ES2743515T3 - Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican las mismas - Google Patents

Abstract

Variante de glucoamilasa que comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 295 del polipéptico de SEQ ID NO:2, donde la variante compende al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: 295W; 295W+410K; 2241+295F; 224T+295W+318V; 295F; 224A+295F; 295W+83D+410K; 163A+295W+410k; 163W+295W+410K; 303N+295W; 1691+295W;o 32V+219R+295W; donde la variante tiene actividad de glucoamilasa y donde la variante tiene al menos un 90 %, al menos un 95%, al menos un 96 %, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una inhibición de glucosa reducida en comparación con la glocoamilasa de SEQ ID NO:2.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican las mismas

Referencia a un listado de secuencias

[0001] Esta aplicación contiene un listado de secuencias en forma legible por ordenador.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

[0002] La presente invención se refiere a variantes de glucoamilasa, polinucleótidos que codifican las variantes, métodos para producir las variantes, células huésped que expresan las variantes y métodos para usar las variantes. También se ha descrito el uso de las glucoamilasas de la invención para la conversión del almidón para producir productos de fermentación, tal como etanol, y jarabes, tal como glucosa. La invención también se refiere a una composición que comprende una glucoamilasa de la invención.

Descripción de las técnicas relacionadas

[0003] La glucoamilasa (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores del almidón o moléculas de oligosacáridos y polisacáridos relacionadas. Las glucoamilasas son producidas por varios hongos filamentosos y levaduras, de los que los Aspergillus son comercialmente los más importantes.

[0004] Comercialmente, se utilizan glucoamilasas para convertir material que contiene almidón, que ya ha sido hidrolizado parcialmente por una alfa-amilasa, a glucosa. La glucosa puede entonces convertirse directa o indirectamente en un producto de fermentación usando un organismo fermentador. Los ejemplos de productos de fermentación comerciales incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol, 1,3-propanodiol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2,5-diceto-D-glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H2 y CO2) y compuestos más complejos, incluyendo, por ejemplo, antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); hormonas y otros compuestos que son difíciles de producir sintéticamente. Los procesos de fermentación también se usan comúnmente en las industrias del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino) y de los productos lácteos (por ejemplo, en la producción de yogur y queso).

[0005] El producto final también puede ser un jarabe. Por ejemplo, el producto final puede ser glucosa, pero también puede convertirse, por ejemplo, por la glucosa isomerasa, a fructosa o una mezcla compuesta casi igualmente de glucosa y fructosa. Esta mezcla, o una mezcla enriquecida además con fructosa, es el jarabe de maíz rico en fructosa (JMRF) más frecuentemente usado comercializado en todo el mundo.

[0006] Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos y que proporcionan un rendimiento elevado en los procesos de producción de productos de fermentación, tales como los procesos de producción de etanol.

[0007] WO2011/068803 divulga glucoamilasas aisladas del hongo Gloeophyllum, en particular de Gloeophyllum sepiarium y Gloeophyllum trabeum.

[0008] WO2014/177546 divulga variantes de una glucoamilasa parental divulgada en WO2011/068803.

[0009] La presente invención proporciona variantes de glucoamilasa con propiedades mejoradas en comparación con su progenitor.

Resumen de la invención

[0010] La presente invención se refiere a una variante de glucoamilasa que comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 295 del polipéptido de SEQ ID NO: 2, donde la variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones:

295W;

295W+ 410K;

224I 295F;

224T 295W 318V;

295F;

224A 295F;

295W 83D 410K;

163A 295W 410K;

163W 295W 410K;

303N 295W;

1691 295W; o

32V 219R 295W;

donde la variante tiene actividad de glucoamilasa y donde la variante tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una inhibición por glucosa reducida en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 2.

[0011] La presente invención se refiere además a polinucleótidos aislados que codifican las variantes; construcciones de ácido nucleico, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos; y métodos para producir las variantes.

[0012] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de un producto de fermentación, particularmente etanol, a partir de material que contiene almidón que incluye los pasos de: (a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa-amilasa; (b) sacarificar el material licuado; y (c) fermentar con un organismo fermentador; donde el paso (b) se realiza usando al menos una variante de una variante de glucoamilasa.

[0013] En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un proceso de producción de un producto de jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende el paso de: (a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa-amilasa; (b) sacarificar el material licuado en presencia de una variante de glucoamilasa de la invención.

[0014] En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende la variante de la invención.

[0015] Otro aspecto de la presente invención se refiere a un uso de la variante de glucoamilasa para producir un jarabe o un producto de fermentación.

Breve descripción de las figuras

[0016] La figura 1 muestra el rendimiento de etanol en función de la actividad enzimática (AGU/g SS) analizada por HPLC. Las variantes de glucoamilasa seleccionadas se compararon con la glucoamilasa parental, JGA098 y con glucoamilasas salvajes de Trametes cingulate (Tc-AMG), Gloeophyllum sepiarium (Gs-AMG), Pycnoporus sanguineus (Ps-AMG).

Definiciones

[0017]

Glucoamilasa: el término "glucoamilasa" (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) se define como una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores del almidón o moléculas de oligosacáridos y polisacáridos relacionadas. A efectos de la presente invención, se determina la actividad de glucoamilasa según el procedimiento descrito en los ejemplos de la presente. La unidad de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar 37°C, pH 4,3, sustrato: 23,2 mM de maltosa, tampón: 0,1 M de acetato, tiempo de reacción: 5 minutos.

En otra forma de realización, los polipéptidos de la presente invención tienen al menos un 20%, preferiblemente al menos un 40%, preferiblemente al menos un 45%, más preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 55%, más preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 65%, más preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 75%, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, aún más preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95% e incluso más preferiblemente al menos un 100% de la actividad de glucoamilasa del polipéptido de SEQ ID NO: 2.

Variante alélica: el término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación y puede resultar en polimorfismos dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o puede codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos modificadas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

ADNc: el término "ADNc" significa una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm empalmada madura obtenida a partir de una célula eucariótica o procariótica. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, incluido el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.

Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" significa un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una variante. Los límites de la secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza con un codón de inicio tal como ATG, GTG o TTG y acaba con un codón de terminación tal como TAA, Ta G o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.

Secuencias de control: el término ""secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o exógena (es decir, de un gen diferente) respecto al polinucleótido que codifica la variante o nativa o exógena entre sí. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden proporcionarse con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.

Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de una variante incluyendo, pero de forma no limitativa, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.

Vector de expresión: el término "vector de expresión" significa una molécula lineal o circular de ADN que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está operativamente unido a secuencias de control que proveen a su expresión.

Fragmento: el término "fragmento" significa un polipéptido con uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de glucoamilasa. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 454 residuos de aminoácidos (por ejemplo, los aminoácidos 1 a 454 de la SeQ ID NO: 2), que comprende el dominio catalítico y que tiene una o más de las sustituciones según la invención.

Condiciones de astringencia alta: el término "condiciones de astringencia alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 50%, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada una durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 65°C.

Célula huésped: el término "célula huésped" significa cualquier tipo celular que es susceptible a la transformación, transfección, transducción o similar con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula parental que no es idéntico a la célula parental debido a las mutaciones que ocurren durante la replicación.

Propiedad mejorada: el término "propiedad mejorada" significa una característica asociada a una variante que está mejorada en comparación con el progenitor. Tales propiedades mejoradas incluyen, pero de forma no limitativa, la actividad específica, una inhibición por glucosa reducida, una actividad de formación de isomaltosa reducida, una actividad DE11 aumentada y una termoestabilidad aumentada. Una propiedad mejorada adicional es un rendimiento de EtOH aumentado cuando la variante se aplica en la sacarificación seguida de la fermentación en un mosto licuado. Aislado: el término "aislado/a/os/as" significa una sustancia en una forma o entorno que no ocurre en la naturaleza. Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen: (1) cualquier sustancia que no ocurra de forma natural; (2) cualquier sustancia incluyendo, pero de forma no limitativa, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se ha separado al menos parcialmente de uno o más o todos los constituyentes de origen natural con los cuales está asociada en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a esa sustancia como se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada aumentando la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los cuales se asocia naturalmente (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

Condiciones de astringencia baja: el término "condiciones de astringencia baja" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 25%, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar durante l2 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada una durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 50°C.

Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como el procesamiento N-terminal, el truncamiento C-terminal, la glicosilación, la fosforilación, etc. El polipéptido maduro se divulga en la presente como la SEQ ID NO: 2.

Secuencia codificante del polipéptido maduro: el término "secuencia codificante del polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de glucoamilasa. En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro consiste en los nucleótidos 52 a 1728 (o 1731 si se incluye el codón de terminación) de la SEQ ID NO: 1. Los nucleótidos 1 a 51 de la SEQ ID NO: 1 codifican un péptido señal.

Condiciones de astringencia media: el término "condiciones de astringencia media" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 35%, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada una durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 55°C.

Condiciones de astringencia media-alta: el término "condiciones de astringencia media-alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 35%, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada una durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 60°C.

Construcción de ácido nucleico: el término "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea mono- o bicatenaria, que se ha aislado de un gen de origen natural o se ha modificado para contener segmentos de ácidos nucleicos de manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.

Operativamente unido: el término "operativamente unido/a" significa una configuración donde una secuencia de control se coloca en una posición apropiada respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de manera que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.

Progenitor o glucoamilasa parental: el término "progenitor" o "glucoamilasa parental" significa una glucoamilasa a la que se le realiza una modificación para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. El progenitor puede ser un polipéptido de origen natural (salvaje) o una variante o fragmento del mismo.

Identidad de secuencia: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad de secuencia".

A efectos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento)

A efectos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, suprá) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, suprá), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento)

Subsecuencia: el término "subsecuencia" significa un polinucleótido con uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante del polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad de glucoamilasa. En un aspecto, una subsecuencia codifica al menos el dominio catalítico de la variante según la invención. Por ejemplo, contiene al menos 1362 nucleótidos (por ejemplo, los nucleótidos 52 a 1413 de la SEQ ID NO: 1).

Variante: el término "variante" significa un polipéptido con actividad de glucoamilasa que incluye una modificación, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución significa la sustitución del aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir un aminoácido adyacente e inmediatamente posterior al aminoácido que ocupa una posición. Las variantes de la presente invención tienen al menos un 20%, por ejemplo, al menos un 40%, al menos un 45%, más preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 55%, más preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 65%, más preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 75%, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, aún más preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95% e incluso más preferiblemente al menos un 100% de la actividad de glucoamilasa del polipéptido de SEQ ID NO: 2.

Condiciones de astringencia muy alta: el término "condiciones de astringencia muy alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 50%, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada una durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 70°C.

Condiciones de astringencia muy baja: el término "condiciones de astringencia muy baja" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 25%, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada una durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 45°C.

Glucoamilasa salvaje: el término glucoamilasa "salvaje" significa una glucoamilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tal como una bacteria, una levadura o un hongo filamentoso encontrado en la naturaleza.

Convenios para la denominación de variantes

[0018] A efectos de la presente invención, el polipéptido maduro divulgado en la SEQ ID NO: 2 se usa para determinar el residuo de aminoácido correspondiente en otra glucoamilasa. La secuencia de aminoácidos de otra glucoamilasa se alinea con el polipéptido maduro divulgado en la SEQ ID NO: 2 y, en base al alineamiento, el número de posición del aminoácido correspondiente a cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido maduro divulgado en la SEQ ID NO: 2 se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62).

[0019] La identificación del residuo de aminoácido correspondiente en otra glucoamilasa se puede determinar mediante un alineamiento de múltiples secuencias de polipéptidos usando varios programas informáticos que incluyen, pero de forma no limitativa, MUSCLE (comparación de múltiples secuencias por log-expectativa; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versión 6.857 o posterior; Katoh y fuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh y Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899­ 1900) y EMBOSS EMMA utilzando ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673­ 4680), usando sus respectivos parámetros por defecto.

[0020] Cuando la otra enzima ha divergido del polipéptido de SEQ ID NO: 2 de manera que la comparación tradicional en base a secuencias no consigue detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol.295: 613-615), se pueden usar otros algoritmos de comparación de secuencias por pares. Se puede lograr una mayor sensibilidad en la búsqueda de secuencias usando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para buscar en las bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso iterativo de búsqueda en bases de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede conseguir incluso una mayor sensibilidad si la familia o superfamilia del polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructuras de proteínas. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información a partir de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineamiento estructural y potenciales de solvatación) como entrada a una red neuronal que predice el plegamiento estructural para una secuencia de consulta. De forma similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903­ 919, se puede usar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilias presentes en la base de datos SCOP. Estos alineamientos se pueden usar a su vez para generar modelos de homología para el polipéptido, y se puede evaluar la precisión de tales modelos usando una variedad de herramientas desarrolladas para ese fin.

[0021] Para proteínas de estructura conocida, están disponibles varias herramientas y recursos para recuperar y generar alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas de SCOP se han alineado estructuralmente, y esos alineamientos son accesibles y descargables. Dos o más estructuras de proteínas se pueden alinear usando una variedad de algoritmos como la matriz de alineamiento de distancias (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y la implementación de estos algoritmos se puede utilizar adicionalmente para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés para descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0022] Al describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura descrita a continuación está adaptada para facilitar la referencia. Se emplea la abreviatura del aminoácido de una sola letra o de tres letras aceptada por la IUPAC.

[0023] Sustituciones. Para la sustitución de un aminoácido, se usa la nomenclatura siguiente: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 por alanina se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples se separan por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg Ser411 Phe" o "G205R S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0024] Deleciones. Para la deleción de un aminoácido, se usa la nomenclatura siguiente: aminoácido original, posición, *. Por consiguiente, la deleción de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones múltiples se separan por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".

[0025] Inserciones. Para la inserción de un aminoácido, se usa la nomenclatura siguiente: aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se designa "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción de múltiples aminoácidos se designa [aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado #1, aminoácido insertado #2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

[0026] En tales casos, el/los residuo(s) de aminoácido insertado(s) se numera(n) mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido precedente al/a los residuo(s) de aminoácido insertado(s). En el ejemplo anterior, la secuencia sería así:

[0027] Modificaciones múltiples. Las variantes que comprenden modificaciones múltiples se separan por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E", que representan una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 por tirosina y ácido glutámico, respectivamente.

[0028] Diferentes modificaciones. Cuando se pueden introducir diferentes modificaciones en una posición, las diferentes modificaciones se separan por una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de arginina en la posición 170 por tirosina o ácido glutámico. Así, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" designa las variantes siguientes: "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" y "Tyr167Ala+Arg170Ala".

Descripción detallada de la invención

[0029] La presente divulgación se refiere a variantes de glucoamilasa que comprenden una sustitución en una posición correspondiente a la posición 295 del polipéptido de SEQ ID NO: 2 y la variante tiene actividad de glucoamilasa. En particular, las variantes tienen propiedades mejoradas en comparación con la glucoamilasa divulgada como la SEQ ID NO: 2. Particularmente, la propiedad mejorada es una inhibición por glucosa reducida. La sacarificación y la fermentación también se pueden realizar en pasos separados. Las variantes según la invención tienen al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

[0030] En un aspecto particular, la divulgación se refiere a una variante de glucoamilasa que comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 295 del polipéptido de SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad de glucoamilasa y donde la variante tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

[0031] La glucoamilasa parental, SEQ ID NO: 2, tiene una prolina en las posiciones 95 y 121. Esta combinación proporciona una termoestabilidad mejorada respecto a la glucoamilasa parental. En una forma de realización particular, las prolinas en las posiciones 95 y 121 se mantienen sin cambios en todas las variantes de la invención.

Variantes

[0032] La presente divulgación proporciona variantes de glucoamilasa que comprenden una modificación, en particular una sustitución, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones que corresponden a las posiciones 295, 224, 410, 271, 72, 77, 145, 318, 60, 32, 83, 163, 169, 303, 219 y 73, y la variante tiene actividad de glucoamilasa y donde la variante tiene al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

[0033] En una forma de realización se aísla la variante.

[0034] En un aspecto de la divulgación, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100%, con la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa parental.

[0035] En otro aspecto de la divulgación, la variante tiene al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

[0036] En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una variante de glucoamilasa que comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 295 del polipéptido de SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad de glucoamilasa y donde la variante tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

[0037] Además la variante puede comprender también una sustitución al menos en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 32, 83, 163, 169, 219, 224, 303 o 410 del polipéptido de SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad de glucoamilasa y donde la variante tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

[0038] Las variantes ejemplificadas divulgadas en la presente se construyeron todas en base a la glucoamilasa parental de SEQ ID NO: 2. Así se incluyó el aminoácido de partida que se va a sustituir, por ejemplo, Y295F, sin embargo, ya que otras glucoamilasas parentales también se pueden mejorar según la invención, en tales casos el aminoácido de partida puede ser diferente. Por lo tanto, las sustituciones específicas también se pueden describir especificando solo el aminoácido que va a estar presente en una posición dada después de que haya tenido lugar la sustitución. En lo que sigue, solo se ha especificado el aminoácido presente tras las sustituciones.

[0039] Así, las variantes de la divulgación en un aspecto comprenden al menos una o más de las sustituciones seleccionadas de 295F, 295W, 224A, 224I, 224T, 32V, 83D, 163A, 163W, 1691, 219R, 303N o 410K.

