CN118176296A - 重组酵母细胞 - Google Patents

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Abstract

公开了一种重组酵母细胞，其包含编码蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

Description

重组酵母细胞
技术领域
本发明涉及一种具有生产乙醇的能力的重组酵母细胞以及一种用于生产乙醇的方法，其中使用了所述酵母细胞。
背景技术
将从可再生碳水化合物原料进行微生物发酵的方法应用于广泛且迅速扩大范围的化合物的工业生产。按体积计，由酿酒酵母生产乙醇是目前工业生物技术中最大的单一发酵方法。已经提出了多种方法以通过基因修饰来改善工业生物技术中使用的生物体的发酵性质。
在文献中已经报道了用于从含淀粉的材料生产乙醇的几种不同的方法。
传统上应用多步骤方法，该方法包括酶水解和基于酵母的发酵两者。作为第一步，可以将淀粉酶和葡糖淀粉酶添加到含淀粉的培养基中以产生葡萄糖。葡萄糖可以在基于酵母的发酵中转化为乙醇。例如，US 2017/0306310描述了一种从含淀粉的材料生产发酵产物(特别是乙醇)的方法，其包括以下步骤：(a)在α淀粉酶存在下使含淀粉的材料液化；(b)使液化的材料糖化；以及(c)用发酵生物进行发酵；其中步骤(b)使用至少变体葡糖淀粉酶进行。US10227613描述了一种用于从含淀粉的材料生产发酵产物的方法，其包括以下步骤：i)在蛋白酶存在下使用α-淀粉酶使含淀粉的材料液化；ii)使用碳水化合物源生成酶使液化的含淀粉的材料糖化；以及iii)使用发酵生物进行发酵，其中在发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加包含选自由内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽组成的组的两种或更多种酶的纤维素分解组合物。
替代性地，酵母可以用葡糖淀粉酶基因转化。例如，WO 2020/043497描述了一种用于生产乙醇的方法，其包括在重组酵母存在下在厌氧条件下发酵玉米浆料；以及回收乙醇，其中所述重组酵母功能性地表达编码某种葡糖淀粉酶的异源核酸序列，其中该方法包括以0.05g/L或更低的浓度加入葡糖淀粉酶。
尽管使用上述方法获得了良好的结果，但期望另外的改善。
淀粉包含直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉由α-1-4连接的葡萄糖的线性链组成，而支链淀粉是葡萄糖残基通过α-1,4连接或α-1,6连接来连接的葡萄糖聚合物。葡糖淀粉酶可有效水解α-1,4连接，但传统上葡糖淀粉酶难以或根本不能水解α-1,6连接，从而导致包含这样的α-1,6连接的寡糖不可发酵。
WO 2006/069289 A2描述了一种特定的瓣环栓菌(Trametes cingulata)葡糖淀粉酶，其据称具有比其他葡糖淀粉酶(如罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)、黑曲霉(Aspergillus niger)和埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)葡糖淀粉酶)高4-7倍的α-1,6-去支化活性。提到可以将所要求保护的多核苷酸插入宿主细胞中。
Jonathan等人在他们发表在Carbohydrate Polymers[碳水化合物聚合物]第132卷(2015),第59-66页的题为“Characterization of branched gluco-oligosaccharidesto study the mode-of-action of a glucoamylase from Hypocrea jecorina[表征支链葡糖寡糖以研究来自红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的葡糖淀粉酶的作用模式]”的文章中描述了来自红褐肉座菌(里氏木霉(Trichoderma reesei))的葡糖淀粉酶，其以比切割线性寡糖中的α-1,4-键的速率更低的速率切割与α-1,6-键相邻的α-1,4-键，但认为其对α-1,6-键的活性比其他葡糖淀粉酶更高。
提供产生糖释放活性增加的酶的酵母在本领域中将是一种进步。这样的改善的酵母可以有利地导致发酵结束时总糖含量降低和/或可以有利地允许在发酵期间减少或甚至避免加入葡糖淀粉酶。
发明内容
诸位发明人现在已经发现适用于在酵母中表达的新的蛋白质，其有利地允许在发酵结束时降低总糖含量，并且可以有利地允许在发酵期间减少或甚至避免加入葡糖淀粉酶。
因此，本发明提供一种重组酵母细胞，其包含编码具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
本发明进一步提供一种优选纯化和/或分离的蛋白质，其包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
另外，本发明提供一种套装盒，其包含：
-第一重组酵母细胞，其包含编码第一蛋白质的第一核苷酸序列，该第一蛋白质包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及
-第二重组酵母细胞，其包含编码具有1,4-水解葡糖淀粉酶活性的第二蛋白质的第二核苷酸序列，其中优选地该第二蛋白质包含或具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列或与SEQ ID NO:03的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
此外，本发明提供上述重组酵母、上述蛋白质或上述套装盒在生产乙醇的方法中的用途。
最后，本发明提供一种用于生产乙醇的方法，其包括使用上述蛋白质、上述套装盒或如上所述的重组酵母细胞转化碳源(优选碳水化合物)。
使用上述重组酵母细胞、蛋白质、套装盒和/或方法可以有利地导致发酵结束时总糖含量的降低。其还可以有利地允许在发酵期间减少或甚至避免加入葡糖淀粉酶。
也就是说，使用根据本发明的重组酵母细胞有利地能够在将向该方法中加入的非原位产生的或其他外部的葡糖淀粉酶减少10％至100％时，仍然允许在发酵结束时具有相同的总残余糖含量。在替代性方案中或另外，使用根据本发明的重组酵母细胞允许在添加相同少量(或甚至不添加)外部葡糖淀粉酶时，在发酵结束时具有较低的残余糖含量。
序列表说明
本申请含有呈计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。下表1提供了概述。
表1：序列表的概述：
定义
除非另有定义或由上下文清楚地指示，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
在整个本说明书和所附权利要求中，词语“包含(comprise)”和“包括(include)”以及变体诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”应被包含性地解释。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词语旨在表达可能包含未具体列举的其他要素或整数。
冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”在本文中用于指代一个/一种(one)或多于一个/多于一种(more than one)(即，一个/一种(one)或至少一个/至少一种(at leastone))该冠词的语法宾语。举例来说，“一个要素/一种要素(an element)”可以意指一个要素/一种要素(one element)或多于一个要素/多于一种要素(more than one element)。当以单数形式提及名词(例如，化合物、添加剂等)时，意在包括复数形式。因此，当提及特定部分(例如，“基因”)时，除非另有规定，否则这意指该基因中的“至少一个”，例如“至少一个基因”。
当提及存在几种异构体(例如，D和L对映异构体)的化合物时，该化合物原则上包括可以在本发明的特定方面中使用的该化合物的所有对映异构体、非对映异构体和顺式/反式异构体；特别是当提及这种化合物时，它包括一种或多种天然异构体。
除非另有明确指示，否则本文所述的本发明的各种实施例可以交叉组合。
术语“碳源”是指碳的来源，优选包含碳的化合物或分子。优选地，碳源是碳水化合物。在本文中将碳水化合物理解为由碳、氧和氢组成的有机化合物。适当地，碳源可以选自由单糖、二糖和/或多糖、酸和酸式盐组成的组。
术语“发酵(ferment)”及其变体诸如“发酵(fermenting)”、“发酵(fermentation)”和/或“发酵(fermentative)”在本文中以经典意义使用，即表明过程在厌氧条件下进行或已经在厌氧条件下进行。在本文中将厌氧发酵定义为在厌氧条件下进行的发酵。在本文中将厌氧条件定义为没有任何氧气或酵母细胞基本上不消耗氧气的条件。基本上不消耗氧气的条件适当地对应于耗氧量小于5mmol/l.h-1，特别是耗氧量小于2.5mmol/l.h-1或小于1mmol/l.h-1。更优选地，消耗0mmol/L/h(即，耗氧量是不可检测的)。这适当地对应于培养液中的溶解氧浓度小于空气饱和度的5％，更适当地溶解氧浓度小于空气饱和度的1％或小于空气饱和度的0.2％。
术语“发酵方法”是指用于制备或生产发酵产物的方法。
术语“细胞”是指真核生物体或原核生物体，优选作为单细胞存在。在本发明中，细胞是重组酵母细胞。也就是说，重组细胞选自由酵母组成的属的组。
术语“酵母”和“酵母细胞”在本文中可互换地使用，并且是指一组在系统发育上多样化的单细胞真菌，其中的大部分属于子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。芽殖酵母(“真酵母”)被分类在酵母目(Saccharomycetales)中。根据本发明的酵母细胞优选地是衍生自酵母属(Saccharomyces)的酵母细胞。更优选地，酵母细胞是酿酒酵母种的酵母细胞。
如本文所用，术语“重组”(例如，提及“重组酵母”、“重组细胞”、“重组微生物”和/或“重组菌株”)分别是指含有作为一种或多种基因修饰的结果的核酸的酵母、细胞、微生物或菌株。简单地说，酵母、细胞、微生物或菌株含有来自其一个或多个亲本(其中的任一个)的核酸的不同组合。为了构建重组酵母、细胞、微生物或菌株，可以使用一种或多种重组DNA技术和/或另外一种或多种诱变技术。例如，重组酵母和/或重组酵母细胞可以包含不存在于对应野生型酵母和/或细胞中的核酸，已经使用重组DNA技术将该核酸引入该酵母和/或酵母细胞中(即，转基因酵母和/或细胞)，或者不存在于所述野生型酵母和/或细胞中的该核酸是存在于所述野生型酵母和/或酵母细胞中的核酸序列(诸如编码野生型多肽的基因)中的一种或多种突变(例如，使用重组DNA技术或另一种诱变技术诸如UV辐照)的结果，或者其中基因的核酸序列已经被修饰以将多肽产物(编码它)靶向至另一个细胞区室。此外，术语“重组”可以适当地涉及例如已经使用重组DNA技术从其中除去核酸序列的酵母、细胞、微生物或菌株。
在本文中将包含或具有某种活性的重组酵母理解为重组酵母可以包含编码具有这种活性的蛋白质的一个或多个核酸序列。因此，允许重组酵母功能性地表达这种蛋白质或酶。
术语“功能性地表达”意指存在相关核酸序列的功能性转录，允许核酸序列实际上被转录，例如导致蛋白质的合成。
如本文所用，术语“转基因”(例如，提及“转基因酵母”和/或“转基因细胞”)分别是指这样的酵母和/或细胞，其含有非天然存在于该酵母和/或细胞中并且已经使用例如重组DNA技术被引入该酵母和/或细胞中的核酸，诸如重组酵母和/或细胞。
如本文关于蛋白质或多肽所用的术语“突变”意指，与野生型或天然存在的蛋白质或多肽序列相比，至少一个氨基酸已经被不同的氨基酸替代、插入氨基酸序列中或从氨基酸序列中缺失。氨基酸的替代、插入或缺失可以例如经由编码这些氨基酸的核酸的诱变来实现。诱变是本领域熟知的方法，并且包括例如通过PCR的手段或经由寡核苷酸介导的诱变的定点诱变，如以下文献中所述：Sambrook等人,Molecular Cloning-ALaboratory Manual[分子克隆-实验室手册],第2版,第1-3卷(1989),由Cold Spring Harbor Publishing[冷泉港出版公司]出版)。
如本文关于基因所用的术语“突变”意指，与野生型或天然存在的核酸序列相比，基因或其调控序列的核酸序列中的至少一个核苷酸已经被不同的核苷酸替代、插入核酸序列中或从核酸序列中缺失。氨基酸的替代、插入或缺失可以例如经由诱变来实现，导致例如具有定性或定量改变的功能的蛋白质序列的转录或该基因的敲除。在本发明的上下文中，“改变基因”具有与突变基因相同的含义。
如本文所用，术语“基因(gen)”或“基因(gene)”是指可以被转录成然后被翻译成蛋白质的mRNA的核酸序列。编码某种蛋白质的基因是指编码这种蛋白质的一个或多个核酸序列。
如本文所用，术语“核酸”或“核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物(即，多核苷酸)中的单体单元，并且除非另有限制，否则涵盖具有天然核苷酸的本质属性的已知类似物，因为它们以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如，肽核酸)。例如，由编码酶的核苷酸序列定义的某种酶包括(除非另有限制)与编码酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列。多核苷酸可以是天然或异源结构或调控基因的全长或子序列。除非另有指示，否则该术语包括对指定序列以及其互补序列的提及。因此，具有出于稳定性或其他原因而修饰的骨架的DNA或RNA是如本文所预期的术语“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(诸如肌苷)或修饰的碱基(诸如三苯甲基化碱基)(仅举两个实例)的DNA或RNA是如本文所用的术语多核苷酸。将理解，已经对DNA和RNA进行了多种多样的修饰，其用于本领域技术人员已知的许多有用目的。如本文所用的术语多核苷酸包括多核苷酸的这样的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(尤其包括简单和复杂细胞)所特有的DNA和RNA的化学形式。
术语“核苷酸序列”和“核酸序列”在本文中可互换地使用。核酸序列的一个实例是DNA序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代例如由氨基酸序列所展示的氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的这样的类似物的本质属性是，当被掺入蛋白质中时，该蛋白质对由相同但完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质引发的抗体具有特异性反应性。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。
术语“酶”在本文中是指具有催化功能的蛋白质。在蛋白质催化某种生物反应的情况下，术语“蛋白质”和“酶”在本文中可以可互换地使用。当参考酶类(EC)提及酶时，酶类是这样的类别，其中酶根据国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会(the NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology，NC-IUBMB)提供的酶命名法被分类或可以被分类，该命名法可以在http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/找到。意在包括还未(尚未)被分类在指定类别中但可以如此分类的其他合适的酶。
如果在本文中通过参考登录号提及蛋白质或核酸序列(诸如基因)，除非另有规定，否则该编号特别用于指代具有可以经由www.ncbi.nlm.nih.gov/(2020年10月1日可获得)找到的序列的蛋白质或核酸序列(基因)。
