸，而X(2)为2个连续位置的任意氨基酸。
在一个优选的方面，所述GH61多肽进一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。
在另一个优选的方面，所述GH61多肽进一步包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一个优选的方面，所述GH61多肽进一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。
在第二个方面，所述GH61多肽包含下述基序：
[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ],
其中x为任意氨基酸，x(4,5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而x(3)为3个连续位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。
在第三个方面，所述GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:1(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:2(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:3(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:4(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:5(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:6(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:7(桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus))，SEQ ID NO:8(里氏木霉)，SEQ ID NO:9(嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila))，SEQ ID NO:10(嗜热毁丝霉)，SEQ ID NO:11(嗜热毁丝霉)，SEQ ID NO:12(嗜热毁丝霉)，SEQ ID NO:13(嗜热毁丝霉)，SEQ ID NO:14(桔橙嗜热子囊菌)，SEQ ID NO:15(烟曲霉)，SEQ ID NO:16(嗜松青霉(Penicillium pinophilum))，SEQ ID NO:17(嗜热子囊菌属菌种(Thermoascussp.))，SEQ ID NO:18(青霉属菌种(Penicillium sp.))，SEQ ID NO:19(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:20(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:21(土生梭孢霉)，SEQ IDNO:22(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:23(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:24(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:25(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:26(土生梭孢霉)，SEQ IDNO:27(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:28(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:29(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:30(甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus))，SEQ ID NO:31(甲壳嗜热子囊菌)，SEQ ID NO:32(甲壳嗜热子囊菌)的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的同一性程度。
在第六个方面，所述GH61多肽人工变体，所述人工变体包含SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQID NO:30，SEQ ID NO:31，或SEQ ID NO:32的成熟多肽；或其同源序列的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入。
优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的纤维素分解增强活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992,Science 255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与亲本多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochemistry.30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ IDNO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，或SEQ ID NO:32的成熟GH61多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过4，例如1、2、3或4。
在一个方面，所述GH61多肽在WO 2008/151043中所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰的存在下使用。
在一个方面，所述GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物或含硫化合物的存在下使用。
所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；联苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acrolein acetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。
所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个(几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色
Figure BDA00002499608500111
离子(flavylium ion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)；桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素(isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)；kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或它们的盐或溶剂合物。
所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂
Figure BDA00002499608500121
基(diazepinyl)、氮杂
Figure BDA00002499608500122
基(azepinyl)、硫杂
Figure BDA00002499608500123
基(thiepinyl)、哌啶基和噁庚基(oxepinyl)。在另一个方面所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己醛糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acid γ-lactone)；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。
所述含氮化合物可为任何具有一个或多个氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-吡啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。
所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或它们的盐或溶剂合物。
所述含硫化合物可为任何包含一个或多个硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯的模块。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。
在一个实施方案中，所述GH61多肽以2-1000微克/g干固形物(DS)，例如5-100，10-40或20-40微克/g DS的量存在。
