ES2636216T3 - Procesos de producción de un producto de fermentación - Google Patents

Abstract

Proceso de producción de un producto de fermentación, que comprende la conversión de un material que contiene almidón a una dextrina con una alfa-amilasa; sacarificación de la dextrina a un azúcar con una enzima de sacarificación; y fermentación del azúcar utilizando un organismo de fermentación en presencia de un polipéptido de familia de glicósido hidrolasa 61 en un paso único a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del material que contiene almidón, donde el polipéptido de familia glicósido hidrolasa 61 está presente en una cantidad que resulta en una cantidad superior del producto de fermentación que la cantidad de fermentación producida por el mismo proceso sin el polipéptido de familia glicósido hidrolasa 61, donde el polipéptido de familia glicósido hidrolasa 61 comprende los motivos siguientes: **Fórmula** donde X es cualquier aminoácido, X (4,5) es cualquier cuatro o cinco aminoácidos contiguos y X (4) es cualquier cuatro aminoácidos contiguos.

Description

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Procesos de produccion de un producto de fermentacion Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a procesos de produccion de un producto de fermentacion de material vegetal usando uno o mas organismos fermentadores.

Antecedentes de la invencion

[0002] Un numero grande de productos comerciales que son diffciles de producir sinteticamente hoy se ha producido por organismos fermentadores.

Tales productos incluyen alcoholes (por ejemplo, butanol, etanol, metanol, 1,3-propanediol) acidos organicos (por ejemplo, acido acetico, acido cftrico, gluconato, acido gluconico, acido itaconico, acido lactico, acido succfnico, acido 2,5-diceto-D-gluconico); cetonas (por ejemplo, de acetona); aminoacidos (por ejemplo, acido glutamico); gases (por ejemplo, H2 y CO2) y compuestos mas complejos, incluyendo, por ejemplo, antibioticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas.

La fermentacion tambien se usa comunmente en el alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), productos lacteos (por ejemplo, en la produccion de yogur y queso), cuero e industrias de tabaco.

[0003] Un numero grande de procesos de produccion de productos de fermentacion, tal como etanol, por fermentacion de azucares proporcionados por degradacion de materiales que contienen almidon se conoce en la tecnica. Por ejemplo, la WO2004/080923 describe un proceso para la produccion de un producto alcoholico de almidon granulado que comprende la sacarificacion simultanea y fermentacion con una composicion enzimatica que consiste en alfa-amilasa acida, glucoamilasa, celulasa y xilanasa, y con levadura a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial del almidon granulado.

Sin embargo, la produccion de productos de fermentacion, tal como etanol, de tales materiales de planta sigue siendo demasiado costosa.

Por lo tanto, hay una necesidad de proporcionar procesos que pueden aumentar el rendimiento del producto de fermentacion y asf reducir los costes de produccion. Los polipeptidos glicosilo hidrolasa de la familia 61 (GH61) se han mostrado para mejorar la actividad de celulasas en sustratos lignocelulosicos (Merino and Cherry, 2007, Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. 108: 95-120).

Es un objeto de la presente invencion proporcionar un proceso mejorado para producir un producto de fermentacion. Resumen de la invencion

[0004] La presente invencion se refiere a un procedimiento de produccion de un producto de fermentacion, que comprende la conversion de un material que contiene almidon a una dextrina con una alfa-amilasa; la sacarificacion de la dextrina a un azucar con una glucoamilasa; y fermentacion del azucar utilizando un organismo de fermentacion en presencia de un polipeptido GH61 en un paso unico a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial del material que contiene almidon, donde el polipeptido GH61 esta presente en una cantidad que resulta en una cantidad superior del producto de fermentacion que la cantidad de fermentacion producida por el mismo proceso sin el polipeptido GH61, donde el polipeptido familia glicosido hidrolasa 61 comprende los aspectos siguientes: [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-i-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] y [FW]-[TF]-K-[AIV], donde X es cualquier aminoacido, X(4,5) es cualquier cuatro o cinco aminoacidos contiguos y X(4) es cualquier cuatro aminoacidos contiguos.

Aquf tambien se describe una composicion que comprende (a) un polipeptido GH61, (b) una glucoamilasa y (c) una alfa-amilasa.

Descripcion detallada de la invencion Definiciones

[0005] Alfa-amilasa (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3,2,1,1) es una enzima, que cataliza la hidrolisis de almidon y otros oligo y polisacaridos lineales y ramificados 1,4-glucosfdicos.

[0006] Fragmento: el termino "fragmento" significa un polipeptido con uno o mas (diferentes) aminoacidos eliminados del amino y/o carboxilo terminal de un polipeptido maduro; donde el fragmento tiene actividad enzimatica.

[0007] Polipeptido GH61: el termino "polipeptido GH61" significa un polipeptido que forma parte de la familia glicosido hidrolasa 61 segun Henrissat, 1991, una clasificacion de glicosil hidrolasa basada en similitudes de secuencia aminoacida, Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat y Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glicosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

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[0008] Glucoamilasa (glucano 1,4-a-glucosidasa, EC 3,2,1,3) es una enzima, que cataliza la hidrolisis de terminal (1^4) -vinculada a-D-residuos de glucosa sucesivamente de extremidades no-reducidas de las cadenas con liberacion de p-D-glucosa.

[0009] Aislado: los terminos "aislado" y "purificado" significan un polipeptido o polinucleotido que se remueve de un mfnimo de un componente con el cual esta asociado naturalmente.

Por ejemplo, una variante puede ser al menos 1% pura, por ejemplo, al menos 5% pura, al menos 10% pura, al menos 20% pura, al menos 40% pura, al menos 60% pura, al menos 80% pura y al menos 90% pura, como se ha determinado por SDS-PAGE y un polinucleotido puede ser al menos 1% puro, por ejemplo, al menos 5% puro, al menos 10% puro, al menos 20% puro, al menos 40% puro, al menos 60% puro, al menos 80% puro, al menos 90% puro y al menos 95% puro, como se ha determinado por electroforesis de agarosa.

[0010] Polipeptido maduro: el termino "polipeptido maduro" significa un polipeptido en su forma final seguida de traduccion y cualquier modificacion postraduccional, tal como tratamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilacion, fosforilacion, etc.

[0011] Enzima original: el termino "progenitor" significa una enzima para la que se realiza una alteracion para producir una variante.

El progenitor puede ser un polipeptido (tipo salvaje) de origen natural o una variante del mismo.

[0012] Identidad de secuencia: la relacion entre dos secuencias de aminoacido o entre dos secuencias de nucleotidos se describe por el parametro "identidad de secuencia".

[0013] Para fines de la presente invencion, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoacidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se ha implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, RIce et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente version 3.0.0 o posterior.

Los parametros opcionales usados son penalizacion por apertura de espacio de 10, penalizacion por extension de espacio de 0.5 y el EBLOSUM62 (version de EMBOsS de BLOSUM62) matriz de sustitucion.

El resultado de Needle etiquetado "identidad mas larga" (obtenido utilizando la opcion -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos identicos x 100)/(longitud de alineamiento-numero total de espacios en alineamiento)

[0014] Para fines de la presente invencion, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleotidas se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se ha implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente version 3.0.0 o posterior.

Los parametros opcionales usados son penalizacion por apertura de espacio de 10, penalizacion por extension de espacio de 0.5 y la matriz de sustitucion EDNAFULL (version de EMBOsS de NCBI nUc4.4).

El resultado de Needle etiquetado "identidad mas larga" (obtenido utilizando la opcion -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:

Deoxiribonucleotidos identicos x 100)/(longitud de alineamiento- numero total de espacios en alineamiento

[0015] Variante: el termino "variante" significa un polipeptido que incluye una alteracion, es decir, una sustitucion, insercion y/o delecion, en una o mas (varias) posiciones.

Una sustitucion implica un remplazo de un aminoacido que ocupa una posicion con un aminoacido diferente; una delecion significa la eliminacion de un aminoacido que ocupa una posicion; y un medio de insercion que anade 1-5 aminoacidos adyacentes a un aminoacido que ocupa una posicion.

[0016] Enzima tipo salvaje: el termino "tipo salvaje" significa una enzima expresada por un microorganismo de origen natural, tal como una bacteria, levadura u hongo filamentoso encontrado en la naturaleza.

Procesos para producir productos de fermentacion de materiales que contienen almidon no gelatinizado.

[0017] La presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentacion de un material que contiene almidon sin gelatinizacion (frecuentemente referido como "sin cocinar") del material que contiene almidon.

En una forma de realizacion, el proceso incluye la sacarificacion del material que contiene almidon (por ejemplo; molido) por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial, preferiblemente en presencia de una alfa-amilasa y/o una enzima(s) generadora de fuente de carbohidratos (enzima(s) de sacarificacion) para producir azucares que se pueden fermentar en el producto de fermentacion por un organismo fermentador, donde el polipeptido GH61 esta

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presente en una cantidad que resulta en una cantidad superior del producto de fermentacion que la cantidad de la fermentacion producida por el mismo proceso sin el polipeptido GH61, donde el polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61 comprende los aspectos siguientes: [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-i-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] y [FW]-[TF]- K-[AIV], donde X es cualquier aminoacido, X(4,5) es cualquier cuatro o cinco aminoacidos contiguos y X(4) es cualquier cuatro aminoacidos contiguos.

[0018] Por consiguiente, este aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento de produccion de un producto de fermentacion, que comprende la conversion de un material que contiene almidon a una dextrina con una alfa- amilasa; sacarificacion de la dextrina a un azucar con una glucoamilasa; y fermentacion del azucar utilizando un organismo de fermentacion en presencia de un polipeptido GH61 en un paso unico a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial del material que contiene almidon, donde el polipeptido de glicosido hidrolasa de la familia 61 comprende los aspectos siguientes: [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-i-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] y [FW]- [TF]-K-[AIV], donde X es cualquier aminoacido, X(4,5) es cualquier cuatro o cinco aminoacidos contiguos y X(4) es cualquier cuatro aminoacidos contiguos.

[0019] El termino "temperatura de gelatinizacion initial" significa la temperatura minima en la que comienza la gelatinizacion de almidon.

En general, el almidon calentado en agua empieza a gelatinizar entre 50 °C y 75 °C; la temperatura exacta de gelatinizacion depende del almidon especifico y puede prontamente ser determinado por el experto en la materia.