[0040] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones del polipéptido de SEQ ID NO: 2:

295W; o

295W+ 410K; o

2241 295F; o

224T 295W 318V; o

295F; o

224A 295F; o

295W 83D 410K; o

163A 295W 410K; o

163W 295W 410K; o

303N 295W; o

1691 295W; o

32V 219R 295W; y donde la variante tiene actividad de glucoamilasa y donde la variante tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2; y donde las variantes tienen una inhibición por glucosa reducida en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 2

[0041] En una forma de realización, las sustituciones se seleccionan de Y295F, Y295W, L224A, L224I, L224T, A32V, S83D, N163A, N163W, V169I, T219R, S303N, R410K y Q318V.

[0042] En particular, las variantes tienen propiedades mejoradas en comparación con la glucoamilasa divulgada como la SEQ ID NO: 2.

[0043] Particularmente, la propiedad mejorada es una inhibición por glucosa reducida.

En otro aspecto particular de la divulgación, la propiedad mejorada es un rendimiento de etanol aumentado en un proceso de la invención cuando la variante de glucoamilasa está presente durante la sacarificación y, particularmente, la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF).

[0044] Las variantes pueden comprender además una o más sustituciones adicionales en una o más (por ejemplo, varias) otras posiciones.

[0045] Cabe señalar que, para todas las variantes específicas divulgadas, tal variación adicional podría introducirse sin afectar significativamente las propiedades de las variantes de glucoamilasa. En un aspecto, el número de sustituciones de las variantes de la presente invención, además de las sustituciones específicas tratadas en la presente, es 1 -20, por ejemplo, 1-10 y 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones.

[0046] Por lo tanto, el % de identidad del polipéptido de la variante en comparación con el polipéptido parental de SEQ ID NO: 2 puede ser al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

[0047] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 90%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID n O: 2.

[0048] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 91%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID n O: 2.

[0049] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 92%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID n O: 2.

[0050] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 93%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID n O: 2.

[0051] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 94%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID n O: 2.

[0052] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 95%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

[0053] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 96%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID n O: 2.

[0054] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 97%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID n O: 2.

[0055] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 98%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID n O: 2.

[0056] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad de glucoamilasa, y la variante tiene al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID n O: 2.

[0057] Los cambios de aminoácidos que pueden estar presente además de las sustituciones específicas descritas en la presente pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de 1-30 aminoácidos; extensiones amino- o carboxiterminales pequeñas, tal como un residuo de metionina aminoterminal; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilite la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0058] Los ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Se conocen en la técnica sustituciones de aminoácidos que no modifican generalmente la actividad específica y se describen, por ejemplo, en H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

[0059] Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que se modifican las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, modificar la especificidad por el sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.

[0060] Se pueden identificar aminoácidos esenciales en un polipéptido según procedimientos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo de la molécula y se evalúa la actividad de glucoamilasa de las moléculas mutantes resultantes para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica puede determinarse también mediante análisis físico de la estructura, como se determina con técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción electrónica o el marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de aminoácidos esenciales también puede inferirse a partir de un alineamiento con un polipéptido relacionado.

[0061] En una forma de realización, la variante de glucoamilasa tiene una actividad específica mejorada en comparación con la enzima parental. La actividad específica se determinó usando el ensayo AGU.

[0062] En una forma de realización, la variante de glucoamilasa tiene una inhibición por glucosa reducida en comparación con la glucoamilasa parental de SEQ ID NO: 2. La inhibición por glucosa se determinó como la proporción de actividad de glucoamilasa con y sin glucosa al 30% con respecto a la enzima parental salvaje divulgada como la SEQ ID NO: 2.

[0063] En otra forma de realización, la variante de glucoamilasa tiene una actividad de formación de isomaltosa reducida en comparación con la glucoamilasa parental de SEQ ID NO: 2.

[0064] En otra forma de realización, la variante de glucoamilasa tiene una actividad DE11 aumentada en comparación con la glucoamilasa parental de SEQ ID NO: 2.

[0065] En otra forma de realización, la variante de glucoamilasa tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con la glucoamilasa parental de SEQ ID NO: 2.

[0066] En otra forma de realización, la variante de glucoamilasa tiene un rendimiento de EtOH aumentado en comparación con la glucoamilasa parental de SEQ ID NO: 2, cuando la variante se aplica en la sacarificación seguida de la fermentación en un mosto licuado.

[0067] Para los detalles véase la sección de materiales y métodos incluida en la presente.

Glucoamilasas parentales

[0068] La glucoamilasa parental puede ser (a) un polipéptido con al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 o (ii) el complemento en toda su longitud de (i); o (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.

[0069] En un aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2 de al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de glucoamilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.

[0070] En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En otra forma de realización, el progenitor es una variante alélica del polipéptido de SEQ ID NO: 2.

[0071] En otro aspecto, el progenitor está codificado por un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 o (ii) el complemento en toda su longitud de (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York).

[0072] El polinucleótido de SEQ ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, así como el polipéptido de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma, se puede usar para diseñar sondas de ácido nucleico para identificar y clonar ADN que codifica un progenitor de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar, para identificar y aislar el gen correspondiente en la misma. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que toda la secuencia, pero deberían ser de al menos 15, por ejemplo, al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico es de al menos 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos o al menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden usar tanto sondas de ADN como de ARN. Las sondas se marcan típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina). Tales sondas están abarcadas por la presente invención.

[0073] Una genoteca de ADN genómico o ADNc preparada a partir de tales otras cepas se puede cribar para buscar ADN que hibride con las sondas anteriormente descritas y codifique un progenitor. Se puede separar ADN genómico o de otro tipo de tales otras cepas por electroforesis en gel de poliacrilamida o de agarosa o por otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado se puede transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que hibride con la SEQ ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en una transferencia de Southern.

[0074] A efectos de la presente divulgación, la hibridación indica que el polinucleótido hibrida con una sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a (i) la SEQ ID NO: 1; (ii) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1; (iii) el complemento en toda su longitud de la misma; o (iv) una subsecuencia de la misma; bajo condiciones de astringencia muy baja a muy alta. Se pueden detectar moléculas con las que híbrida la sonda de ácido nucleico bajo estas condiciones usando, por ejemplo, película radiográfica o cualquier otro medio de detección conocido en la técnica.

[0075] En un aspecto, la sonda de ácido nucleico es la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico consiste en los nucleótidos 52 a 1728 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2; o un fragmento del mismo. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es la SEQ ID NO: 1.

[0076] En otro aspecto, el progenitor está codificado por un polinucleótido con una identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 de al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%.

[0077] El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido donde la región de un polipéptido se fusiona en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de una región de otro polipéptido.

[0078] El progenitor puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible donde se fusiona otro polipéptido en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido con un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo control del/de los mismo(s) promotor(es) y terminador. También se pueden construir polipéptidos de fusión usando la tecnología de inteína donde se crean polipéptidos de fusión postraduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0079] Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. Tras la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde liberando dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios divulgados en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568­ 576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488­ 3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[0080] El progenitor puede ser una glucoamilasa fúngica. Por ejemplo, el progenitor puede ser una glucoamilasa de Gloeophyllum o de Trametes.

[0081] En otro aspecto, el progenitor es una glucoamilasa de Gloeophyllum trabeum, Gloeophyllum sepiarium o Trametes cingulata.

[0082] En otro aspecto, el progenitor es una glucoamilasa de Gloeophyllum trabeum, por ejemplo, la glucoamilasa de SEQ ID NO: 2.

[0083] Cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en una serie de colecciones de cultivo, como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0084] El progenitor se puede identificar y obtener de otras fuentes, incluidos microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelos, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelos, abonos, agua, etc.), usando las sondas anteriormente mencionadas. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales se conocen en la técnica. Un polinucleótido que codifica un progenitor puede entonces obtenerse de forma similar cribando una genoteca de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez se ha detectado un polinucleótido que codifica un progenitor con la(s) sonda(s), el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que conocen las personas expertas en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Preparación de variantes

[0085] Las variantes se pueden preparar usando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio, la construcción de genes sintéticos, la construcción de genes semisintéticos, la mutagénesis aleatoria, la transposición, etc.

[0086] La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica donde una o más (por ejemplo, varias) mutaciones se introducen en uno o más sitios definidos en un polinucleótido que codifica el progenitor.

[0087] La mutagénesis dirigida al sitio se puede realizar in vitro por PCR, lo que implica el uso de cebadores oligonucleotídicos con la mutación deseada. La mutagénesis dirigida al sitio puede realizarse también in vitro por mutagénesis de "casete", lo que implica la escisión por una enzima de restricción en un sitio del plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el progenitor y el ligamiento posterior de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Normalmente, la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, lo que permite que los extremos pegajosos del plásmido y el inserto se liguen uno con el otro. Véase, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[0088] La mutagénesis dirigida al sitio también se puede realizar in)vivo por métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de la patente de EE.UU. n.02004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol.

19: 773-776; fren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[0089] En la presente invención se puede usar cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Hay muchos kits comerciales disponibles que se pueden usar para preparar variantes.

[0090] La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diseñada para codificar un polipéptido de interés. La síntesis génica se puede realizar utilizando una serie de técnicas, como la tecnología multiplex con microchips descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares donde se sintetizan y se ensamblan oligonucleótidos sobre chips microfluídicos fotoprogramables.

[0091] Se pueden realizar y evaluar sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos individuales o múltiples usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o transposición, seguido de un procedimiento de cribado pertinente, tal como los divulgados por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen la PCR propensa a error, la presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; la patente de EE.UU. n.o 5,223,409; WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0092] Se pueden combinar métodos de mutagénesis/transposición con métodos de cribado de alto rendimiento automatizados para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.

[0093] La construcción de genes semisintéticos se realiza combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos, y/o la mutagénesis dirigida al sitio, y/o la mutagénesis aleatoria, y/o la transposición. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótidos que se sintetizan, en combinación con técnicas de PCR. Las regiones definidas de los genes se pueden sintetizar así de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar usando cebadores mutagénicos específicos de sitio, mientras que otras regiones se pueden someter a una amplificación por PCR propensa a error o por PCR no propensa a error. Las subsecuencias de los polinucleótidos pueden entonces transponerse.

Polinucleótidos

[0094] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican una variante de la presente invención.

Construcciones de ácido nucleico

[0095] La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido codificante de una variante de la presente invención operativamente unido a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

[0096] El polinucleótido se puede manipular de diversas maneras para proveer a la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria en función del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.

[0097] La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula huésped para la expresión del polinucleótido. El promotor contiene secuencias de control transcripcional que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula huésped, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos respecto a la célula huésped.

[0098] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son los promotores obtenidos de los genes para la acetamidasa de Aspergillus nidulans, la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, la glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, la proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), la amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, la celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, la endoglucanasa I de Trichoderma reesei, la endoglucanasa II de Trichoderma reesei, la endoglucanasa III de Trichoderma reesei, la endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, la endoglucanasa V de Trichoderma reesei, la xilanasa de I Trichoderma reesei, la xilanasa II de Trichoderma reesei, la beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de la alfa-amilasa neutra de Aspergillus donde el líder no traducido se ha sustituido por un líder no traducido de un gen de la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus-, ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados de un gen de la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger donde el líder no traducido se ha sustituido por un líder no traducido de un Aspergillus nidulans o un gen de la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae)- y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.

[0099] En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes para la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, la galactocinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, la triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, la metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae y la 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0100] La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia de terminación está operativamente unida al extremo 3' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede usar cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped.

[0101] Terminadores preferidos para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum.

[0102] Los terminadores preferidos para células huésped de levadura se obtienen de los genes para la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, el citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y la gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.

[0103] La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm aguas abajo de un promotor y aguas arriba de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.

[0104] Ejemplos de regiones estabilizadores de ARNm adecuadas se obtienen de un gen crílllA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[0105] La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente unida al extremo 5' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede usar cualquier líder que sea funcional en la célula huésped.

[0106] Los líderes preferidos para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

[0107] Se obtienen líderes adecuados para células huésped de levadura de los genes para la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, la 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerev s ae.

[0108] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente unida al extremo 3' de la secuencia codificante de la variante y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped.

[0109] Se obtienen secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped fúngicas filamentosas de los genes para la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum.

[0110] Se describen secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[0111] La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifique un péptido señal unido al extremo N-terminal de una variante y dirija la variante a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener intrínsecamente una secuencia codificante del péptido señal unida naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica la variante. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es exógena respecto a la secuencia codificante. Puede requerirse una secuencia codificante del péptido señal exógena cuando la secuencia codificante no contiene naturalmente una secuencia codificante del péptido señal. Alternativamente, una secuencia codificante del péptido señal exógena puede reemplazar simplemente la secuencia codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción de la variante. Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia codificante del péptido señal que dirija la variante expresada a la vía secretora de una célula huésped.

[0112] Secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células huésped fúngicas filamentosas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para la amilasa neutra de Aspergillus niger, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la celulasa de Humicola insolens, la endoglucanasa V de Humicola insolens, la lipasa de Humicola lanuginosa y la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

[0113] Se obtienen péptidos señal útiles para células huésped de levadura de los genes para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes del péptido señal útiles se describen en Romanos et al., 1992, supra.

[0114] La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante del propéptido que codifica un propéptido situado en el extremo N-terminal de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido está generalmente inactivo y se puede convertir a un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido se puede obtener de los genes para la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), la proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), la lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y el factor alfa de Saccharomyces)cerevisiae.

[0115] Cuando están presentes las secuencias tanto del péptido señal como del propéptido, la secuencia del propéptido está situada junto al extremo N-terminal de la variante y la secuencia del péptido señal está situada junto al extremo N-terminal de la secuencia del propéptido.

[0116] También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión de la variante en relación con el crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores de los sistemas procarióticos incluyen los sistemas de operadores lac, tac y trp. En levaduras, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En los hongos filamentosos, se puede usar el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellos que permiten la amplificación génica. En los sistemas eucarióticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneínas que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido codificante de la variante estaría operativamente unido a la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

[0117] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control se pueden juntar para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en tales sitios. Alternativamente, el polinucleótido se puede expresar insertando el polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté operativamente unida a las secuencias de control apropiadas para la expresión.

[0118] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o un virus) que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda producir la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que debe introducirse el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

[0119] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el/los cromosoma(s) donde se ha integrado. Además, se puede usar un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que, juntos, contengan el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

[0120] El vector contiene preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.

[0121] Los marcadores adecuados para células huésped de levadura incluyen, pero de forma no limitativa, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para usar en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5-fosfatodescarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Para usar en una célula de Aspergillus se prefieren los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

[0122] El vector contiene preferiblemente un elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.

[0123] Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido codificante de la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula huésped en una ubicación o ubicaciones precisa(s) en el/los cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

[0124] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

[0125] Ejemplos de orígenes de replicación para usar en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.

[0126] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede realizar según los métodos divulgados en WO 00/24883.

[0127] Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula huésped para aumentar la producción de una variante. Se puede obtener un aumento del número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde se pueden seleccionar las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, por lo tanto, se pueden seleccionar copias adicionales del polinucleótido cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

[0128] Los procedimientos usados para ligar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por una persona experta en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células huésped

[0129] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido codificante de una variante de la presente invención operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula huésped de modo que la construcción o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se ha descrito anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula parental que no es idéntico a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran parte del gen codificante de la variante y su fuente.

[0130] La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota.

[0131] La célula huésped también puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, de insecto, vegetal o fúngica.

[0132] La célula huésped puede ser una célula fúngica. "Hongos", como se utiliza en la presente, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como los definen Hawkswort et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).

[0133] La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura/s", como se utiliza en la presente, incluye levaduras ascoesporógenas (Endomycetales), levaduras basidioesporogéneas y levaduras pertenecientes a los hongos imperfectos (Blastomycetes). Debido a que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, a efectos de esta invención, la levadura se define como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series n.09, 1980).

[0134] La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.

[0135] La célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como definen Hawkswort et al., 1995, supra. Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación de hifas y el catabolismo del carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por brote de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

[0136] La célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.

[0137] Por ejemplo, la célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium)sambucinum, Fusarium)sarcochroum, Fusarium)sporotrichioides, Fusarium)sulphureum, Fusarium)torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0138] Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implique la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Se describen procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus)y Trichoderma en EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Se describen métodos adecuados para transformar especies de Fusarium en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. Las levaduras pueden transformarse usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs. 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de producción

[0139] La presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante, que comprenden: (a) el cultivo de una célula huésped de la presente invención bajo condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) opcionalmente la recuperación de la variante.

[0140] Las células huésped se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la variante usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz agitado, o fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lote, por lote alimentado o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que la variante sea expresada y/o aislada. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si la variante se secreta en el medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar de lisados celulares.

[0141] La variante puede detectarse usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección incluyen, pero de forma no limitativa, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede usar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.

[0142] La variante se puede recuperar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero de forma no limitativa, la recolección, la centrifugación, la filtración, la extracción, el secado por pulverización, la evaporación o la precipitación.

[0143] La variante se puede purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero de forma no limitativa, la cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, el cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, el isoelectroenfoque preparativo), la solubilidad diferencial (por ejemplo, la precipitación con sulfato amónico), la SDS-PAGE o la extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.

[0144] En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que una célula huésped de la presente invención que expresa la variante se usa como una fuente de la variante. En una forma de realización particular, la variante de glucoamilasa de la invención no se recupera y la célula huésped es una célula huésped de levadura. En particular la levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica. En una forma de realización preferida, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

Composiciones

[0145] La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, la composición comprende también un portador y/o un excipiente. Más preferiblemente, las composiciones están enriquecidas con tal polipéptido. El término "enriquecido" indica que se ha aumentado la actividad de glucoamilasa de la composición, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1,1. Preferiblemente, las composiciones se formulan para proporcionar características deseables tales como poco color, poco olor y una estabilidad de almacenamiento aceptable.