α-淀粉酶
根据本发明，可使用任何α-淀粉酶，如真菌、细菌或植物来源的α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加时在3至7，优选3.5至6，或更优选4-5的范围内的pH具有最佳活性的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。
细菌α-淀粉酶
用于本发明的α-淀粉酶可为细菌α-淀粉酶，例如来源于芽孢杆菌属(Bacillus)的α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的菌株，但也可来源于其它芽孢杆菌属菌种。
α-淀粉酶的特定实例包括WO 99/19467的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，和WO 99/19467的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为分别与示于WO99/19467的SEQ ID NOS:3、4或5中的任何序列具有至少60%，例如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。
所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文件通过提述并入本文)中描述的变体和/或杂合体。具体α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,187,576或美国专利号6,297,038(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG α-淀粉酶)变体，优选WO 96/23873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467公开的SEQ IDNO:3所列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 99/19467公开的SEQ ID NO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合体α-淀粉酶
所述α-淀粉酶可为杂合体α-淀粉酶，例如，包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO 1999/19467的SEQ ID NO:4)的445个C-末端氨基酸残基，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部的α-淀粉酶：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中地衣芽孢杆菌编号方式)。也优选具有一个或多个下述突变的变体(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶中的对应突变)：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(关于编号方式，使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5)。
在一个实施方案中，所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS(干固体)，优选0.001-1KNU每g DS，如大约0.050KNU每g DS的量剂量添加。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如川地曲霉(Aspergilluskawachii)，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶为下述的α-淀粉酶，其与WO 96/23874的SEQID NO:10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
另一个优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶是黑曲霉α-淀粉酶，其作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO 89/01969(实施例3，其通过提述并入本文)。源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由Novozymes A/S,Denmark得到)。
其它野生型α-淀粉酶包括源自多孔菌属(Meripilus)和根毛霉属(Rhizomucor)的菌株，优选巨多孔菌(Meripilus giganteus)或微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO 2004/055178，其通过提述并入本文)的菌株的那些α-淀粉酶。
在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉(Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable α-amylase from Aspergilluskawachii”，并进一步为EMBL:#AB008370)。
所述真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶或其变体。
真菌杂合体α-淀粉酶
在一个优选实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶为杂合体α-淀粉酶。真菌杂合体α-淀粉酶的实例包括WO 2005/003311或美国专利申请公开号2005/0054071(Novozymes)和WO 2006/069290(Novozymes)中公开的那些，所述文件通过提述并入本文。杂合体α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域(SBD)，以及任选的接头。
杂合体α-淀粉酶的实例包括WO 2006/069290实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的变体(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合公开于表5)，或WO2006/069290中表5中作为V039的α-淀粉酶，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQID NO:102)。其它杂合体α-淀粉酶列于美国申请号11/316,535和WO2006/069290(其通过提述并入本文)实施例4中表3、4、5和6中。
杂合体α-淀粉酶的其它实例包括美国专利申请公开号2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
其它α-淀粉酶与任何上面提及的α-淀粉酶显示高序列同一性程度，即，与上述公开的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%同一性。
酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.001至10AFAU/g DS，例如0.01至5AFAU/g DS，特别是0.3至2AFAU/g DS，或0.001至1FAU-F/g DS，优选0.01至1FAU-F/g DS的量添加。
商业性α-淀粉酶产品
优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括MYCOLASETM(DSM)，BANTM，TERMAMYLTM SC，FUNGAMYLTM，LIQUOZYMETM X，LIQUOZYMETM SC和SANTM SUPER，SANTM EXTRA L (Novozymes A/S)和CLARASETML-40,000，DEX-LOTM，SPEZYMETM FRED，SPEZYMETM AA，SPEZYMETMDELTAAA，GC358，GC980，以及SPEZYMETM RSL(Danisco A/S)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
糖源生成酶(糖化酶)
术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(均为麦芽糖生成者)以及α-葡糖苷酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本发明的产生发酵产物如乙醇的方法时。所产生的碳水化合物可直接或间接转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。混合物包括包含至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。
在一个实施方案中，葡糖淀粉酶活性(AGU)和酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比例(即AGU每FAU-F)可为0.1至100AGU/FAU-F，特别是2至50AGU/FAU-F，如10-40AGU/FAU-F的范围。
葡糖淀粉酶