Asi, la temperatura de gelatinizacion inicial puede variar segun las especies de planta, a la variedad particular de las especies de planta al igual que con las condiciones de crecimiento.

La temperatura de gelatinizacion inicial de un material que contiene almidon dado se puede determinar como la temperatura a la que la birrefringencia se pierde en 5% de los granulos de almidon utilizando el metodo descrito por Gorinstein y Lii, 1992, Starch/Starke 44(12): 461-466.

[0020] El proceso de la presente invencion puede comprender ademas la recuperacion del producto de fermentacion, por ejemplo, por destilacion.

[0021] El material que contiene almidon puede ser un lodo, tal como almidon granulado, con 10-55 peso. % solidos secos (DS), preferiblemente 25-45 peso. % solidos secos, mas preferiblemente 30-40 peso. % solidos secos de material que contiene almidon pueden ser preparados.

El lodo puede incluir agua y/o aguas de proceso, tal como vinaza (destilacion), agua de depuradora, evaporador condensado o destilado, agua de decapante de destilacion o agua de proceso de otras plantas de producto de fermentacion.

Debido a que el proceso se realiza por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial y asi no tiene lugar ningun aumento de viscosidad significativo, niveles altos de vinaza se pueden utilizar si se desea.

En una forma de realizacion, el lodo acuoso contiene de 1 a 70 vol. %, preferiblemente 15-60 vol. %, especialmente de 30 a 50 vol. % agua y/o aguas de proceso, tal como vinaza (destilacion), agua de depuradora, condensado de evaporador o destilado, agua de decapante de destilacion o agua de proceso de otras plantas de producto de fermentacion o combinaciones de las mismas o similar.

[0022] El material que contiene almidon se puede preparar reduciendo el tamano de partfcula, preferiblemente por molienda en humedo o en seco, para 0.05-3.0 mm, preferiblemente 0.1-0.5 mm.

Despues de ser sometido a un proceso de la invencion al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% del almidon en el material que contiene almidon se convierte en un almidon soluble hidrolizado.

[0023] El proceso de este aspecto de la invencion se conduce a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial, por ejemplo, una temperatura en el rango entre 25-40°C, tal como 25-40°C, 29- 35°C, 30- 34°C, tal como alrededor de 32°C.

Un experto en la tecnica puede facilmente determinar las condiciones del proceso adecuadas.

[0024] El proceso de la invencion se puede realizar a un pH de 3 y 7, por ejemplo, 3.5 a 6 o pH 4 a 5.

[0025] En una forma de realizacion, el proceso se realiza de modo que el nivel de azucar, tal como nivel de glucosa, se mantiene a un nivel bajo, tal como debajo de 6 peso. %, debajo de 3 peso. %, debajo de 2 peso.%, debajo de 1 peso. %., debajo de 0.5 peso. %, debajo de 0.25% peso. %, o debajo de 0.1 peso. %.

Tales bajos niveles de azucar se pueden realizar sencillamente utilzando cantidades ajustadas de enzima y organismo fermentador.

Una persona experta en la tecnica puede facilmente determinar que dosis/cantidades de enzima y organismo fermentador usar.

Las cantidades empleadas de enzima y organismo fermentador tambien se pueden seleccionar para mantener bajas concentraciones de maltosa en el caldo de fermentacion.

Por ejemplo, el nivel de maltosa se puede mantener debajo de 0.5 peso. %, tal como debajo de 0.2 peso. %.

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Materiales que contienen almidon

[0026] Cualquier materia prima que contiene almidon adecuado se puede utilizar en un proceso de la presente invencion.

La materia prima se selecciona generalmente basandose en el producto de fermentacion deseado.

Los ejemplos de materias primas que contienen almidon, adecuados para usar en los procesos de la presente invencion, incluyen cebada, alubias, mandioca, cereales, mafz, sorgo, guisantes, patatas, arroz, centeno, sagu, sorgo, patatas dulces, tapioca, trigo y granos enteros o cualquier mezcla de los mismos.

El material que contiene almidon tambien puede ser un tipo ceroso o no ceroso de mafz y cebada.

Productos de fermentacion

[0027] El termino "producto de fermentacion" significa un producto producido por un proceso que incluye la fermentacion utilizando un organismo fermentador.

Los productos de fermentacion incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); acidos organicos (por ejemplo, acido cftrico, acido acetico, acido itaconico, acido lactico, acido succfnico, acido gluconico); cetonas (por ejemplo, de acetona); aminoacidos (por ejemplo, acido glutamico); gases (por ejemplo, H2 y CO2) antibioticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas.

En una forma de realizacion preferida, el producto de fermentacion es etanol, por ejemplo, etanol combustible; etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutrales potables; o etanol industrial o productos usados en la industria de alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), industria lactea (por ejemplo, productos lacteos fermentados), industria de cuero e industria de tabaco.

Tipos de cerveza preferidos comprenden cerveza inglesa de malta, cerveza negra, portador cerveza rubia, amarga, soluciones de malta, cerveza happoushu, cerveza de alta en alcohol, cerveza baja en alcohol, cerveza baja en calorfas o cerveza ligera.

Organismos fermentadores

[0028] El termino "organismo fermentador" se refiere a cualquier organismo, incluyendo organismos bacterianos y fungicos, tal como levadura y hongos filamentosos, adecuados para producir un producto de fermentacion deseado. Organismos fermentadores adecuados segun la invencion son capaces de fermentar, es decir, convertir, azucares fermentables, tal como arabinosa, fructosa, glucosa, maltosa, manosa o xilosa, directa o indirectamente en el producto de fermentacion deseado.

[0029] Los ejemplos de organismos fermentadores incluyen organismos fungicos tales como levadura.

Levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces uvarum; cepas de Pichia, en particular, Pichia stipitis tal como Pichia stipitis CBS 5773 o Pichia pastoris; cepas de Candida, en particular, Candida arabinofermentanos, Candida boidinii, Candida diddensii, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis o Candida utilis.

Otros organismos fermentadores incluyen cepas de Hansenula, en particular, Hansenula anomala o polimorfa de Hansenula; cepas de Kluyveromyces, en particular Kluyveromyces fragilis o Kluyveromyces marxianus; y cepas de Schizosaccharomyces, en particular Schizosaccharomyces pombe.

[0030] Los organismos fermentadores bacterianos preferidos incluyen cepas de Escherichia, en particular,

Escherichia coli, cepas de Zymomonas, en particular Zymomonas mobilis, cepas de Zymobacter, en particular Zymobactor palmae, cepas de Klebsiella en particular Klebsiella oxytoca, cepas de Leuconostoc, en particular Leuconostoc mesenteroides, cepas de Clostridium, en particular Clostridium butyricum, cepas de Enterobacter, en particular Enterobacter aerogenes y cepas de Thermoanaerobacter, en particular Thermoanaerobacter BG1L1 (Appl. Microbiol. Biotecnologfa. 77: 61-86), Thermoanarobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter mathranii o

Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum.

Cepas de Lactobacillus estan tambien previstas como son las cepas de Corynebacterium glutamicum R, Bacillus thermoglucosidaisus y Geobacillus thermoglucosidasius.

[0031] En una forma de realizacion, el organismo fermentador es un organismo fermentador de azucar C6, tal como una cepa de, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.

[0032] En una forma de realizacion, el organismo fermentador se anade al medio de fermentacion de modo que el organismo fermentador viable, tal como levadura, cuenta por mL de medio de fermentacion en el rango de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, especialmente aproximadamente 5x107.

[0033] La levadura es el organismo fermentador preferido para fermentacion de etanol.

Preferidas son las cepas de Saccharomyces, especialmente cepas de las especies Saccharomyces cerevisiae, preferiblemente, cepas que son resistentes hacia niveles altos de etanol, es decir, hasta, por ejemplo, 10, 12, 15 o 20 vol. % o mas etanol.

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[0034] La levadura disponible comercialmente incluye LNF SA-1, LNF BG-1, LNF PE-2,y LNF CAT-1 (disponible de Brazil LNF), RED STAR™ y levadura ETHANOL RED™ (disponible de Fermentis/Lesaffre, EE.UU), FALI (disponible de Fleischmann's yeast, EE.UU), SUPERSTART y levadura fresca THERMOSACC™ (disponible de Ethanol Technology, WI, EE.UU), BIOFERM AFT y XR (disponible de NABC - North American Bioproducta Corporation, GA, USA), GeRt STRANS (disponible de GeRt Strand AB, Sweden) y FERMIOL (disponible de DSM especialidades).

[0035] Segun la invencion, el organismo fermentador capaz de producir un producto de fermentacion deseado de azucares fermentables preferiblemente crece bajo condiciones precisas a un fndice de crecimiento particular.

Cuando el organismo fermentador es introducido en/anadido al medio de fermentacion, el organismo fermentador inoculado pasa por un numero de etapas.

Inicialmente el crecimiento no se produce. Este periodo se refiere como la "fase de latencia" y se puede considerar un periodo de adaptacion.

Durante la fase siguiente referida como la "fase exponencial", el fndice de crecimiento aumenta gradualmente. Despues de un periodo de crecimiento maximo, el fndice cesa y el organismo fermentador entra en "fase estacionaria".

Despues de otro periodo de tiempo, el organismo fermentador entra la "fase de muerte" donde el numero de celulas viables desciende.

Fermentacion

[0036] Se determinan las condiciones de fermentacion basadas en, por ejemplo, la especie de material vegetal, los azucares fermentables disponibles, el organismo(s) de fermentacion y/o el producto de fermentacion deseado.

Un experto en la tecnica puede facilmente determinar condiciones de fermentacion adecuadas.

La fermentacion segun la invencion puede realizarse en condiciones usadas de forma convencional.

Los procesos de fermentacion preferidos son procesos anaerobicos.

[0037] Por ejemplo, las fermentaciones se pueden realizar a temperaturas tan altas como 75°C, por ejemplo, entre 40-70°C, tal como entre 50-60°C.

Sin embargo, tambien se conocen las bacterias con una temperatura inferior significativamente optima hasta alrededor de temperatura ambiente (alrededor de 20°C).

Ejemplos de organismos fermentadores adecuados se pueden encontrar en "organismos de fermentacion" de la seccion de arriba.

[0038] Para la produccion de etanol usando levadura, la fermentacion puede seguir durante 24 a 96 horas, en particular durante 35 a 60 horas.