[0146] La composición puede comprender un polipéptido de la presente invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples, tales como una aminopeptidasa, alfa-amilasa, isoamilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, pululanasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.

[0147] En una forma de realización particular, la composición comprende una alfa-amilasa y la variante de glucoamilasa según la invención. En otra forma de realización, la composición comprende una isoamilasa y la variante de glucoamilasa según la invención. En otra forma de realización, la composición comprende una alfa-amilasa, una isoamilasa y la variante de glucoamilasa según la invención.

[0148] En otro aspecto, la composición comprende la variante de glucoamilasa de la invención combinada con una pululanasa. En otro aspecto, la composición comprende la variante de glucoamilasa de la invención combinada con una pululanasa y una isoamilasa. En otro aspecto, la composición comprende la variante de glucoamilasa de la invención combinada con una pululanasa y una alfa-amilasa.

[0149] En una forma de realización particular, la composición comprende además una proteasa.

[0150] Las composiciones de polipéptido se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que se va a incluir en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0151] Además de una glucoamilasa, la composición puede comprender también una alfa-amilasa. Particularmente, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa fúngica ácida. Una alfa-amilasa estable en ácido fúngica es una alfa-amilasa que tiene actividad en el rango de pH de 3,0 a 7,0 y preferiblemente en el rango de pH de 3,5 a 6,5, con actividad a un pH de aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 y 6,0.

[0152] Preferiblemente, la alfa-amilasa fúngica ácida se deriva del género Aspergillus, especialmente una cepa de A. terreus, A. niger, A. oryzae, A. awamori o Aspergillus kawachii, o del género Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Rhizomucor pusillus, o el género Meripilus, preferiblemente una cepa de Meripilus giganteus.

[0153] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa se deriva de una cepa del género Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Rhizomucor pusillus, tal como la que se muestra en la SEQ ID NO: 3 en WO 2013/006756, tal como un híbrido de la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un dominio de unión al almidón y un conector de Aspergillus niger, tal como el que se muestra en la SEQ ID NO: 16 en la presente, o una variante de la misma.

[0154] En una forma de realización, la alfa-amilasa se selecciona del grupo que consiste en:

(i) una alfa-amilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 16 en la presente;

(ii) una alfa-amilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60%, al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 16 en la presente.

[0155] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa es una variante de la alfa-amilasa mostrada en la SEQ ID NO: 16 que tiene al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H Y141W; G20S Y141W; A76G Y141W; G128D Y141W; G128D D143N; P219C Y141W; N142D D143N; Y141W K192R; Y141W D143N; Y141W N383R; Y141W P219C A265C; Y141W N142D D143N; Y141W K192R V410A; G128D Y141W D143N; Y141W D143N P219C; Y141W D143N K192R; G128D D143N K192R; Y141W D143N K192R P219C; G128D Y141W D143N K192R; o G128D Y141W D143N K192R P219C (usando la SEQ ID NO: 16 para la numeración).

[0156] En una forma de realización, la alfa-amilasa se deriva de un Rhizomucor pusillus con un dominio de unión al almidón (SBD) y un conector de la glucoamilasa de Aspergillus niger, preferiblemente divulgado como la SEQ ID NO: 4 en la presente, preferiblemente con una o más de las siguientes sustituciones: G128D, D143N, preferiblemente G128D+D143N (usando la SEQ ID NO: 4 para la numeración), y donde la variante de alfa-amilasa tiene al menos un 75% de identidad, preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92%, aún más preferiblemente al menos un 93%, más preferiblemente al menos un 94% y aún más preferiblemente al menos un 95%, tal como incluso al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 4 en la presente.

[0157] En una forma de realización preferida, la proporción entre glucoamilasa y alfa-amilasa presentes y/o añadidas durante la sacarificación y/o la fermentación puede estar preferiblemente en el rango de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como de 100:1 a 1:1, tal como de 100:2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70 g PE/g SS.

[0158] Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de granulado o microgranulado. La variante se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0159] Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Las composiciones se pueden estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0160] La composición enzimática de la presente invención puede estar en cualquier forma adecuada para el uso, tal como, por ejemplo, un caldo de fermentación crudo con o sin las células eliminadas, un lisado celular con o sin restos celulares, una composición enzimática semipurificada o purificada, o una célula huésped, como fuente de las enzimas.

[0161] La composición enzimática puede ser un granulado o polvo seco, un granulado no pulverulento, un líquido, un líquido estabilizado o una enzima protegida estabilizada. Las composiciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse por adición de estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido láctico u otro ácido orgánico según procesos establecidos.

[0162] A continuación se dan ejemplos de usos preferidos del polipéptido o las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las que se usa la composición se pueden determinar basándose en métodos conocidos en la técnica.

[0163] Las composiciones anteriores son adecuadas para usar en procesos de licuefacción, sacarificación y/o fermentación, preferiblemente en la conversión del almidón, especialmente para producir jarabe y productos de fermentación, tal como etanol.

[0164] A continuación se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la presente invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las que se usa la composición se pueden determinar basándose en métodos conocidos en la técnica.

Métodos de uso de la variante de glucoamilasa de la invención - aplicaciones industriales

[0165] Las variantes de glucoamilasa de la presente invención poseen propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, las glucoamilasas se pueden usar en la fabricación de cerveza, la producción de etanol y procesos de conversión del almidón.

[0166] Las variantes de glucoamilasa se pueden usar para procesos de almidón, en particular la conversión del almidón, especialmente la licuefacción del almidón (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.03,912,590, EP 252730 y EP 063909, WO 99/19467 y WO 96/28567, que se incorporan todas por la presente por referencia). También se contemplan las composiciones para fines de conversión del almidón, que pueden comprender además de la glucoamilasa de la invención también una alfa-amilasa, una pululanasa y/o una proteasa.

[0167] Además, las glucoamilasas de la invención son particularmente útiles en la producción de edulcorantes y etanol (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.o 5,231,017, que se incorpora por la presente por referencia), tal como combustible, bebida y etanol industrial, a partir de almidón o granos enteros.

[0168] En una forma de realización, la presente invención se refiere a un uso de la glucoamilasa según la invención para la producción de jarabe y/o un producto de fermentación a partir de un material que contiene almidón. En una forma de realización, el material de almidón puede ser gelatinizado. En otra forma de realización, el material de almidón no es gelatinizado.

Procesamiento del almidón

[0169] El almidón natural consiste en gránulos microscópicos que son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando se calienta una suspensión acuosa de almidón, los gránulos se hinchan y finalmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. A temperaturas de hasta aproximadamente 50°C a 75°C, el hinchamiento puede ser reversible. Sin embargo, con temperaturas más altas empieza un hinchamiento irreversible llamado "gelatinización". Durante este proceso de "gelatinización" hay un aumento drástico de la viscosidad. El almidón granulado que se va a procesar puede ser un almidón altamente refinado de calidad, preferiblemente al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 97% o al menos un 99,5% puro o puede ser un material que contiene almidón más crudo que comprende granos enteros (por ejemplo, molidos) que incluyen fracciones no amiláceas tales como residuos de germen y fibras. La materia prima, tal como granos enteros, se puede reducir en tamaño de partícula, por ejemplo, por molienda, para abrir la estructura y permitir un procesamiento adicional. En la molienda en seco se muelen y usan granos enteros. La molienda húmeda proporciona una buena separación de germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y se aplica a menudo en ubicaciones donde se usa el hidrolizado de almidón en la producción de, por ejemplo, jarabes. Tanto la molienda húmeda como en seco son bien conocidas en la técnica del procesamiento del almidón y se pueden usar en un proceso de la invención. Las personas expertas en la técnica conocen métodos para reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón.

[0170] Como el nivel de sólidos es 30-40% en un proceso industrial típico, el almidón tiene que diluirse o "licuarse" de modo que pueda procesarse adecuadamente. Esta reducción de viscosidad se logra principalmente por degradación enzimática en la práctica comercial actual.

[0171] La licuefacción se realiza en presencia de una alfa-amilasa, preferiblemente una alfa-amilasa bacteriana y/o una alfa-amilasa fúngica ácida. En una forma de realización, también está presente una fitasa durante la licuefacción. En una forma de realización, también están presentes durante la licuefacción enzimas reductoras de la viscosidad tales como una xilanasa y/o una beta-glucanasa.

[0172] Durante la licuefacción, el almidón de cadena larga es degradado en unidades ramificadas y lineales más cortas (maltodextrinas) por una alfa-amilasa. La licuefacción se puede realizar como un proceso de suspensión en caliente de tres pasos. La suspensión se calienta a entre 60-95°C (por ejemplo, 70-90°C, tal como 77-86°C, 80-85°C, 83-85°C) y se añade una alfa-amilasa para iniciar la licuefacción (disolución).

[0173] La suspensión puede cocerse en una forma de realización con vapor a presión a entre 95-140°C, por ejemplo, 105-125°C, durante aproximadamente 1-15 minutos, por ejemplo, aproximadamente 3-10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos. La suspensión se enfría entonces a 60-95°C y se añade más alfa-amilasa para obtener la hidrólisis final (licuefacción secundaria). El proceso de cocción con vapor a presión se realiza a pH 4,5-6,5, típicamente a un pH entre 5 y 6. La alfa-amilasa se puede añadir como una dosis individual, por ejemplo, antes de la cocción con vapor a presión.

[0174] El proceso de licuefacción se realiza a entre 70-95°C, tal como 80-90°C, tal como alrededor de 85°C, durante aproximadamente 10 minutos a 5 horas, típicamente durante 1-2 horas. El pH es de entre 4 y 7, tal como entre 5,5 y 6,2. Para asegurar la estabilidad óptima de la enzima bajo estas condiciones, se puede añadir opcionalmente calcio (para proporcionar 1-60 ppm de iones de calcio libre, tal como aproximadamente 40 ppm de iones de calcio libre). Después de tal tratamiento, el almidón licuado tendrá típicamente un "equivalente de dextrosa" (DE) de 10-15.

[0175] Generalmente, la licuefacción y las condiciones de licuefacción son bien conocidas en la técnica.

[0176] Se divulgan ejemplos de alfa-amilasa en la sección "alfa-amilasas" a continuación.

[0177] La sacarificación puede realizarse usando condiciones bien conocidas en la técnica con una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, en particular una glucoamilasa o una beta-amilasa, y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa. Por ejemplo, un paso de sacarificación completo puede durar de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas. Sin embargo, resulta común hacer una presacarificación de típicamente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65°C, típicamente a aproximadamente 60°C, seguida de la sacarificación completa durante la fermentación en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). La sacarificación se realiza típicamente a una temperatura en el rango de 20-75°C, por ejemplo, 25-65°C y 40-70°C, típicamente a alrededor de 60°C, y a un pH entre aproximadamente 4 y 5, normalmente alrededor de pH 4,5.

[0178] Los pasos de sacarificación y fermentación se pueden realizar secuencial o simultáneamente. En una forma de realización, la sacarificación y la fermentación se realizan simultáneamente (que se denomina "SSF"). Sin embargo, resulta común realizar un paso de presacarificación durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas (por ejemplo, 30 a 90 minutos) a una temperatura de 30 a 65°C, típicamente alrededor de 60°C, que es seguido por una sacarificación completa durante la fermentación que se denomina sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). El pH es normalmente de entre 4,2-4,8, por ejemplo, pH 4,5. En un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), no hay fase de retención para la sacarificación, sino que la levadura y las enzimas se añaden juntas.

[0179] En un proceso de sacarificación típico, las maltodextrinas producidas durante la licuefacción se convierten en dextrosa por adición de una glucoamilasa y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (patente de EE.UU. n.04,335,208) o una pululanasa. La temperatura se reduce a 60°C antes de la adición de la glucoamilasa y la enzima desramificante. El proceso de sacarificación procede durante 24-72 horas. Antes de la adición de las enzimas de sacarificación, el pH se baja por debajo de 4,5, mientras se mantiene una alta temperatura (por encima de 95°C), para inactivar la alfa-amilasa encargada de la licuefacción. Este proceso reduce la formación de oligosacáridos cortos llamados "precursores de la panosa", que no se pueden hidrolizar debidamente mediante la enzima desramificante. Normalmente, aproximadamente 0,2-0,5% del producto de sacarificación es el trisacárido ramificado panosa (Glc pa1-6Glc pa1-4Glc), que no se puede degradar mediante una pululanasa. Si la amilasa activa de la licuefacción permanece presente durante la sacarificación (es decir, sin desnaturalización), la cantidad de panosa puede ser tan alta como 1-2%, que es altamente indeseable ya que baja el rendimiento de sacarificación significativamente.

[0180] Otros productos de fermentación se pueden fermentar en condiciones y temperaturas bien conocidas por personas expertas en la técnica, adecuadas para el organismo fermentador en cuestión.

[0181] El producto de fermentación se puede recuperar por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por destilación. Ejemplos de enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos se divulgan en la sección de "enzimas" a continuación.

[0182] En una forma de realización particular, el proceso de la invención comprende, además, antes de la conversión de un material que contiene almidón a azúcares/dextrinas, los pasos de:

(x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón; y

(y) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.

[0183] En una forma de realización, el material que contiene almidón se muele para reducir el tamaño de partícula. En una forma de realización, el tamaño de partícula se reduce a entre 0,05-3,0 mm, preferiblemente 0,1-0,5 mm, o de modo que al menos un 30%, preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 70%, aún más preferiblemente al menos un 90% del material que contiene almidón quepa a través de un tamiz con una malla de 0,05­ 3,0 mm, preferiblemente una malla de 0,1-0,5 mm.

[0184] La suspensión acuosa puede contener de 10-55 % en peso de sólidos secos (SS), preferiblemente 25-45 % en peso de sólidos secos (SS), más preferiblemente 30-40 % en peso de sólidos secos (SS) de material que contiene almidón.

[0185] Los procesos convencionales de conversión del almidón, tales como los procesos de licuefacción y sacarificación, se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.03,912,590, EP 252730 y EP 063909, que se incorporan en la presente por referencia.

[0186] En una forma de realización, el proceso de conversión que degrada el almidón para bajar el peso molecular de los componentes de carbohidratos tales como azúcares o sustitutos de grasa incluye un paso desramificante.

[0187] En el caso de convertir el almidón en un azúcar, se despolimeriza el almidón. Tal proceso de despolimerización consiste en, por ejemplo, un paso de pretratamiento y dos o tres pasos consecutivos del proceso, es decir, un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación y, en función del producto final deseado, un proceso de isomerización opcional.

[0188] Cuando el producto de azúcar final deseado es, por ejemplo, jarabe rico en fructosa, el jarabe de dextrosa se puede convertir en fructosa. Después del proceso de sacarificación, el pH se aumenta a un valor en el rango de 6-8, por ejemplo, pH 7,5, y el calcio se elimina por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa se convierte luego en jarabe rico en fructosa usando, por ejemplo, una glucosa isomerasa inmovilizada.

Producción de productos de fermentación

[0189] Los azúcares fermentables (por ejemplo, dextrinas, monosacáridos, particularmente glucosa) se producen a partir de una sacarificación enzimática. Estos azúcares fermentables se pueden purificar adicionalmente y/o convertir en productos de azúcar útiles. Además, los azúcares se pueden usar como materia prima de fermentación en un proceso de fermentación microbiana para producir productos finales, tales como alcohol (por ejemplo, etanol y butanol), ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido succínico, 3-HP y ácido láctico), polialcoholes (por ejemplo, glicerol), productos intermedios del ácido ascórbico (por ejemplo, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato y ácido 2-ceto-L-gulónico), aminoácidos (por ejemplo, lisina), proteínas (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de los mismos).

[0190] En un aspecto, los azúcares fermentables obtenidos durante los pasos del proceso de licuefacción se utilizan para producir alcohol y particularmente etanol. En la producción de etanol, se usa comúnmente un proceso de SSF donde las enzimas sacarificantes y los organismos fermentadores (por ejemplo, levadura) se añaden juntos y entonces se realiza a una temperatura de 30-40°C.

[0191] El organismo usado en la fermentación dependerá del producto final deseado. Típicamente, si el producto final deseado es el etanol, se usará levadura como organismo fermentador. En algunas formas de realización preferidas, el microorganismo productor de etanol es una levadura y específicamente Saccharomyces, tales como cepas de S. cerevisiae (patente de EE.UU. n.04,316,956). Una variedad de S. cerevisiae están disponibles comercialmente y estas incluyen, pero de forma no limitativa, FALI (Fleischmann's Yeast), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR (Lesaffre) y Angel alcohol yeast (Angel Yeast Company, China). La cantidad de levadura iniciadora empleada en los métodos es una cantidad eficaz para producir una cantidad comercialmente significativa de etanol en una cantidad adecuada de tiempo, (por ejemplo, para producir al menos un 10% de etanol a partir de un sustrato que tiene entre 25-40% SS en menos de 72 horas). Las células de levadura se suministran generalmente en cantidades de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 y preferiblemente de aproximadamente 107 a aproximadamente 1010 recuento de levaduras viables por ml de caldo de fermentación. Después de añadir levadura al mosto, se somete típicamente a una fermentación durante aproximadamente 24-96 horas, por ejemplo, 35-60 horas. La temperatura es de entre aproximadamente 26-34°C, típicamente a aproximadamente 32°C, y el pH es de pH 3-6, por ejemplo, alrededor de pH 4-5.

[0192] La fermentación puede incluir, además de unos microorganismos fermentadores (por ejemplo, levadura), nutrientes y enzimas adicionales, incluidas fitasas. El uso de levadura en la fermentación es bien conocido en la técnica.