所述葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等,1984,EMBO J.3(5):1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381,WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的那些；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Hata等,1991,Agric.Biol.Chem.,55(4):941-949)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等,1996,Biochemistry,35:8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等,1997,Protein Eng.10:1199-1204)。
其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等，1998,ApplMicrobiol Biotechnol.50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)。
细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)，均在WO 2006/069289中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)和大白桩菇(Leucopaxillusgiganteus)，PCT/US2007/066618中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)的葡糖淀粉酶；或其混合物。杂合体葡糖淀粉酶可用于本发明。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例在WO 2005/045018中公开。具体实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合体葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。
所述葡糖淀粉酶，可与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高序列同一性程度，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER，SANTM EXTRA L，SPIRIZYMETM PLUS，SPIRIZYMETMFUEL，SPIRIZYMETM B4U，SPIRIZYME ULTRATM和AMGTM E(来自Novozymes A/S，Denmark)；OPTIDEXTM 300，GC480TM和GC147TM(来自Genencor Int.，USA)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900，G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
所述葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS，特别是在0.1-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS，如0.5AGU/g DS的量，或以0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，特别是0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS的量添加。
β-淀粉酶
“β-淀粉酶”(E.C 3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1,4-α-葡糖苷键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β-淀粉酶的名称。
已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(Fogarty和Kelly,1979,Progress in Industrial Microbiology,15,112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自Novozymes A/S,Denmark的NOVOZYMTM WBA和来自Genencor Int.,USA的SPEZYMETM BBA 1500。
产麦芽糖淀粉酶
淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)，其催化将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。产麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。
所述产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。
肌醇六磷酸酶
任何肌醇六磷酸酶可用于本发明的方法。肌醇六磷酸酶是通过特异性水解肌醇和磷之间的酯键而降解肌醇六磷酸盐和/或肌醇六磷酸的酶。肌醇六磷酸酶活性取决于许多成分中磷和离子的可获得性。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶能够从肌醇六磷酸(例如植酸)释放至少一个无机磷酸。肌醇六磷酸酶可根据其对于植酸分子上起始水解处的磷酸酯基团的具体位置的偏好进行分组(例如3-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8)或6-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.26))。肌醇六磷酸酶的实例是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶(myo-inositol-hexakiphosphate-3-phosphohydrolase)。
肌醇六磷酸酶可从微生物如真菌或细菌生物获得。举例而言，所述肌醇六磷酸酶可从丝状真菌如曲霉属(例如无花果曲霉(A.ficuum)，烟曲霉，黑曲霉和土曲霉(A.terreus))，支胞属(Cladospirum)，毛霉属(Mucor)(例如梨形毛霉(Mucorpiriformis))，毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophila))，青霉属(例如P.hordei(ATCC No.22053)，桧状青霉(P.piceum)(ATCC No.10519)，或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC No.48944))，踝节菌属(Talaromyces)(例如嗜热踝节菌(T.thermophilus))，嗜热霉属(Thermomyces)(WO 99/49740)和木霉属菌种(Trichoderma spp.)(例如里氏木霉(T.reesei))获得。
在一个实施方案中，所述肌醇六磷酸降解酶从酵母(例如Arxulaadeninivorans、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、西方许望酵母(Schwanniomycesoccidentalis))，革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌、克雷伯氏菌属菌种(Klebsiellaspp.)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.))，和革兰氏阳性细菌(例如芽孢杆菌属菌种如枯草芽孢杆菌)获得。
所述肌醇六磷酸酶亦可从柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)或隔孢伏革菌属(Peniophora)获得。
在一个实施方案中，所述肌醇六磷酸酶来源于布丘氏菌属菌种(Buttiauxiellaspp.)如乡间布丘氏菌(B.agrestis)、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。在一些实施方案中，所述肌醇六磷酸酶是WO 2006/043178或美国申请号11/714,487中公开的肌醇六磷酸酶。
在一个优选实施方案中，所述肌醇六磷酸酶与美国申请号No.12/263,886的SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少88%，至少90%，至少93%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%和至少99%的序列同一性。
商业上可获得的肌醇六磷酸酶为NATUPHOS(BASF)，RONOZYME P(Novozymes A/S)，PHZYME(Danisco A/S,Diversa)和FINASE(AB Enzymes)。用于确定微生物肌醇六磷酸酶活性的方法和肌醇六磷酸酶单位的定义公开于Engelen等,1994,Journal of AOAC International 77:760-764。所述肌醇六磷酸酶可为野生型肌醇六磷酸酶，其活性变体或活性片段。