En una forma de realizacion, la fermentacion se realiza a una temperatura entre 20 a 40°C, preferiblemente 26 a 34°C, en particular, alrededor de 32°C.

En una forma de realizacion, el pH es de pH 3 a 6, preferiblemente, alrededor de pH 4 a 5.

[0039] Otros productos de fermentacion se pueden fermentar a temperaturas conocidas por la persona experta en la tecnica por ser adecuadas para el organismo fermentador en cuestion.

[0040] La fermentacion tfpicamente se realiza a un pH en el rango entre 3 y 7, preferiblemente de pH 3.5 a 6, tal como alrededor de pH 5.

Las fermentaciones estan en curso tfpicamente durante 6-96 horas.

[0041] Los procesos de la invencion se pueden realizar como un lote o como un proceso continuo.

Las fermentaciones se pueden conducir en un sistema de ultrafiltracion donde el retenido se sujeta bajo recirculacion en presencia de solidos, agua y el organismo fermentador, y donde el permeato es el producto de fermentacion deseado que contiene lfquido.

Contemplados igualmente son procesos conducidos en los reactores de membrana continua con membranas de ultrafiltracion y donde el retenido se sujeta bajo recirculacion en la presencia de solidos, agua y el organismo(s) de fermentacion, y donde el permeato es el producto de fermentacion que contiene lfquido.

[0042] Despues de la fermentacion, el organismo fermentador se puede separar del lodo fermentado y reciclar.

Medio de fermentacion

[0043] La frase "fermentacion media" o "medio de fermentacion" se refiere al ambiente donde se realiza la fermentacion y comprende el sustrato de fermentacion, que es, la fuente de carbohidrato que se metaboliza por el organismo(s) de fermentacion.

[0044] El medio de fermentacion puede comprender otros nutrientes y estimulador(es) de crecimiento para el organismo(s) de fermentacion.

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El nutriente y estimuladores de crecimiento son muy usados en la tecnica de fermentacion e incluyen fuentes de nitrogeno, tales como amomaco; vitaminas y minerales o combinaciones de los mismos.

Recuperacion

[0045] Despues de la fermentacion, el producto de fermentacion se puede separar del medio de fermentacion.

El medio de fermentacion se puede destilar para extraer el producto de fermentacion deseado o el producto de fermentacion deseado se puede extraer del medio de fermentacion por tecnicas de micro o filtracion de membrana. Alternativamente, el producto de fermentacion se puede recuperar por desorcion.

Metodos para recuperacion se conocen en la tecnica.

Enzimas

[0046] La enzima(s) descrita abajo se debe(n) usar en una "cantidad efectiva" en los procesos de la presente invencion.

Polipeptidos GH61

[0047] En los procesos descritos aqrn, cualquier polipeptido GH61 se puede usar.

[0048] En un primer aspecto de la invencion, el polipeptido GH61 comprende los motivos siguientes:

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donde X es cualquier aminoacido, X(4,5) es cualquier cuatro o cinco aminoacidos contiguos y X(4) es cualquier cuatro aminoacidos contiguos.

[0049] El polipeptido GH61 que comprende los aspectos mencionados anteriormente puede comprender ademas:

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]3 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], o

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] y [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],

donde X es cualquier aminoacido, X(1,2) es cualquier uno o dos aminoacidos contiguos, X(3) es cualquier tres aminoacidos contiguos y X(2) es cualquier dos aminoacidos contiguos.

[0050] En un aspecto preferido, el polipeptido GH61 comprende ademas H-X(1,2)-G-P-X(3)-[iW]-[AILMV].

En otro aspecto preferido, el polipeptido GH61 comprende ademas [EQ]-X-i-X(2)-C-X-[EHQN]-[FiLV]-X-[ILV].

En otro aspecto preferido, el polipeptido GH61 comprende ademas H-X(1,2)-G-P-X(3)-[iW]-[AILMV] y [EQ]-X-i-X(2)- C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV].

[0051] En un segundo aspecto, el polipeptido GH61 comprende el motivo siguiente:

imagen2

donde x es cualquier aminoacido, x (4,5) es cualquier 4 o 5 aminoacidos contiguos y x(3) es cualquier 3 aminoacido contiguo.

En el motivo anterior, se emplea la abreviatura de aminoacido de una sola letra IUPAC aceptada.

[0052] En un tercer aspecto, el polipeptido GH61 comprende una secuencia de aminoacidos que tiene un grado de identidad con el polipeptido maduro de la SEQ ID N.°: 1 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 2 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 3 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 4 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 5 (Thielavia terrestris), SEQ iD N.°: 6 (Thielavia terrestris), SEQ iD N.°: 7 (Thermoascus aurantiacus), SEQ ID N.°: 8 (Trichoderma reesei), SEQ ID N.°: 9 (Myceliophthora thermophila), SEQ ID N.°: 10 (Myceliophthora thermophila), SEQ ID N.°: 11 (Myceliophthora thermophila), SeQ ID N.°: 12 (Myceliophthora thermophila), SeQ ID N.°: 13 (Myceliophthora thermophila), SEQ ID N.°: 14 (Thermoascus aurantiacus), SEQ ID N.°: 15 (Aspergillus fumigatus), sEq ID N.°: 16 (Penicillium pinophilum), SEQ ID N.°: 17 (Termoascus sp.), SEQ ID N.°: 18 (Penicillium sp.), SEQ iD N.°: 19 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 20 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 21 (Thielavia terrestris), SeQ ID N.°: 22 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 23 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 24 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 25 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 26 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 27 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 28 (Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(Thielavia terrestris), SEQ ID N.°: 30 (Thermoascus crustaceus), SEQ ID N.°: 31 (Thermoascus crustaceus) o SEQ ID N.°: 32 (Thermoascus crustaceus) de al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% o al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100%.

[0053] En un sexto aspecto, el polipeptido GH61 es una variante artificial que comprende una sustitucion, delecion, y/o insercion de uno o mas (o diferentes) aminoacidos del polipeptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID

N.°:

10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12, SEQ ID N.°: 13, SEQ ID N.°: 14, SEQ ID N.°: 15, SEQ ID N.°: 16, SEQ ID

N.°:

17, SEQ ID N.°: 18, SEQ ID N.°: 19, SEQ ID N.°: 20, SEQ ID N.°: 21, SEQ ID N.°: 22, SEQ ID N.°: 23, SEQ ID

N.°:

24, SEQ ID N.°: 25, SEQ ID N.°: 26, SEQ ID N.°: 27, SEQ ID N.°: 28, SEQ ID N.°: 29, SEQ ID N.°: 30, SEQ ID

N.°:

31 o SEQ ID N.° 32 o una secuencia homologa de la misma.

[0054] Preferiblemente, los cambios aminoacidos son de una naturaleza menor, esto es sustituciones de aminoacidos conservadoras o inserciones que significativamente no afectan al plegado y/o actividad de la protefna; deleciones pequenas, tfpicamente de uno a aproximadamente 30 aminoacidos; pequenas extensiones amino o carboxiloterminal, tal como un residuo de metionina aminoterminal; un peptido enlazador pequeno de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extension pequena que facilita la purificacion por la carga de red de cambio u otra funcion, tal como un tracto de polihistidina, un epftopo antigenico o un dominio de union.

[0055] Ejemplos de sustituciones conservadoras son en el grupo de aminoacidos basicos (arginina, lisina e histidina), aminoacidos acidos (acido glutamico y acido aspartico), aminoacidos polares (glutamina y asparagina), aminoacidos hidrofobicos (leucina, isoleucina y valina), aminoacidos aromaticos (fenilalanina, triptofano y tirosina), y aminoacidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina).

Sustituciones de aminoacidos que generalmente no alteran la actividad especffica se conocen en la tecnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York.

Los intercambios mas frecuentes son Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

[0056] Alternativamente, los cambios aminoacidos son de tal naturaleza que las propiedades ffsico qufmicas de los polipeptidos se alteran.

Por ejemplo, los cambios aminoacidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipeptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH optimo y similar.

[0057] Los aminoacidos esenciales en un polipeptido progenitor se pueden identificar segun procedimientos conocidos en la tecnica, tal como mutagenesis dirigida al sitio o mutagenesis de escaneado de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085).

En la tecnica anterior, las mutaciones de alanina unicas se introducen en cada residuo en la molecula y las moleculas mutantes resultantes se evaluan para una actividad de mejora celulolftica para identificar residuos de aminoacidos que son crfticos para la actividad de la molecula.

Ver tambien, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708.

El sitio activo de la enzima u otra interaccion biologica puede tambien ser determinado por analisis ffsico de estructura, como se ha determinado por tales tecnicas como resonancia magnetica nuclear, cristalograffa, difraccion electronica o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con mutacion de aminoacidos de sitio de contacto putativo.

Ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64.

Las identidades de aminoacidos esenciales tambien pueden ser inferidas de analisis de identidades con polipeptidos que se relacionan con el polipeptido progenitor.

[0058] Las sustituciones de aminoacidos unicas o multiples, deleciones y/o inserciones se pueden hacer y evaluar usando metodos conocidos de mutagenesis, recombinacion y/o redistribucion, seguidos de un procedimiento de seleccion pertinente, tal como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625.

Otros metodos que se pueden usar incluyen PCR con tendencia al error, presentacion en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente EEUU n° 5,223,409; WO 92/06204) y mutagenesis dirigida por region (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0059] Metodos de mutagenesis/redistribucion se pueden combinar con alto rendimiento, metodos de seleccion automatizados para detectar la actividad de polipeptidos mutagenizados clonados expresados por celulas huesped (Ness et al., 1999, Biotechnology 17: 893-896).

Moleculas de ADN mutagenizadas que codifican polipeptidos activos se pueden recuperar de las celulas huesped y secuenciar rapidamente usando metodos estandar en la tecnica. Estos metodos permiten la determinacion rapida de la importancia de residuos de aminoacidos individuales en un polipeptido.

[0060] El numero total de sustituciones de aminoacidos, deleciones y/o inserciones del polipeptido GH61 maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12, SEQ ID N.°: 13, SEQ ID N.°: 14, SEQ ID N.°:

15, SEQ ID N.°: 16, SEQ ID N.°: 17, SEQ ID N.°: 18, SEQ ID N.°: 19, SEQ ID N.°: 20, SEQ ID N.°: 21, SEQ ID N.°:

22, SEQ ID N.°: 23, SEQ ID N.°: 24, SEQ ID N.°: 25, SEQ ID N.°: 26, SEQ ID N.°: 27, SEQ ID N.°: 28, SEQ ID N.°:

29, SEQ ID N.°: 30, SEQ ID N.°: 31 o SEQ ID N.°: 32 no es mas de 4, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4.