在本文中编码多肽的每个核酸序列都还包括其任何保守修饰的变体。通过参考遗传密码，这包括，它描述了核酸的每种可能的沉默变异。术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定核酸序列，保守修饰的变体是指由于遗传密码的简并性而编码相同氨基酸序列或保守修饰的氨基酸序列变体的那些核酸。术语“遗传密码的简并性”是指大量在功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质的事实。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置处，密码子可以被改变为任何所描述的对应密码子而不改变编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，并且代表一种保守修饰的变异。
如本文所用，术语具有特定序列(例如，“SEQ ID NO:X”)的多肽和/或氨基酸序列的“功能性同源物”(或简称“同源物”)是指包含所述特定序列的多肽和/或氨基酸序列，条件是一个或多个氨基酸被突变、取代、缺失、添加和/或插入，并且该多肽具有(定性地)相同的用于底物转化的酶功能。
如本文所用，术语具有特定序列(例如，“SEQ ID NO:X”)的多核苷酸和/或核酸序列的“功能性同源物”(或简称“同源物”)是指包含所述特定序列的多核苷酸和/或核酸序列，条件是一个或多个核酸被突变、取代、缺失、添加和/或插入，并且该多核苷酸编码具有(定性地)相同的用于底物转化的酶功能的多肽序列。关于核酸序列，术语功能性同源物意在包括由于遗传密码的简并性而与另一个核酸序列不同并且编码相同多肽序列的核酸序列。
在本文中将序列同一性定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定。通常，在所比较的序列的整个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”还意指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过这样的序列的串之间的匹配所确定。
当展现出一定水平的相似性时，氨基酸或核苷酸序列被说成是同源的。两个序列是同源的表明有共同的进化起源。两个同源序列是密切相关还是更远距离相关由“同一性百分比”或“相似性百分比”指示，其分别为高或低。尽管有争议，但为了指示“同一性百分比”或“相似性百分比”，“同源性水平”或“同源性百分比”经常可互换地使用。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。技术人员将意识到几种不同的计算机程序可用于比对两个序列并确定两个序列之间的同源性的事实(Kruskal等人,"An overview of sequence comparison:Time warps,string edits,andmacromolecules",[“序列比较的概述：时间扭曲、串编辑与大分子”],(1983),Society forIndustrial and Applied Mathematics(SIAM)[工业与应用数学学会(SIAM)],第25卷,第2期,第201-237页以及由D.Sankoff和J.B.Kruskal(编辑)编辑的手册,“Time warps,stringedits and macromolecules:the theory and practice of sequence comparison”,[“时间扭曲、串编辑与大分子：序列比较的理论与实践”],(1983),第1-44页,由Addison-WesleyPublishing Company,Massachusetts USA[美国马萨诸塞州的艾迪生-韦斯利出版公司]出版)。
可以使用尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)算法对两个序列进行比对来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。(Needleman等人“A General Method Applicable tothe Search for Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins”[“一种适用于寻找两种蛋白质的氨基酸序列的相似性的通用方法”](1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]第48卷,第443-453页)。该算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。尼德曼-翁施算法已经在计算机程序NEEDLE中实施。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(2.8.0版本或更高版本，参见Rice等人,"EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite"[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],(2000),Trends in Genetics[遗传学趋势]第16卷,(6)第276—277页,http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62作为取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。可以指定其他矩阵。用于氨基酸序列比对的任选的参数是空位开放罚分为10且空位扩展罚分为0.5。技术人员将理解，所有这些不同的参数都将产生稍微不同的结果，但是当使用不同的算法时，两个序列的总体同一性百分比没有显著改变。
同源性或同一性是两个完整序列之间在包括任何空位或扩展的总比对区域上相同匹配的百分比。如下计算两个比对序列之间的同源性或同一性：在比对中在两个序列中显示相同氨基酸的对应位置的数目除以包括空位的比对的总长度。如本文所定义的同一性可以从NEEDLE获得，并且在程序的输出中被标记为“同一性(IDENTITY)”。
如下计算两个比对序列之间的同源性或同一性：在比对中在两个序列中显示相同氨基酸的对应位置的数目除以在减去比对中的空位的总数后比对的总长度。如本文所定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序的输出中被标记为“最长同一性(longest-identity)”。
也可以将本文公开的核苷酸或氨基酸序列的变体定义为与本文具体公开的核苷酸或氨基酸序列(例如，在序列表中)相比具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失的核苷酸或氨基酸序列。
任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，这对于技术人员将是清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。在实施例中，保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是所公开的序列中的至少一个残基已经被除去并且不同的残基插入其位置的变体。优选地，氨基酸变化是保守的。在实施例中，每种天然存在的氨基酸的保守取代如下：Ala至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或His；Asp至Glu；Cys至Ser或Ala；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Pro；His至Asn或Gln；Ile至Leu或Val；Leu至Ile或Val；Lys至Arg；Gln或Glu；Met至Leu或Ile；Phe至Met、Leu或Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp或Phe；以及Val至Ile或Leu。
本发明的核苷酸序列还可以由它们在中等杂交条件下或优选地在严格杂交条件下分别与本文公开的特定核苷酸序列的部分杂交的能力来定义。在本文中将严格杂交条件定义为这样的条件，其允许至少约25个核苷酸，优选约50个、75个或100个核苷酸，最优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约65℃的温度下在包含约1M盐的溶液(优选6xSSC或具有相当的离子强度的任何其他溶液)中杂交，并且在65℃下在包含约0.1M或更少的盐的溶液(优选0.2x SSC或具有相当的离子强度的任何其他溶液)中洗涤。优选地，杂交进行过夜，即至少10小时；并且优选地，洗涤进行至少一小时，其中洗涤溶液至少更换两次。这些条件通常将允许具有约90％或更高序列同一性的序列的特异性杂交。在本文中将中等条件定义为这样的条件，其允许至少50个核苷酸、优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约45℃的温度下在包含约1M盐的溶液(优选6x SSC或具有相当的离子强度的任何其他溶液)中杂交，并且在室温下在包含约1M盐的溶液(优选6x SSC或具有相当的离子强度的任何其他溶液)中洗涤。优选地，杂交进行过夜，即至少10小时；并且优选地，洗涤进行至少一小时，其中洗涤溶液至少更换两次。这些条件通常将允许具有高达50％序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员将能够修改这些杂交条件，以便特异性地鉴定同一性在50％与90％之间变化的序列。
“表达”是指基因转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或信使RNA(mRNA)，随后翻译成蛋白质。
“过表达”是指重组细胞对基因(对应地核酸序列)的表达超过其在对应野生型细胞中的表达。这种过表达可以例如通过以下方式安排：增加一个或多个核酸序列的转录频率，例如通过将核酸序列可操作地连接到在重组细胞内有功能的启动子；和/或通过增加某个核酸序列的拷贝数。
术语“上调(upregulate)”、“上调(upregulated)”和“上调(upregulation)”是指细胞增加细胞组分(诸如RNA或蛋白质)的量的过程。这种上调可以响应于基因修饰或由基因修饰引起。
在本文中将术语“途径”或“代谢途径”理解为细胞中构建和分解分子的一系列化学反应。
核酸序列(即，多核苷酸)或蛋白质(即，多肽)对于宿主细胞的基因组可以是天然的或异源的。
关于宿主细胞的“天然”、“同源”或“内源”意指核酸序列确实天然存在于宿主细胞的基因组中，或者蛋白质由该细胞天然产生。术语“天然”、“同源”和“内源”在本文中可互换地使用。
如本文所用，“异源”可以指代核酸序列或蛋白质。例如，关于宿主细胞，“异源”可以指代不以该方式天然存在于宿主细胞的基因组中的多核苷酸，或者多肽或蛋白质不以该方式由该细胞天然产生。异源核酸序列是源自外来物种的核酸，或者如果来自相同物种，则通过故意的人为干预在组成和/或基因组基因座方面相对于其天然形式进行了实质修饰。例如，可操作地连接到天然结构基因的启动子来自与衍生出结构基因的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则一者或两者相对于其原始形式进行了实质修饰。异源蛋白可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则通过故意的人为干预相对于其原始形式进行了实质修饰。也就是说，异源蛋白表达涉及在宿主细胞中不以该方式天然表达的蛋白质的表达。术语“异源表达”是指在宿主细胞中表达异源核酸。异源蛋白在真核宿主细胞系统(诸如酵母)中的表达是本领域技术人员熟知的。包含编码具有特定活性的某种蛋白质或酶的基因的核酸序列的多核苷酸可以在这种真核系统中表达。在一些实施例中，转化/转染细胞可以用作表达酶的表达系统。异源蛋白在酵母中的表达是熟知的。Sherman,F.等人,Methodsin Yeast Genetics[酵母遗传学方法],(1986),由Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室]出版是描述可用于在酵母中表达蛋白质的多种方法的公认的著作。两种广泛利用的酵母是酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。用于在酵母属和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方案是本领域已知的并且可从商业供应商(例如，英杰公司(Invitrogen))获得。合适的载体通常具有表达控制序列，诸如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)以及按需的复制起点、终止序列等。
如本文所用，“启动子”是指导(结构)基因或其他(部分的)核酸序列的转录的DNA序列。适当地，启动子位于基因的5'区，靠近(结构)基因的转录起始位点。启动子序列可以是组成型的、诱导型的或阻遏型的。在实施例中，不需要(外部)诱导物。
如本文所用，术语“载体”包括对常染色体表达载体和用于整合至染色体中的整合载体的提及。
术语“表达载体”是指包含编码目的多肽的区段的线性或环状的DNA分子，该区段在提供其转录的另外的核酸区段的控制下(即，与其可操作地连接)。这样的另外的区段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点、一种或多种选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或者可以含有两者的元件。特别地，表达载体包含核酸序列，其在5'至3'方向上包含并且可操作地连接：(a)酵母识别的转录和翻译起始区，(b)目的多肽的编码序列，以及(c)酵母识别的转录和翻译终止区。
“质粒”是指自主复制的染色体外DNA，其不整合至微生物的基因组中并且通常在自然界中是环状的。
“整合载体”是指线性或环状的DNA分子，其可以掺入微生物的基因组中并且提供编码目的多肽的基因的稳定遗传。整合载体通常包含含有编码目的多肽的基因序列的一个或多个区段，该基因序列在提供其转录的另外的核酸区段的控制下(即，与其可操作地连接)。这样的另外的区段可以包括启动子和终止子序列，以及驱动目的基因掺入靶细胞的基因组中(通常通过同源重组的方法)的一个或多个区段。典型地，整合载体将是可以转移至靶细胞中但具有在该生物体中无功能的复制子的载体。如果在该区段内包括适当的标记，则可以选择包含目的基因的区段的整合。
在本文中将“宿主细胞”理解为这样的细胞(诸如酵母细胞)，其将被编码一种或多种异源蛋白的一个或多个核酸序列转化以构建转化细胞(也称为重组细胞)。例如，转化细胞可以含有载体并且可以支持载体的复制和/或表达。
如本文所用，“转化(transformation)”和“转化(transforming)”是指外源多核苷酸插入宿主细胞中，而不考虑用于插入的方法，例如直接摄取、转导、f-接合或电穿孔。外源多核苷酸可以作为非整合载体(例如，质粒)维持，或者替代性地可以整合至宿主细胞基因组中。如本文所用，“转化(transformation)”和“转化(transforming)”是指外源多核苷酸(即，外源核酸序列)插入宿主细胞中，而不考虑用于插入的方法，例如直接摄取、转导、f-接合或电穿孔。外源多核苷酸可以作为非整合载体(例如，质粒)维持，或者替代性地可以整合至宿主细胞基因组中。
在本文中将“组成性表达(constitutive expression)”和“组成性地表达(constitutively expressing)”理解为存在核酸序列的连续转录。也就是说，核酸序列以持续的方式进行转录。组成性地表达的基因总是“开启”。
在本文中将“厌氧组成性表达”理解为核酸序列在厌氧条件下在生物体中组成性地表达。也就是说，在厌氧条件下，核酸序列以持续的方式进行转录，即在这样的厌氧条件下，基因总是“开启”。