普鲁兰酶
任何普鲁兰酶可用于本发明的方法。在一个实施方案中，所述普鲁兰酶为GH57普鲁兰酶，例如从热球菌属(Thermococcus)，包括热球菌属菌种AM4，热球菌属菌种HJ21，Thermococcus barophilus，Thermococcus gammatolerans，Thermococcus hydrothermalis；Thermococcus kodakarensis，Thermococcus litoralis；和Thermococcus onnurineus的菌株；或从火球菌属(Pyrococcus)，如深海火球菌(Pyrococcus abyssi)和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株获得的普鲁兰酶。
蛋白酶
蛋白酶可在糖化、发酵或同时糖化和发酵过程中添加。所述蛋白酶可为任何蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其它蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。
酸性真菌蛋白酶可来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。具体而言，所述蛋白酶可来源于棘孢曲霉(WO 95/02044)，泡盛曲霉(Hayashida等,1977 Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)，黑曲霉(参见，例如，Koaze等,1964,Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)或米曲霉，如pepA蛋白酶，以及来自米黑毛霉(Mucor miehei)和微小毛霉(Mucor pusillus)的酸性蛋白酶。
所述蛋白酶可为中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。所述蛋白酶可与在Swissprot作为登录号P06832公开的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别是至少99%同一性。
所述蛋白酶可与WO 2003/048353中作为SEQ ID NO:1公开的氨基酸序列具有至少90%的同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别为至少99%同一性。
所述蛋白酶可为选自下组的木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
在一个实施方案中，所述蛋白酶来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施例中，所述蛋白酶来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。在另一个实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶制备物，优选来源于曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，Handbook of Proteolytic Enzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编,Academic Press,San Diego,1998,270章。天冬氨酸蛋白酶的实例包括，例如，Berka等,1990,Gene 96:313;Berka等,1993,Gene125:195-198;以及Gomi等,1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100中公开的那些，其通过提述并入本文。
所述蛋白酶亦可为金属蛋白酶，其定义为选自下组的蛋白酶：
(a)属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶；
(b)上述手册中属于M组的金属蛋白酶；
(c)尚未分配至宗族(clan)(命名：宗族MX)，或属于宗族MA，MB，MC，MD，ME，MF，MG，MH之一(如上述手册第989-991页定义)的金属蛋白酶；
(d)其它家族的金属蛋白酶(如上述手册第1448-1452页定义)；
(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；
(f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；
(g)属于家族M3，M26，M27，M32，M34，M35，M36，M41，M43，或M47之一(如上述手册第1448-1452页定义)的金属蛋白酶；
(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；和
(i)属于家族M35的金属蛋白酶(如上述手册第1492-1495页定义)。
在其它具体实施方案中，金属蛋白酶是其中对肽键的亲核攻击通过由二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰离子。所述金属离子的位置可由氨基酸配体固定。配体的数量可为五个、四个、三个、两个、一个或零个。在一个具体实施方案中，该数量为两个或三个，优选三个。
对于本发明的方法中使用的金属蛋白酶的来源并无限制。在一个实施方案中，该金属蛋白酶归类为EC 3.4.24，优选EC 3.4.24.39。在一个实施方案中，所述金属蛋白酶是酸稳定性金属蛋白酶，例如真菌酸稳定性金属蛋白酶，如来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶(归类为EC 3.4.24.39)。在另一个实施方案中，所述金属蛋白酶来源于曲霉属的菌株，优选米曲霉的菌株。
在一个实施方案中，所述金属蛋白酶与WO 2010/008841的SEQ ID NO:1(桔橙嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-178至177，-159至177，或优选氨基酸1至177具有至少80%，至少82%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少97%的序列同一性程度，并具有金属蛋白酶活性。在具体实施方案中，所述金属蛋白酶由与上面提及的SEQ ID NO:1具有同一性程度的氨基酸序列组成。
所述桔橙嗜热子囊菌金属蛋白酶是适用于本发明的方法的金属蛋白酶的优选实例。另一种金属蛋白酶来源于米曲霉，并包含WO 2003/048353中公开的SEQID NO:11的序列，或其氨基酸-23-353；-23-374；-23-397；1-353；1-374；1-397；177-353；177-374；或177-397，和WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:10。
另一种适用于本发明的方法的金属蛋白酶是包含WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的米曲霉金属蛋白酶，或下述金属蛋白酶：其为分离的多肽，与SEQ ID NO:5具有至少80%，至少82%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少97%的同一性程度，并具有金属蛋白酶活性。在具体实施方案中，所述金属蛋白酶组成为SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，金属蛋白酶具有与桔橙嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个、或十五个氨基酸的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，金属蛋白酶具有与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177相差十个、九个、八个、七个、六个或五个氨基酸，例如四个、三个、两个或一个氨基酸的氨基酸序列。
在具体实施方案中，所述金属蛋白酶a)包含如下或b)由如下组成：
i)WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177的氨基酸序列；
ii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353，-23-374，-23-397，1-353，1-374，1-397，177-353，177-374，或177-397的氨基酸序列；
iii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或
i)，ii)，和iii)的序列具有蛋白酶活性的等位变体或片段。
WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177，或WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353，-23-374，-23-397，1-353，1-374，1-397，177-353，177-374，或177-397的片段是从这些氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施方案中，片段含有至少75个氨基酸残基，或至少100个氨基酸残基，或至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基，或至少160个氨基酸残基，或至少165个氨基酸残基，或至少170个氨基酸残基，或至少175个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，所述金属蛋白酶与另一种蛋白酶如真菌蛋白酶，优选酸性真菌蛋白酶组合。
商业上可得到的产品包括
Figure BDA00002499608500231
ESPERASETM，FLAVOURZYMETM，
Figure BDA00002499608500232
Figure BDA00002499608500233
NOVOZYMTM FM 2.0L，以及iZyme BA(可从Novozymes A/S,Denmark获得)和GC106TM和来自Genencor International,Inc.,USA的SPEZYMETM FAN。
所述蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白每克DS，优选0.001到0.1mg酶蛋白每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以0.0001到1LAPU/g DS，优选0.001到0.1LAPU/g DS和/或0.0001到1mAU-RH/g DS，优选0.001到0.1mAU-RH/g DS的量存在。
组合物
在该方面，本发明涉及组合物，其包含(a)GH61多肽，(b)葡糖淀粉酶和(c)α-淀粉酶。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种其它糖酶，如α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶或真菌α-淀粉酶，优选酸性真菌α-淀粉酶。
所述组合物可包含一种或多种糖源生成酶，如特别是葡糖淀粉酶，β-淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶，普鲁兰酶，α-葡糖苷酶或其组合。
在另一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种GH61多肽和一种或多种发酵生物如酵母和/或细菌。发酵生物的实例可见于上文“发酵生物”部分。
用途
本发明亦涉及GH61多肽在发酵方法中的用途。在一个实施方案中，GH61多肽用于改善发酵产物收率。
修饰的发酵生物
本发明亦涉及用编码GH61多肽的多核苷酸转化的修饰的发酵生物，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达所述GH61多肽。
在一个优选实施方案中，所述发酵生物是微生物，如酵母或丝状真菌，或细菌。其它发酵生物的实例可见于“发酵生物”部分。
发酵生物可用编码GH61多肽的基因使用本领域公知的技术进行转化。
本文中描述并要求保护的发明不限于本文中公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。意图将任何等同的实施方案包括在本发明的范围内。事实上，根据前文的描述，除了本文中说明和记载的修饰之外对本发明的各种修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。意欲使这些修饰也落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包含定义的本公开为准。
此处引用了多篇参考文献，将它们整体通过提述并入。
材料和方法
葡糖淀粉酶活性(AGU)
葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测量。Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH 4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。
AMG温育：
底物： 23.2mM麦芽糖
缓冲液： 0.1M乙酸盐
pH： 4.30±0.05
温育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
颜色反应：
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M;0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
温育温度 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
α-淀粉酶活性(KNU)
α-淀粉酶活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的降解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue)，但在淀粉降解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其和有色玻璃标准(colored glass standard)进行比较。
一个千Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；以及pH 5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质MerckAmylum Solubile所需的酶量。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)或FAU-F测量。酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量，其相对于酶标准物来确定。一AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-葡糖苷键以形成具有不同链长的寡糖和糊精。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法(reversecolorimetry)在规定的分析条件下测定淀粉浓度的降低作为淀粉酶活性。
Figure BDA00002499608500251
标准条件/反应条件：
底物： 可溶性淀粉，大约0.17g/L
缓冲液： 柠檬酸(盐)，大约0.03M
碘(I2)： 0.03g/L
CaCl2： 1.85mM
pH： 2.50±0.05
温育温度： 40℃
反应时间： 23秒
波长： 590nm
酶浓度： 0.025AFAU/mL
酶工作范围： 0.01-0.04AFAU/mL
FAU-F的确定
FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)是相对于已声明强度的酶标样测量的。
Figure BDA00002499608500252
Figure BDA00002499608500261
蛋白酶测定方法AU(RH)
蛋白分解活性可用变性的血红蛋白作为底物来确定。在用于确定蛋白分解活性的Anson-Hemoglobin方法中，消化变性的血红蛋白，然后将未消化的血红蛋白用三氯乙酸(TCA)沉淀。用酚试剂确定TCA可溶性产物的量，所述酚试剂遇到酪氨酸和色氨酸呈蓝色。
一Anson单位(AU-RH)定义为在标准条件下(即，25℃，pH 5.5和10分钟反应时间)以使得每分钟释放的TCA可溶产物量与一毫当量的酪氨酸遇到酚试剂给出相同的颜色的起始速率消化血红蛋白。
AU(RH)方法描述于EAL-SM-0350，并可应要求从Novozymes A/SDenmark获得。
蛋白酶测定方法(LAPU)
一亮氨酸氨基酸肽酶单位(LAPU)是在下述条件下每分钟分解1微摩尔底物的酶量：26mM的L-亮氨酸对硝基苯胺作为底物，0.1M Tris缓冲液(pH8.0)，37℃，10分钟反应时间。
LAPU描述于EB-SM-0298.02/01，其可应要求从Novozymes A/S Denmark获得。
产麦芽糖淀粉酶活性(MANU)
一MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位，Maltogenic Amylase Novo Unit)为在37℃，在每ml的0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0中10mg麦芽三糖(SigmaM 8378)底物的浓度反应30分钟，每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需的酶量。
实施例
实施例1
在生淀粉酶水解方法中多个GH61多肽的作用
所有处理通过微尺度发酵评估。将总共410g磨碎的黄色马齿型玉米(具有大约0.5mm的平均粒度)添加至590g自来水。对该混合物补充3.0ml的1g/l青霉素和1g的尿素。将该浆料的pH用40%H2SO4调整至4.5。干固体(DS)水平确定为35wt%。将大约5g的该浆料添加至20ml小瓶。每个小瓶以下表中显示的α-淀粉酶(微小根毛霉α-淀粉酶和黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域的杂合体，其公开于WO 2006/069290)，葡糖淀粉酶(瓣环栓菌葡糖淀粉酶，其公开于WO 2006/069289)，和GH61多肽的量剂量添加，然后每5g浆料添加200微升酵母繁殖物。试剂剂量基于每个小瓶中玉米浆料的准确重量。