[0061] En un aspecto, el polipeptido GH61 se usa en presencia de un cation metalico bivalente de activacion soluble descrito en la WO 2008/151043, por ejemplo, sulfato de manganeso.

[0062] En un aspecto, el polipeptido GH61 se usa en presencia de un compuesto dioxi, un compuesto bicfclico, un compuesto heterocfclico, un compuesto que contiene nitrogeno o un compuesto con sulfuro.

[0063] El compuesto dioxi puede incluir cualquier compuesto adecuado con dos o mas atomos de oxfgeno.

En algunos aspectos, los compuestos dioxi contienen una fraccion de arilo sustituido como se describe en este caso. Los compuestos dioxi pueden comprender uno o mas (varios) hidroxilo y/o derivados hidroxilo, pero tambien incluyen fracciones de arilo sustituido que carecen de hidroxilo y derivados de hidroxilo.

Ejemplos no limitativos de compuestos dioxi incluyen pirocatecol o catecol; acido cafeico; acido 3,4- dihidroxibenzoico; 4-tert-butil-5-metoxi-1,2-benzenediol; pirogalol; acido galico; metil-3,4,5-trihidroxibenzoato; 2,3,4- trihidroxibenzofenona; 2,6-dimetoxifenol; acido sinapfnico; acido 3,5-dihidroxibenzoico; 4-chloro-1,2-benzenediol; 4- nitro-1,2-benzenediol; acido tanico; galato etilo; glicolato de metilo; acido dihidroxifumarico; 2-butino-1,4-diol; (acido croconico; 1,3-propanodiol; acido tartarico; 2,4-pentanediol; 3-etioxi-1,2-propanediol; 2,4,4'-trihidroxibenzofenona; cis-2-buteno-1,4-diol; 3,4-dihidroxy-3-cyclobuteno-1,2-dione; dihidroxiacetona; acroleina acetalico; metil-4- hidroxibenzoato; acido 4-hidroxibenzoico; y metil-3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoato; o una sal o solvato de los mismos.

[0064] El compuesto bicfclico puede incluir cualquier sistema anular fusionado sustituido adecuado como se describe en este caso.

Los compuestos pueden comprender uno o mas (varios) anillos adicionales y no se limitan a un numero especffico de anillos a menos que se haya dicho de otro modo.

En un aspecto, el compuesto bicfclico es un flavonoide.

En otro aspecto, el compuesto bicfclico es un isoflavonoide substitufdo opcionalmente.

En otro aspecto, el compuesto bicfclico es un ion de flavilio sustituido opcionalmente, tal como una antocianidina sustituida opcionalmente o antocianina sustituida opcionalmente o derivado.

Ejemplos no limitativos de compuestos bicfclicos incluyen epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; kaempferol; morin; acacetina; naringenina; isoramnetina; apigenina; cianidina; cianina; kuromanina; (keracianina; o una sal o solvato de los mismos.

[0065] El compuesto heterocfclico puede ser cualquier compuesto adecuado, tal como un anillo aromatico sustituido opcionalmente o no-aromatico que comprende un heteroatomo, como se describe en este caso.

En un aspecto, el heterocfclico es un compuesto que incluye una fraccion de heterocicloalquilo sustituida opcionalmente o una fraccion de heteroarilo sustituida opcionalmente.

En otro aspecto, la fraccion de heterocicloalquilo sustituido opcionalmente o fraccion de heteroarilo sustituido opcionalmente es un heterocicloalquilo dividido en 5 miembros sustituido opcionalmente o una fraccion de heteroarilo dividido en 5 miembros sustituido opcionalmente.

En otro aspecto, el heterocicloalquilo sustituido opcionalmente o fraccion de heteroarilo sustituido opcionalmente es una fraccion sustituida opcionalmente seleccionada de pirazolilo, furanilo, imidazolilo, isoxazolil, oxadiazolilo, oxazolilo, pirrolil, piridilo, pirimidilo, piridazinil, tiazolilo, triazolilo, tienilo, dihidrotieno-pirazolilo, tianaftenilo, carbazolilo, benzimidazolilo, benzotienil, benzofuranilo, indolil, quinolefnilo, benzotriazolil benzotiazolilo, benzooxazolilo, benzimidazolilo, isoquinolefnilo, isoindolil, acridinilo, benzoisazolilo, dimetilhidantoina, pirazinilo, tetrahidrofuranilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, morfinilo, indolil, diazepinilo, azepinilo, tiepinilo, piperidinil y oxepinilo.

En otro aspecto, la fraccion de heterocicloalquilo sustituido opcionalmente o fraccion de heteroarilo sustituido opcionalmente es un furanilo sustituido opcionalmente.

Ejemplos no limitativos de compuestos heterocfclicos incluyen (1,2-dihidroxietil)-3,4-dihidroxifuran-2(5H)-ona; 4- hidroxi-5-metil-3-furanona; 5-hidroxi-2(5H)-furanona; [1,2-dihidroxietil]furan-2,3,4(5H)-triona; a-hidroxi-y-butirolactona; y-lactona ribonica; acido y-lactona aldohexuronicaldohexuronico; acido gluconico 8 lactona; 4-hidroxicumarina; dihidrobenzofurano; 5-(hidroximetil)furfural; furoin; 2(5H)-furanona; 5,6-dihidro-2H-piran-2-ona; y 5,6-dihidro-4- hidroxi-6-metil-2H-piran-2-ona; o una sal o solvato de los mismos.

[0066] El compuesto que contiene nitrogeno puede ser cualquier compuesto adecuado con uno o mas atomos de nitrogeno.

En un aspecto, el compuesto que contiene nitrogeno comprende una amina, imina, hidroxilamina o fraccion de nitroxido.

Ejemplos no limitativos de compuestos que contienen nitrogeno incluyen oxima de acetona; acido violurico; piridina- 2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-benzenediamina; 2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidiniloxi; 5,6,7,8-tetrahidrobiopterin; 6,7- dimetil-5,6,7,8-tetrahidropterina; y acido maleamico; o una sal o solvato de los mismos.

5

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20

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65

[0067] El compuesto de quinona puede ser cualquier compuesto adecuado que comprende una fraccion de quinona como se describe en este caso.

Ejemplos no limitativos de compuestos de quinona incluyen 1,4-benzoquinona; 1,4-naphthoquinone; 2-hydroxy-1,4- naftoquinona; 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4-benzoquinona o coenzima Q0, 2,3,5,6-tetrametil-1,4-benzoquinona o duroquinona; 1,4-dihidroxiantraquinona; 3-hidroxi-1-metil-5,6-indolinediona o adrenocromo; 4-tert-butil-5-metoxi-1,2- benzoquinona; quinona de pirroloquinolina; o una sal o solvato de los mismos.

[0068] El compuesto con sulfuro puede ser cualquier compuesto adecuado que comprende uno o mas atomos de azufre.

En un aspecto, el sulfuro que comprende una fraccion seleccionada de tionilo, tioeter, sulfinilo, sulfonil, sulfamida, sulfonamida, acido sulfonico y ester sulfonico.

Ejemplos no limitativos de compuestos con sulfuro incluyen etanotiol; 2-propanetiol; 2-propeno-1-tiol; acido 2- mercaptoetanosulfonico; bencenotiol; benzeno-1,2-ditiol; cistefna; metionina; glutation; cistina; o una sal o solvato de los mismos.

[0069] En una forma de realizacion, el polipeptido GH61 esta presente en la cantidad de 2-1000 microgramos/g solidos secos (DS), por ejemplo, 5-100, 10-40 o 20-40 microgramos/g DS.

Alfa-amilasas

[0070] Segun la invencion, cualquier alfa-amilasa puede ser utilizada, tal como de origen fungico, bacteriano o vegetal.

En una forma de realizacion preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa acida, por ejemplo, alfa-amilasa bacteriana acida o fungica acida.

El termino "alfa amilasa acida" significa una alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) que anadida en una cantidad eficaz tiene actividad optima en el rango de pH de 3 a 7, preferiblemente de 3.5 a 6, o mas preferiblemente de 4-5.

Alfa-amilasas bacterianas

[0071] Una alfa-amilasa para usar en la presente invencion puede ser una alfa-amilasa bacteriana, por ejemplo, derivada de Bacillus.

En una forma de realizacion preferida, la alfa-amilasa de Bacillus se deriva de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis, pero tambien se puede derivar de otra especie Bacillus.

[0072] Ejemplos especfficos de alfa-amilasas incluyen la alfa-amilasa Bacillus amyloliquefaciens de la SEQ ID N.°: 5 en WO 99/19467, la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis de la SEQ ID N.°: 4 en WO 99/19467 y la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID N.°: 3 en WO 99/19467.

En una forma de realizacion, la alfa-amilasa puede ser una enzima con un grado de identidad de al menos 60%, por ejemplo, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% a cualquiera de las secuencias mostradas en la SEQ ID N.°: 3,4 o 5, respectivamente, en la WO 99/19467.

[0073] La alfa-amilasa de Bacillus tambien puede ser una variante y/o hfbrido, especialmente una descrita en cualquiera de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355.

Variantes de alfa-amilasa especfficas se describen en la patente EEUU Nos. 6,093,562, 6,187,576, y 6,297,038 e incluyen variantes alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (alfa-amilasa BSG) con una eliminacion de uno o dos aminoacidos en posiciones R179 a G182, preferiblemente, una eliminacion doble descrita en WO 96/23873 - ver, por ejemplo, pagina 20, lfneas 1-10, preferiblemente correspondientes a delta(181 -182) en comparacion con la secuencia de aminoacidos de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus expuesta en la SEQ ID N.°: 3 descrita en la WO 99/19467 o la eliminacion de aminoacidos R179 y G180 usando la SEQ ID N.°: 3 en la WO 99/19467 para la numeracion.

Aun mas preferidas son alfa-amilasas de Bacillus, especialmente alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus, que tienen una eliminacion doble que corresponde con delta (181-182) y ademas comprenden una N193F sustitucion (denominada tambien I181* + G182* + N193F) en comparacion con la secuencia de aminoacidos alfa-amilasa de tipo salvaje BSG expuesta en la SEQ ID N. °: 3 descrita en la WO 99/19467.