[0193] En otros aspectos, el uso de microorganismos fermentadores apropiados, como se conoce en la técnica, puede resultar en que el producto final de fermentación incluya, por ejemplo, glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L-gulónico, ácido succínico, ácido láctico, aminoácidos y derivados de los mismos. Más específicamente, cuando el ácido láctico es el producto final deseado, se puede usar una Lactobacillus sp. (L. casei); cuando el glicerol o el 1,3-propanodiol son los productos finales deseados se puede usar E. coli; y cuando el 2-ceto-D-gluconato, el 2,5-diceto-D-gluconato y el ácido 2-ceto-L-gulónico son los productos finales deseados, se puede usar Pantoea citrea como el microorganismo fermentador. La lista enumerada anterior son solo ejemplos, y una persona experta en la técnica será consciente de una serie de microorganismos fermentadores que se pueden usar para obtener un producto final deseado.

Procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón no gelatinizado

[0194] La invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón sin gelatinización (es decir, sin cocción) del material que contiene almidón (a menudo denominado proceso de "hidrólisis de almidón crudo"). El producto de fermentación, tal como el etanol, se puede producir sin licuar la suspensión acuosa que contiene el material que contiene almidón y agua. En una forma de realización, un proceso de la invención incluye sacarificar material que contiene almidón (por ejemplo, molido), por ejemplo, almidón granulado, por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, preferiblemente en presencia de alfa-amilasa y/o enzima(s) generadora(s) de fuentes de carbohidratos para producir azúcares que pueden ser fermentados por un organismo fermentador adecuado para dar el producto de fermentación. En esta forma de realización, el producto de fermentación deseado, por ejemplo, etanol, se produce a partir de granos de cereales no gelatinizados (es decir, sin cocer) preferiblemente molidos, tal como granos de maíz.

[0195] Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón que comprende simultáneamente sacarificar y fermentar material que contiene almidón usando una enzima generadora de fuentes de carbohidratos y un organismo fermentador a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho material que contiene almidón. La sacarificación y la fermentación también pueden ser separadas. Así, en otro aspecto, la invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación que comprenden los pasos siguientes:

(i) sacarificar un material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial; y

(ii) fermentar usando un organismo fermentador;

donde el paso (i) se realiza usando al menos una variante de glucoamilasa de la invención.

[0196] En una forma de realización, una alfa-amilasa se añade en el paso (i). En otra forma de realización los pasos (i) y (ii) se realizan simultáneamente.

[0197] En un aspecto, está también presente una proteasa. La proteasa puede ser cualquier proteasa fúngica ácida o metaloproteasa. El producto de fermentación, por ejemplo, etanol, se puede recuperar opcionalmente tras la fermentación, por ejemplo, por destilación. Típicamente, durante la fermentación está(n) presente(s) amilasa(s), tales como glucoamilasa(s) y/u otras enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos, y/o alfa-amilasa(s). Los ejemplos de glucoamilasas y otras enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos incluyen glucoamilasas hidrolizantes de almidón crudo. Los ejemplos de alfa-amilasa(s) incluyen alfa-amilasas ácidas tales como alfa-amilasas fúngicas ácidas. Los ejemplos de organismos fermentadores incluyen levadura, por ejemplo, una cepa de Saccharomyces cerevisiae. El término "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura más baja a la cual comienza la gelatinización del almidón. En general, el almidón calentado en agua empieza a gelatinizar entre aproximadamente 50°C y 75°C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y puede ser determinada fácilmente por la persona experta en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según la especie vegetal, la variedad particular de la especie vegetal, así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un material que contiene almidón dado se puede determinar como la temperatura a la cual la birrefringencia se pierde en un 5% de los gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein y Lii, 1992, Starch/Starke 44(12): 461-466. Antes de iniciar el proceso puede prepararse una suspensión de material que contiene almidón, tal como almidón granulado, con 10-55 % p/p de sólidos secos (SS), preferiblemente 25-45 % p/p de sólidos secos, más preferiblemente 30-40 % p/p de sólidos secos de material que contiene almidón. La suspensión puede incluir agua y/o aguas de proceso, tales como vinaza (agua de proceso), agua de lavado, condensado o destilado de evaporador, agua de extracción secundaria de destilación o agua de proceso de otras plantas de productos de fermentación. Debido a que el proceso de la invención se realiza por debajo de la temperatura de gelatinización inicial y, así no se produce ningún aumento de viscosidad significativo, se pueden usar altos niveles de vinaza si se desea. En una forma de realización, la suspensión acuosa contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente un 70 % vol., preferiblemente 15-60 % vol., especialmente de aproximadamente un 30 a un 50 % vol. de agua y/o aguas de proceso, tal como vinaza (agua de proceso), agua de lavado, condensado o destilado de evaporador, agua de extracción secundaria de destilación, o agua de proceso de otras plantas de productos de fermentación, o combinaciones de las mismas, o similares. El material que contiene almidón se puede preparar reduciendo el tamaño de partícula, preferiblemente por molienda en seco o húmeda, hasta de 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente 0,1-0,5 mm. Después de haberse sometido a un proceso de la invención, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o preferiblemente al menos un 99% de los sólidos secos en el material que contiene almidón se convierten en un hidrolizado de almidón soluble. Un proceso de la invención se realiza a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, lo que significa que la temperatura se encuentra típicamente en el rango entre 30-75°C, preferiblemente entre 45-60°C. En una forma de realización preferida, el proceso se realiza a una temperatura de 25°C a 40°C, tal como de 28°C a 35°C, tal como de 30°C a 34°C, preferiblemente alrededor de 32°C. En una forma de realización, el proceso se realiza de modo que el nivel de azúcar, tal como el nivel de glucosa, se mantiene a un nivel bajo, tal como por debajo de un 6 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 3 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 2 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 1 % p/p., tal como por debajo de aproximadamente un 0,5 % p/p o por debajo de un 0,25 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 0,1 % p/p. Tales bajos niveles de azúcar se pueden conseguir utilizando simplemente cantidades ajustadas de enzima y organismo fermentador. Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente qué dosis/cantidades de enzima y organismo fermentador usar. Las cantidades empleadas de enzima y organismo fermentador también se pueden seleccionar para mantener concentraciones bajas de maltosa en el caldo de fermentación. Por ejemplo, el nivel de maltosa se puede mantener por debajo de aproximadamente un 0,5 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 0,2 % p/p. El proceso de la invención se puede realizar a un pH de aproximadamente 3 y 7, preferiblemente de pH 3,5 a 6, o más preferiblemente de pH 4 a 5. En una forma de realización, la fermentación está en curso durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.

Procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón gelatinizado

[0198] En este aspecto, la invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación, especialmente etanol, a partir de material que contiene almidón, donde el proceso incluye un paso de licuefacción y pasos de sacarificación y fermentación realizados secuencial o simultáneamente. Por consiguiente, la invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón que comprenden los pasos de:

(a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa-amilasa;

(b) sacarificar el material licuado obtenido en el paso (a) usando una glucoamilasa;

(c) fermentar usando un organismo fermentador;

donde el paso (a) y/o el paso (b) se realiza en presencia de una glucoamilasa según la invención.

[0199] En un aspecto, una proteasa, tal como una proteasa fúngica ácida o una metaloproteasa, se añade antes, durante y/o después de la licuefacción. En un aspecto, la metaloproteasa se deriva de una cepa de Thermoascus, por ejemplo, una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus c Gm CC n.00670. En otro aspecto, la proteasa es una proteasa bacteriana, particularmente una proteasa derivada de una cepa de Pyrococcus, más particularmente de Pyrococcus furiosus divulgada en US 6,358,726.

[0200] Se puede añadir una glucoamilasa adicional. En un aspecto, la glucoamilasa adicional se deriva de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger o Aspergillus awamori, una cepa de Talaromyces, especialmente Talaromyces emersonii; o una cepa de Athelia, especialmente Athelia rolfsii; una cepa de Trametes, por ejemplo, Trametes cingulata; una cepa del género Gloeophyllum, por ejemplo, una cepa de Gloeophyllum sepiarium o Gloeophyllum trabeum; o una mezcla de las mismas. El paso de sacarificación (b) y el paso de fermentación (c) se pueden realizar secuencial o simultáneamente. Una pululanasa y/o una metaloproteasa se puede añadir durante la sacarificación y/o la fermentación cuando el proceso se realiza como un proceso de sacarificación y fermentación secuenciales y antes o durante la fermentación cuando los pasos (b) y (c) se realizan simultáneamente (proceso SSF). La pululanasa y/o la metaloproteasa pueden añadirse también ventajosamente antes de la licuefacción (tratamiento de prelicuefacción), es decir, antes o durante el paso (a), y/o después de la licuefacción (tratamiento de postlicuefacción), es decir, después del paso (a). La pululanasa se añade más ventajosamente antes o durante la licuefacción, es decir, antes o durante el paso (a). El producto de fermentación, tal como especialmente el etanol, se puede recuperar opcionalmente tras la fermentación, por ejemplo, por destilación. El organismo fermentador es preferiblemente levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae. En un aspecto particular, el proceso de la invención comprende, además, antes del paso (a), los pasos de:

x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente por molienda (por ejemplo, usando un molino de martillos);

y) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.

[0201] En un aspecto, el tamaño de partícula es menor que una malla # 7, por ejemplo, una malla # 6. Una malla # 7 se usa normalmente en los procesos convencionales del estado de la técnica. La suspensión acuosa puede contener de 10-55, por ejemplo, 25-45 y 30-40, % p/p de sólidos secos (SS) de material que contiene almidón. La suspensión se calienta por encima de la temperatura de gelatinización y se puede añadir una variante de alfa-amilasa para iniciar la licuefacción (disolución). En un aspecto, la suspensión puede cocerse con vapor a presión para gelatinizar adicionalmente la suspensión antes de ser sometida a la alfa-amilasa en el paso (a). La licuefacción puede realizarse como un proceso de suspensión en caliente de tres pasos. En un aspecto, la suspensión se calienta a entre 60-95°C, preferiblemente entre 70-90°C, tal como preferiblemente entre 80-85°C, a pH 4-6, preferiblemente 4,5-5,5, y se añade una variante de alfa-amilasa, opcionalmente junto con una pululanasa y/o una proteasa, preferiblemente una metaloproteasa, para iniciar la licuefacción (disolución). En un aspecto, la suspensión se puede cocer con vapor a presión entonces a una temperatura entre 95-140°C, preferiblemente 100-135°C, tal como 105-125°C, durante aproximadamente 1-15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 3-10 minutos, especialmente alrededor de aproximadamente 5 minutos. La suspensión se enfría a 60-95°C y se añade(n) más alfa-amilasa y opcionalmente pululanasa y/o proteasa, preferiblemente metaloproteasa, para finalizar la hidrólisis (licuefacción secundaria). El proceso de licuefacción se realiza normalmente a pH 4,0-6, en particular a un pH de 4,5 a 5,5. El paso de sacarificación (b) puede realizarse usando condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un proceso de sacarificación completo puede durar hasta de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, sin embargo, es común hacer solo una presacarificación de típicamente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65°C, típicamente aproximadamente 60°C, seguida de la sacarificación completa durante la fermentación en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (proceso SSF). La sacarificación se realiza típicamente a temperaturas de 20-75°C, preferiblemente de 40-70°C, típicamente alrededor de 60°C, y a un pH entre 4 y 5, normalmente a alrededor de pH 4,5. El proceso más ampliamente usado para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, es un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), donde no hay fase de retención para la sacarificación, lo que significa que un organismo fermentador, tal como levadura, y enzima(s), se pueden añadir juntos. La SSF se puede realizar típicamente a una temperatura de 25°C a 40°C, tal como de 28°C a 35°C, tal como de 30°C a 34°C, preferiblemente alrededor de aproximadamente 32°C. En un aspecto, la fermentación está en curso durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.

Materiales que contienen almidón

[0202] Cualquier material de partida que contiene almidón adecuado se puede usar en un proceso de la presente invención. El material de partida se selecciona generalmente en función del producto de fermentación deseado. Los ejemplos de materiales de partida que contienen almidón, adecuados para usar en los procesos de la presente invención, incluyen cebada, alubias, mandioca, cereales, maíz, milo, guisantes, patatas, arroz, centeno, sagú, sorgo, boniatos, tapioca, trigo y granos enteros o cualquier mezcla de los mismos. El material que contiene almidón también puede ser un tipo ceroso o no ceroso de maíz y cebada. En un aspecto preferido, el material que contiene almidón es maíz. En un aspecto preferido, el material que contiene almidón es trigo.

Productos de fermentación

[0203] El término "producto de fermentación" significa un producto producido por un método o proceso que incluye fermentar usando un organismo fermentador. Los productos de fermentación incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H2 y CO2); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. En un aspecto preferido, el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol combustible; etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutras potables; o etanol industrial o productos usados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), la industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), la industria del cuero y la industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferidos comprenden cervezas ale, cervezas stout, cervezas porter, cervezas lager, bíters, licores de malta, cerveza happoushu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza baja en alcohol, cerveza baja en calorías o cerveza ligera. En un aspecto preferido, el producto de fermentación es el etanol.

Fabricación de cerveza

[0204] Las variantes de glucoamilasa también se pueden usar en un proceso de fabricación de cerveza y fermentaciones similares. El proceso es sustancialmente similar a los procesos de molienda, licuefacción, sacarificación y fermentación anteriormente descritos.

Procesado de la suspensión de almidón con vinaza

[0205] El material que contiene almidón molido se combina con agua y vinaza diluida reciclada, lo que da como resultado una suspensión acuosa. La suspensión puede comprender de un 15 a un 55% SS p/p (por ejemplo, de un 20 a un 50%, de un 25 a un 50%, de un 25 a un 45%, de un 25 a un 40%, de un 20 a un 35% y de un 30 a un 36% SS). En algunos aspectos, la vinaza diluida reciclada (agua de proceso) está en el rango de aproximadamente un 10 a un 70% v/v (por ejemplo, de un 10 a un 60%, de un 10 a un 50%, de un 10 a un 40%, de un 10 a un 30%, de un 10 a un 20%, de un 20 a un 60%, de un 20 a un 50%, de un 20 a un 40% y también de un 20 a un 30%).

[0206] Una vez el material que contiene almidón molido se ha combinado con agua y agua de proceso, el pH no se ajusta en la suspensión. Además, el pH no se ajusta tras la adición de una fitasa y opcionalmente una alfa-amilasa a la suspensión. En un aspecto, el pH de la suspensión estará en el rango de aproximadamente pH 4,5 a menos de aproximadamente 6,0 (por ejemplo, pH de 4,5 a 5,8, pH de 4,5 a 5,6, pH de 4,8 a 5,8, pH de 5,0 a 5,8, pH de 5,0 a 5,4, pH de 5,2 a 5,5 y pH de 5,2 a 5,9). El pH de la suspensión puede ser entre alrededor de pH 4,5 y 5,2 en función de la cantidad de vinaza diluida añadida a la suspensión y el tipo de material que comprende la vinaza diluida. Por ejemplo, el pH de la vinaza diluida puede ser de entre pH 3,8 y pH 4,5.

[0207] Durante la producción de etanol, se pueden añadir ácidos para bajar el pH en el pozo de cerveza, para reducir el riesgo de contaminación microbiana antes de la destilación.

[0208] En algunos aspectos, se añade una fitasa a la suspensión. En otros aspectos, además de fitasa, se añade una alfa-amilasa a la suspensión. En algunos aspectos, se añaden secuencialmente una fitasa y una alfa-amilasa a la suspensión. En otros aspectos, se añaden simultáneamente una fitasa y una alfa-amilasa. En algunos aspectos, la suspensión que comprende una fitasa y, opcionalmente, una alfa-amilasa, se incuba (se pretrata) durante un periodo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 8 horas (por ejemplo, de 5 minutos a 6 horas, de 5 minutos a 4 horas, de 5 minutos a 2 horas y de 15 minutos a 4 horas). En otros aspectos, la suspensión se incuba a una temperatura en el rango de aproximadamente 40 a 115°C (por ejemplo, de 45 a 80°C, de 50 a 70°C, de 50 a 75°C, de 60 a 110°C, de 60 a 95°C, de 70 a 110°C, de 70 a 85°C y de 77 a 86°C).

[0209] En otros aspectos, la suspensión se incuba a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 30°C (por ejemplo, de 0 a 25°C, de 0 a 20°C, de 0 a 15°C, de 0 a 10°C y de 0 a 5°C) por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón del material que contiene almidón. En algunos aspectos, la temperatura está por debajo de aproximadamente 68°C, por debajo de aproximadamente 65°C, por debajo de aproximadamente 62°C, por debajo de aproximadamente 60°C y por debajo de aproximadamente 55°C. En algunos aspectos, la temperatura está aproximadamente por encima de 45°C, aproximadamente por encima de 50°C, aproximadamente por encima de 55°C y aproximadamente por encima de 60°C. En algunos aspectos, la incubación de la suspensión que comprende una fitasa y una alfa-amilasa a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón se denomina licuefacción primaria (1a).

[0210] En un aspecto, el material que contiene almidón molido es maíz o milo. La suspensión comprende de un 25 a un 40% SS, el pH está en el rango de 4,8 a 5,2 y la suspensión se incuba con una fitasa y opcionalmente una alfa-amilasa durante 5 minutos a 2 horas, a un rango de temperatura de 60 a 75°C.