在本文中将“破坏”理解为对活性的任何破坏，包括但不限于被破坏的基因的亲和力和与这种被破坏的基因互补的RNA的表达的缺失、突变和降低。它包括所有核酸修饰，诸如核苷酸缺失或取代、基因敲除以及影响对应多肽的翻译或转录和/或影响酶(特定)活性、其底物特异性和/或稳定性的其他行为。它还包括可以靶向基因的编码序列或启动子的修饰。基因破坏株(disruptant)是具有相应基因的一种或多种破坏的细胞。在本文中将对于酵母是天然的理解为基因在破坏前存在于酵母细胞中。
术语“编码(encoding)”具有与“编码(coding for)”相同的含义。因此，举例来说，“编码转酮酶的一个或多个基因(one or more genes encoding a transketolase)”具有与“编码转酮酶的一个或多个基因(one or more genes coding for a transketolase)”相同的含义。
就编码蛋白质或酶的基因或核酸序列而言，短语“编码X的一个或多个核酸序列”(其中X表示蛋白质)具有与“编码具有X活性的蛋白质的一个或多个核酸序列”相同的含义。因此，举例来说，“编码转酮酶的一个或多个核酸序列”具有与“编码具有转酮酶活性的蛋白质的一个或多个核酸序列”相同的含义。
缩写“NADH”是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原氢化形式。缩写“NAD+”是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化形式。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸可以充当所谓的辅因子，辅助细胞中的生化反应和/或转化。
“NADH依赖性(NADH dependent)”或“NAD+依赖性(NAD+dependent)”在本文中等同于NADH特异性(NADH specific)，并且“NADH依赖性(NADH dependency)”或“NAD+依赖性(NAD+dependency)”在本文中等同于NADH特异性(NADH specificity)。
在本文中将“NADH依赖性”或“NAD+依赖性”酶理解为即与其他类型的辅因子相比仅依赖于作为辅因子的NADH/NAD+或主要依赖于作为辅因子的NADH/NAD+的酶。在本文中将“仅NADH/NAD+依赖性”酶理解为相对于NADPH/NADP+对NADH/NAD+具有绝对需求的酶。也就是说，它仅在将NADH/NAD+作为辅因子应用时才有活性。在本文中将“主要NADH/NDA+依赖性”酶理解为对作为辅因子的NADH/NAD+比对作为辅因子的NADPH/NADP+具有更高的特异性和/或更高的催化效率的酶。
酶的特异性特征可以通过以下公式来描述：
1<Km NADP+/Km NAD+<∞(无穷大)
其中Km是所谓的米氏常数。
对于主要NADH依赖性酶，优选地，KmNADP+/KmNAD+在1与1000之间、在1与500之间、在1与200之间、在1与100之间、在1与50之间、在1与10之间、在5与100之间、在5与50之间、在5与20之间或在5与10之间。
使用已知的分析技术、计算和方案可以将本文的酶的Km确定为分别针对NAD+和NADP+的酶特异性。这些例如在以下文献中有描述：Lodish等人,Molecular Cell Biology[分子细胞生物学]第6版,编辑Freeman,第80和81页,例如图3-图22。对于主要NADH依赖性酶，优选地，对作为辅因子的NADPH/NADP+的催化效率(kcat/Km)NADP+与对作为辅因子的NADH/NAD+的催化效率(kcat/Km)NAD+的比率(即，催化效率比率(kcat/Km)NADP+:(kcat/Km)NAD+)大于1:1，更优选等于或大于2:1，还更优选等于或大于5:1，甚至更优选等于或大于10:1，又甚至更优选等于或大于20:1，甚至还更优选等于或大于100:1，最优选等于或大于1000:1。没有上限，但是出于实际原因，主要NADH依赖性酶的催化效率比率(kcat/Km)NADP+:(kcat/Km)NAD+可以等于或小于1.000.000.000:1(即，1.109:1)。
酵母细胞
重组酵母细胞优选地是以下的酵母细胞，或者衍生自以下的酵母细胞，即该酵母细胞来自酵母科(Saccharomycetaceae)的属或裂殖酵母科(Schizosaccharomycetaceae)的属。也就是说，优选地，衍生出重组酵母细胞的宿主细胞是来自酵母科的属或裂殖酵母科的属的酵母细胞。
合适的酵母细胞的实例包括酵母属，诸如酿酒酵母、真贝酵母(Saccharomyceseubayanus)、Saccharomyces jurei、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、Saccharomyces beticus、发酵性酵母(Saccharomyces fermentati)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)和贝酵母(Saccharomyces bayanus)。
合适的酵母细胞的实例进一步包括裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，诸如粟酒裂殖酵母、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)和嗜冷裂殖酵母(Schizosaccharomycescryophilus)。
其他实例性酵母包括有孢圆酵母属(Torulaspora)，诸如戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，诸如马克斯克鲁维酵母；毕赤酵母属，诸如树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、巴斯德毕赤酵母或安格斯毕赤酵母；结合酵母属(Zygosaccharomyces)，诸如拜氏结合酵母(Zygosaccharomyces bailii)；酒香酵母属(Brettanomyces)，诸如间型酒香酵母(Brettanomyces inter medius)；布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、异酒香酵母(Brettanomyces anomalus)、班图酒香酵母(Brettanomyces custersianus)、纳氏酒香酵母(Brettanomyces naardenensis)、南斯酒香酵母(Brettanomyces nanus)，布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)和异型德克酵母(Dekkera anomala)；梅奇酵母属(Metschmkowia)，伊萨酵母属(Issatchenkia)，诸如东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)，克勒克酵母属(Kloeckera)，诸如柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)；以及短梗霉属(Aureobasidium)，诸如出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。
酵母细胞优选地是裂殖酵母属的酵母细胞(在本文中也称为裂殖酵母属酵母细胞)，或是酵母属的酵母细胞(在本文中也称为酵母属酵母细胞)。更优选地，酵母细胞是衍生自酿酒酵母种的酵母细胞(在本文中也称为酿酒酵母细胞)。也就是说，优选地，衍生出重组酵母细胞的宿主细胞是来自酿酒酵母种的酵母细胞。因此，重组酵母细胞优选为重组酿酒酵母细胞。
优选地，酵母细胞是工业酵母细胞。酵母细胞在工业过程中的生存环境与在实验室中的生存环境显著不同。工业酵母细胞必须能够在多种环境条件下表现良好，这些环境条件在期间可以变化。这样的变化包括营养源、pH、乙醇浓度、温度、氧气浓度等的变化，它们一起对酵母细胞的细胞生长和乙醇生产具有潜在的影响。可以将工业酵母细胞理解为指代当与实验室对应物相比时具有更稳健的性能的酵母细胞。也就是说，当与实验室对应物相比时，当选自营养源、pH、乙醇浓度、温度、氧气浓度的组的一种或多种环境条件在发酵期间变化时，工业酵母细胞显示出更少的性能变化。优选地，酵母细胞是在作为宿主的工业酵母细胞的基础上构建的，其中构建如下文所述进行。工业酵母细胞的实例是Ethanol(弗曼蒂斯公司(Fermentis))、(帝斯曼公司(DSM))和(拉曼公司(Lallemand))。
本文所述的重组酵母细胞可以衍生自能够产生发酵产物的任何宿主细胞。优选地，宿主细胞是酵母细胞，更优选如上文所述的工业酵母细胞。优选地，本文所述的酵母细胞衍生自具有生产乙醇的能力的宿主细胞。
因此，本文所述的酵母细胞可以通过本领域技术人员已知合适的任何技术而衍生自宿主细胞。这样的技术可以包括诱变、重组DNA技术(包括但不限于CRISPR-CAS技术)、选择性和/或适应性进化、接合、细胞融合和/或酵母菌株之间的胞导中的任何一种或多种。适当地，通过一种或多种以上技术的组合将一种或多种所需基因掺入酵母细胞中。
根据本发明的重组酵母细胞优选地是抑制剂耐受的，即它们可以在它们典型地具有的共同预处理和水解条件的水平下经受住共同的抑制剂，使得重组酵母细胞可用于广泛的应用，即它对于不同的原料、不同的预处理方法和不同的水解条件具有高适应性。在实施例中，重组酵母细胞是抑制剂耐受的。抑制剂耐受性是对抑制性化合物的抗性。木质纤维素中抑制性化合物的存在和水平可以随着原料、预处理方法、水解方法的变化而广泛变化。抑制剂类别的实例是羧酸、呋喃和/或酚类化合物。羧酸的实例是乳酸、乙酸或甲酸。呋喃的实例是糠醛和羟基-甲基糠醛。酚类化合物的实例是香草醛(vannilin)、丁香酸、阿魏酸和香豆酸。抑制剂的典型量，对于羧酸：为数克/升，高达20克/升或更多，取决于原料、预处理和水解条件。对于呋喃：为数百毫克/升，高达数克/升，取决于原料、预处理和水解条件。对于酚类：为数十毫克/升，高达一克/升，取决于原料、预处理和水解条件。
在实施例中，重组酵母细胞是天然能够进行酒精发酵、优选厌氧酒精发酵的细胞。重组酵母细胞优选地对乙醇具有高耐受性，对低pH(即，能够在低于约5、约4、约3或约2.5的pH下生长)和有机物具有高耐受性，和/或对升高的温度具有高耐受性。
葡糖淀粉酶
本发明提供一种重组酵母细胞，其包含编码具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
本发明还提供一种优选纯化和/或分离的蛋白质，其包含以下或由以下组成：SEQID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
如上文所指示，来自酿酒酵母物种的重组酵母宿主细胞是优选的。因此，优选核苷酸序列为异源核苷酸序列，且优选蛋白质为异源蛋白质(优选具有葡糖淀粉酶活性)。
包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或者由其组成的蛋白质优选是可以有利地催化以下的蛋白质：
-1,4-连接的α-D-葡萄糖残基的水解，也称为α-1,4-糖苷键的水解；以及
-1,6-连接的α-D-葡萄糖残基的水解，也称为α-1,6-糖苷键的水解。
也就是说，蛋白质优选为包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的具有α-1,4-葡糖苷酶和/或α-1,6-葡糖苷酶活性的蛋白质。
因此，本发明的重组酵母细胞可以有利地分解直链淀粉和支链淀粉。
具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质在本文中也被称为“葡糖淀粉酶(glucoamylaseenzyme)”、“葡糖淀粉酶蛋白”、“α-1,4-葡糖苷酶”或被简称为“葡糖淀粉酶”(glucoamylase)。上述术语在本文中可互换使用。葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.20或3.2.1.3)通常也称为“淀粉葡糖苷酶”、“α-1,4-葡糖苷酶”、“葡聚糖1,4-α葡糖苷酶”、麦芽糖酶葡糖淀粉酶和麦芽糖酶-葡糖淀粉酶，其至少可以催化1,4-连接的α-D-葡萄糖残基从直链淀粉链的非还原端水解，以释放游离的D-葡萄糖。
水解或破坏α-1,6-糖苷键的能力也被称为“1,6-水解”活性、“1,6-去支化”活性或被简称为“去支化”活性。因此，具有1,6-水解葡糖淀粉酶活性的蛋白质也称为“去支化酶”、“去支化蛋白”、“去支化葡糖淀粉酶”、“α-1,6-葡糖苷酶”、“1,6-去支化葡糖淀粉酶”或“1,6-水解葡糖淀粉酶”。上述术语在本文中可互换使用。这样的具有去支化葡糖淀粉酶活性的蛋白质通常被分类在酶类E.C.3.2.1.10中。
水解或破坏α-1,4-糖苷键的能力也称为“1,4-水解”或“非去支化”。仅具有1,4-水解葡糖淀粉酶活性且没有或几乎没有1,6-水解葡糖淀粉酶活性的蛋白质在本文中也可称为“非去支化酶”、“非去支化蛋白”、“非去支化葡糖淀粉酶”或“1,4-水解葡糖淀粉酶”。
根据本发明的重组酵母细胞中的葡糖淀粉酶蛋白有利地提供双活性。也就是说，包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质可以有利地水解或破坏α-1,4-糖苷键以及水解或破坏α-1,6-糖苷键。具有1,4-水解葡糖淀粉酶活性和1,6-水解葡糖淀粉酶活性的蛋白质在本文中也称为双活性葡糖淀粉酶。包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质(对应地酶)可以适当地被分类在酶类E.C.3.2.1.3和酶类E.C.3.2.1.10两者中。
优选地，重组酵母细胞的1,6-水解活性与1,4-水解活性的比率在10:1至1:10的范围内，更优选在5:1至1:5的范围内，并且最优选在3:1至1:3的范围内。
包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质在本文中也缩写为“dGLA”。
葡糖淀粉酶可以由其氨基酸序列定义。另外，葡糖淀粉酶可以进一步由编码葡糖淀粉酶的核苷酸序列定义。如上文在定义下详细解释的，由编码酶的核苷酸序列定义的某种葡糖淀粉酶包括(除非另有限制)与编码葡糖淀粉酶的这种核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
优选地，编码具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质的优选地异源的核苷酸序列是SEQ IDNO:02的核苷酸序列或与SEQ ID NO:02的核苷酸序列具有至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
重组酵母细胞可以包含编码具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质的核苷酸序列的一个、两个或更多个拷贝。适当地，重组酵母细胞可以包含编码具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质的核苷酸序列的在等于或大于1个、优选等于或大于2个至等于或小于30个、优选等于或小于20个以及最优选等于或小于10个范围内的拷贝。最优选地，重组酵母细胞可以包含编码具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质的核苷酸序列的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个拷贝。
信号序列(也称为信号肽、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)可以存在于多肽(此处为GA)的N-末端，在该N-末端处，它发出多肽将被分泌(例如分泌到细胞外并进入培养基)的信号。