Alfa-amilasas de hfbrido bacteriano

[0074] La alfa-amilasa puede ser una alfa-amilasa hfbrida, por ejemplo, una alfa-amilasa que comprende 445 residuos de aminoacidos C-terminal de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada en sEq ID N. °: 4 de WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoacidos N-terminal de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada en la SEQ ID N. °: 5 de WO 99/19467), con uno o mas, especialmente todos, de las siguientes sustituciones:

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (utilizando la numeracion de Bacillus licheniformis en la SEQ ID N. °: 4 de WO 99/19467).

5

10

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20

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Preferidas tambien son variantes que tienen una o varias de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otras alfa-amilasas de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o la eliminacion de dos residuos entre posiciones 176 y 179, preferiblemente la eliminacion de E178 y G179 (usando la SEQ ID N. °: 5 de WO 99/19467 para la numeracion de la posicion).

[0075] En una forma de realizacion, la alfa-amilasa bacteriana se dosifica en una cantidad de 0.0005-5 KNU por g DS (solidos secos), preferiblemente 0.001-1 KNU por g DS, tal como alrededor de 0.050 KNU por g DS.

Alfa-amilasas fungicas

[0076] Las alfa-amilasas fungicas incluyen alfa-amilasas derivadas de una cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus kawachii, Aspergillus niger y alfa-amilasas de Aspergillus oryzae.

[0077] Una alfa-amilasa fungica acida preferida es una alfa-amilasa que muestra una alta identidad, es decir, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con la parte madura de la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID N.°: 10 en la WO 96/23874.

[0078] Otra alfa-amilasa acida preferida se deriva de una cepa de Aspergillus niger.

En una forma de realizacion preferida, la alfa-amilasa fungica acida es una alfa-amilasa de Aspergillus niger descrita como "AMYA ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el n.° de acceso primario P56271 y descrito en la WO 89/01969 (ejemplo 3 -).

Una alfa-amilasa fungica de acido disponible comercialmente derivada de Aspergillus niger es SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).

[0079] Otras alfa-amilasas tipo salvaje incluyen aquellas derivadas de una cepa de Meripilus y Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Meripilus giganteus o Rhizomucor pusillus (WO 2004/055178).

[0080] En una forma de realizacion preferida, la alfa-amilasa se deriva de Aspergillus kawachii (Kaneko et al., 1996, J. Fermento. Bioeng. 81: 292-298, "Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii"; y ademas como EMBL: #AB008370).

[0081] La alfa-amilasa fungica tambien puede ser una enzima tipo salvaje que comprende un dominio de union al almidon (SBD) y un dominio catalftico de alfa-amilasa o una variante del mismo.

Alfa-amilasas de hfbrido fungico

[0082] En una forma de realizacion preferida, la alfa-amilasa acida fungica es una alfa-amilasa hfbrida.

Ejemplos de alfa-amilasas de hfbrido fungico incluyen aquellas descritas en la WO 2005/003311, publicacion de solicitud de patente EEUU n° 2005/0054071 (Novozymes) y WO 2006/069290 (Novozymes).

Una alfa-amilasa hfbrida puede comprender un dominio catalftico de alfa-amilasa (CD) y un dominio/modulo de enlace de carbohidratos (CBM), tal como un dominio de union al almidon (SBD) y opcionalmente un enlazador.

[0083] Ejemplos de alfa-amilasas de hfbridas incluyen aquellas descritas en tablas 1 a 5 de los ejemplos en la WO 2006/069290 con la variante con el dominio catalftico JA118 y SBD Athelia rolfsii (SEQ ID N.°: 100 en WO 2006/069290), alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador AMG Athelia rolfsii y SBD (SEQ ID N.°: 101 en WO 2006/069290), alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y SBD (que se describen en la tabla 5 como una combinacion de secuencias de aminoacidos SEQ ID N.°: 20, SEQ ID N.°: 72 y SEQ ID N.°: 96 en la solicitud EEUU n° 11/316,535) o como V039 en la tabla 5 en WO 2006/069290 y alfa- amilasa Meripilus giganteus con enlazador de glucoamilasa Athelia rolfsii y SBD (SEQ ID N.°: 102 en la WO 2006/069290).

Otras alfa-amilasas hfbridas se enumeran en tablas 3, 4, 5 y 6 en el ejemplo 4 en la solicitud EEUU n° 11/316,535 y la WO 2006/069290.

[0084] Otros ejemplos de alfa-amilasas de hfbrido incluyen aquellas descritas en la publicacion de solicitud de patente EEUU n° 2005/0054071, incluyendo aquellas descritas en la tabla 3 en la pagina 15, tales como alfa-amilasa de Aspergillus niger con enlazador de Aspergillus kawachii y dominio de union al almidon.

[0085] Otras alfa-amilasas muestran un alto grado de identidad de secuencia con cualquiera de las alfa-amilasas anteriormente mencionadas, es decir, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con las secuencias de enzima madura descritas arriba.

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40

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[0086] Una alfa-amilasa acida puede segun la invencion ser adicionada en una cantidad de 0.001 a 10 AFAU/g DS, por ejemplo, 0.01 a 5 AFAU/g DS, especialmente 0.3 a 2 AFAU/g DS, o 0.001 a 1 f/G FAU DS, preferiblemente 0.01 a 1 f/G FAU DS.

Productos de alfa-amilasa comercial

[0087] Las composiciones comerciales preferidas que comprenden alfa-amilasa incluyen MYCOLASE™ (DSM), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X, LIQUOZYME™ SC y SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ DELTA AA, GC358; GC980 y SPEZYME™ RSL (Danisco A/S) y la alfa-amilasa fungica acida vendida bajo el nombre comercial SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).

Enzimas generadores de fuente de carbohidratos (sacarificacion de enzimas)

[0088] El termino "enzima generadora de fuente de carbohidratos" incluye glucoamilasa (un generador de glucosa), beta-amilasa y amilasa maltogenica (ambos generadores de maltosa) y tambien alfa-glucosidasa, isoamilasa y pululanasa.

Una enzima generadora de fuente de carbohidratos es capaz de producir un carbohidrato que se puede usar como una fuente de energfa por el organismo(s) de fermentacion en cuestion, por ejemplo, cuando se usa en un proceso de la invencion para producir un producto de fermentacion, tal como etanol.

El carbohidrato generado se puede convertir directa o indirectamente al producto de fermentacion deseado, preferiblemente etanol.

Segun la invencion, una mezcla de enzimas generadoras de fuente de carbohidratos puede ser utilizada.

Las mezclas incluyen mezclas que comprenden al menos una glucoamilasa y una alfa-amilasa, especialmente una amilasa acida, aun mas preferida una alfa-amilasa fungica acida.

[0089] En una forma de realizacion, la proporcion entre la actividad de glucoamilasa (AGU) y actividad de alfa- amilasa fungica acida (FAU-F) (es decir, AgU por FAU-F) puede ser entre 0.1 y 100 AGU/FAU-F, en particular, entre 2 y 50 AGU/FAU-F, tal como en el rango de 10-40 AGU/FAU-F.

Glucoamilasas

[0090] Una glucoamilasa se puede derivar de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, derivada de un microorganismo o una planta.

Las glucoamilasas preferidas son de origen fungico o bacteriano, seleccionadas del grupo que consiste en glucoamilasas de Aspergillus, en particular, Aspergillus niger G1 o G2 glucoamilasa (Boel et al., 1984, EMBO J. 3(5): 1097-1102) o variantes de las mismas, tal como las descritas en la WO 92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); la glucoamilasa de A. Awamori descrita en la WO 84/02921, glucoamilasa de Aspergillus oryzae (Hata et al., 1991, Agric. Biol. Chem. 55(4): 941-949) o variantes o fragmentos de las mismas.

Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus incluyen variantes con termoestabilidad mejorada: G137A y G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505) D257E y D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582) N182 (Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275-281); enlaces de disulfuro, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 86988704; e introduccion de Pro residuos en posiciones A435 y S436 (Li et al., 1997, Protein Eng. 10: 1199-1204.

[0091] Otras glucoamilasas incluyen Athelia rolfsii (denominada previamente Corticium rolfsii) glucoamilasa (ver patente EEUU n° 4,727,026 y Nagasaka et al., 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 323-330), glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces duponti, Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente EEUU n°. Re. 32,153) y Talaromyces thermophilus (patente EEUU n° 4,587,215).

[0092] Las glucoamilasas bacterianas incluyen glucoamilasas de Clostridium, en particular C. Thermoamylolyticum (EP 135138) y C. Thermohydrosulfuricum (WO 86/01831), Trametes cingulata, Pachykytospora papyracea y Leucopaxillus giganteus, todas descritas en la WO 2006/069289; o Peniophora rufomarginata descritas en PCT/US2007/066618 o una mezcla de las mismas.

Una glucoamilasa hfbrida se puede utilizar en la presente invencion.

Ejemplos de glucoamilasas de hfbrido se describen en la WO 2005/045018.

Los ejemplos especfficos incluyen la glucoamilasa hfbrida descrita en tablas 1 y 4 del ejemplo 1.

[0093] La glucoamilasa puede tener un alto grado de identidad de secuencia con cualquiera de las glucoamilasas anteriormente mencionadas, es decir, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con las secuencias de enzimas maduras mencionadas anteriormente.

[0094] Las composiciones de glucoamilasa disponibles comercialmente incluyen AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, FUEL, SPIRIZYME™, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME ULTRA™ y

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AMG™ E (de Novozymes AS, Dinamarca); OPTIDEX™ 300; GC480™ y GC147™ (de Genencor Int., USA); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUD (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de Genencor Int.).

[0095] Las glucoamilasas se pueden adicionar en una cantidad de 0.02-20 AGU/g DS, preferiblemente 0.1-10 AGU/g DS, especialmente entre 0.1-5 AGU/g DS, tal como 0.1-2 AGU/g DS, tal como 0.5 AGU/g DS o en una cantidad de 0.0001-20 AGU/g DS, preferiblemente 0.001-10 AGU/g DS, especialmente entre 0.01-5 AGU/g DS, tal como 0.1-2 AGU/g DS.

Beta-amilasas

[0096] Una beta-amilasa (E.C 3,2,1,2) es el nombre generalmente dado para las amilasas maltogenicas de exo-acto, que catalizan la hidrolisis de enlaces 1,4-alfa-glicosfdicos en la amilosa, amilopectina y relativos polfmeros de glucosa.