[0211] Actualmente, se cree que las alfa-amilasas microbianas disponibles comercialmente usadas en el proceso de licuefacción por lo general no son suficientemente estables para producir un sustrato de almidón licuado a partir de un proceso de molienda en seco usando grano entero molido a una temperatura aproximadamente por encima de 80°C a un nivel de pH que es inferior a pH 5,6. La estabilidad de muchas alfa-amilasas disponibles comercialmente se reduce a un pH inferior a aproximadamente 4,0.

[0212] En otro paso de licuefacción, el material que contiene almidón incubado o pretratado se expone a un aumento de temperatura tal como de aproximadamente 0 a aproximadamente 45°C sobre la temperatura de gelatinización del almidón del material que contiene almidón (por ejemplo, de 70°C a 120°C, de 70°C a 110°C y de 70°C a 90°C) durante un periodo de tiempo de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 6 horas (por ejemplo, de 2 minutos a 4 horas, 90 minutos, 140 minutos y de 90 a 140 minutos) a un pH de aproximadamente 4,0 a 5,5, más preferiblemente de 1 hora a 2 horas. La temperatura se puede aumentar mediante un sistema de cocción con vapor a presión a alta temperatura convencional durante un periodo de tiempo corto, por ejemplo, durante 1 a 15 minutos. Entonces el almidón se puede hidrolizar adicionalmente a una temperatura que varía de aproximadamente 75°C a 95°C (por ejemplo, de 80°C a 90°C y de 80°C a 85°C) durante un periodo de aproximadamente 15 a 150 minutos (por ejemplo, de 30 a 120 minutos). En un aspecto preferido, el pH no se ajusta durante estos pasos del proceso y el pH del mosto licuado está en el rango de aproximadamente pH 4,0 a pH 5,8 (por ejemplo, pH de 4,5 a 5,8, pH de 4,8 a 5,4 y pH de 5,0 a 5,2). En algunos aspectos, una segunda dosis de alfa-amilasa termoestable se añade al paso de licuefacción secundaria, pero en otros aspectos no hay dosificación adicional de alfa-amilasa.

[0213] Los pasos de incubación y licuefacción pueden estar seguidos por pasos de sacarificación y fermentación bien conocidos en la técnica.

Destilación

[0214] Opcionalmente, tras la fermentación, un alcohol (por ejemplo, el etanol) se puede extraer mediante, por ejemplo, destilación y opcionalmente seguida de uno o más pasos del proceso.

[0215] En algunos aspectos, el rendimiento de etanol producido por los métodos proporcionados en la presente es al menos un 8%, al menos un 10%, al menos un 12%, al menos un 14%, al menos un 15%, al menos un 16%, al menos un 17% y al menos un 18% (v/v) y al menos un 23% v/v. El etanol obtenido según el proceso proporcionado en la presente se puede usar como, por ejemplo, etanol combustible, etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutras potables, o etanol industrial.

Productos derivados

[0216] Los residuos de destilería son restos de la fermentación que se usan típicamente como alimento para animales o en forma líquida o seca. En otros aspectos, el producto final puede incluir los coproductos de fermentación tales como residuos de destilería secos (DDG) y los residuos de destilería secos con solubles (DDGS), que pueden usarse, por ejemplo, como alimento para animales.

[0217] La persona experta conoce bien los detalles adicionales de cómo realizar la licuefacción, la sacarificación, la fermentación, la destilación y la recuperación del etanol.

[0218] Según el proceso proporcionado en la presente, la sacarificación y la fermentación se pueden realizar simultáneamente o por separado.

Organismos fermentadores

[0219] El término "organismo fermentador" se refiere a cualquier organismo, incluidos organismos bacterianos y fúngicos, tales como levaduras y hongos filamentosos, adecuados para producir un producto de fermentación deseado. Los organismos fermentadores adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares fermentables, tales como arabinosa, fructosa, glucosa, maltosa, manosa o xilosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado.

[0220] Ejemplos de organismos fermentadores incluyen organismos fúngicos tales como levaduras. Las levaduras preferidas incluyen cepas de Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces uvarum-cepas de Pichia, en particular Pichia stipitis tales como Pichia stipitis CBS 5773 o Pichia pastoris- cepas de Candida, en particular Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensii, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis o Candida utilis. Otros organismos fermentadores incluyen cepas de Hansenula, en particular Hansenula anomala o Hansenula polymorpha- cepas de Kluyveromyces, en particular Kluyveromyces fragilis o Kluyveromyces marxianus- y cepas de Schizosaccharomyces, en particular Schizosaccharomyces pombe.

[0221] Los organismos fermentadores bacterianos preferidos incluyen cepas de Escherichia, en particular Escherichia coli, cepas de Zymomonas, en particular Zymomonas mobilis, cepas de Zymobacter, en particular Zymobactor palmae, cepas de Klebsiella en particular Klebsiella oxytoca, cepas de Leuconostoc, en particular Leuconostoc mesenteroides, cepas de Clostridium, en particular Clostridium butyricum, cepas de Enterobacter, en particular Enterobacter aerogenes, y cepas de Thermoanaerobacter, en particular Thermoanaerobacter BG1L1 (Appl. Microbiol. Biotech. 77: 61-86), Thermoanarobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter mathranii o Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. También se preveen cepas de Lactobacillus, así como las cepas de Corynebacterium glutamicum R, Bacillus thermoglucosidaisus y Geobacillus thermoglucosidasius.

[0222] En un aspecto, el organismo fermentador es un organismo fermentador de azúcares C6, tal como una cepa de, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.

[0223] En un aspecto, el organismo fermentador es un organismo fermentador de azúcares C5, tal como una cepa de, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.

[0224] En un aspecto, el organismo fermentador se añade al medio de fermentación de modo que el recuento por ml de medio de fermentación del organismo fermentador viable, tal como una levadura, esté en el rango de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, especialmente aproximadamente 5x107.

[0225] La levadura es el organismo fermentador preferido para la fermentación de etanol. Se prefieren cepas de Saccharomyces, especialmente cepas de las especies Saccharomyces cerevisiae, preferiblemente cepas que son resistentes a altos niveles de etanol, es decir, hasta, por ejemplo, aproximadamente un 10, 12, 15 o 20 % vol. o más de etanol.

[0226] En un aspecto, la levadura que utiliza C5 es una cepa de Saccharomyces cerevisiae divulgada en WO 2004/085627.

[0227] En un aspecto, el organismo fermentador es una célula microbiana eucariótica C5 tratada en WO 2010/074577 (Nedalco).

[0228] En un aspecto, el organismo fermentador es una célula eucariota C5 transformada capaz de isomerizar directamente xilosa a la xilosa divulgada en US 2008/0014620.

[0229] En un aspecto, el organismo termentador es una célula termentadora de azúcares C5 divulgada en WO 2009/109633.

[0230] Las levaduras disponibles comercialmente incluyen LNF SA-1, LNF BG-1, LNF PE-2 y LNF CAT-1 (disponibles de LNF Brazil), levaduras RED STAR™ y ETHANOL RED™ (disponibles de Fermentis/Lesattre, EE.UU.), FALI (disponible de Fleischmann's Yeast, EE.UU.), levadura tresca THERMOSACC™ y SUPERSTART (disponibles de Ethanol Technology, WI, EE.UU.), BIOFERM AFT y XR (disponibles de NAbC - North American Bioproducts Corporation, GA, EE.UU.), GERT STRAND (disponible de Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM Specialties).

[0231] El organismo termentador capaz de producir un producto de termentación deseado a partir de azúcares termentables se cultiva preteriblemente bajo condiciones precisas con una velocidad de crecimiento particular. Cuando el organismo termentador se introduce en/se añade al medio de termentación, el organismo termentador inoculado pasa por un número de pasos. Inicialmente no se produce crecimiento. Este periodo se denomina la "tase latente" y se puede considerar un periodo de adaptación. Durante la tase siguiente, denominada la "tase exponencial", la velocidad de crecimiento aumenta gradualmente. Tras un periodo de crecimiento máximo, la velocidad cesa y el organismo termentador entra en la "tase estacionaria". Tras un periodo de tiempo adicional, el organismo termentador entra en la "tase de muerte", en la que desciende el número de células viables.

Fermentación

[0232] Las condiciones de termentación se determinan en tunción de, por ejemplo, el tipo de material vegetal, los azúcares termentables disponibles, el/los organismo(s) termentador(es) y/o el producto de termentación deseado. Una persona experta en la técnica puede determinar tácilmente las condiciones de termentación adecuadas. La termentación se puede realizar en condiciones usadas de torma convencional. Los procesos de termentación preteridos son los procesos anaeróbicos.

[0233] Por ejemplo, se pueden realizar termentaciones a temperaturas tan altas como 75°C, por ejemplo, entre 40-70°C, tal como entre 50-60°C. Sin embargo, también se conocen bacterias con una temperatura óptima signiticativamente interior hasta alrededor de la temperatura ambiente (alrededor de 20°C). Se pueden encontrar ejemplos de organismos termentadores adecuados en la sección anterior "organismos termentadores".

[0234] Para la producción de etanol usando levadura, la termentación puede seguir durante 24 a 96 horas, en particular, durante 35 a 60 horas. En un aspecto, la termentación se realiza a una temperatura entre 20 y 40°C, preteriblemente de 26 a 34°C, en particular alrededor de 32°C. En un aspecto, el pH es de pH 3 a 6, preteriblemente alrededor de pH 4 a 5.

[0235] Otros productos de termentación se pueden termentar a temperaturas que la persona experta en la técnica sabe que son adecuadas para el organismo termentador en cuestión.

[0236] La termentación se realiza típicamente a un pH en el rango de entre 3 y 7, preteriblemente de pH 3,5 a 6, tal como alrededor de pH 5. Las termentaciones están en curso típicamente durante 6-_6 horas.

[0237] Los procesos de la invención se pueden realizar como un proceso por lotes o como uno continuo. Las termentaciones se pueden realizar en un sistema de ultratiltración donde la tracción retenida se mantiene en circulación en presencia de sólidos, agua y el organismo termentador, y donde el permeato es el líquido que contiene el producto de termentación deseado. Se contemplan también los métodos/procesos realizados en reactores de membrana continuos con membranas de ultratiltración y donde la tracción retenida se mantiene en circulación en presencia de sólidos, agua y el/los organismo(s) termentadores, y donde el permeato es el líquido que contiene el producto de termentación.

[0238] Tras la termentación, el organismo termentador puede separarse de la suspensión termentada y reciclarse.

Medio de fermentación

[0239] La expresión "medios de fermentación" o "medio de fermentación" se refiere al entorno donde se realiza la fermentación y comprende el sustrato de fermentación, es decir, la fuente de carbohidratos que metaboliza el/los organismo(s) fermentador(es).

[0240] El medio de fermentación puede comprender otros nutrientes y promotor(es) del crecimiento para el/los organismo(s) fermentador(es). Los nutrientes y promotores del crecimiento se usan ampliamente en la técnica de la fermentación e incluyen fuentes de nitrógeno, tal como el amoníaco; vitaminas y minerales, o combinaciones de los mismos.

Recuperación

[0241] Después de la fermentación, el producto de fermentación se puede separar del medio de fermentación. El medio de fermentación se puede destilar para extraer el producto de fermentación deseado o el producto de fermentación deseado puede extraerse del medio de fermentación mediante técnicas de microfiltración o filtración por membrana. Alternativamente, el producto de fermentación se puede recuperar por arrastre con vapor. Métodos para la recuperación se conocen en la técnica.

Enzimas

[0242] La(s) enzima(s) y los polipéptidos descritos a continuación deben usarse en una "cantidad eficaz" en procesos de la presente invención.

Alfa-amilasas

[0243] Se puede usar cualquier alfa-amilasa, tal como de origen fúngico, bacteriano o vegetal. En un aspecto preferido, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, por ejemplo, una alfa-amilasa fúngica ácida o bacteriana ácida. El término "alfa-amilasa ácida" significa una alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) que, añadida en una cantidad eficaz, tiene una actividad óptima a un pH en el rango de 3 a 7, preferiblemente de 3,5 a 6, o más preferiblemente de 4-5.

Alfa-amilasas bacterianas

[0244] Una alfa-amilasa para usar en la presente invención puede ser una alfa-amilasa bacteriana, por ejemplo, derivada de Bacillus. En un aspecto preferido, la alfa-amilasa de Bacillus se deriva de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis, pero también se puede derivar de otra Bacillus sp.

[0245] Los ejemplos específicos de alfa-amilasas incluyen la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 en WO 99/19467, la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 4 en WO 99/19467 y la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 en WO 99/19467 (todas las secuencias se incorporan por la presente por referencia). En un aspecto, la alfa-amilasa puede ser una enzima con un grado de identidad de al menos un 60%, por ejemplo, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% con cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 3, 4 o 5, respectivamente, en WO 99/19467.

[0246] La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o un híbrido, especialmente una descrita en cualquiera de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355 (todos los documentos se incorporan por la presente por referencia). Se divulgan variantes de alfa-amilasa específicas en las patentes de EE.UU. Nos. 6,093,562, 6,187,576 y 6,297,038 (por la presente incorporadas por referencia) e incluyen variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (alfa-amilasa BSG) con una deleción de uno o dos aminoácidos en las posiciones R179 a G182, preferiblemente una deleción doble divulgada en WO 96/23873 -véase, por ejemplo, página 20, líneas 1-10 (por la presente incorporada por referencia), preferiblemente correspondiente a delta(181-182) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus expuesta en la SEQ ID NO: 3 divulgada en WO 99/19467 o la deleción de los aminoácidos R179 y G180 usando la SEQ ID NO: 3 de WO 99/19467 para la numeración (referencia que se incorpora por la presente por referencia). En un aspecto preferido, la alfa-amilasa se deriva de Bacillus stearothermophilus. La alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus puede ser una salvaje madura o una variante madura de la misma. Las alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus maduras pueden truncarse naturalmente durante la producción recombinante. Por ejemplo, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus puede truncarse para que tenga alrededor de 491 aminoácidos (en comparación con la SEQ ID NO: 3 de WO 99/19467). Se prefieren alfa-amilasas de Bacillus, especialmente alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus, que tienen una deleción doble correspondiente a una deleción de las posiciones 181 y 182 y además comprenden una sustitución N193F (también denominada I181* G182* N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfaamilasa BSG salvaje expuesta en la SEQ ID NO: 3 divulgada en WO 99/19467. La alfa-amilasa bacteriana también puede tener una sustitución en una posición correspondiente a S239 en la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467 o una variante S242 de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 de WO 99/19467. En un aspecto preferido, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus:

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E;

1181*+G182*+N 193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

I181*+G182*+N193F V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; y

1181*+G182*+N 193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando la SEQ ID NO: 3 divulgada en WO 99/19467 para la numeración).

Alfa-amilasas híbridas bacterianas

[0247] La alfa-amilasa puede ser una alfa-amilasa híbrida, por ejemplo, una alfa-amilasa que comprende 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada en la SeQ ID NO: 4 de WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada en la SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467), con una o más, especialmente todas, de las siguientes sustituciones: G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (usando la numeración de Bacillus licheniformis de la SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467). Se prefieren también variantes que tienen una o más de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otras alfa-amilasas de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o la deleción de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente la deleción de E178 y G179 (usando la SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467 para la numeración de las posiciones).

Alfa-amilasas fúngicas

[0248] Las alfa-amilasas fúngicas incluyen alfa-amilasas derivadas de una cepa de Aspergillus, tales como, alfaamilasas de Aspergillus kawachii, Aspergillus niger y Aspergillus oryzae.

[0249] Una alfa-amilasa fúngica ácida preferida es una alfa-amilasa que muestra una alta identidad, es decir, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o incluso el 100% de identidad con la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10 de WO 96/23874.

[0250] Otra alfa-amilasa ácida preferida se deriva de una cepa de Aspergillus niger. En un aspecto preferido, la alfaamilasa fúngica ácida es una alfa-amilasa de Aspergillus niger divulgada como "AMYA ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el n.0 de acceso primario P56271 y descrita en WO 89/01969 (ejemplo 3 - incorporada por referencia).

[0251] Otras alfa-amilasas salvajes incluyen aquellas derivadas de una cepa de Meripilus y Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Meripilus giganteus o Rhizomucor pusillus (WO 2004/055178, que se incorpora en la presente por referencia).

[0252] En otro aspecto preferido, la alfa-amilasa se deriva de Aspergillus terreus.

[0253] En un aspecto preferido, la alfa-amilasa se deriva de Aspergillus kawachii (Kaneko et al., 1996, J. Ferment. Bioeng. 81: 292-298, "Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acidstable alpha-amylase from Aspergillus kawachii'; y además como EMBL: #AB008370).

[0254] La alfa-amilasa fúngica también puede ser una enzima salvaje que comprende un dominio de unión al almidón (SBD) y un dominio catalítico de alfa-amilasa, o una variante de la misma.

Alfa-amilasas híbridas fúnaicas

[0255] En un aspecto preferido, la alfa-amilasa ácida fún+ica es una alfa-amilasa híbrida. Los ejemplos de alfa-amilasas híbridas fún+icas incluyen las divul+adas en WO 2005/003311, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.0 2005/0054071 (Novozymes) y WO 2006/069290 (Novozymes), que se incorporan por la presente por referencia. Una alfa-amilasa híbrida puede comprender un dominio catalítico (CD) de alfa-amilasa y un dominio/módulo de unión a carbohidratos (CBM), tal como un dominio de unión al almidón (SBD), y opcionalmente un conector.