Figure BDA00002499608500271
将小瓶在32℃温育。对每个处理重复运行一式九次发酵。选择三个重复用于24小时、48小时和70小时时间点分析。将小瓶在24、48和70小时涡旋并通过HPLC分析。HPLC制备物由通过添加50微升40%H2SO4停止反应，离心和通过0.45微米过滤器过滤组成。将样品储藏在4℃直至进行分析。使用与折射率(RI)检测器偶联的AgilentTM 1100HPLC系统确定乙醇和二糖浓度。分离柱为来自
Figure BDA00002499608500272
的AminexTM HPX-87H离子排阻柱(300mmx7.8mm)。
在70小时之后的乙醇收率提供于表1：
表1-相对于对照的乙醇收率
Figure BDA00002499608500273
结果(粗体)显示GH61多肽的添加导致与对照相比在最终乙醇收率方面统计学上显著的增加。
获得的二糖浓度提供于表2。
表2-相对于对照的二糖收率
Figure BDA00002499608500274
Figure BDA00002499608500281
结果显示GH61多肽的添加减少了二糖的终浓度。
本发明由下述段落限定：
1.一种产生发酵产物的方法，其包括：用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用糖化酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同方法产生的发酵量相比产生更多量的发酵产物。
2.一种产生发酵产物的方法，其包括：用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用糖化酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同方法产生的二糖的量相比产生更少量的二糖。
3.段落1或2的方法，其中所述糖化酶是β-淀粉酶、葡糖淀粉酶或产麦芽糖α-淀粉酶。
4.段落1-3任一项的方法，其在普鲁兰酶和/或异淀粉酶的存在下进行。
5.段落1-4任一项的方法，其在蛋白酶的存在下进行。
6.段落1-5任一项的方法，其在20-40℃的温度进行。
7.段落1-6任一项的方法，其中所述含淀粉材料选自下组：大麦、豆、木薯、谷类、玉米、买罗高粱、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯、小麦、和全谷粒，或它们的组合。
8.段落1-7任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母。
9.段落1-8任一项的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇(例如丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如乙酸、柠檬酸、衣康酸、葡糖酸、葡糖酸盐/酯、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。
10.权利要求9的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
11.段落1-10任一项的方法，进一步包括回收所述发酵产物。
12.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:1具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:1具有GH61多肽活性的片段。
13.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:2具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:2具有GH61多肽活性的片段。
14.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:3具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:3具有GH61多肽活性的片段。
15.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:4具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:4具有GH61多肽活性的片段。
16.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:5具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:5具有GH61多肽活性的片段。
17.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:6具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:6具有GH61多肽活性的片段。
18.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:7具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:7具有GH61多肽活性的片段。
19.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:8具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:8具有GH61多肽活性的片段。
20.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:9具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:9具有GH61多肽活性的片段。
21.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:10具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:10具有GH61多肽活性的片段。
22.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:11具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:11具有GH61多肽活性的片段。
23.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:12具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:12具有GH61多肽活性的片段。
24.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:13具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:13具有GH61多肽活性的片段。
25.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:14具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:14具有GH61多肽活性的片段。
26.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:15具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:15具有GH61多肽活性的片段。
27.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:16具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:16具有GH61多肽活性的片段。
28.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:17具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:17具有GH61多肽活性的片段。
29.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:18具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:18具有GH61多肽活性的片段。
30.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:19具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:19具有GH61多肽活性的片段。
31.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:20具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:20具有GH61多肽活性的片段。