Las unidades de maltosa son sucesivamente retiradas de las extremidades de cadena no-reducida de una manera gradual hasta que la molecula es degradada o, en el caso de amilopectina, hasta que se alcanza un punto de derivacion.

La maltosa liberada tiene la configuracion anomerica beta, por lo tanto, el nombre beta-amilasa.

[0097] Las beta-amilasas han sido aisladas de varias plantas y microorganismos (Fogarty y Kelly, 1979, Progress in Industrial Microbiology 15: 112-115).

Estas beta-amilasas se caracterizan por el hecho de que tienen una temperatura optima en el rango de 40°C a 65°C y un pH optimo en el rango de 4.5 a 7.

Una beta-amilasa disponible comercialmente de cebada es NOVOZYM™ WBA de Novozymes A/S, Dinamarca y SPEZYME™ BBA 1500 de Genencor Int., EE.UU.

Amilasas maltogenicas

[0098] La amilasa tambien puede ser una alfa-amilasa maltogenica (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, EC 3,2,1,133), que cataliza la hidrolisis de amilosa y amilopectina para maltosa en la configuracion alfa.

Una amilasa maltogenica de cepa de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 esta comercialmente disponible de Novozymes A/S.

Alfa-amilasas maltogenicas se describen en la patente EEUU Nos. 4,598,048, 4,604,355 y 6,162,628.

[0099] La amilasa maltogenica se puede adicionar en una cantidad de 0.05-5 mg total protefna/gramo DS o 0.05-5 MANU/g DS.

Fitasas

[0100] Cualquier fitasa se puede utilizar en un proceso de la presente invencion.

Las fitasas son enzimas que degradan fitatos y/o acido fftico hidrolizando especfficamente la conexion de ester entre el inositol y fosforo.

La actividad de fitasa se acredita con fosforo y disponibilidad ionica en muchos ingredientes.

En algunas formas de realizacion, la fitasa es capaz de la liberacion al menos de un fosfato inorganico a partir de un hexafosfato de inositol (por ejemplo, acido fftico).

Las fitasas se pueden reagrupar segun su preferencia para una posicion especffica del grupo de ester de fosfato en la molecula de fitato en la que la hidrolisis se inicia (por ejemplo, 3-fitasa (EC 3.1.3.8) o 6-fitasa (EC 3.1.3.26)).

Un ejemplo de fitasa es myo-inositol-hexakifosfato-3-fosfohidrolasa.

[0101] Las fitasas se pueden obtener de microorganismos tales como organismos fungicos y bacterianos.

Por ejemplo, la fitasa se puede obtener de hongos filamentosos tal como Aspergillus (por ejemplo, A., ficuum A. Fumigatus, A. Niger, y A. Terreus), Cladospirum, Mucor (por ejemplo, Mucor piriformis), Myceliophthora (por ejemplo, M. Thermophila), Penicillium (por ejemplo, P. Hordei (AtCC n° 22053)), P. Piceum (ATCC n° 10519) o P. Brevi- compactum (ATCC n° 48944), Talaromyces (por ejemplo, T. Thermophilus), Thermomyces (WO 99/49740) y Trichoderma spp. (por ejemplo, T. Reesei).

[0102] En una forma de realizacion, la enzima de degradacion de fitato se obtiene de levadura (por ejemplo, Arxula, adeninivorans, Pichia anomala, Schwanniomyces occidentalis), bacterias gram-negativas (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp.) y bacterias gram-positivas (por ejemplo, Bacillus spp. tal como Bacillus subtilis).

[0103] La fitasa tambien se puede obtener de Citrobacter, Enterbacter o Peniophora.

[0104] En una forma de realizacion, la fitasa se deriva de Buttiauxiella spp. tal como B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae y B. warmboldiae.

En algunas formas de realizacion, la fitasa es una fitasa descrita en la WO 2006/043178 o solicitud EEUU n° 11/714,487.

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[0105] En una forma de realizacion preferida, la fitasa tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% y al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID N.°: 31 de solicitud EEUU n° 12/263,886.

[0106] Las fitasas disponibles comercialmente son NATUPHOS (BASF), RONOZYME P (Novozymes A/S), PHZYME (Danisco A/S, Diversa) y FINASE (AB enzimas).

El metodo para determinar la actividad de fitasa microbiana y la definicion de una unidad de fitasa se describe en Engelen et al., 1994, Journal of AOAC International 77: 760-764.

La fitasa puede ser una fitasa tipo salvaje, una variante activa o fragmento activo de la misma.

Pululanasas

[0107] Cualquier pululanasa se puede utilizar en un proceso de la presente invencion.

En una forma de realizacion, la pululanasa es una pululanasa GH57, por ejemplo, una pululanasa obtenida a partir de una cepa de Thermococcus, incluyendo Thermococcus sp.

AM4, Thermococcus sp. HJ21, Thermococcus barophilus, Thermococcus gammatolerans, Thermococcus hydrothermalis; Thermococcus kodakarensis, Thermococcus litoralis y Thermococcus onnurineus; o de una cepa de Pyrococcus, tal como Pyrococcus abyssi y Pyrococcus furiosus.

Proteasas

[0108] Una proteasa se puede adicionar durante la sacarificacion, fermentacion, sacarificacion simultanea y fermentacion.

La proteasa puede ser cualquier proteasa.

En una forma de realizacion preferida, la proteasa es una proteasa acida de origen microbiano, preferiblemente, de origen fungico o bacteriano.

Se prefiere una proteasa fungica acida, pero tambien se pueden usar otras proteasas.

[0109] Las proteasas adecuadas incluyen proteasas microbianas, tales como proteasas fungicas y bacterianas.

Las proteasas preferidas son proteasas acfdicas, es decir, proteasas caracterizadas por la capacidad de hidrolizar protefnas bajo condiciones acidas por debajo de pH 7.

[0110] La proteasa fungica acida se puede derivar de Aspergillus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sclerotium y Torulopsis.

En particular, la proteasa se puede derivar de Aspergillus aculeatus (WO 95/02044), Aspergillus awamori (Hayashida et al., 1977, Agric. Biol. Chem. 42(5), 927-933), Aspergillus niger (ver, por ejemplo, Koaze et al., 1964, Agr. Biol. Chem. Japon 28: 216), Aspergillus saitoi (ver, por ejemplo, Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soc. Japan 28: 66) o Aspergillus oryzae, como la proteasa pepA; y proteasas acidas de Mucor miehei o Mucor pusillus.

[0111] La proteasa puede ser una proteasa neutra o alcalina, tal como una proteasa derivada a partir de una cepa de Bacillus.

Una proteasa particular se deriva de Bacillus amyloliquefaciens y tiene la secuencia obtenible en Swissprot como n° de acceso P06832.

Las proteasas pueden tener al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos descrita en la base de datos de Swissprot, n° de acceso.

P06832 tal como al menos 92%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o particularmente al menos 99% de identidad.

[0112] La proteasa puede tener al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos descrita como la SeQ ID N. °: 1 en WO 2003/048353 tal como a 92%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o particularmente al menos 99% de identidad.

[0113] La proteasa puede ser una proteasa tipo papafna seleccionada del grupo que consiste en proteasas dentro de eC 3,4,22.* (proteasa de cistefna), tal como eC 3,4,22,2 (papafna), EC 3,4,22,6 (quimopapafna), EC 3,4,22,7 (asclepafna), EC 3,4,22,14 (actinidafna), EC 3,4,22,15 (catepsina L), Ec 3,4,22,25 (endopeptidasa de glicil) y EC 3,4,22,30 (caricafna).

[0114] En una forma de realizacion, la proteasa es una preparacion de proteasa derivada de una cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae.

En otra forma de realizacion, la proteasa se deriva de una cepa de Rhizomucor, preferiblemente Rhizomucor miehei. En otra forma de realizacion, la proteasa es una preparacion de proteasa, preferiblemente, una mezcla de una preparacion proteolftica derivada de una cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae y una proteasa derivada de una cepa de Rhizomucor, preferiblemente, Rhizomucor miehei.

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[0115] Las proteasas de acido aspartico se describen en, por ejemplo, Handbook of Proteolytic Enzymes, Edited by A.J. Barrett, N.D. Rawlings and J.F. Woessner, Academic Press, San Diego, 1998, Chapter 270.

Los ejemplos de proteasas de acido aspartico incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en Berka et al., 1990, Gene 96: 313; Berka et al., 1993, Gene 125: 195-198; y Gomi et al., 1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1095-11.

[0116] La proteasa tambien puede ser una metaloproteasa, que se define como una proteasa seleccionada del grupo que consiste en:

(a) proteasas de EC 3.4.24 (metaloendopeptidasas); preferiblemente EC 3.4.24.39 (acido metalo proteinasas);

(b) metaloproteasas del M grupo del manual anterior;

(c) metaloproteasas todavfa no asignadas a clanes (designacion: Clan MX) o que pertenecen bien a uno de los clanes, mB, MC, MD, ME, MF, MG, MH (como se ha definido en las pags. 989-991 del manual anterior);

(d) otras familias de metaloproteasas (como se ha definido en las pags. 1448-1452 del manual anterior);

(e) metaloproteasas con una unidad HEXXH;

(f) metaloproteasas con una unidad HEFT;

(g) metaloproteasas que pertenecen a una de las familias M3; M26; M27; M32; M34; M35; M36; M41; M43 o M47 (como se ha definido en las pags. 1448-1452 del manual anterior);

(h) metaloproteasas de la familia M28E; y

(i) metaloproteasas de la familia M35 (como se ha definido en las pags. 1492-1495 del manual anterior).

[0117] En otras formas de realizacion particulares, las metaloproteasas son hidrolasas donde el ataque nucleofflico en un enlace de peptido se media por una molecula de agua, que se activa por un cation metalico bivalente.

Los ejemplos de cationes bivalentes son zinc, cobalto o manganeso.

El ion metalico se puede sujetar en su lugar por ligandos de aminoacido.

El numero de ligandos pueden ser cinco, cuatro, tres, dos, uno o cero.

En una forma de realizacion particular, el numero es dos o tres, preferiblemente tres.

[0118] No hay limitaciones en el origen de la metaloproteasa usada en un proceso de la invencion.

En una forma de realizacion, la metaloproteasa se clasifica como EC 3.4.24, preferiblemente EC 3.4.24.39.