[0256] Los ejemplos de alfa-amilasas híbridas incluyen las divul+adas en las tablas 1 a 5 de los ejemplos de WO 2006/069290, incluida la variante con el dominio catalítico JA118 y el SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 100 de WO 2006/069290), la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un SBD y un conector de la AMG de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 101 de WO 2006/069290), la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un SBD y un conector de la lucoamilasa de Aspergillus niger (que se divul+a en la tabla 5 como una combinación de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 96 de la solicitud de EE.UU. n.o 11/316,535) o como V039 en la tabla 5 de WO 2006/069290, y la alfa-amilasa de Meripilus giganteus con un SBD y un conector de la lucoamilasa de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 102 de WO 2006/069290). Otras alfa-amilasas híbridas se enumeran en las tablas 3, 4, 5 y 6 en el ejemplo 4 de la solicitud de EE.UU. n.o 11/316,535 y WO 2006/069290 (que se incorporan por la presente por referencia).

[0257] En un aspecto preferido, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa derivada de Rhizomucor pusillus con un dominio de unión al almidón (SBD) y un conector de la lucoamilasa de Aspergillus niger, preferiblemente la mostrada en la SEQ ID NO: 7 de w O2013/006756, preferiblemente con una o más de las si+uientes sustituciones: G128D, D143N, especialmente G128D+D143N.

[0258] Otros ejemplos de alfa-amilasas híbridas incluyen las divul+adas en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.o 2005/0054071, incluidas las divul+adas en la tabla 3 en la pá+ina 15, tal como la alfa-amilasa de Aspergillus niger con un dominio de unión al almidón y un conector de Aspergillus kawachii.

[0259] Otras alfa-amilasas muestran un alto rado de identidad de secuencia con cualquiera de las alfa-amilasas mencionadas anteriormente, es decir, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o incluso el 100% de identidad con las secuencias de enzimas maduras divul+adas anteriormente.

Productos comerciales de alfa-amilasa

[0260] Las composiciones comerciales preferidas que comprenden alfa-amilasa incluyen MYCOLASE™ (DSM), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X, LIQUOZYME™ SC y SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ ALPHA, SPEZYME™ DELTA AA, GC358, GC980, SPEZYME™ CL y SPEZYME™ RSL (DuPont Industrial Biosciences), y la alfa-amilasa fún+ica ácida de Aspergillus niger denominada SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).

Enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos (enzimas sacarificantes)

[0261] El término "enzima eneradora de fuentes de carbohidratos" incluye la lucoamilasa (un enerador de lucosa), la beta-amilasa y la amilasa malto+énica (ambas eneradoras de maltosa) y también la alfa-+lucosidasa, la isoamilasa y la pululanasa. Una enzima eneradora de fuentes de carbohidratos es capaz de producir un carbohidrato que se puede usar como una fuente de ener+ía por el/los or+anismo(s) fermentador(es) en cuestión, por ejemplo, cuando se usa en un proceso de la invención para producir un producto de fermentación, tal como el etanol. El carbohidrato enerado se puede convertir directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado, preferiblemente etanol. Se puede usar una mezcla de enzimas eneradoras de fuentes de carbohidratos. Las mezclas incluyen mezclas que comprenden al menos una lucoamilasa y una alfa-amilasa, especialmente una amilasa ácida, aún más preferida una alfa-amilasa fún+ica ácida.

[0262] En un proceso convencional de almidón a etanol (es decir, que incluye un paso de licuefacción), la proporción puede ser preferiblemente como se define en EP 140410, especialmente cuando la sacarificación y la fermentación se realizan simultáneamente.

Glucoamilasas

[0263] El término "glucoamilasa" (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores del almidón o moléculas de oligosacáridos y polisacáridos relacionadas. Preferiblemente, la glucoamilasa es la variante de glucoamilasa de la invención.

[0264] La glucoamilasa se puede añadir en una cantidad de 0,001 a 10 AGU/g SS, preferiblemente de 0,01 a 5 AGU/g SS, tal como alrededor de 0,1, 0,3, 0,5, 1 o 2 AGU/g SS, especialmente de 0,1 a 0,5 AGU/g SS o 0,02-20 AGU/g SS, preferiblemente 0,1-10 AGU/g SS.

[0265] Sin embargo, en un aspecto, también pueden añadirse otras glucoamilasas. Tales otras glucoamilasas se pueden derivar de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, derivar de un microorganismo o una planta. Las glucoamilasas preferidas son de origen fúngico o bacteriano, seleccionadas del grupo que consiste en glucoamilasas de Aspergillus, en particular la glucoamilasa G1 o G2 de Aspergillus niger (Boel et al., 1984, EMBO J. 3(5): 1097-1102), o variantes de las mismas, tales como las divulgadas en WO 92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); la glucoamilasa de A. awamori divulgada en WO 84/02921, la glucoamilasa de Aspergillus oryzae (Hata et al., 1991, Agric. Biol. Chem. 55(4): 941-949), o variantes o fragmentos de las mismas. Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus incluyen variantes con una termoestabilidad mejorada: G137A y G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505) D257E y D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582) N182 (Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275­ 281); enlaces disulfuro, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 8698-8704); y la introducción de residuos Pro en las posiciones A435 y S436 (Li et al., 1997, Prot. Eng. 10: 1199-1204).

[0266] Otras glucoamilasas incluyen la glucoamilasa de Athelia rolfsii (previamente denominada Corticium rolfsii) (véase la patente de EE.UU. n.04,727,026 y Nagasaka et al., 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 323-330), las glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces duponti, Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente de EE.UU. n.o Re. 32,153) y Talaromyces thermophilus (patente de EE.UU. n.o 4,587,215).

[0267] En un aspecto específico, la glucoamilasa es de una cepa del género Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum, en particular la glucoamilasa de Penicillium oxalicum divulgada como la SEQ ID NO: 2 en WO 2011/127802. En un aspecto preferido, la glucoamilasa es una variante de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum divulgada como la SeQ ID NO: 2 en WO 2011/127802 con una sustitución K79V usando el polipéptido maduro (aminoácidos 22-616 de la SEQ ID NO: 2) para la numeración, y descrita en WO 2013/036526. En un aspecto preferido, la glucoamilasa es una variante de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum divulgada como los aminoácidos 22-616 de la SEQ ID NO: 2 en WO 2011/127802 con una sustitución K79V y una o más de las siguientes sustituciones P2N, P4S, P11F, T65A, Q327F, especialmente P2N P4S P11F T65A Q327F como se describe en WO2013/053801.

[0268] En un aspecto específico, la glucoamilasa es de una cepa del género Pycnoporus, especialmente una cepa de Pycnoporus sanguineus, en particular la glucoamilasa de Pycnoporus sanguineus divulgada como la SEQ ID NO: 2, 4 o 6 en WO 2011/066576. En un aspecto preferido, la composición enzimática comprende la glucoamilasa mostrada como los aminoácidos 19-573 de la SEQ ID NO: 6 en WO 2011/066576.

[0269] En un aspecto específico, la glucoamilasa es de una cepa del género Gloeophyllum, especialmente una cepa de Gloeophyllum trabeum, en particular la glucoamilasa de Gloeophyllum trabeum divulgada como la SEQ ID NO: 18 en WO 2011/068803. En un aspecto especialmente preferido, la composición enzimática comprende la glucoamilasa de Gloeophyllum trabeum mostrada en los aminoácidos 18-576 de la SEQ ID NO: 18 en WO2011/068803 y con una o más de las siguientes sustituciones: S95P, A121P, especialmente S95P+A121P usando el polipéptido maduro (posiciones 18-576 de la SEQ ID NO: 18) para la numeración.

[0270] En un aspecto específico, la glucoamilasa es de una cepa del género G'oeophy''um, especialmente una cepa de Gloeophyllum sepiarium, en particular la glucoamilasa madura de Gloeophyllum sepiarium divulgada como los aminoácidos 18-573 de la SEQ ID NO: 2 en WO2011/068803.

[0271] Las glucoamilasas bacterianas incluyen las glucoamilasas de Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP 135138) y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831), Trametes cingulata, Pachykytospora papyracea y Leucopaxillus giganteus, todas divulgadas en WO 2006/069289; o Peniophora rufomarginata divulgada en PCT/US2007/066618; o una mezcla de las mismas. Se puede usar una glucoamilasa híbrida en la presente invención. Ejemplos de glucoamilasas híbridas se divulgan en WO 2005/045018. Los ejemplos específicos incluyen la glucoamilasa híbrida divulgada en las tablas 1 y 4 del ejemplo 1 (híbridos que se incorporan por la presente por referencia).

[0272] La glucoamilasa puede tener un alto grado de identidad de secuencia con cualquiera de las glucoamilasas mencionadas anteriormente, es decir, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o incluso el 100% de identidad con las secuencias de las enzimas maduras mencionadas anteriormente.

[0273] Las composiciones de glucoamilasa disponibles comercialmente incluyen AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME ULTRA™ y AMG™ E (de Novozymes A/S, Dinamarca); OPTIDEX™ 300; GC480™ y GC147™ (de DuPont Industrial Biosciences, EE.UU.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de DuPont Industrial Biosciences).

[0274] Las glucoamilasas se pueden añadir en una cantidad de 0,02-20 AGU/g SS, preferiblemente 0,1-10 AGU/g SS, especialmente entre 1-5 AGU/g SS, tal como 0,1-2 AGU/g SS, tal como 0,5 AGU/g SS o en una cantidad de 0,0001-20 AGU/g SS, preferiblemente 0,001-10 AGU/g SS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g SS, tal como 0,1-2 AGU/g SS.

Beta-amilasas

[0275] Una beta-amilasa (E.C 3.2.1.2) es el nombre dado generalmente a amilasas maltogénicas de tipo exo, que catalizan la hidrólisis de enlaces 1,4-alfa-glicosídicos en amilosa, amilopectina y polímeros de glucosa relacionados. Se eliminan sucesivamente unidades de maltosa de los extremos de la cadena no reductores de una manera gradual hasta que la molécula se degrada o, en el caso de la amilopectina, hasta que se alcanza un punto de ramificación. La maltosa liberada tiene la configuración anomérica beta, de ahí el nombre de beta-amilasa.

[0276] Las beta-amilasas se han aislado de varias plantas y microorganismos (Fogarty y Kelly, 1979, Progress in Industrial Microbiology 15: 112-115). Estas beta-amilasas se caracterizan por el hecho de que tienen una temperatura óptima en el rango de 40°C a 65°C y un pH óptimo en el rango de 4,5 a 7. Una beta-amilasa disponible comercialmente de cebada es NOVOZYM™ WBA de Novozymes A/S, Dinamarca y SPEZYME™ BBA 1500 de DuPont Industrial Biosciences, EE.UU.

Amilasas maltogénicas

[0277] La amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, EC 3.2.1.133), que cataliza la hidrólisis de amilosa y amilopectina a maltosa en la configuración alfa. Una amilasa maltogénica de la cepa de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponible de Novozymes A/S. Se describen alfa-amilasas maltogénicas en las patentes de EE.UU. Nos. 4,598,048,. 4,604,355 y 6,162,628, que se incorporan por la presente por referencia.

[0278] La amilasa maltogénica se puede añadir en una cantidad de 0,05-5 mg de proteína total/gramo de SS o 0,05-5 MANU/g SS.

Fitasas

[0279] En un proceso de la presente invención se puede usar cualquier fitasa. Las fitasas son enzimas que degradan fitatos y/o ácido fítico hidrolizando específicamente el enlace éster entre el inositol y el fósforo. La actividad de fitasa se acredita con disponibilidad de fósforo y iones en muchos ingredientes. En algunos aspectos, la fitasa es capaz de liberar al menos un fosfato inorgánico a partir de un hexafosfato de inositol (por ejemplo, ácido fítico). Las fitasas se pueden agrupar según su preferencia por una posición específica del grupo éster de fosfato en la molécula de fitato en la cual se inicia la hidrólisis (por ejemplo, 3-fitasa (EC 3.1.3.8) o 6-fitasa (EC 3.1.3.26)). Un ejemplo de fitasa es la mio-inositolhexakisfosfato-3-fosfohidrolasa.

[0280] Las fitasas se pueden obtener de microorganismos tales como organismos fúngicos y bacterianos. Por ejemplo, la fitasa se puede obtener de hongos filamentosos tales como Aspergillus (por ejemplo, A. ficuum, A. fumigatus, A. niger y A. terreus), Cladospirum, Mucor (por ejemplo, Mucor piriformis), Myceliophthora (por ejemplo, M. thermophila), Penicillium (por ejemplo, P. hordei (ATCC n.022053)), P. piceum (ATc C n.010519) o P. brevi-compactum (At Cc n.0 48944), Talaromyces (por ejemplo, T. thermophilus), Thermomyces (WO 99/49740) y Tríchoderma spp. (por ejemplo, T. reesei).

[0281] En un aspecto, la enzima que degrada fitatos se obtiene de levadura (por ejemplo, Arxula adeninivorans, Pichia anómala, Schwanniomyces occidentalis), bacterias gram-negativas (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp.) y bacterias gram-positivas (por ejemplo, Bacillus spp. tal como Bacillus subtilis).

[0282] La fitasa se puede obtener también de Citrobacter, Enterobacter o Peniophora.

[0283] En un aspecto, la fitasa se deriva de Buttiauxiella spp. tal como B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae y B. warmboldiae. En algunos aspectos, la fitasa es una fitasa divulgada en WO 2006/043178 o la solicitud de EE.UU. n.011/714,487.

[0284] En un aspecto preferido, la fitasa tiene al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 93%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31 de la solicitud de EE.UU. n.o 12/263,886.

[0285] Las fitasas disponibles comercialmente son NATUPHOS (BASF), RONOZYME P (Novozymes A/S), PHYZYME (Danisco A/S, Verenium) y FINASE (AB Enzymes). El método para determinar la actividad de fitasa microbiana y la definición de una unidad de fitasa se divulgan en Engelen et al., 1994, Journal of AOAC International 77: 760-764. La fitasa puede ser una fitasa salvaje, una variante activa o un fragmento activo de la misma.

Pululanasas

[0286] Las pululanasas (E.C. 3.2.1.41, pululano 6-glucano-hidrolasa), son enzimas desramificantes caracterizadas por su capacidad para hidrolizar los enlaces alfa-1,6-glicosídicos en, por ejemplo, amilopectina y pululano.

[0287] La pululanasa puede ser una pululanasa bacteriana, derivada preferiblemente de una cepa del género Bacillus, especialmente derivada de una cepa de Bacillus deramificans, Bacillus subtilis, Bacillus amyloderamificans o Bacillus acidopullulyticus.

[0288] Las pululanasas específicamente contempladas útiles según la presente invención incluyen las pululanasas de Bacillus deramificans divulgada como la SEQ ID NO: 4 en WO 01/151620 (por la presente incorporada por referencia), así como las pululanasas de Bacillus deramificans divulgadas como las secuencias 2, 4 y 6 de WO 2008/024372 (por la presente incorporadas por referencia).

[0289] Las pululanasas específicamente contempladas útiles según la presente invención incluyen las pululanasas de Bacillus amyloderamificans divulgadas en la patente de EE.UU. n.o 4,560,651 (por la presente incorporada por referencia), la pululanasa divulgada como la SEQ ID NO: 2 en WO 01/151620 (por la presente incorporada por referencia) y la pululanasa de Bacillus acidopullulyticus divulgada como la SEQ ID NO: 6 en WO 01/151620 (por la presente incorporada por referencia) y también descrita en FEMS Mic. Let. (1994) 115, 97-106.

Otras pululanasas específicamente contempladas son las divulgadas en WO2015/110473, en particular la variante de pululanasa divulgada como la SEQ ID NO: 21 en WO2015/110473 (incluida en la presente como la SEQ ID NO: 5), donde se mantienen las sustituciones 368G+393A+492S,A. Así, en este aspecto, la pululanasa se selecciona de la SEQ ID NO: 5 o una pululanasa con al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% o el 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 5, y que comprende las sustituciones N368G+N393A+A492S,A, usando la SEQ ID NO: 5 para la numeración.

[0290] La pululanasa puede añadirse según la invención en una cantidad eficaz que incluye el rango preferido de entre 1-100 pg por g SS, especialmente de 10-60 pg por g SS. La actividad de pululanasa se puede determinar como NPUN. Un ensayo para la determinación de NPUN se describe en la sección "materiales y métodos" a continuación.

[0291] En un aspecto preferido, la pululanasa se usa en una cantidad de entre 1-100 pg de proteína enzimática por g SS, preferiblemente entre 10-60 pg de proteína enzimática por g SS.

[0292] Los productos de pululanasa disponibles comercialmente adecuados incluyen PROMOZYME D, PROMOZYME™ D2 (Novozymes A/S, Dinamarca), OPTIMAX L-1000, OPTIMAX L-300 (DuPont Industrial Biosciences) y AMANO 8 (Amano, Japón).

Proteasas

[0293] Se puede añadir una proteasa durante la sacarificación, la fermentación, la sacarificación y fermentación simultáneas. La proteasa puede ser cualquier proteasa. En un aspecto preferido, la proteasa es una proteasa ácida de origen microbiano, preferiblemente de origen fúngico o bacteriano. Se prefiere una proteasa fúngica ácida, pero también se pueden usar otras proteasas.

[0294] Las proteasas adecuadas incluyen proteasas microbianas, tales como proteasas fúngicas y bacterianas. Las proteasas preferidas son las proteasas ácidas, es decir, proteasas caracterizadas por la capacidad para hidrolizar proteínas bajo condiciones ácidas por debajo de pH 7.

[0295] En un aspecto preferido, la proteasa se deriva de una cepa de la bacteria Pyrococcus, tal como una cepa de Pyrococcus furiosus (proteasa pfu). Particularmente, la proteasa es la mostrada como la SEQ ID NO: 1 en la patente de EE.UU. n.06,358,726-B1. En otro aspecto, la proteasa es la mostrada como la SEQ ID NO: 13 en WO2012/088303.