优选地，编码葡糖淀粉酶的一个或多个核苷酸序列是经密码子优化的，并且任何天然信号序列被宿主细胞的那些替换。如上文所指示，来自酿酒酵母物种的重组酵母宿主细胞是优选的。因此，优选地，编码葡糖淀粉酶的核苷酸序列是经密码子优化的，并且任何天然信号序列被酿酒酵母MATα信号序列、更优选SEQ ID NO:05的酿酒酵母MATα信号核苷酸序列替换
重组酵母可以经受进化工程以改善其特性。进化工程方法是已知的方法。进化工程是以下方法，其中微生物(本文中为重组酵母)的工业相关表型可以通过合理设立的自然选择的过程与特定生长速率和/或对营养物的亲和力偶联。例如，Kuijper,M,等人,FEMS,Eukaryotic cell Research[欧洲微生物学会联合会真核细胞研究]5(2005)925-934、WO2008041840和WO 2009112472中详细描述了进化工程。进化工程化后，分离所得的戊糖发酵重组细胞。分离可以以任何已知的方式进行，例如通过从进化工程中使用的重组细胞培养液中分离细胞，例如通过采集细胞样品或通过过滤或离心。
在实施例中，重组酵母是无标记的。如本文所用，术语“标记”是指编码性状或表型的基因，其允许选择或筛选含有该标记的宿主细胞。无标记意指重组酵母中基本上不存在标记。当抗生素标记已用于重组酵母的构建并随后去除时，无标记是特别有利的。可以使用任何合适的现有技术(例如分子内重组)去除标记。
在一个实施例中，重组酵母是在抑制剂耐受型宿主细胞的基础上构建的，其中构建如下文所述进行。可以通过筛选在含有抑制剂的材料上生长的菌株来选择抑制剂耐受型宿主细胞，如Kadar等人,Appl.Biochem.Biotechnol[应用生物化学和生物技术].(2007),第136-140卷,847-858中所述，其中选择抑制剂耐受型酿酒酵母菌株ATCC 26602。
与其他去支化和/或非去支化蛋白组合
包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列且优选具有α-1,4-葡糖苷酶和/或α-1,6-葡糖苷酶活性的蛋白质可以有利地与以下组合：具有α1,4-葡糖苷酶活性的另外的蛋白质(优选在酶类E.C.3.2.1.3内)；和/或具有α1,6-葡糖苷酶活性的另外的蛋白质(优选在酶类E.C.3.2.1.10内)；和/或具有β-葡糖苷酶活性的另外的蛋白质(优选在酶类E.C.3.2.1.21内)；和/或具有α1,1-葡糖苷酶活性的另外的蛋白质(优选在酶类E.C.3.2.1.28内)。
优选地，包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质(即dGLA)与1,4-水解葡糖淀粉酶(即没有或几乎没有1,6-水解葡糖淀粉酶活性的葡糖淀粉酶)组合。这可以有利地甚至进一步降低发酵结束时可发酵糖的总量的水平。另外，其还有助于减少对外部酶的需求。
这样的蛋白质(对应地酶)的组合可以通过将表达组合在一个重组酵母细胞中，或通过使用包括多个重组酵母细胞的套装盒来适当地进行。
例如，本发明还提供一种套装盒，其包括：
-第一重组酵母细胞，其包含编码第一蛋白质的第一核苷酸序列，该第一蛋白质包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及
-第二重组酵母细胞，其包含编码具有α1,4-葡糖苷酶活性的另外的蛋白质(优选在酶类E.C.3.2.1.3内)的另外的核苷酸序列；和/或编码具有α1,6-葡糖苷酶活性的另外的蛋白质(优选在酶类E.C.3.2.1.10内)的另外的核苷酸序列；和/或编码具有β-葡糖苷酶活性的另外的蛋白质(优选在酶类E.C.3.2.1.21内)的另外的核苷酸序列；和/或编码具有α1,1-葡糖苷酶活性的另外的蛋白质(优选在酶类E.C.3.2.1.28内)的另外的核苷酸序列。
优选地，第二重组酵母细胞包含编码具有1,4-水解葡糖淀粉酶活性的另外的蛋白质的另外的核苷酸序列，其中优选地该第二蛋白质包含或具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列或与SEQ ID NO:03的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
重组酵母细胞也可能包含或功能上表达：
-编码具有1,6-水解葡糖淀粉酶活性的第一蛋白质的第一核苷酸序列，该第一蛋白质包含或具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及
-编码具有1,4-水解葡糖淀粉酶活性的第二蛋白质的第二核苷酸序列，该第二蛋白质包含或具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列或与SEQ ID NO:03的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
优选地，第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列是异源的，并且优选地，第一蛋白质和/或第二蛋白质是异源的。
优选地，编码具有1,4-水解葡糖淀粉酶活性的第二蛋白质的优选地异源的第二核苷酸序列是SEQ ID NO:04的核苷酸序列或与SEQ ID NO:04的核苷酸序列具有至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
因此，重组酵母细胞可以优选地是包含以下或功能上表达以下的重组酵母细胞：
-第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列是SEQ ID NO:02的核苷酸序列或与SEQ IDNO:02的核苷酸序列具有至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及-第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列是SEQ ID NO:04的核苷酸序列或与SEQ ID NO:04的核苷酸序列具有至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
优选地，由第一核苷酸序列编码的第一蛋白质具有1,6-水解葡糖淀粉酶活性，该活性是由第二核苷酸序列编码的第二蛋白质的1,6-水解葡糖淀粉酶活性的至少三(3)倍、更优选至少四(4)倍、以及最优选至少十(10)倍或甚至至少二十(20)倍。
优选地，由第二核苷酸序列编码的第二蛋白质具有1,4-水解葡糖淀粉酶活性，该活性是由第一核苷酸序列编码的第一蛋白质的1,4-水解葡糖淀粉酶活性的至少三(3)倍、更优选至少四(4)倍、以及最优选至少十(10)倍或甚至至少二十(20)倍。
另外，重组酵母可以包含编码具有去支化、糖解或其他活性的其他蛋白质的一个或多个核苷酸序列，例如编码支链淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶和/或β-葡聚糖酶的一个或多个核苷酸序列。
葡糖淀粉酶启动子
在优选的实施例中，上述1,6-水解和/或1,4-水解葡糖淀粉酶的活性通过过表达进行微调或上调。也就是说，编码具有1,6-水解和/或1,4-水解葡糖淀粉酶活性的蛋白质的核苷酸序列(的表达)优选地在启动子(dGLA启动子)的控制下。
启动子可以是天然启动子、异源启动子或合成启动子。本文中提及天然启动子是提及对于宿主细胞而言天然的启动子。优选地，重组酵母细胞为重组酿酒酵母细胞，并且优选地dGLA启动子为对于酿酒酵母而言天然的启动子。dGLA启动子也可以是异源或合成寡核苷酸。例如，dGLA启动子可以源自宿主细胞以外的另一物种，或者它可以是人工寡核苷酸合成的产物。人工寡核苷酸合成是合成生物学中用于在实验室中产生人工寡核苷酸(诸如基因)的方法。商业基因合成服务现在可从世界各地的许多公司获得，其中的一些已经围绕该任务建立了其商业模式。当前的基因合成方法最常基于有机化学和分子生物学技术的组合，并且可以“从头”合成整个基因，而无需前体模板DNA。
更优选地，dGLA启动子选自由以下组成的列表：pPRS3、pZOU1和pPFY1，或其功能性同源物，该功能性同源物包含与以上项具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列
dGLA启动子有利地使葡糖淀粉酶的表达更高，优选倍增因子为2或更高。
外部葡糖淀粉酶的加入。
术语“加入”在本文中被理解为非原位添加(外部)葡糖淀粉酶(即不是酵母在发酵期间原位产生的葡糖淀粉酶)。除了已经由功能上表达葡糖淀粉酶的酵母原位产生的葡糖淀粉酶外，还可以添加这样的外部葡糖淀粉酶。
例如，非原位产生的葡糖淀粉酶可以以0.005至0.05g/L(克/升)、0.01至0.05g/L、0.02至0.05g/L、0.03至0.05g/L或0.04至0.05g/L的浓度加入。在实施例中，非原位产生的葡糖淀粉酶以0.005至0.04g/L、0.01至0.04g/L、0.02至0.04g/L或0.03至0.04g/L的浓度加入。在实施例中，非原位产生的葡糖淀粉酶以0.005至0.04g/L、0.005至0.03g/L、0.005至0.02g/L或0.005至0.01g/L的浓度加入。
例如，非原位产生的葡糖淀粉酶(优选作为液体产品)可以以等于或小于0.05克/一千克进料(如玉米浆料)的量，优选以等于或小于0.005克/一千克进料(例如玉米浆料)的量加入。
优选地，本发明的方法在不添加任何葡糖淀粉酶的情况下进行。因此，非原位产生的葡糖淀粉酶的剂量优选为零。
技术人员知道如何加入葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以加入到发酵中。葡糖淀粉酶可以在添加酵母之前或之后单独加入。葡糖淀粉酶可以作为干燥产品(例如作为粉末或颗粒)或作为液体加入。葡糖淀粉酶可以与其他组分(如抗生素)一起加入。葡糖淀粉酶也可以作为回流(即其中部分稀釜馏物再循环到例如发酵中的流)的一部分加入。葡糖淀粉酶也可以使用这些方法的组合加入。
氧化还原汇
优选地，重组酵母细胞可以进一步包含用于功能性地表达在形成非天然氧化还原汇的代谢途径中起作用的蛋白质的一种或多种基因修饰。
例如，这一种或多种基因修饰可以是用于编码一种或多种NAD+/NADH依赖性蛋白的一个或多个任选地异源的核酸序列的功能性表达的一种或多种基因修饰，该一种或多种NAD+/NADH依赖性蛋白在将NADH转化为NAD+的代谢途径中起作用。存在这样的代谢途径的几个实例，如下文进一步所展示。
例如，“用于功能性地表达在形成非天然氧化还原汇的代谢途径中起作用的蛋白质的一种或多种基因修饰”可以选自由以下组成的组：
a)包含以下或由以下组成的一种或多种基因修饰：
-编码包含磷酸转酮酶活性的蛋白质(EC 4.1.2.9或EC 4.1.2.22，PKL)的优选地异源的核酸序列；和/或
-编码具有磷酸转乙酰酶(PTA)活性的蛋白质(EC 2.3.1.8)的优选地异源的核酸序列；和/或
-编码具有乙酸激酶(ACK)活性的蛋白质(EC 2.7.2.12)的优选地异源的核酸序列。
和/或
b)包含以下或由以下组成的一种或多种基因修饰：
-编码具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质的优选地异源的核酸序列；和/或
-编码具有磷酸核酮糖激酶(PRK)活性的蛋白质的优选地异源的核酸序列；以及
-任选地，编码具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质的一种或多种分子伴侣的优选地异源的核酸序列；
和/或
c)包含以下或由以下组成的一种或多种基因修饰：
编码包含NADH依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的优选地异源的核酸序列。
例如，WO 2014/081803描述了表达异源磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶或乙酸激酶和双功能性乙醛-醇脱氢酶的重组微生物，将其通过援引并入本文；并且WO 2015/148272描述了表达异源磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶和乙酰化乙醛脱氢酶的重组酿酒酵母菌株，将其通过援引并入本文。此外，WO 2018172328A1描述了可以包含编码具有磷酸转酮酶活性的酶的一个或多个(异源)基因的重组细胞。描述于WO 2014/081803、WO 2015/148272和WO2018172328 A1(全部通过援引并入本文)中的磷酸转酮酶(PKL)路径提供了将NADH转化为NAD+的优选的代谢途径，并且描述于其中的NADH依赖性磷酸转酮酶是用于在本发明中应用的优选的NADH依赖性蛋白。
Rubisco
如上文所指示，重组酵母细胞可以有利地功能性地表达编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC 4.1.1.39；Rubisco)和任选地Rubisco的一种或多种分子伴侣的一个或多个优选地异源的核酸序列。
更优选地，重组酵母细胞功能性地表达：
-编码具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质的异源核酸序列；和/或
-编码具有磷酸核酮糖激酶(PRK)活性的蛋白质的异源核酸序列；和/或
-任选地编码具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质的一种或多种分子伴侣的一个或多个异源核酸序列。
具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质在本文中也被称为“核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(ribulose-1,5-biphosphate carboxylaseoxygenase)”、“核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶蛋白”、“核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(ribulose-1,5-biphosphate carboxylase oxygenase enzyme)”、“Rubisco酶”、“Rubisco蛋白”或被简称为“Rubisco”。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶可以进一步由其氨基酸序列定义。同样地，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶可以进一步由编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶的核苷酸序列定义。如上文在定义下详细解释的，由编码酶的核苷酸序列定义的某种核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶包括(除非另有限制)与编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶的这种核苷酸序列杂交的核苷酸序列。Rubisco蛋白和编码这种蛋白的核酸序列的优选物如WO2014/129898(通过援引并入本文)中所述。
Rubisco蛋白可以适当地选自真核和原核Rubisco蛋白的组。Rubisco蛋白优选地来自非光养生物体。例如，Rubisco蛋白可以来自化能无机自养性微生物。用细菌Rubisco蛋白已经获得了良好的结果。优选地，Rubisco蛋白源自化能无机自养性的硫杆菌属(Thiobacillus)，特别是脱氮硫杆菌。
Rubisco蛋白可以是单亚基Rubisco蛋白或具有多于一个亚基的Rubisco蛋白。优选地，Rubisco蛋白是单亚基Rubisco蛋白。用作为所谓的II型Rubisco蛋白的Rubisco蛋白已经获得了良好的结果。用由cbbM基因(也称为CbbM)编码的Rubisco蛋白获得了尤其良好的结果。