32.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:21具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:21具有GH61多肽活性的片段。
33.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:22具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:22具有GH61多肽活性的片段。
34.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:23具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:23具有GH61多肽活性的片段。
35.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:24具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:24具有GH61多肽活性的片段。
36.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:25具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:25具有GH61多肽活性的片段。
37.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:26具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:26具有GH61多肽活性的片段。
38.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:27具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:27具有GH61多肽活性的片段。
39.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:28具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:28具有GH61多肽活性的片段。
40.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:29具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:29具有GH61多肽活性的片段。
41.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:30具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:30具有GH61多肽活性的片段。
42.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:31具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:31具有GH61多肽活性的片段。
43.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与SEQ ID NO:32具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:32具有GH61多肽活性的片段。
44.段落1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽是Aurantiporusalborubescens的。
45.一种组合物，其包含(a)GH61多肽，(b)葡糖淀粉酶和(c)α-淀粉酶。
46.段落45的组合物，其进一步包含普鲁兰酶。
47.段落45或46的组合物，其中所述GH61多肽：
(a)与任何SEQ ID NOS:1-32具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是任何SEQ ID NOS:1-32具有GH61多肽活性的片段。
48.段落45或46的组合物，其中所述GH61多肽是Aurantiporusalborubescens的。
Figure IDA00002499608800011
Figure IDA00002499608800021
Figure IDA00002499608800031
Figure IDA00002499608800041
Figure IDA00002499608800051
Figure IDA00002499608800071
Figure IDA00002499608800081
Figure IDA00002499608800091
Figure IDA00002499608800101
Figure IDA00002499608800111
Figure IDA00002499608800121
Figure IDA00002499608800131
Figure IDA00002499608800141
Figure IDA00002499608800151
Figure IDA00002499608800161
Figure IDA00002499608800171
Figure IDA00002499608800181
Figure IDA00002499608800191
Figure IDA00002499608800201
Figure IDA00002499608800221
Figure IDA00002499608800241
Figure IDA00002499608800251
Figure IDA00002499608800261
Figure IDA00002499608800271
Figure IDA00002499608800281
Figure IDA00002499608800291

Claims (17)

1.一种产生发酵产物的方法，其包括：用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用糖化酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同方法产生的发酵量相比产生更多量的发酵产物。
2.一种产生发酵产物的方法，其包括：用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用糖化酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同方法产生的二糖的量相比产生更少量的二糖。
3.权利要求1或2的方法，其中所述糖化酶是β-淀粉酶、葡糖淀粉酶或产麦芽糖淀粉酶。
4.权利要求1-3任一项的方法，其在普鲁兰酶和/或异淀粉酶的存在下进行。
5.权利要求1-4任一项的方法，其在蛋白酶的存在下进行。
6.权利要求1-5任一项的方法，其在20-40℃的温度进行。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述含淀粉材料选自下组：大麦、豆、木薯、谷类、玉米、买罗高粱、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯、小麦、和全谷粒，或它们的任意混合物。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇(例如丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如乙酸、柠檬酸、衣康酸、葡糖酸、葡糖酸盐/酯、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。
10.权利要求9的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
11.权利要求1-10任一项的方法，进一步包括回收所述发酵产物。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽：
(a)与任何SEQ ID NOS:1-32具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是任何SEQ ID NOS:1-32具有GH61多肽活性的片段。
13.权利要求1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽是Aurantiporusalborubescens的。
14.一种组合物，其包含(a)GH61多肽，(b)葡糖淀粉酶和(c)α-淀粉酶。
15.权利要求14的组合物，其进一步包含普鲁兰酶。
16.权利要求14或15的组合物，其中所述GH61多肽：
(a)与任何SEQ ID NOS:1-32具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是任何SEQ ID NOS:1-32具有GH61多肽活性的片段。
17.权利要求14或15的组合物，其中所述GH61多肽是Aurantiporusalborubescens的。
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