En una forma de realizacion, la metaloproteasa es una metaloproteasa de acido estable, por ejemplo, una metaloproteasa de acido estable fungica, tal como una metaloproteasa derivada de una cepa del genero Termoascus, preferiblemente, una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente, Thermoascus aurantiacus CGMCC n° 0670 (clasificado como EC 3.4.24.39).

En otra forma de realizacion, la metaloproteasa se deriva de una cepa del genero Aspergillus, preferiblemente, una cepa de Aspergillus oryzae.

[0119] En una forma de realizacion, la metaloproteasa tiene un grado de identidad de secuencia con amino acidos - 178 a 177; -159 a 177 o preferiblemente aminoacidos 1 a 177 (el polipeptido maduro) de la SEQ ID N. °: 1 de WO 2010/008841 (una metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus) de al menos 80%, al menos 82%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 97%; y que tienen actividad de metaloproteasa.

En formas de realizacion particulares, la metaloproteasa consiste en una secuencia de aminoacidos con un grado de identidad con la SEQ ID N. °: 1 como se ha mencionado anteriormente.

[0120] La metaloproteasa Thermoascus aurantiacus es un ejemplo preferido de una metaloproteasa adecuada para usar en un proceso de la invencion.

Otra metaloproteasa se deriva de Aspergillus oryzae y comprende la secuencia de la SEQ ID N. °: 11 descrita en la WO 2003/048353 o aminoacidos -23-353 -23-374 1-353,1-374,1-397,177-353,177-374 o 177-397 de los mismos y SEQ ID N. °: 10 descritas en la WO 2003/048353.

[0121] Otra metaloproteasa adecuada para usar en un proceso de la invencion es la metaloproteasa de Aspergillus oryzae que comprende SEQ ID N. °: 5 de WO 2010/008841 o una metaloproteasa es un polipeptido aislado que tiene un grado de identidad con la SEQ ID N. °: 5 de al menos un 80%, al menos 82%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 97%; y que tienen una actividad de metaloproteasa.

En formas de realizacion particulares, la metaloproteasa consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N. °: 5.

[0122] En una forma de realizacion particular, una metaloproteasa tiene una secuencia de aminoacidos que difiere por cuarenta, treinta y cinco, treinta, veinticinco, veinte o por quince aminoacidos de aminoacidos -178 a 177; -159 a 177 o +1 a 177 de las secuencias de aminoacidos de la Thermoascus aurantiacus o metaloproteasa de Aspergillus oryzae.

[0123] En otra forma de realizacion, una metaloproteasa tiene una secuencia de aminoacidos que difiere por diez o por nueve, o por ocho, o por siete, o por seis, o por cinco aminoacidos de aminoacidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de las secuencias de aminoacidos de estas metaloproteasas, por ejemplo, por cuatro, por tres, por dos o por un aminoacido.

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[0124] En formas de realizacion particulares, la metaloproteasa a) comprende o b) consiste en

i) la secuencia de aminoacidos de aminoacidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEQ ID N.°:1 de la WO 2010/008841;

ii) la secuencia de aminoacidos de aminoacidos -23-353; -23-374; -23-397,1-353,1-374,1-397,177-353,177-374, o 177-397 de SEQ ID N. °: 3 de la WO 2010/008841;

iii) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N. °: 5 de WO 2010/008841; o

variantes alelicas, o fragmentos, de las secuencias de i), ii) e iii) que tienen actividad de proteasa.

[0125] Un fragmento de aminoacidos -178 a 177; -159 a 177 o +1 a 177 de SEQ ID N.°: 1 de la WO 2010/008841 o de aminoacidos -23-353; -23-374; -23-397,1-353,1-374,1-397,177-353,177-374, o 177-397 de SEQ ID N.°: 3 de WO 2010/008841; es un polipeptido con uno o mas aminoacidos eliminados de amino y/o carboxilo terminal de estas secuencias de aminoacidos.

En una forma de realizacion, un fragmento contiene al menos 75 residuos de aminoacidos o al menos 100 residuos de aminoacidos, o al menos 125 residuos de aminoacidos, o al menos 150 residuos de aminoacidos, o al menos 160 residuos de aminoacidos, o al menos 165 residuos de aminoacidos, o al menos 170 residuos de aminoacidos, o al menos 175 residuos de aminoacidos.

[0126] En otra forma de realizacion, la metaloproteasa se combina con otra proteasa, tal como una proteasa fungica, preferiblemente una proteasa fungica acida.

[0127] Productos disponibles comercialmente incluyen ALCALASE®, ESPERASE™, FLAVOURZYME™, NEUTRASE®, RENNIlAsE®, NOVOZYM™ FM 2.0L, e iZyme BA (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca) y GC106™ SPEZYME™ FAN de Genencor Internacional, Inc., USA.

[0128] La proteasa puede estar presente en una cantidad de 0.0001-1 mg de protefna enzimatica por g DS, preferiblemente 0.001 a 0.1 mg de protefna enzimatica por g DS.

Alternativamente, la proteasa puede estar presente en una cantidad de 0.0001 a 1 LAPU/g DS, preferiblemente 0.001 a 0.1 LAPU/g DS y/o 0.0001 a 1 mAU-RH/g DS, preferiblemente 0.001 a 0.1 mAU-RH/g DS.

Composiciones

[0129] Descrita aquf tambien hay una composicion que comprende (a) un polipeptido GH61, (b) una glucoamilasa y (c) una alfa-amilasa.

[0130] En una forma de realizacion, la composicion comprende ademas unas u otras mas carbohidrasas, tales como alfa-amilasas.

En una forma de realizacion preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa acida o una alfa-amilasa fungica, preferiblemente una alfa-amilasa fungica acida.

[0131] La composicion puede comprender una o mas enzimas generadores de fuente de carbohidratos, tal como especialmente glucoamilasas, beta-amilasas, amilasas maltogenicas, pululanasas, alfa-glucosidasas o una mezcla de las mismas.

[0132] En otra forma de realizacion preferida, la composicion comprende uno o mas polipeptidos GH61 y uno o mas organismos fermentadores, tales como levadura y/o bacterias.

Ejemplos de organismos fermentadores se pueden encontrar en el "organismo de fermentacion" de la seccion de arriba.

Usos

[0133] Descrito aquf tambien esta el uso del polipeptido GH61 en un proceso de fermentacion.

En una forma de realizacion, se usa un polipeptido GH61 para mejorar el rendimiento del producto de fermentacion.

Organismos fermentadores modificados

[0134] Descrito tambien esta un organismo fermentador modificado transformado con un polinucleotido que codifica un polipeptido GH61, donde el organismo fermentador es capaz de expresar el polipeptido GH61 en condiciones de fermentacion.

[0135] En una forma de realizacion preferida, el organismo fermentador es un organismo microbiano, tal como levadura u hongo filamentoso, o una bacteria.

Ejemplos de otros organismos fermentadores se pueden encontrar en la seccion "organismos fermentadores".

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[0136] Un organismo fermentador se puede transformar con un gen que codifica de un polipeptido GH61 que usa tecnicas bien conocidas en la tecnica.

[0137] La invencion descrita y reivindicada aquf no es para ser limitada en su alcance por las formas de realizacion especfficas aquf descritas, ya que estas formas de realizacion se destinan como ilustraciones de diferentes aspectos de la invencion.

Cualquier forma de realizacion equivalente se destina a estar dentro del campo de esta invencion.

De hecho, varias modificaciones de la invencion ademas de aquellas mostradas y descritas aquf seran evidentes para los expertos en la tecnica de la descripcion precedente.

Tales modificaciones estan tambien destinadas a pertenecer al campo de las reivindicaciones anexas.

En el caso de conflicto, se controlara la presente descripcion, incluyendo las definiciones.

[0138] Varias referencias son citadas aquf, las descripciones son incorporadas por referencia en sus totalidades. Materiales y metodos

Actividad de glucoamilasa (AGU)

[0139] La actividad de glucoamilasa se puede medir en las unidades de glucoamilasa (AGU).

La unidad Novo de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol maltosa por minuto bajo las condiciones estandar 37°C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23.2 mM, tampon: acetato 0.1 M, tiempo de reaccion 5 minutos.

[0140] Se puede utilizar un sistema de autoanalizador.

La mutarotasa se anade al reactivo de glucosa deshidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente se gira en la beta-D-glucosa.

La glucosa deshidrogenasa reacciona especfficamente con beta-D-glucosa en la reaccion mencionada anteriormente, formacion NADH que se determina usando un fotometro a 340 nm como una medida de la concentracion de glucosa original.

Incubacion AMG:

Sustrato:

Maltosa 23.2 mM

Tampon:

Acetato 0.1 M

pH:

4.30 ± 0.05

Temperatura de incubacion:

37°C ± 1

Tiempo de reaccion:

5 Minutos

Gama de trabajo de enzima:

0.5-4.0 AGU/mL

Reaccion de Color:

GlucDH:

430 U/L

Mutarotasa:

9 U/L

NAD:

0.21 mM

Tampon:

Fosfato 0.12 M; 0.15 M NaCl

pH:

7.60 ± 0.05

Temperatura de incubacion:

37°C ± 1

Tiempo de reaccion:

5 minutos

Longitud de onda:

340 nm

Actividad de alfa-amilasa (KNU)

[0141] La actividad de alfa-amilasa se puede determinar utilizando almidon de patata como sustrato.

Este metodo se basa en la descomposicion de almidon de patata modificado por la enzima y la reaccion esta seguida de la mezcla de muestras de la solucion de almidon/enzima con una solucion de yodo.

Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la descomposicion del almidon el color azul se vuelve mas debil y cambia gradualmente a un marron rojizo, que se compara con un estandar de vidrio coloreado.

[0142] Una unidad Kilo Novo de alfa-amilasa (KNU) se define como la cantidad de enzima que, bajo condiciones estandar (es decir, a 37°C +/- 0.05,0.0003 M Ca2+; y pH 5.6) dextriniza 5260 mg de almidon de sustancia seca Merck Amylum soluble.

Actividad de alfa-amilasa acida (AFAU)

[0143] La actividad de una alfa-amilasa acida se puede medir en AFAU (unidades de alfa-amilasa fungica acida) o FAU-F.