[0296] La proteasa fúngica ácida se puede derivar de Aspergillus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sclerotium y Torulopsis. En particular, la proteasa se puede derivar de Aspergillus aculeatus (WO 95/02044), Aspergillus awamori (Hayashida et al., 1977, Agric. Biol. Chem. 42(5), 927-933), Aspergillus niger (véase, por ejemplo, Koaze et al., 1964, Agr. Biol. Chem. Japan 28: 216), Aspergillus saitoi (véase, por ejemplo, Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soc. Japan 28: 66) o Aspergillus oryzae, como la proteasa pepA; y proteasas ácidas de Mucor miehei o Mucor pusillus.

[0297] La proteasa puede ser una proteasa neutra o alcalina, tal como una proteasa derivada de una cepa de Bacillus. Una proteasa particular se deriva de Bacillus amyloliquefaciens y tiene la secuencia obtenible en la base de datos de Swissprot, n.o de acceso P06832. Las proteasas pueden tener al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos divulgada en la base de datos de Swissprot, n.o de acceso P06832, tal como al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o particularmente al menos un 99% de identidad.

[0298] La proteasa puede tener al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos divulgada como la SEQ ID n O: 1 en WO 2003/048353 tal como al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o particularmente al menos un 99% de identidad.

[0299] La proteasa puede ser una proteasa de tipo papaína seleccionada del grupo que consiste en las proteasas incluidas en EC 3.4.22.* (proteasa de cisteína), tal como EC 3.4.22.2 (papaína), EC 3.4.22.6 (quimopapaína), EC 3.4.22.7 (asclepaína), EC 3.4.22.14 (actinidaína), EC 3.4.22.15 (catepsina L), EC 3.4.22.25 (glicil endopeptidasa) y EC 3.4.22.30 (caricaína).

[0300] En un aspecto, la proteasa es una preparación de proteasa derivada de una cepa de Aspergi''us, tal como Aspergillus oryzae. En otro aspecto, la proteasa se deriva de una cepa de Rhizomucor, preferiblemente Rhizomucor miehei. En otro aspecto, la proteasa es una preparación de proteasa, preferiblemente una mezcla de una preparación proteolítica derivada de una cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, y una proteasa derivada de una cepa de Rhizomucor, preferiblemente Rhizomucor miehei.

[0301] Se describen proteasas de ácido aspártico en, por ejemplo, Handbook of Proteolytic Enzymes, editado por A.J. Barrett, N.D. Rawlings y J.F. Woessner, Academic Press, San Diego, 1998, capítulo 270. Los ejemplos de proteasas de ácido aspártico incluyen, por ejemplo, las descritas en Berka et al., 1990, Gene 96: 313; Berka et al., 1993, Gene 125: 195-198; y Gomi et al., 1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1095-1100, que se incorporan por la presente por referencia.

[0302] La proteasa también puede ser una metaloproteasa, que se define como una proteasa seleccionada del grupo que consiste en:

(a) proteasas pertenecientes a EC 3.4.24 (metaloendopeptidasas); preferiblemente EC 3.4.24.39 (metaloproteinasas ácidas);

(b) metaloproteasas pertenecientes al grupo M del manual anterior;

(c) metaloproteasas todavía no asignadas a clanes (denominación: Clan MX) o pertenecientes a uno de los clanes MA, MB, MC, MD, ME, MF, MG, MH (como se define en las págs. 989-991 del manual anterior);

(d) otras familias de metaloproteasas (como se define en las págs. 1448-1452 del manual anterior);

(e) metaloproteasas con un motivo HEXXH;

(f) metaloproteasas con un motivo HEFT;

(g) metaloproteasas pertenecientes a o una de las familias M3, M26, M27, M32, M34, M35, M36, M41, M43 o M47 (como se define en las págs. 1448-1452 del manual anterior);

(h) metaloproteasas pertenecientes a la familia M28E; y

(i) metaloproteasas pertenecientes a la familia M35 (como se define en las págs. 1492-1495 del manual anterior).

[0303] En otros aspectos particulares, las metaloproteasas son hidrolasas donde el ataque nucleofílico sobre un enlace peptídico es mediado por una molécula de agua, que se activa por un catión metálico bivalente. Ejemplos de cationes bivalentes son zinc, cobalto o manganeso. El ion metálico se puede mantener en su lugar por ligandos aminoacídicos. El número de ligandos puede ser cinco, cuatro, tres, dos, uno o cero. En un aspecto particular, el número es dos o tres, preferiblemente tres.

[0304] No hay limitaciones en el origen de la metaloproteasa usada en un proceso de la invención. En un aspecto, la metaloproteasa se clasifica como EC 3.4.24, preferiblemente EC 3.4.24.39. En un aspecto, la metaloproteasa es una metaloproteasa estable en ácido, por ejemplo, una metaloproteasa estable en ácido fúngica, tal como una metaloproteasa derivada de una cepa del género Thermoascus, preferiblemente una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC n.00670 (clasificada como e C 3.4.24.39). En otro aspecto, la metaloproteasa se deriva de una cepa del género Aspergillus, preferiblemente una cepa de Aspergillus oryzae.

[0305] En un aspecto, la metaloproteasa tiene un grado de identidad de secuencia con los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 o preferiblemente los aminoácidos 1 a 177 (el polipéptido maduro) de la SEQ ID NO: 1 de WO 2010/008841 (una metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus) de al menos un 80%, al menos un 82%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 97%; y que tienen actividad de metaloproteasa. En aspectos particulares, la metaloproteasa consiste en una secuencia de aminoácidos con un grado de identidad con la SEQ ID NO: 1 como se ha mencionado anteriormente.

[0306] La metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus es un ejemplo preferido de una metaloproteasa adecuada para usar en un proceso de la invención. En un aspecto preferido, la proteasa es una variante de la metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus divulgada como la SEQ ID NO: 2 en w O 2003/048353 o los aminoácidos 1-177 de la SEQ ID NO: 2 en WO 2011/072191 con las mutaciones siguientes:

D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; o

A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0307] Otra metaloproteasa se deriva de Aspergillus oryzae y comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11 divulgada en WO 2003/048353, o los aminoácidos -23-353; -23-374; -23-397; 1-353; 1-374; 1-397; 177-353; 177-374; o 177-397 de la misma, y la SEQ ID NO: 10 divulgada en WO 2003/048353.

[0308] Otra metaloproteasa adecuada para usar en un proceso de la invención es la metaloproteasa de Aspergillus oryzae que comprende la SEQ ID NO: 5 de WO 2010/008841, o una metaloproteasa es un polipéptido aislado que tiene un grado de identidad con la SEQ ID NO: 5 de al menos aproximadamente un 80%, al menos un 82%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 97%; y que tiene actividad de metaloproteasa. En aspectos particulares, la metaloproteasa consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0309] En un aspecto particular, una metaloproteasa tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en cuarenta, treinta y cinco, treinta, veinticinco, veinte o en quince aminoácidos de los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 o 1 a 177 de las secuencias de aminoácidos de la metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus o Aspergillus oryzae.

[0310] En otro aspecto, una metaloproteasa tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en diez, o en nueve, o en ocho, o en siete, o en seis, o en cinco aminoácidos de los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 o 1 a 177 de las secuencias de aminoácidos de estas metaloproteasas, por ejemplo, en cuatro, en tres, en dos o en un aminoácido.

[0311] En aspectos particulares, la metaloproteasa a) comprende o b) consiste en

i) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 o 1 a 177 de la SEQ ID NO:1 de WO 2010/008841;

ii) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177­ 374 o 177-397 de la SEQ ID NO: 3 de WO 2010/008841;

iii) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 de WO 2010/008841; o

variantes alélicas, o fragmentos, de las secuencias de i), ii) y iii) que tienen actividad de proteasa.

[0312] Un fragmento de los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 o 1 a 177 de la SEQ ID NO: 1 de WO 2010/008841 o de los aminoácidos -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374 o 177-397 de la SEQ ID NO: 3 de WO 2010/008841; es un polipéptido que tiene deleciones de uno o más aminoácidos del extremo amino y/o carboxilo terminal de estas secuencias de aminoácidos. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 75 residuos de aminoácidos, o al menos 100 residuos de aminoácidos, o al menos 125 residuos de aminoácidos, o al menos 150 residuos de aminoácidos, o al menos 160 residuos de aminoácidos, o al menos 165 residuos de aminoácidos, o al menos 170 residuos de aminoácidos, o al menos 175 residuos de aminoácidos.

[0313] Los productos disponibles comercialmente incluyen ALCALASE®, ESPERASE™, FLAVOURZYME™, NEUTRASE®, NOVOZYM™ FM 2.0L e iZyme BA (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca) y GC106™ y SPEZYME™ FAN de DuPont Industrial Biosciences, EE.UU., y RENNILASE® de DSM.

[0314] La presente invención se describe además mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Materiales y métodos

[0315] Enzimas glucoamilasas de Trametes cingulate (Tc-AMG) divulgada en WO2006/069289, Gloeophyllum sepiarium (Gs-AMG) divulgada en WO2011/068803, Pycnoporus sanguineus (Ps-AMG) divulgada en WO2011/066576.

Ensayos de pululanasa

Ensayos de actividad de pululanasa (NPUN)

[0316] La actividad de endopululanasa en NPUN se mide con respecto a un patrón de pululanasa de Novozymes. Una unidad de pululanasa (NPUN) se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de glucosa por minuto bajo las condiciones estándar (rojo pululano al 0,7% (Megazyme), pH 5, 40°C, 20 minutos). La actividad se mide en NPUN/ml usando rojo pululano.

[0317] Se incuba 1 ml de muestra o patrón diluido a 40°C durante 2 minutos. Se añaden y se mezclan 0,5 ml de rojo pululano al 2%, 0,5 M de KCI, 50 mM de ácido cítrico, pH 5. Los tubos se incuban a 40°C durante 20 minutos y se detienen añadiendo 2,5 ml de etanol al 80%. Los tubos se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 10-60 minutos seguidos de una centrifugación durante 10 minutos a 4000 r.p.m. La DO de los sobrenadantes se mide entonces a 510 nm y la actividad se calcula usando una curva patrón.

Actividad de glucoamilasa

[0318] La actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades AGU.

Actividad de alucoamilasa (AGU)

[0319] La unidad de alucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar (37°C, pH 4,3, sustrato: maltosa 100 mM, tampón: acetato 0,1 M, tiempo de reacción: 6 minutos, como se expone en la incubación de alucoamilasa a continuación), enerando así lucosa.

[0320] El principio del análisis se describe mediante 3 pasos de reacción:

El paso 1 es una reacción con enzima:

La alucoamilasa (AMG), EC 3.2.1.3 (exo-alfa-1,4-alucan-alucohidrolasa), hidroliza maltosa para formar alfa-D-+lucosa. Tras la incubación, la reacción se detiene con NaOH.

Los pasos 2 y 3 resultan en una reacción de punto final:

El ATP fosforila la alucosa, en una reacción catalizada por hexoquinasa. La alucosa-6-fosfato deshidroaenasa oxida la alucosa-6-fosfato formada a 6-fosfoaluconato. En esta misma reacción, una cantidad equimolar de NADe se reduce a NADH, lo que resulta en un aumento en la absorbancia a 340 nm. Se puede usar un sistema autoanalizador tal como el Konelab 30 Analyzer (Thermo Fisher Scientific).

Ensayo de actividad de alucoamilasa (Kikkoman)

[0321] Códiao del producto: 60211

Principio del ensayo:

[0322]

glucoamilasa (B-glucosidasa

a-glucosidasa

G2-p-pNP ______________ ► G1-3-pNP ----------------- ► pNP

[0323] El sustrato, 4-nitrofenil-P-maltósido (G2-P-pNP), es degradado por la glucoamilasa o -glucosidasa a 4-nitrofenil-P-glucósido (G1-P-pNP). La P-glucosidasa de este kit degrada posteriormente el G1-P-pNP a 4-nitrofenol (pNP). La reacción se realiza a temperatura ambiente a un pH de aproximadamente 4. La reacción se detiene mediante la adición de carbonato de sodio, y, al mismo tiempo, la solución adquiere un pH alcalino para maximizar la absorbancia del pNP. La actividad de formación de glucosa se mide cuantificando el pNP a 400 nm.

1) La respuesta medida muestra la actividad de degradación del G2-P-pNP de la glucoamilasa y la -glucosidasa en la muestra. Se piensa que esto se debe a la actividad de formación de glucosa en la muestra.

2) La prueba se puede usar para el extracto de arroz koji sin diálisis.

3) Este ensayo no es afectado por la -amilasa en la muestra.

Componentes del kit

1) Mezclar la "solución de sustrato" y la "solución de enzima" del kit a 1:1.

2) Pipetear 10 pl de la muestra de variante de glucoamilasa purificada con aproximadamente 0,1 AGU/ml de actividad (o agua como blanco) y transferir a un pocillo de una placa de microtitulación. (duplicado)

3) Añadir 60 pl de la mezcla de sustrato y enzima al pocillo.

4) Incubar a una temperatura de 32°C durante 20 min.

5) Añadir 120 pl de la solución de parada al pocillo.

6) Leer la DO a 400 nm. # DO400 neta = DO400 (muestra) - DO400 (blanco)

1. Blanco: normalmente, la absorbancia del blanco es inferior a 0,200.

2. Especificidad: la respuesta no es afectada por la glucosa (hasta 100 g/l) o la -amilasa (725 U/ml).

3. Reproducibilidad: el CV de la absorbancia es menor a un 1% cuando la misma muestra se analiza 10 veces.

4. Rango lineal: la DO400 neta hasta 1,6 debería ser proporcional a la concentración de la enzima.

5. Estabilidad del color: la absorbancia no cambia durante 2h a 25°C.

Termoestabilidad

[0324] La termoestabilidad se determinó como la actividad residual tras el tratamiento térmico a 65°C durante 1 hora usando 0,2 AGU/ml de muestra. Se incubaron sesenta microlitros de las muestras diluidas a 65 °C durante 1 hora en placas de PCR. La actividad de AMG de la muestra tratada con calor se midió mediante el kit de ensayo de Kikkoman, y la actividad residual se calculó según la ecuación siguiente;

Termoestabilidad = Vht / Vdw

Vht; delta A400 de la variante de muestra tratada con calor del sustrato sin glucosa

Vdw; delta A400 de la Gt-AMG del sustrato sin glucosa

Inhibición de glucosa LIGM

[0325] La inhibición de glucosa se determinó como la proporción de las actividades de glucoamilasa (AMG) con y sin glucosa (30%). El kit de ensayo Kikkoman se usó para la determinación de la actividad de glucoamilasa. Los resultados se determinaron como el valor relativo en comparación con la glucoamilasa parental de SEQ ID NO: 2. Un valor más alto corresponde a menos inhibición.

[0326] Se añadieron diez microlitros de las muestras diluidas 3 veces a 190 microlitros de sustrato (solución de sustrato en el kit: solución enzimática en el kit: 40% glucosa o DW = 1:1:6) y la mezcla reactiva se incubó a 37°C. El tiempo de reacción dependió de los sustratos, 30 min para el sustrato sin glucosa y 2 h con glucosa. Entonces se mezclaron 80 microlitros de mezcla reactiva con 160 microlitros de Na2CO3 al 3% para detener la reacción y se midió la A400.

[0327] El valor de inhibición de glucosa se calculó según la ecuación siguiente;

Inhibición de glucosa = (Vg/Vdw) / (WTg/WTdw)/2*0,5*100

Vg; delta A400 de la variante del sustrato con glucosa

Vdw; delta A400 de la variante del sustrato sin glucosa

WTg; delta A400 de la Gt-AMG del sustrato con glucosa

Vdw; delta A400 de la Gt-AMG del sustrato sin glucosa

Actividad específica de qlucoamilasa (AE)

[0328] La actividad específica se determinó mediante un ensayo AGU determinada con el instrumento Konelab como se ha descrito anteriormente. La concentración de proteína se calculó por A280 y el coeficiente de extinción teórico de 1 mg/ml que se calcula teóricamente de la secuencia de la proteína.

[0329] La actividad específica se determinó a partir de la actividad AGU y la concentración de proteína.

Ensayo de actividad de formación de ¡somaltosa (Fl)

[0330] La actividad de formación de isomaltosa por AGU de glucoamilasa de glucosa al 30% p/v a pH 4,3, 37°C en 24 h se midió como sigue:

Las muestras de glucoamilasa se diluyeron a 0,4 AGU/ml con tampón con 100 mM de Na-acetato, TritonX-100 al 0,02%, pH 4,3. Se mezclaron cien microlitros de la muestra con 100 pl de solución de glucosa con glucosa al 60% p/v, 100 mM de NaOAc, pH 4,3 en un tubo de PCR de 0,2 ml. La muestra se incubó a 37°C durante 24 h. Tras la incubación, se tomaron los 100 pl y se mezclaron con los 200 pl de agua desionizada y 300 pl de 1 mg/ml de solución de xilosa como un patrón interno, y entonces se desionizaron añadiendo aproximadamente 50 mg de matriz de intercambio iónico (Amberlite, OREGANO, EE.UU.). Entonces se transfirieron 250 pl de la solución a un microtubo de 1,5 ml y se mezclaron con 500 pl de acetonitrilo, y entonces se filtraron a través de un filtro de 0,2 pm de membrana de nailon antes del análisis de HPLC. La isomaltosa formada se separó de otros oligosacáridos por HPLC equipando una columna SZ5532 (Shodex, Japón) con un gradiente de elución lineal (7 minutos; se empieza con acetonitrilo:agua al 70%:30%; se termina con acetonitrilo:agua al 60%:40%) y se cuantificó con un detector Corona CAD (Thermo, EE.UU.) como el área de pico relativa frente al patrón interno de xilosa. Como las muestras patrón, las soluciones de isomaltosa (Hayashibara, Japón) de concentraciones de 0,125 a 1 mg/ml se trataron de la misma manera. La actividad de formación de isomaltosa relativa por AGU frente a JGA098 (SEQ ID NO: 2) se mostró en las tablas 1 y 2.