优选的Rubisco蛋白是由来自脱氮硫杆菌的cbbM基因编码的Rubisco蛋白。SEQ IDNO:06显示了由来自脱氮硫杆菌的cbbM基因编码的合适Rubisco蛋白的氨基酸序列。SEQ IDNO:07展示了来自脱氮硫杆菌的cbbM基因的核酸序列，其针对酿酒酵母进行了密码子优化。
因此，优选地，具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:06的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:06的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:06的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:06的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:06的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:06的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
优选地，编码具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质的核酸序列包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:07的核酸序列；或者
-SEQ ID NO:07的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:07的核酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:07的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:07的核酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:07的核酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个核酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
参考与SEQ ID NO:06的氨基酸序列的序列同一性，WO 2014/129898(通过援引并入本文)的表1和下表2中给出了其他合适的Rubisco多肽及其来源的实例。
可以将编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)蛋白的核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中，例如如在WO2014/129898的实例和以下文章中所述：Guadalupe-Medina等人,“Carbon dioxide fixation by Calvin-Cycle enzymesimproves ethanol yield in yeast”[“由卡尔文循环酶固定二氧化碳提高了酵母中的乙醇产率”],发表于Biotechnol,Biofuels[生物燃料的生物技术],2013,第6卷,第125页，两者都通过援引并入本文。
表2：适用于表达的天然Rubisco多肽
如上文所指示，至少在发酵方法中使用的期间，Rubisco蛋白在重组酵母细胞中适当地功能性地表达。
编码Rubisco蛋白的核酸序列可以以一个、两个或更多个拷贝存在于重组酵母细胞中。不希望受任何类型的理论的约束，据信当编码Rubisco蛋白的核酸序列(例如，基因)以小于12个拷贝、更优选小于8个拷贝存在于重组酵母细胞中时，对重组酵母细胞的稳健性最好。因此，优选地，重组酵母细胞包含范围从等于或大于1个拷贝、更优选等于或大于2个拷贝至等于或小于7个拷贝、更优选等于或小于6个拷贝的编码Rubisco蛋白的核酸序列(例如，基因)。重组酵母细胞可以例如包含编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)的核酸序列的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个拷贝。
为了增加Rubisco蛋白在本发明的转化(重组)宿主细胞中以足够水平和活性形式表达的可能性，编码Rubisco蛋白和如本文所述的其他蛋白质(参见下文)的核酸序列优选地适于将其密码子使用优化为所讨论的宿主细胞的密码子使用。编码酶的核酸序列对宿主细胞的密码子使用的适应性可以表示为密码子适应指数(CAI)。在本文中将密码子适应指数定义为基因的密码子使用对特定宿主细胞或生物体中高表达的基因的密码子使用的相对适应性的测量值。每个密码子的相对适应性(w)是对于同一种氨基酸，每个密码子的使用与最高丰度密码子的使用的比率。将CAI指数定义为这些相对适应性值的几何平均值。排除非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)。CAI值的范围从0至1，较高的值指示最高丰度的密码子的比例较高(参见Sharp和Li,“The codon adaptation index-a measure ofdirectional synonymous codon usage bias,and its potential applications”[“密码子适应指数-定向同义密码子使用偏倚的度量及其潜在应用”],(1987),发表于NucleicAcids Research[核酸研究]第15卷,第1281-1295页；还参见：Jansen等人,“Revisitingthe codon adaptation index from a whole-genome perspective:analyzing therelationship between gene expression and codon occurrence in yeast using avariety of models”[“从全基因组角度重新审视密码子适应指数：使用多种模型分析酵母中的基因表达和密码子出现之间的关系”],(2003),Nucleic Acids Res.[核酸研究]第31卷(8),第2242-51页)。适应的核酸序列的CAI优选地为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9。优选地，序列已经针对在所讨论的真菌宿主细胞(例如像酿酒酵母细胞)中表达进行密码子优化。
优选地，功能性地表达的Rubisco蛋白的由核酮糖-1,5-二磷酸依赖性14C碳酸氢盐掺入细胞提取物的速率定义的活性为至少1nmol.min-1.(mg蛋白质)-1，特别地活性为至少2nmol.min-1.(mg蛋白质)-1，更特别地活性为至少4nmol.min-1.(mg蛋白质)-1。活性的上限不是关键的。实际上，活性可以为约200nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低，特别是25nmol.min-1.(mg蛋白质)-1，更特别是15nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低，例如约10nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低。用于确定该Rubisco活性的测定的条件如WO 2014/129898(通过援引并入本文)的实例(例如，实例4)中所见。
磷酸核酮糖激酶
优选地，重组酵母细胞还功能性地表达编码具有磷酸核酮糖激酶(PRK)活性的蛋白质(EC2.7.1.19；PRK)的异源核酸序列。
具有磷酸核酮糖激酶(PRK)活性的蛋白质在本文中也被称为“磷酸核酮糖激酶蛋白”、“磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase enzyme)”、“磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase)”、“PRK酶”、“PRK蛋白”或被简称为“PRK”。PRK蛋白和编码这种PRK蛋白的核酸序列的优选物如WO 2014/129898(通过援引并入本文)中所述。
根据本发明的功能性地表达的磷酸核酮糖激酶(PRK，(EC 2.7.1.19))能够催化以下化学反应：
因此，该酶的两种底物是ATP和D-核酮糖5-磷酸；其两种产物是ADP和D-核酮糖1,5-二磷酸。
PRK蛋白属于转移酶家族，特别是以醇基作为受体转移含磷基团的转移酶(磷酸转移酶)。该酶类的系统名称是ATP:D-核酮糖-5-磷酸1-磷酸转移酶。常用的其他名称包括磷酸戊糖激酶、核酮糖-5-磷酸激酶、磷酸戊糖激酶、磷酸核酮糖激酶(磷酸化)、5-磷酸核酮糖激酶、核酮糖磷酸激酶、PKK、PRuK和PRK。PRK酶参与碳固定。磷酸核酮糖激酶(PRK)蛋白可以进一步由其氨基酸序列定义。同样地，磷酸核酮糖激酶(PRK)蛋白可以进一步由编码磷酸核酮糖激酶(PRK)的核苷酸序列定义。如上文在定义下详细解释的，由编码酶的核苷酸序列定义的某种磷酸核酮糖激酶(PRK)包括(除非另有限制)与编码磷酸核酮糖激酶(PRK)的这种核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
PRK可以来自原核生物或真核生物。用源自真核生物的PRK已经获得了良好的结果。优选地，PRK蛋白源自选自石竹目(Caryophyllales)、特别是选自苋科(Amaranthaceae)、更特别是选自菠菜属(Spinacia)的植物。
优选的PRK蛋白是来自菠菜属的PRK蛋白。SEQ ID NO:08显示了这样的来自菠菜属的PRK蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:09展示了来自菠菜的prk基因的核酸序列-针对酿酒酵母进行了密码子优化。
因此，优选地，具有磷酸核酮糖激酶(PRK)活性的蛋白质包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:08的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:08的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:08的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:08的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:08的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:08的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
优选地，编码具有磷酸核酮糖激酶(PRK)活性的蛋白质的核酸序列包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:09的核酸序列；或者
-SEQ ID NO:09的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:09的核酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:09的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:09的核酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:09的核酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个核酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
可以将编码具有磷酸核酮糖激酶(PRK)活性的蛋白质的核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中，例如如WO 2014/129898(通过援引并入本文)的实例中所述。
参考与SEQ ID NO:08的氨基酸序列的序列同一性，WO 2014/129898(通过援引并入本文)的表2和下表3中给出了合适的PRK多肽及其来源的实例。
表3：适用于表达的天然PRK多肽和与来自菠菜属的PRK的同一性
来源 登录号 MAX ID(％)
菠菜 P09559.1 100
蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) XP_003612664.1 88
拟南芥(Arabidopsis thaliana) NP_174486.1 87
葡萄(Vitis vinifera) XP_002263724.1 86
极锐新月藻(Closterium peracerosum) BAL03266.1 82
玉蜀黍(Zea mays) NP_001148258.1 78
编码PRK蛋白的核酸序列可以在启动子(“PRK启动子”)的控制下，该启动子使得在厌氧条件下的表达能够高于在好氧条件下的表达。这样的启动子的实例描述于WO 2017/216136A1和WO 2018/228836(两者都通过援引并入本文)中。更优选地，这种启动子的PRK表达比率厌氧/好氧优选地为2或更高、3或更高、4或更高、5或更高、6或更高、7或更高、8或更高、9或更高、10或更高、20或更高或者50或更高。其他优选物如WO 2018/228836(通过援引并入本文)中所述。
Rubisco分子伴侣
任选地，重组酵母细胞进一步包含编码具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质的一种或多种分子伴侣的一个或多个优选地异源的核酸序列。
适当地，这样的分子伴侣在本文中也被称为“分子伴侣蛋白”、“伴侣蛋白”或被简称为“分子伴侣”。分子伴侣和编码这样的分子伴侣的核酸序列的优选物如WO 2014/129898(通过援引并入本文)中所述。
优选地，重组酵母细胞包含编码具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质的一种或多种分子伴侣的一个或多个异源核酸序列。
伴侣蛋白是为其他蛋白质的正确折叠提供有利条件从而防止聚集的蛋白质。新产生的蛋白质通常必须从氨基酸的线性链折叠成三维形式。伴侣蛋白属于协助蛋白质折叠的一大类分子，称为分子伴侣。折叠蛋白质的能量由腺苷三磷酸(ATP)提供。以下文献撰写了一篇关于可用于本文的分子伴侣的综述文章：Yébenes等人,“Chaperonins:two rings forfolding”[“伴侣蛋白：两个用于折叠的环”](2011),Trends in Biochemical Sciences[生物化学科学趋势],第36卷,第8期,第424-432页，通过援引并入本文。
一种或多种分子伴侣可以是原核分子伴侣或真核分子伴侣。此外，分子伴侣可以是同源的或异源的。例如，重组酵母细胞可以包含编码一种或多种同源或异源的原核或真核的分子伴侣的一个或多个核酸序列，这些分子伴侣在表达时能够与重组酵母细胞中的酶、特别是与Rubisco和PRK中的至少一种功能性地相互作用。
适当地，一种或多种分子伴侣衍生自细菌，更优选衍生自埃希氏杆菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌。优选的分子伴侣是来自大肠杆菌的GroEL和GroEs。其他优选的分子伴侣是来自酵母属的分子伴侣，特别是酿酒酵母Hsp10和Hsp60。