5

10

15

20

25

30

35

40

La actividad de alfa-amilasa acida se puede medir en AFAU (unidades de alfa-amilasa fungica acida), que se determinan con respecto a un estandar enzimatico. 1 AFAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5.260 mg de almidon en sustancia seca por hora bajo las condiciones estandar mencionadas abajo.

[0144] La alfa-amilasa acida, una endo-alfa-amilasa (1,4-alfa-D-glucano-glucanohidrolasa, EC 3,2,1, 1) hidroliza enlaces alfa-1,4-glucosfdicos en las regiones internas de la molecula de almidon para formar dextrinas y oligosacaridos con longitudes de cadena diferentes.

La intensidad de color formada con yodo es directamente proporcional a la concentracion de almidon.

La actividad amilasa se determina utilizando colorimetrfa inversa como una reduccion en la concentracion de almidon bajo las condiciones analfticas especfficas.

ALFA - AMILASA

ALMIDON + YODO ———-—> DEXTRINAS + OLIGOSACARIDOS

40 , pH 2,5

X = 590 nm

azul/violeta t = 23 seg decoloracion

Condiciones estandar/condiciones de reaccion:

Sustrato:

Almidon soluble, aprox. 0.17 g/L

Tampon:

Citrato, aprox. 0.03 M

Yodo (I2):

0.03 G/L

CaCh:

1.85 mM

pH:

2.50 ± 0.05

Temperatura de incubacion:

40°C

Tiempo de reaccion:

23 segundos

Longitud de onda:

590 nm

Concentracion enzimatica:

0.025 AFAU/mL

Gama de trabajo de enzima:

0.01-0.04 AFAU/mL

Determinacion de FAU-F

[0145] FAU-F unidades de alfa-amilasa fungica (fungamil) se miden con respecto a un estandar enzimatico de una fuerza declarada.

Condiciones de reaccion

Temperatura

37°C

ph

7.15

Longitud de onda

405 nm

Tiempo de reaccion

5 min

Tiempo de medicion

2 min

Metodo de ensayo de proteasa - AU(RH)

[0146] La actividad proteolftica se puede determinar con hemoglobina desnaturalizada como sustrato.

En el metodo Anson-Hemoglobin para la determinacion de actividad proteolftica desnaturalizada se digiere la hemoglobina y la hemoglobina no asimilada se precipita con acido tricloroacetico (ATC).

La cantidad de producto soluble ATC se determina con reactivo de fenol, que da un color azul con tirosina y triptofano.

[0147] Una unidad de Anson (AU-RH) se define como la cantidad de enzima que bajo condiciones estandar (es decir, 25°C, pH 5.5 y tiempo de reaccion de 10 minutos) digiere hemoglobina a un nivel inicial, de manera que se libera por minuto una cantidad de ATC producto soluble que da el mismo color con reactivo de fenol como un miliequivalente de tirosina.

[0148] El metodo AU(RH) se describe en EAL-SM-0350 y esta disponible de Novozymes A/S Dinamarca en la solicitud.

Metodo de ensayo de proteasa (LAPU)

[0149] Una Unidad de Leucina Amino Peptidasa (LAPU) es la cantidad de enzima que descompone sustrato 1 microM por minuto en las condiciones siguientes: 26 mM de L-leucina-p-nitroanilida como sustrato, tampon 0.1 M Tris (pH 8.0), 37°C, 10 minutos de tiempo de reaccion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0150] LAPU se describe en EB-SM-0298.02/01 disponible de Novozymes A/S Dinamarca en la solicitud. Actividad amilasa maltogenica (MANU)

[0151] Una MANU (Unidad Novo de amilasa maltogenica) es la cantidad de enzima requerida para la liberacion de un micromol de maltosa por minuto a una concentracion de 10 mg de maltotriosa (Sigma M 8378) sustrato por ml de 0.1 M tampon de citrato, pH 5.0 a 37°C durante 30 minutos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Efecto de varios polipeptidos GH61 en un proceso de hidrolisis de almidon crudo

[0152] Todos los tratamientos fueron evaluados via fermentaciones de mini-escala.

Un total de 410 g de mafz amarillo dentado triutrado (con un tamano de partfcula medio alrededor de 0.5 mm) se anadio a 590 g de agua corriente.

Esta mezcla fue suplementada con 3.0 ml de 1 g/l penicilina y 1 g de urea.

El pH de este lodo fue ajustado a 4.5 con 40% H2SO4.

El nivel de solido seco (DS) se determino a 35 peso. %.

Aproximadamente, 5 g de este lodo se anadio a frascos de 20 ml.

Cada uno de los frascos se dosifico con las cantidades de alfa-amilasa (un hfbrido de la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus y enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y dominio de union al almidon, que se describe en la WO 2006/069290), glucoamilasa (glucoamilasa de Trametes cingulata descrita en la WO 2006/069289) y polipeptido GH61 mostrado en la tabla de debajo seguido de la adicion de 200 microlitros de levadura se propagan por 5 g de lodo.

Las dosificaciones reales fueron basadas en el peso exacto de lodo de mafz en cada uno de los frascos.

Tratamientos

Alfa-amilasa (AA) dosis (FAU-F/g DS) Glucoamilasa (AMG) dosis (AGU/g DS) Dosis GH61 (microgramos/g DS

AA+AMG

0.0475 0.5 0

AA + AMG + GH61 (un primer Aurantiporus alborubescens polipeptido GH61)

0.0475 0.5 10

AA + AMG + GH61 (un segundo Aurantiporus alborubescens polipeptido GH61)

0.0475 0.5 10

AA + AMG + GH61 (SEQ ID N. °: 25)

0.0475 0.5 10

[0153] Los frascos fueron incubados a 32°C.

Se realizaron nueve fermentaciones replicadas de cada tratamiento.

Tres replics fueron seleccionadas durante 24 horas, 48 horas y 70 horas de punto de analisis.

Los frascos fueron agitados en vortex en 24, 48 y 70 horas y analizados por HPLC.

La preparacion de HPLC consistio en parar la reaccion por adicion de 50 microlitros de 40% H2SO4, centrifugar y filtrar a traves de un filtro de micrometres 0.45.

Las muestras fueron almacenadas a 4°C hasta el analisis.

Un sistema de HPLC de Agilent™ 1100 acoplado con un detector de fndice de refraccion (RI) fue usado para determinar etanol y concentraciones de disacarido.

La columna de separacion fue una columna de exclusion ionica Aminex™ HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) de BioRad®.

[0154] Los rendimientos de etanol despues de 70 horas se proporcionan en la tabla 1:

Tabla 1 - Rendimientos de etanol con respecto al control

GH61

Dosis (microgramos/g DS)

10

20 40

Primer polipeptido Aurantiporus alborubescens GH61

100.41% 100.32% 100.45%

Segundo polipeptido Aurantiporus alborubescens GH61

100.69% 100.86% 98. 50%

SEQ ID N. °: 25

100.94% 98. 68% 100.38%

[0155] Los resultados (en negrita) muestran que la adicion de polipeptido GH61 produce un aumento significativo estadfsticamente en el rendimiento de etanol final en comparacion con el control.

[0156] Las concentraciones de disacarido obtenidas se proporcionan en la tabla 2.

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   1. Proceso de produccion de un producto de fermentacion, que comprende la conversion de un material que contiene almidon a una dextrina con una alfa-amilasa; sacarificacion de la dextrina a un azucar con una enzima de sacarificacion; y fermentacion del azucar utilizando un organismo de fermentacion en presencia de un polipeptido de familia de glicosido hidrolasa 61 en un paso unico a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial del material que contiene almidon, donde el polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61 esta presente en una cantidad que resulta en una cantidad superior del producto de fermentacion que la cantidad de fermentacion producida por el mismo proceso sin el polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61, donde el polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61 comprende los motivos siguientes:

   imagen1

   donde X es cualquier aminoacido, X (4,5) es cualquier cuatro o cinco aminoacidos contiguos y X (4) es cualquier cuatro aminoacidos contiguos.
2. 2. Proceso de produccion de un producto de fermentacion, que comprende la conversion de un material que contiene almidon a una dextrina con una alfa-amilasa; sacarificacion de la dextrina a un azucar con una enzima de sacarificacion; y fermentacion del azucar utilizando un organismo de fermentacion en presencia de un polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61 en un paso unico a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial del material que contiene almidon, donde el polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61 esta presente en una cantidad que resulta en una cantidad menor de disacarido que la cantidad de disacarido producida por el mismo proceso sin el polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61, donde el polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61 comprende los motivos siguientes:

   imagen2

   donde X es cualquier aminoacido, X (4,5) es cualquier cuatro o cinco aminoacidos contiguos y X (4) es cualquier cuatro aminoacidos contiguos.
3. 3. Proceso, segun la reivindicacion 1 o 2, donde la enzima de sacarificacion es una beta-amilasa, glucoamilasa o alfa-amilasa maltogenica.
4. 4. Proceso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que se realiza en presencia de una pululanasa y/o una isoamilasa.
5. 5. Proceso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se realiza en presencia de una proteasa.
6. 6. Proceso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que se realiza a una temperatura de 20-40°C.
7. 7. Proceso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el material que contiene almidon esta seleccionado del grupo que consiste en cebada, alubias, mandioca, cereales, mafz, sorgo, guisantes, patatas, arroz, centeno, sagu, sorgo, patatas dulces, tapioca, trigo y granos enteros o cualquier mezcla de los mismos.
8. 8. Proceso; segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el organismo fermentador es una levadura.
9. 9. Proceso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el producto de fermentacion esta seleccionado del grupo que consiste en alcoholes (por ejemplo, butanol, etanol, metanol, 1,3-propanediol) acidos organicos (por ejemplo, acido acetico, acido cftrico, acido itaconico, acido gluconico, gluconato, acido lactico, acido succfnico, acido 2,5-diceto-D-gluconico); cetonas (por ejemplo, de acetona); aminoacidos (por ejemplo, acido glutamico); gases (por ejemplo, H2 y CO2) y compuestos mas complejos, que incluyen, por ejemplo, antibioticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas.
10. 10. Proceso, segun la reivindicacion 9, donde el producto de fermentacion es etanol.
11. 11. Proceso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende ademas la recuperacion del producto de fermentacion.
12. 12. Proceso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61 tiene al menos 70% de identidad de secuencia con cualquier SEQ ID N. °: 25, por ejemplo, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.
13. 13. Proceso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el polipeptido de familia glicosido hidrolasa 61 se deriva de Aurantiporus alborubescens.