Ensayo de actividad DE11 (DE11)

[0331] La actividad de glucoamilasa hacia la maltodextrina DE11 con SS al 30% a pH 4,3, 60°C se midió como sigue: Las muestras de glucoamilasa se diluyeron a 0,3 AGU/ml con solución de TritonX-100 al 0,02%. Se mezclaron cincuenta microlitros de muestra diluida con 500 pl de solución de maltodextrina al 33% tamponada con 50 mM de Na-acetato y se incubaron a 60°C durante 20 min. La reacción se detuvo añadiendo 200 pl de 1M de Tris-HCl, pH 9,0. Tras el enfriamiento hasta la temperatura ambiente, una alícuota de 50 pl de la muestra se diluyó 5 veces con agua desionizada y la glucosa producida en este periodo se cuantificó por el método GOD-POD (Clinica Chimica Acta, 1972, Vol. 37, págs. 538-540), por ejemplo, usando la solución del kit de prueba de glucosa C2 (Wako, Japón). La actividad de formación de glucosa relativa por AGU frente a JGA098 (SEQ ID NO: 2) se muestra en las tablas 1 y 2.

Manipulaciones de ADN

[0332] Todos los plásmidos se construyeron y propagaron en células de E. coli DH5 . Las endonucleasas de restricción para manipulaciones de ADN se pueden obtener de New England Biolabs, Inc. y se usan según las instrucciones. Infusion (Clontech) se usa para el ligamiento de los ADN. Se recuperan plásmidos amplificados con el kit Qiagen Plasmid. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realiza con la polimerasa de ADN Prime star Max (Takara). El kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) se usa para la purificación de fragmentos de ADN extraídos de geles de agarosa. Toda manipulación de ADN fue básicamente siguiendo las instrucciones del fabricante y Molecular cloning: a laboratory manual (2a ed.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York descritas en Sambrook, Fritsch EF, Maniatis T (1989).

Ejemplo 1: construcción de variantes según la invención

[0333] W02011/068803 divulga glucoamilasas aisladas del hongo Gloeophyllum. En particular de Gloeophyllum sepiarium (Gs-AMG) y Gloeophyllum trabeum (Gt-AMG). Una variante de glucoamilasa, JGA098, con las sustituciones S95P A121P y divulgada en la presente como la SEQ ID NO: 2 se usó como la glucoamilasa parental. Partiendo de JGA098 se introdujeron sustituciones adicionales por procedimientos estándar en la técnica y se construyeron las variantes resultantes mostradas en la tabla siguiente.

Ejemplo 2: variantes de glucoamilasa según la invención con una inhibición de glucosa (IG) reducida

[0334] Las variantes específicas construidas y mostradas en el ejemplo 1 se expresaron como se describe en W02011/068803. Después de la expresión, las muestras purificadas se caracterizaron según la termoestabilidad (T), la inhibición de glucosa (IG), la formación de isomaltosa (FI), la actividad específica (AE) y la actividad hacia DE11 (DE11) como se describe en la sección de ensayos anterior. Todas las variantes mostradas en la tabla 1 presentaron una inhibición de glucosa reducida en comparación con la glucoamilasa parental de SEQ ID NO: 2.

Tabla 1

Ejemplo 3: variantes de glucoamilasa según la invención con una actividad específica (AE) aumentada

[0335] Las variantes específicas construidas y mostradas en el ejemplo 1 se expresaron como se describe en W02011/068803. Después de la expresión, las muestras purificadas se caracterizaron según la termoestabilidad (T), la inhibición de glucosa (IG), la formación de isomaltosa (Fl), la actividad específica (AE) y la actividad hacia DE11 (DE11) como se describe en la sección de ensayos anterior. Todas las variantes mostradas en la tabla 2 presentaron una actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa parental de SEQ ID NO: 2.

Tabla 2

Ejemplo 3: aplicación de variantes de Gt-AMG en el proceso de SSF convencional para la producción de etanol

[0336] Todos los tratamientos se evaluaron mediante un ensayo pequeño de 5 g. De cada tratamiento se corrieron tres réplicas. Para el análisis se usó mosto de maíz licuado usando una composición enzimática experimental que incluye una alfa-amilasa, una glucoamilasa y una proteasa, donde la alfa-amilasa se puede seleccionar del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus:

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; o

1181*+G182*+N 193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; o I181*+G182*+N193F V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; o 1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando la SEQ ID NO: 3 divulgada en WO 99/19467 para la numeración);

la proteasa se puede seleccionar de la proteasa divulgada en la SEQ ID NO: 13 en WO2012/088303 o una variante de proteasa de la metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus divulgada en WO 2011/072191 con las mutaciones siguientes:

D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; o

A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

y la glucoamilasa se selecciona de una variante del Penicillium oxalicum descrito en WO 2013/036526.

[0337] El mosto se suplementó con 3 ppm de penicilina y 1000 ppm de urea. El pH de esta suspensión se ajustó a 5,0 con H2SO4 al 40%, y se midieron los sólidos totales del mosto como un 28,4%. Aproximadamente 5 g de esta suspensión se añadieron a un tubo de polipropileno de 15 ml. Los tubos se prepararon taladrando un agujero de 1/32 pulgadas y los tubos vacíos se pesaron entonces antes de añadir la suspensión de maíz. Los tubos se pesaron de nuevo después de añadir el mosto para determinar el peso exacto de mosto en cada tubo. Cada tubo se dosificó con la dosis real de enzima en función del peso exacto de suspensión de maíz en cada tubo. La dosis de enzima para cada tratamiento se enumeró en la tabla 3, y las variantes de la Gt-AMG de la invención evaluadas en este estudio se enumeraron en la tabla 4, y la Ps-AMG salvaje (una glucoamilasa de Pycnoporus sanguineus divulgada en WO2011/066576 como la SEQ ID NO: 4), Gs-AMG (una glucoamilasa de Gloeophyllum sepiarium divulgada en WO2011/068803 como la SEQ ID NO:

2) y Tc-AMG (una glucoamilasa de Trametes cingulata divulgada en WO2006/069289 como la SEQ ID NO: 2) se usaron como controles. Después, los tubos se dosificaron con 100 pl de propagado de levadura a alrededor de 5 g de mosto de maíz y luego se incubaron en un agitador de aire humidificado a 32°C para la SSF (sacarificación y fermentación simultáneas). Se tomaron muestras tras 53 horas de fermentación para el análisis de HPLC. La preparación de HPLC consistió en detener la reacción añadiendo 50 microlitros de H2SO4 al 40%, centrifugar y filtrar a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Las muestras se almacenaron a 4°C hasta el análisis. Se usó el sistema de HPLC Agilent™ 1100 acoplado con un detector RI para determinar la concentración de etanol y oligosacáridos. La columna de separación fue la columna de exclusión iónica aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) de BioRad™.

Tabla 3. Dosis de enzima para cada tratamiento

Tabla 4. Lista de variantes de Gt-AMG evaluadas en la SSF convencional. JGA098 representa la glucoamilasa parental usada en este estudio. Se divulga en la presente como la SEQ ID NO: 2.

Resultados:

[0338] Los resultados del análisis de HPLC se resumieron en la figura 1. La dosis de enzima en el eje x fue AGU/g SS, (SS = sólidos secos), que se convirtió a partir de una dosis de proteína enzimática de pg/g SS en la tabla 3 y la actividad específica de cada AMG (glucoamilasa). Los resultados mostraron que las variantes de Gt-AMG JGA245, JGA251, JGA255, JGA283, JGA287, JGA296 y jGa 310 todas superaron a las AMG salvajes del estudio.

Ejemplo 4: prueba de sacarificación de JGA287

[0339] Se disolvió polvo de maltodextrina de la licuefacción de almidón de maíz en agua mientras se calentaba para hacer una suspensión de almidón con un 35,6% de sólidos secos. El contenido sólido de la suspensión se midió utilizando la medición del índice de refracción, que indicó un 1,39503. La suspensión se ajustó a un pH de 4,3 usando una solución de ácido clorhídrico 1M. Se añadieron alícuotas de 18 gramos de esta suspensión a viales de vidrio de reacción de centelleo con cierres de tapa de tabique y se insertaron en un bloque de calentamiento para calentarse a una temperatura de 61°C. A cada vial se le proporcionó una dosis de enzima en base a la tabla siguiente y se añadió agua adicional a cada vial para alcanzar un contenido de sólidos secos deseado de un 33%. La sacarificación se realizó usando una glucoamilasa y una pululanasa. La pululanasa, Promozyme D2 (disponible de Novozymes A/S), se deriva de Bacillus deramificans y se describe en la presente como la SEQ ID NO: 3. Se cogieron muestras de 1,5 ml mediante agujas a través del tabique de cada vial en diferentes puntos de tiempo y se desactivaron a 105°C durante 5 minutos. Se diluyó 1 ml de cada muestra desactivada con 4 ml de agua desionizada. Las muestras diluidas se evaluaron usando un método de HPLC DP1-4 para medir la pureza de dextrosa (%DP1 o %DX) y %DP2.

[0340] La tabla 5 muestra el %DX y el %DP2 de jarabes tratados con dos AMG diferentes tras 72 horas de sacarificación. Se usaron la media y la desviación estándar de tres tratamientos. Los resultados muestran que a las dosis evaluadas tanto JGA98 como JGA287 muestran valores de %DX similares que no son estadísticamente significativamente diferentes. Sin embargo, los resultados de % DP2 muestran una DP2 estadísticamente significativamente 0,09% inferior generada cuando se usó JGA287.

Tabla 5

Ejemplo 5: prueba de sacarificación de JGA252

[0341] Se disolvió en agua polvo de maltodextrina de la licuefacción de almidón de maíz mientras se calentaba para hacer una suspensión de almidón con un 36,5% de sólidos secos. El contenido sólido de la suspensión se midió utilizando la medición del índice de refracción, que indicó un 1,39690. La suspensión se ajustó a un pH de 4,3 usando una solución de ácido clorhídrico 1M. Se añadieron alícuotas de 18 gramos de esta suspensión a viales de vidrio de reacción de centelleo con cierres de tapa de tabique y se insertaron en un bloque de calentamiento para calentarse a una temperatura de 61°C. A cada vial se le proporcionó una dosis de enzima en base a la tabla siguiente y se añadió agua adicional a cada vial para alcanzar un contenido de sólidos secos deseado de un 33%. Se cogieron muestras de 1,5 ml mediante agujas a través del tabique de cada vial en diferentes puntos de tiempo y se desactivaron a 105°C durante 5 minutos. Se diluyó 1 ml de cada muestra desactivada con 4 ml de agua desionizada. Las muestras diluidas se evaluaron usando un método de HPLC DP1-4 para medir la pureza de dextrosa (%DP1 o %DX) y %DP2.

[0342] La tabla 6 muestra el %DX y el %DP2 de jarabes tratados con dos AMG diferentes tras 72 horas de sacarificación.

Se usaron la media y la desviación estándar de tres tratamientos. Los resultados muestran que a las dosis evaluadas JGA252 muestra valores de %DX estadísticamente significativamente más altos que JGA98. Los resultados de % DP2 muestran una DP2 estadísticamente significativamente inferior generada cuando se usó JGA252.

Tabla 6

Ejemplo 6: prueba de sacarificación de JGA288

[0343] Se disolvió en agua polvo de maltodextrina de la licuefacción de almidón de maíz mientras se calentaba para hacer una suspensión de almidón con un 39,7% de sólidos secos. El contenido sólido de la suspensión se midió utilizando la medición del índice de refracción, que indicó un 1,4035. La suspensión se ajustó a un pH de 4,3 usando una solución de ácido clorhídrico 1M. Se añadieron alícuotas de 18 gramos de esta suspensión a viales de vidrio de reacción de centelleo con cierres de tapa de tabique y se insertaron en un bloque de calentamiento para calentarse a una temperatura de 61°C. A cada vial se le proporcionó una dosis de enzima en base a la tabla siguiente y se añadió agua adicional a cada vial para alcanzar un contenido de sólidos secos deseado de un 33%. Se cogieron muestras de 1,5 ml mediante agujas a través del tabique de cada vial en diferentes puntos de tiempo y se desactivaron a 105°C durante 5 minutos. Se diluyó 1 ml de cada muestra desactivada con 4 ml de agua desionizada. Las muestras diluidas se evaluaron usando un método de HPLC DP1-4 para medir la pureza de dextrosa (%DP1 o %DX).

[0344] La tabla 7 muestra el %DX de jarabes tratados con dos AMG diferentes durante la sacarificación. Media obtenida de tres tratamientos. Los resultados muestran que JGA288 muestra un tiempo de reacción más rápido que JGA98, por lo tanto, alcanza el objetivo de pureza de dextrosa para la sacarificación en un tiempo más corto.

Tabla 7

Ejemplo 7: prueba de sacarificación de JGA334

[0345] Se disolvió en agua polvo de maltodextrina de la licuefacción de almidón de maíz mientras se calentaba para hacer una suspensión de almidón con un 36,5% de sólidos secos. El contenido sólido de la suspensión se midió utilizando la medición del índice de refracción, que indicó un 1,39999. La suspensión se ajustó a un pH de 4,3 usando una solución de ácido clorhídrico 1M. Se añadieron alícuotas de 50 gramos de esta suspensión a viales de vidrio de reacción con cierres de tapa de tabique y se insertaron en un baño maría para calentarse a una temperatura de 61°C. A cada vial se le proporcionó una dosis de enzima en base a la tabla siguiente y se añadió agua adicional a cada vial para alcanzar un contenido de sólidos secos deseado de un 33%. Se cogieron muestras de 1,5 ml mediante agujas a través del tabique de cada vial en diferentes puntos de tiempo y se desactivaron a 105°C durante 10 minutos. Se diluyó 1 ml de cada muestra desactivada con 4 ml de agua desionizada. Las muestras diluidas se evaluaron usando un método de HPLC DP1-4 para medir la pureza de dextrosa (%DP1 o %DX).

[0346] La tabla 8 muestra el %DX de jarabes tratados con dos AMG (glucoamilasas) diferentes tras 60 horas de sacarificación. Se usaron la media y la desviación estándar de dos réplicas. Los resultados muestran que JGA334 muestra un tiempo de reacción más rápido que JGA98, por lo tanto, alcanza el objetivo de pureza de dextrosa para la sacarificación en un tiempo más corto. También a las dosis evaluadas, JGA334 muestra valores de %DX más altos que son estadísticamente diferentes a los de JGA98.

Tabla 8

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Variante de glucoamilasa que comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 295 del polipéptido de SEQ ID NO: 2, donde la variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones:

295W;

295W+ 410K;

2241 295F;

224T 295W 318V;

295F;

224A 295F;

295W 83D 410K;

163A 295W 410K;

163W 295W 410K;

303N 295W;

1691 295W; o

32V 219R 295W;

donde la variante tiene actividad de glucoamilasa y donde la variante tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una inhibición de glucosa reducida en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 2.

2. Variante según la reivindicación 1, donde el aminoácido en la posición 95 y 121 es una prolina.

3. Composición que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. Composición según la reivindicación 3, que comprende además una pululanasa.

5. Composición según la reivindicación 2 o 3, que comprende además una alfa-amilasa, particularmente una alfaamilasa fúngica, más particularmente una alfa-amilasa derivada de Rhizomucorpusillus o Aspergillus terreus, aún más particularmente una alfa-amilasa seleccionada de la alfa-amilasa divulgada como la SEQ ID NO: 4, preferiblemente con una o más de las siguientes sustituciones: G128D, D143N, preferiblemente G128D+D143N (usando la SEQ ID NO: 4 para la numeración), y donde la variante de alfa-amilasa tiene al menos un 75% de identidad, preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 91%, más preferiblemente al menos un 92%, aún más preferiblemente al menos un 93%, más preferiblemente al menos un 94%, e incluso más preferiblemente al menos un 95%, tal como incluso al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 4.

6. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la producción de un jarabe y/o un producto de fermentación.

7. Proceso de producción de un producto de fermentación, particularmente etanol, a partir de material que contiene almidón que incluye los pasos de: (a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa-amilasa; (b) sacarificar el material licuado; y (c) fermentar con un organismo fermentador; donde el paso (b) se realiza usando al menos una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

8. Proceso según la reivindicación 7, donde el paso (b) y el paso (c) se realizan simultáneamente.

9. Proceso de producción de un producto de jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende el paso de: (a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa-amilasa; (b) sacarificar el material licuado en presencia de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

10. Polinucleótido aislado que codifica la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

11. Construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido según la reivindicación 10.

12. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 10.

13. Célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación 10.

14. Célula huésped según la reivindicación 13, donde la célula huésped es una célula de levadura, particularmente una Saccharomyces sp., más particularmente Saccharomyces cerevisiae.

15. Método de producción de una variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende:

el cultivo de la célula huésped según las reivindicaciones 13-14 bajo condiciones adecuadas para la expresión de la variante;

y opcionalmente la recuperación de la variante de glucoamilasa.

16. Proceso según la reivindicación 7-8, donde la variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1­ 2 se expresa a partir del organismo termentador, preferiblemente un organismo termentador de levadura, más preferiblemente Saccharomyces cerevisiae.