如果分子伴侣在诸如线粒体的细胞器中天然表达(实例是酿酒酵母的Hsp60和Hsp10)，则可以例如通过修饰伴侣蛋白的天然信号序列来实现至胞质溶胶的重新定位。在真核生物中，蛋白质Hsp60和Hsp10在结构和功能上分别与GroEL和GroES几乎相同。因此，设想到了来自任何重组酵母细胞的Hsp60和Hsp10都可以用作Rubisco的分子伴侣。这例如在以下文献中有描述：Zeilstra-Ryalls等人,“The universally conserved GroE(Hsp60)chaperonins”[“普遍保守的GroE(Hsp60)伴侣蛋白”],(1991),Annu Rev Microbiol.[微生物学年鉴]第45卷,第301-325页；以及Horwich等人,"Two Families of Chaperonin:Physiologyand Mechanism[伴侣蛋白的两个家族：生理学和机制]"(2007),Annu..Rev.Cell.Dev.Biol.[细胞和发育生物学年鉴]第23卷,第115–145页，两者均通过援引并入本文。
用包含异源分子伴侣GroEL和GroES两者的重组酵母细胞已经获得了良好的结果。
作为GroES的替代物，可以存在GroES的功能性同源物，特别是包含与GroES的氨基酸序列(对应地SEQ ID NO:12的氨基酸序列)具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的功能性同源物。
SEQ ID NO:12提供了基于大肠杆菌的GroES的优选的翻译蛋白序列。SEQ ID NO:13提供了基于来自大肠杆菌的GroES的合成核酸序列，其针对酿酒酵母中的表达进行了密码子优化。
与GroES同源的合适的天然分子伴侣多肽的实例在表4中给出。
表4：适用于表达的与GroES多肽同源的天然分子伴侣
作为GroEL的替代物，可以存在GroEL的功能性同源物，特别是包含与GroEL的氨基酸序列(对应地SEQ ID NO:10的氨基酸序列)具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的功能性同源物。
SEQ ID NO:10提供了基于大肠杆菌的GroEL的优选的翻译蛋白序列。SEQ ID NO:11提供了基于来自大肠杆菌的GroEL的合成核酸序列，其针对酿酒酵母中的表达进行了密码子优化。
表5给出了与GroEL同源的合适的天然分子伴侣多肽。
表5：适于表达的与GroEL多肽同源的天然分子伴侣
重组酵母细胞优选地包含(对应地功能性地表达)GroES分子伴侣和GroEL分子伴侣。优选地，将来自表4的10kDa分子伴侣(“GroES”)与来自表5的相同生物体属或种的匹配的60kDa分子伴侣(“GroEL”)组合，用于在重组酵母细胞中表达。
例如：>gi|189189366|ref|XP_001931022.1|:71-168 10kDa伴侣蛋白[偃麦草核腔菌]与匹配的>gi|189190432|ref|XP_001931555.1|热休克蛋白60，线粒体的，前体[偃麦草核腔菌Pt-1C-BFP]一起表达。以相同生物体来源类似地产生的来自表4和表5的所有其他组合也都可供技术人员用于表达。此外，可以将来自表4的来自一种生物体的分子伴侣与来自表5的来自另一种生物体的分子伴侣组合，或者可以将GroES与来自表5的分子伴侣组合，或者可以将GroEL与来自表4的分子伴侣组合。
因此，优选地，一种或多种分子伴侣包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:12的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:12的一种或多种功能性同源物，该一种或多种功能性同源物分别与SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:12的一种或多种功能性同源物，该一种或多种功能性同源物当分别与SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:12的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当分别与SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:12的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的一种或多种功能性同源物。
优选地，编码分子伴侣的一个或多个核酸序列包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:13的核酸序列；或者
-SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:13的一种或多种功能性同源物，该一种或多种功能性同源物分别与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:13的一种或多种功能性同源物，该一种或多种功能性同源物当分别与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:13的核酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当分别与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:13的核酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个核酸突变、取代、插入和/或缺失的一种或多种功能性同源物。
可以将编码分子伴侣的一个或多个核酸序列适当地掺入重组酵母细胞的基因组中，例如如WO 2014/129898(通过援引并入本文)的实例中所述。
磷酸转酮酶
如上文所指示，重组酵母细胞可以有利地包含编码含有磷酸转酮酶(PKL)活性的蛋白质(EC 4.1.2.9或EC 4.1.2.22)的优选地异源的核酸序列和/或编码具有磷酸转乙酰酶(PTA)活性的蛋白质(EC 2.3.1.8)的优选地异源的核酸序列和/或编码具有乙酸激酶(ACK)活性的蛋白质(EC 2.7.2.12)的优选地异源的核酸序列。
重组细胞可以包含编码具有磷酸转酮酶活性的蛋白质的一个或多个异源基因。这样的具有磷酸转酮酶活性的蛋白质在本文中也被称为“磷酸转酮酶蛋白”、“磷酸转酮酶(phosphoketolase enzyme)”或被简称为“磷酸转酮酶(phosphoketolase)”。磷酸转酮酶在本文中进一步缩写为“PKL”或“XFP”。
如本文所用，磷酸转酮酶至少催化D-木酮糖5-磷酸转化为D-甘油醛3-磷酸和乙酰磷酸。磷酸转酮酶参与以下反应中的至少一种：
EC 4.1.2.9：
EC 4.1.2.22：
测量磷酸转酮酶活性的合适的酶测定描述于例如以下文献中：Sonderegger等人,"Metabolic Engineering of a Phosphoketolase Pathway for PentoseCatabolismin Saccharomyces cerevisiae"[“酿酒酵母中戊糖分解代谢的磷酸转酮酶途径的代谢工程”],(2004),Applied&Environmental Microbiology[应用与环境微生物学],第70卷(5),第2892-2897页，将其通过援引并入本文。
优选地，具有磷酸转酮酶(PKL)活性的蛋白质包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
编码磷酸转酮酶蛋白的合适的核酸序列可以在选自以下的组的生物中找到：黑曲霉、粗糙脉孢菌、干酪乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、植物乳杆菌、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、高卢双歧杆菌(B.gallicum)、动物双歧杆菌(B.animalis)、乳酸双歧杆菌(B.lactis)、戊糖乳杆菌(L.pentosum)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、产黄青霉(P.chrysogenum)、构巢曲霉(A.nidulans)、棒曲霉(A.clavatus)、肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)和酒类酒球菌(O.oenii)。
可以将编码具有磷酸转酮酶(PKL)活性的蛋白质的核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中。
重组细胞可以包含编码具有磷酸转酮酶活性的酶的一个或多个(异源)基因。
磷酸转乙酰酶
如上文所指示，重组酵母细胞可以有利地包含编码含有磷酸转酮酶(PKL)活性的蛋白质(EC 4.1.2.9或EC 4.1.2.22)的优选地异源的核酸序列和/或编码具有磷酸转乙酰酶(PTA)活性的蛋白质(EC 2.3.1.8)的优选地异源的核酸序列和/或编码具有乙酸激酶(ACK)活性的蛋白质(EC 2.7.2.12)的优选地异源的核酸序列。
如本文所用，磷酸转乙酰酶至少催化乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A。
重组细胞可以包含编码具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白质的一个或多个异源基因。这样的具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白质在本文中也被称为“磷酸转乙酰酶蛋白”、“磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase enzyme)”或被简称为“磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase)”。磷酸转乙酰酶在本文中进一步缩写为“PTA”。
优选地，具有磷酸转乙酰酶(PTA)活性的蛋白质包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
编码具有磷酸转乙酰酶的酶的合适的核酸序列可以在选自以下的组的生物中找到：青春双歧杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解纤维梭菌(C.cellulolyticum)、植物发酵梭菌(C.phytofermentans)、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、嗜热毁丝霉(M.thermophila)和酒类酒球菌。
可以将编码具有磷酸转乙酰酶(PTA)活性的蛋白质的核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中。
乙酸激酶
如上文所指示，重组酵母细胞可以包含编码含有磷酸转酮酶(PKL)活性的蛋白质(EC 4.1.2.9或EC 4.1.2.22)的优选地异源的核酸序列和/或编码具有磷酸转乙酰酶(PTA)活性的蛋白质(EC 2.3.1.8)的优选地异源的核酸序列和/或编码具有乙酸激酶(ACK)活性的蛋白质(EC 2.7.2.12)的优选地异源的核酸序列。
如本文所用，乙酸激酶至少催化乙酸转化为乙酰磷酸。
重组细胞可以包含编码具有乙酸激酶活性的蛋白质(EC 2.7.2.12)的一个或多个优选地异源的基因。这样的具有乙酸激酶活性的蛋白质在本文中也被称为“乙酸激酶蛋白”、“乙酸激酶(acetate kinase enzyme)”或被简称为“乙酸激酶(acetate kinase)”。乙酸激酶在本文中进一步缩写为“ACK”。
优选地，具有乙酸激酶(ACK)活性的蛋白质包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
可以将编码具有乙酸激酶(ACK)活性的蛋白质的核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中。
乙酰化乙醛脱氢酶
如上文所指示，重组酵母细胞可以有利地包含并功能性地表达编码含有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.2.1.10)的优选地异源的核酸序列。
如果存在乙酰化乙醛脱氢酶，则更优选地，重组酵母细胞功能性地表达：
-编码包含NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.2.1.10)的优选地异源的核酸序列；以及
-编码具有NAD+依赖性醇脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.1.1.1或EC1.1.1.2)的适当地内源或异源的核酸序列；以及
-编码具有乙酰辅酶A合成酶活性的蛋白质(EC 6.2.1.1)的适当地内源或异源的核酸序列。
乙酰化乙醛脱氢酶是催化乙酰辅酶A转化为乙醛的酶(EC1.2.1.10)。该转化可以由以下平衡反应式表示：
乙酰辅酶A+NADH+H+<->乙醛+NAD++辅酶A
具有乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质在本文中也被称为“乙酰化乙醛脱氢酶蛋白”、“乙酰化乙醛脱氢酶(acetylating acetaldehyde dehydrogenase enzyme)”或被简称为“乙酰化乙醛脱氢酶(acetylating acetaldehyde dehydrogenase)”。乙酰化乙醛脱氢酶和编码乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列的优选物如WO 2011/010923和WO 2019/063507(将这些文献通过援引并入本文)中所述。
编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质(EC1.2.1.10)的核酸序列优选地是异源核酸序列。因此，编码的NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶可以优选地是异源NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶。
具有乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质可以是单功能性的或双功能性的。
编码NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列原则上可以源自包含编码所述脱氢酶的核酸序列的任何生物。已知的可以催化NADH依赖性地将乙酰辅酶A还原为乙醛的乙酰化乙醛脱氢酶通常可以分为以下三种类型的NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶功能性同源物：
1)催化乙酰辅酶A可逆地转化为乙醛、以及随后乙醛可逆地转化为乙醇的双功能性蛋白。这些类型的蛋白质有利地具有乙酰化乙醛脱氢酶活性以及醇脱氢酶活性两者。该类型的蛋白质的实例是大肠杆菌中的AdhE蛋白(Gen Bank编号：NP_415757)。AdhE似乎是基因融合的进化产物。AdhE蛋白的NH2-末端区域与醛:NAD+氧化还原酶高度同源，而COOH-末端区域与Fe2+依赖性乙醇:NAD+氧化物还原酶家族同源(参见Membrillo-Hernandez等人,“Evolution of the adhE Gene Product of Escherichia coli from a FunctionalReductase to a Dehydrogenase[大肠杆菌的adhE基因产物从功能还原酶到脱氢酶的进化]”,(2000)J.BioI.Chem.[生物化学杂志]275:第33869-33875页，将其通过援引并入本文)。大肠杆菌AdhE经受金属催化的氧化，并因此对氧气敏感(参见Tamarit等人“Identification of the Major Oxidatively Damaged Proteins in Escherichia coliCells Exposed to Oxidative Stress[暴露于氧化应激的大肠杆菌细胞中主要氧化损伤蛋白的鉴定]”(1998)J.BioI.Chem.[生物化学杂志]273:第3027-3032页，将其通过援引并入本文)。
2)在严格或兼性厌氧微生物中催化乙酰辅酶A可逆地转化为乙醛但不具有醇脱氢酶活性的蛋白质。该类型的蛋白质的实例已经在克氏梭菌(Clostridium kluyveri)中报道(参见Smith等人,“Purification,Properties,and Kinetic Mechanism of Coenzyme A-Linked Aldehyde Dehydrogenase from Clostridium kluyveri[来自克氏梭菌的辅酶A连接的醛脱氢酶的纯化、特性和动力学机制]”(1980)Arch.Biochem.Biophys.[生物化学和生物物理学档案]第203卷:第663-675页，将其通过援引并入本文)。乙酰化乙醛脱氢酶(GenBank编号：EDK33116)已经在克氏梭菌DSM 555的基因组中注释。在植物乳杆菌的基因组中鉴定出同源蛋白AcdH(GenBank编号：NP_784141)。该类型的蛋白质的另一实例是拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593中的所述基因产物(参见Toth等人“The aldGene,Encoding a Coenzyme A-Acylating Aldehyde Dehydrogenase,DistinguishesClostridium beijerinckii and Two Other Solvent-Producing Clostridia fromClostridium acetobutylicum[编码辅酶A乙酰化醛脱氢酶的ald基因将拜氏梭菌和其他两种产生溶剂的梭菌与丙酮丁醇梭菌区分开来]”,(1999),Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]第65卷:第4973-4980页，GenBank编号：AAD31841，将其通过援引并入本文)。
3)作为参与4-羟基-2-酮戊酸分解代谢的双功能性醛缩酶-脱氢酶复合物的一部分的蛋白质。这样的双功能酶催化儿茶酚的间位切割途径的最后两个步骤，儿茶酚是许多细菌物种降解酚、甲苯酸酯、萘、联苯和其他芳香族化合物的中间体(Powlowski和Shingler"Genetics and biochemistry of phenol degradation by Pseudomonassp.CF600[假单胞菌属(Pseudomonas)物种CF600降解苯酚的遗传学和生物化学]"(1994)Biodegradation[生物降解]第5卷,第219-236页，将其通过援引并入本文)。4-羟基-2-酮戊酸首先被4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶转化为丙酮酸和乙醛，随后乙醛被乙酰化乙醛脱氢酶转化为乙酰辅酶A。该类型的乙酰化乙醛脱氢酶的实例是假单胞菌属物种CF600中的DmpF蛋白(GenBank编号：CAA43226)(Shingler等人,“Nucleotide Sequence and FunctionalAnalysis of the Complete Phenol/3,4-Dimethylphenol Catabolic Pathway ofPseudomonas sp.Strain CF600[假单胞菌属物种菌株CF600的完整苯酚/3,4-二甲基苯酚分解代谢途径的核苷酸序列及功能性分析]”,(1992),J.Bacteriol.[细菌学杂志],第174卷,第711-724页，将其通过援引并入本文)。大肠杆菌MphF蛋白(Ferrandez等人,“GeneticCharacterization and Expression in Heterologous Hosts of the 3-(3-Hydroxyphenyl)Propionate Catabolic Pathway of Escherichia coli K-12[大肠杆菌K-12的3-(3-羟基苯基)丙酸分解代谢途径的遗传表征及其在异源宿主中的表达]”(1997)J.Bacteriol.[细菌学杂志]179:第2573-2581页，GenBank编号：NP_414885，将其通过援引并入本文)与假单胞菌属物种CF600中的DmpF蛋白同源。
在优选的实施例中，具有乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质是双功能性的，并且包含NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)活性和NAD+依赖性醇脱氢酶(EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2)活性两者。
合适的核酸序列特别可以在选自以下的组的生物中找到：埃希氏杆菌属，特别是大肠杆菌；分枝杆菌属(Mycobacterium)，特别是海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)，特别是生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermushydrogenoformans)；内阿米巴属(Entamoeba)，特别是溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)；志贺菌属(Shigella)，特别是宋内志贺菌(Shigella sonnei)；伯克霍尔德菌属(Burkholderia)，特别是类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudo mallei)，克雷伯菌属(Klebsiella)，特别是肺炎克雷伯菌；固氮菌属(Azotobacter)，特别是棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)；固氮弧菌属(Azoarcus)物种；贪铜菌属(Cupriavidus)，特别是台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)；假单胞菌属，特别是假单胞菌属物种CF600；Pelomaculum，特别是Pelotomaculum thermopropionicum。优选地，编码NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列源自埃希氏杆菌属，更优选地源自大肠杆菌。
特别合适的是来自大肠杆菌的mhpF基因或其功能性同源物。该基因描述于以下文献中：Ferrandez等人,“Genetic Characterization and Expression in HeterologousHosts of the 3-(3-Hydroxyphenyl)Propionate Catabolic Pathway of Escherichiacoli K-12[大肠杆菌K-12的3-(3-羟基苯基)丙酸分解代谢途径的遗传表征及其在异源宿主中的表达]”(1997)J.Bacteriol.[细菌学杂志]179:第2573-2581页。用酿酒酵母已经获得了良好的结果，其中已经掺入了来自大肠杆菌的mhpF基因。在进一步有利的实施例中，编码(乙酰化)乙醛脱氢酶的核酸序列来自假单胞菌属，特别是例如来自假单胞菌属物种CF600的dmpF。
此外，乙酰化乙醛脱氢酶(或编码这样的活性的核酸序列)可以例如选自以下的组：大肠杆菌adhE、溶组织内阿米巴adh2、金黄色葡萄球菌adhE、瘤胃壶菌属(Piromyces)物种E2 adhE、克氏梭菌EDK33116、植物乳杆菌acdH、大肠杆菌eutE、无害李斯特菌acdH和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)YP 001268189。
优选地，具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
最优选地，乙酰化乙醛脱氢酶蛋白是具有乙酰化乙醛脱氢酶活性以及醇脱氢酶活性两者的双功能性蛋白。
可以将编码具有乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中。
对于所列酶的BLAST，合适的酶的实例在下文的表6(a)至表6(e)中进一步展示，给出了合适的替代性醇/乙醛脱氢酶。
表6(a)BLAST查询-来自大肠杆菌的adHE
表6(b)BLAST查询-来自植物乳杆菌的acdH
表6(c)BLAST查询-来自大肠杆菌的eutE
表6(d)BLAST查询-来自无害李斯特菌的Lin1129
表6(e)BLAST查询-来自金黄色葡萄球菌的adhE
乙酰辅酶A合成酶
如果重组酵母细胞功能性地表达具有乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质，则优选地，重组酵母细胞进一步功能性地表达：
-编码具有NAD+依赖性醇脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.1.1.1或EC1.1.1.2)的核酸序列；和/或
-编码具有乙酰辅酶A合成酶活性的蛋白质(EC 6.2.1.1)的核酸序列。
具有乙酰辅酶A合成酶活性的蛋白质在本文中也可以被称为“乙酰辅酶A合成酶蛋白”、“乙酰辅酶A合成酶(acetyl-Coenzyme A synthetase enzyme)”或被简称为“乙酰辅酶A合成酶(acetyl-Coenzyme A synthetase)”或甚至“乙酰辅酶A合成酶(acetyl CoAsynthetase)”。该蛋白质在本文中进一步缩写为“ACS”。
乙酰辅酶A合成酶(也称为乙酸-辅酶A连接酶或乙酰基激活酶)催化从乙酸、辅酶A(coenzyme A、CoA)和ATP形成乙酰辅酶A，如下所示：
ATP+乙酸+辅酶A＝AMP+二磷酸+乙酰辅酶A
应理解，重组酵母细胞可以天然包含编码乙酰辅酶A合成酶蛋白的内源基因。作为其替代或附加，重组酵母细胞可以包含编码具有乙酰辅酶A合成酶活性的蛋白质(EC6.2.1.1)的异源核酸序列。
例如，根据本发明的重组酵母细胞可以包含可存在于野生型细胞中的乙酰辅酶A合成酶，正如例如酿酒酵母的情况一样，酿酒酵母含有由ACS1(氨基酸序列展示为SEQ IDNO:30)和ACS2(氨基酸序列展示为SEQ ID NO:31)基因编码的两种乙酰辅酶A合成酶同工酶(van den Berg等人(1996)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:第28953-28959页，将其通过援引并入本文)，或者宿主细胞可以提供有编码该活性的一个或多个异源基因，例如可以将酿酒酵母的ACS1和/或ACS2基因或其功能性同源物掺入缺乏乙酰辅酶A合成酶同工酶活性的细胞中。
优选地，具有NAD+依赖性乙酰辅酶A合成酶活性的蛋白质包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ IDNO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
优选地，重组酵母细胞是这样的重组酵母细胞，其中内源或异源的乙酰辅酶A合成酶蛋白被过表达，最优选地通过使用如例如WO 2011/010923(将其通过援引并入本文)中所述的合适的启动子。可以将编码具有乙酰辅酶A合成酶活性的蛋白质的任何异源核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中。
表7列出了具有乙酰辅酶A合成酶活性的合适蛋白质的实例。在表7的顶部提到了实例中使用并经BLAST的ACS2。
表7：BLAST查询-来自酿酒酵母的ACS2
醇脱氢酶
如果重组酵母细胞功能性地表达具有乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质，则优选地，重组酵母细胞进一步功能性地表达：
-编码具有NAD+依赖性醇脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.1.1.1或EC1.1.1.2)的核酸序列；和/或
-编码具有乙酰辅酶A合成酶活性的蛋白质(EC 6.2.1.1)的核酸序列。
具有醇脱氢酶活性的蛋白质在本文中也被称为“醇脱氢酶蛋白”、“醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase enzyme)”或被简称为“醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)”。该蛋白质在本文中进一步缩写为“ADH”。
醇脱氢酶催化乙醛转化为乙醇。
应理解，重组酵母细胞可以天然包含编码醇脱氢酶蛋白的内源核酸序列。作为其替代或附加，重组酵母细胞可以包含编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质的异源核酸序列
例如，重组酵母细胞可以天然包含编码醇脱氢酶的基因，正如酿酒酵母的情况一样(天然酿酒酵母醇脱氢酶ADH1、ADH2、ADH3、ADH4和ADH5的氨基酸序列分别展示为SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36)，参见Lutstorf和Megnet,“Multiple Forms of Alcohol Dehydrogenase in Saccharomyces Cerevisiae[酿酒酵母中的多种形式的醇脱氢酶]”,(1968),Arch.Biochem.Biophys.[生物化学和生物物理学档案],第126卷,第933-944页，将其通过援引并入本文；或Ciriacy,“Genetics ofAlcohol Dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae I.Isolation and geneticanalysis of adh mutants[酿酒酵母中醇脱氢酶的遗传学I.adh突变体的分离和遗传分析]”,(1975),Mutat.Res.[突变研究]29,第315-326页，将其通过援引并入本文)。
然而，优选地，重组酵母细胞在具有乙酰化乙醛脱氢酶活性以及醇脱氢酶活性两者的适当地异源的双功能性酶内包含醇脱氢酶活性，如上文所述。也就是说，最优选地，醇脱氢酶蛋白是具有乙酰化乙醛脱氢酶活性以及醇脱氢酶活性两者的双功能性蛋白。当重组酵母细胞包含编码具有乙酰化乙醛脱氢酶活性以及醇脱氢酶活性两者的双功能性蛋白的异源核酸序列时，编码编码醇脱氢酶活性的任何天然蛋白的任何天然核酸序列都可以被破坏和/或缺失或可以不被破坏和/或缺失。
因此，重组酵母细胞可以有利地是功能性地表达以下的重组酵母细胞：
-编码具有以下活性的双功能性蛋白的一个或多个异源核酸序列：NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性(EC 1.2.1.10)；和NAD+依赖性醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1或EC1.1.1.2)；以及
-编码具有乙酰辅酶A合成酶活性的蛋白质(EC 6.2.1.1)的一个或多个天然或异源的核酸序列，
其中任选地，编码具有NAD+依赖性醇脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.1.1.1或EC1.1.1.2)的一个或多个天然核酸序列被破坏或缺失。
替代性地，重组酵母细胞可以有利地是功能性地表达以下的重组酵母细胞：
-编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的单功能性蛋白(EC 1.2.1.10)的一个或多个天然或异源的核酸序列；以及
-编码具有乙酰辅酶A合成酶活性的蛋白质(EC 6.2.1.1)的一个或多个天然或异源的核酸序列；以及
-编码具有NAD+依赖性醇脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.1.1.1或EC1.1.1.2)的一个或多个天然或异源的核酸序列。
上文提供了双功能性蛋白的优选物，并且如针对乙酰化乙醛脱氢酶蛋白所列。如果该蛋白质不是双功能性的，则NAD+依赖性醇脱氢酶蛋白优选地是具有NAD+依赖性醇脱氢酶活性的蛋白质，其包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选与SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
可以将编码具有NAD+依赖性醇脱氢酶活性的蛋白质的任何异源核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中。
PPP基因
本发明中的重组酵母细胞可以进一步包含增加戊糖磷酸途径通量的一个或多个基因修饰。编码该戊糖磷酸途径的基因在本文中也被称为“PPP”基因。
在优选的宿主细胞中，基因修饰包括(非氧化部分)戊糖磷酸途径的至少一种酶的过表达。优选地，该酶选自由以下组成的组：编码核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮酶和转醛醇酶的酶。可以过表达(非氧化部分)戊糖磷酸途径的酶的多种组合。例如，过表达的酶可以是至少核酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶；或至少核酮糖-5-磷酸异构酶和转酮酶；或至少核酮糖-5-磷酸异构酶和转醛醇酶；或至少核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转酮酶；或至少核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛醇酶；或至少转酮酶和转醛醇酶；或至少核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮酶和转醛醇酶；或至少核酮糖-5-磷酸异构酶、转酮酶和转醛醇酶；或至少核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛醇酶；或至少核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转酮酶。
可能的是，在宿主细胞中过表达核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮酶和转醛醇酶中的每一种。更优选的是这样的宿主细胞，其中基因修饰至少包括转酮酶和转醛醇酶两者的过表达。
在本文中将“核酮糖5-磷酸差向异构酶”(EC 5.1.3.1)定义为催化D-木酮糖5-磷酸向D-核酮糖5-磷酸的差向异构化(反之亦然)的酶。该酶也被称为磷酸核酮糖差向异构酶；赤藓糖-4-磷酸异构酶；磷酸戊酮糖3-差向异构酶；木酮糖磷酸3-差向异构酶；磷酸戊酮糖差向异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；D-核酮糖磷酸-3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖-5-P 3-差向异构酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；戊糖-5-磷酸3-差向异构酶；或D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。核酮糖5-磷酸差向异构酶可以进一步由其氨基酸序列定义。同样地，核酮糖5-磷酸差向异构酶可以由编码酶的核苷酸序列以及与编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列在本文中被称为RPE1。
在本文中将“核酮糖5-磷酸异构酶”(EC 5.3.1.6)定义为催化D-核糖5-磷酸向D-核酮糖5-磷酸的直接异构化(反之亦然)的酶。该酶也被称为磷酸戊糖异构酶；磷酸核糖异构酶；核糖磷酸异构酶；5-磷酸核糖异构酶；D-核糖5-磷酸异构酶；D-核糖-5-磷酸酮醇-异构酶；或D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-异构酶。核酮糖5-磷酸异构酶可以进一步由其氨基酸序列定义。同样地，核酮糖5-磷酸异构酶可以由编码酶的核苷酸序列以及与编码核酮糖5-磷酸异构酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸异构酶的核苷酸序列在本文中被称为RKI1。
在本文中将“转酮酶”(EC 2.2.1.1)定义为催化以下反应的酶：D-核糖5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸<->景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸，反之亦然。该酶也被称为转羟乙醛基酶或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸转羟乙醛基酶。转酮酶可以进一步由其氨基酸定义。同样地，转酮酶可以由编码该酶的核苷酸序列以及由与编码转酮酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮酶的核苷酸序列在本文中被称为TKL1。
在本文中将“转醛醇酶”(EC 2.2.1.2)定义为催化以下反应的酶：景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸<->D-赤藓糖4-磷酸+D-果糖6-磷酸，反之亦然。该酶也被称为二羟基丙酮转移酶；二羟基丙酮合酶；甲醛转酮酶；或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸甘油酮转移酶。转醛醇酶可以进一步由其氨基酸序列定义。同样地，转醛醇酶可以由编码酶的核苷酸序列以及与编码转醛醇酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮酶的核苷酸序列在本文中被称为TAL1。
甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或甘油3-磷酸脱氢酶的缺失或破坏
重组酵母细胞进一步可以包含或可以不包含编码甘油3-磷酸磷酸水解酶基因和/或编码甘油3-磷酸脱氢酶基因的一个或多个内源核苷酸序列的缺失或破坏。
优选地，降低或缺失酵母细胞中NADH依赖性甘油合成所需的酶活性。甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或甘油3-磷酸脱氢酶的酶活性的降低或缺失可以通过以下方式来实现：修饰编码NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)的一个或多个基因和/或编码甘油磷酸磷酸酶(GPP)的一个或多个基因，使得酶的表达大大低于野生型或使得基因编码活性降低的多肽。这样的修饰可以使用通常已知的生物技术进行，并且可以特别地包括编码GPD和/或GPP的结构基因的启动子区或编码区的一个或多个敲除突变或定点诱变。替代性地，可以通过随机诱变、然后选择GPD和/或GPP活性降低或不存在的菌株来获得甘油生产有缺陷的酵母菌株。酿酒酵母GPD1、GPD2、GPP1和GPP2基因示于WO 2011010923中，并且公开于该申请的SEQID NO:24-27中。
优选地，重组酵母是这样的重组酵母，其进一步包含甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。甘油磷酸磷酸酶(GPP)基因中的一个或多个可以被缺失或破坏或可以不被缺失或破坏。
更优选地，重组酵母是这样的重组酵母，其包含甘油-3-磷酸脱氢酶1(GPD1)基因的缺失或破坏。甘油-3-磷酸脱氢酶2(GPD2)基因可以被缺失或破坏或可以不被缺失或破坏。
最优选地，重组酵母是这样的重组酵母，其包含甘油-3-磷酸脱氢酶1(GPD1)基因的缺失或破坏，而甘油-3-磷酸脱氢酶2(GPD2)基因保持活性和/或完整。因此，优选地，酿酒酵母GPD1、GPD2、GPP1和GPP2基因中的仅一个被破坏和缺失，而最优选地，仅选自由GPD1、GPD2、GPP1和GPP2基因组成的组的GPD1被破坏或缺失。
不希望受任何类型的理论的约束，据信根据本发明的重组酵母(其中GPD1基因而不是GPD2基因被缺失或破坏)当应用于以下发酵方法中时可以是有利的，在该发酵方法中，葡萄糖在发酵开始时或发酵期间优选地等于或大于80g/L，更优选等于或大于90g/L，甚至更优选等于或大于100g/L，还更优选等于或大于110g/L，又甚至更优选等于或大于120g/L、等于或大于130g/L、等于或大于140g/L、等于或大于150g/L、等于或大于160g/L、等于或大于170g/L或者等于或大于180g/L。
优选地，至少一个编码GPD的基因和/或至少一个编码GPP的基因被完全缺失，或者编码对其活性必需的酶的一部分的基因的至少一部分被缺失。用酿酒酵母细胞可以获得良好的结果，其中GPD1基因和/或GPD2基因的可读框已经失活。结构基因(靶基因)的失活可以由本领域技术人员通过合成地合成或以其他方式构建由侧翼为这样的DNA序列的选择标记基因组成的DNA片段来完成，这些DNA序列与待缺失的宿主细胞基因组区域侧翼的序列相同。适当地，通过整合标记基因kanMX和hphMX4使酿酒酵母中的GPD1和GPD2基因失活可以获得良好的结果。随后，将该DNA片段转化到宿主细胞中。检查表达显性标记基因的转化细胞是否正确替换了被设计为缺失的区域，例如通过诊断聚合酶链式反应或Southern杂交。
因此，在本发明的重组酵母细胞中，可以有利地降低细胞中的甘油3-磷酸磷酸水解酶活性和/或细胞中的甘油3-磷酸脱氢酶活性。
甘油再摄取
重组酵母细胞可以进一步包含或可以不进一步包含作为甘油再摄取途径的一部分的一个或多个另外的核酸序列。也就是说，重组酵母细胞可以进一步包含或可以不进一步包含：
-编码甘油脱氢酶的一个或多个异源核酸序列；和/或
-编码二羟基丙酮激酶的一个或多个同源或异源的核酸序列；和/或
-编码甘油转运蛋白的一个或多个异源核酸序列。
因此，在一个优选的实施例中，重组酵母细胞是功能性地表达以下的重组酵母细胞：
-编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)的一个或多个异源核酸序列和任选地编码Rubisco的分子伴侣的一个或多个核酸序列；
-编码磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)的一个或多个异源核酸序列；
-编码转酮酶(EC 2.2.1.1)的一个或多个核酸序列，其中该转酮酶在启动子(“TKL”启动子)的控制下，该启动子的TKL表达比率厌氧/好氧为2或更高；
-编码甘油脱氢酶的一个或多个异源核酸序列；
-编码二羟基丙酮激酶的一个或多个同源或异源的核酸序列；以及
-任选地，编码甘油转运蛋白的一个或多个异源核酸序列。
不希望受任何类型的理论的约束，据信进一步包含甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶和任选地甘油转运蛋白的组合的重组酵母细胞具有更高乙醇产率形式的改善的总体性能。
在一个替代性的优选的实施例中，重组酵母细胞是不功能性地表达以下的重组酵母细胞：
-编码甘油脱氢酶的一个或多个异源核酸序列；和/或
-编码二羟基丙酮激酶的一个或多个异源核酸序列；和/或
-编码甘油转运蛋白的一个或多个异源核酸序列。
不希望受任何类型的理论的约束，据信在不存在这种甘油再摄取途径的这些特征中的一个或多个的情况下，获得的重组酵母细胞具有非常低的葡萄糖和/或其他糖积累，并且当应用于包含大量糖的培养基中时具有改善的稳健性。因此，当应用于以下发酵方法中时，不包含以下中的一种或多种的重组酵母细胞的应用可以是有利的：异源和/或同源的甘油脱氢酶；异源和/或同源的二羟基丙酮激酶；和/或异源和/或同源的甘油转运蛋白，在该发酵方法中葡萄糖在发酵开始时或发酵期间优选地等于或大于80g/L，更优选等于或大于90g/L，甚至更优选等于或大于100g/L，还更优选等于或大于110g/L，又甚至更优选等于或大于120g/L、等于或大于130g/L、等于或大于140g/L、等于或大于150g/L、等于或大于160g/L、等于或大于170g/L或者等于或大于180g/L。
因此，最优选地，重组酵母是功能性地表达以下的重组酵母：
-编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)的一个或多个异源核酸序列和任选地编码Rubisco的分子伴侣的一个或多个核酸序列；
-编码磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)的一个或多个异源核酸序列；
-编码转酮酶(EC 2.2.1.1)的一个或多个核酸序列，其中该转酮酶在启动子(“TKL”启动子)的控制下，该启动子的TKL表达比率厌氧/好氧为2或更高；
其中重组酵母细胞不功能性地表达
-编码甘油脱氢酶的一个或多个异源核酸序列；和/或
-编码二羟基丙酮激酶的一个或多个异源核酸序列；和/或
-编码甘油转运蛋白的一个或多个异源核酸序列。
甘油脱氢酶
如上文所指示，重组酵母细胞可以功能性地表达或可以不功能性地表达
-编码具有甘油脱氢酶活性的蛋白质(E.C.1.1.1.6)的核酸序列；
-编码具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核酸序列；以及
-任选地编码具有甘油转运蛋白活性的蛋白质的核酸序列。
因此，重组酵母细胞可以功能性地表达或可以不功能性地表达编码甘油脱氢酶的一个或多个优选地异源的核酸序列。
如果存在甘油脱氢酶，则重组酵母细胞可以包含NAD+连接的甘油脱氢酶(EC1.1.1.6)和/或NADP+连接的甘油脱氢酶(EC 1.1.1.72)。也就是说，重组酵母细胞可以包含或可以不包含编码具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.1.1.6)的核酸序列和/或编码具有NADP+依赖性甘油脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.1.1.72)的核酸序列。
在一个实施例中，具有甘油脱氢酶活性的蛋白质优选地是具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.1.1.6)；并且优选地，重组酵母细胞功能性地表达编码具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.1.1.6)的核酸序列。这种蛋白质可以来自细菌来源或例如来自真菌来源。一个实例是来自大肠杆菌(E.coli)的gldA。
在一个替代性的或另外的实施例中，可以存在NADP+依赖性甘油脱氢酶(EC1.1.1.72)。
如果存在甘油脱氢酶，则NAD+连接的甘油脱氢酶是优选的。
具有甘油脱氢酶活性的蛋白质在本文中也被称为“甘油脱氢酶蛋白”、“甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase enzyme)”或被简称为“甘油脱氢酶(glyceroldehydrogenase)”。以此类推，具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的蛋白质在本文中也被称为“NAD+依赖性甘油脱氢酶蛋白”、“NAD+依赖性甘油脱氢酶(NAD+dependent glyceroldehydrogenase enzyme)”或被简称为“NAD+依赖性甘油脱氢酶(NAD+dependent glyceroldehydrogenase)”。甘油脱氢酶缩写为GLD。
甘油脱氢酶和编码这种甘油脱氢酶的核酸序列的优选物如WO 2015028582(通过援引并入本文)中所述。
NAD+依赖性甘油脱氢酶(EC 1.1.1.6)是催化以下化学反应的酶：
因此，该酶的两种底物是甘油和NAD+，而其三种产物是甘油酮、NADH和H+。甘油酮和二羟基丙酮在本文中是同义词。
甘油脱氢酶属于氧化还原酶家族，特别是以NAD+或NADP+作为受体作用于供体的CH-OH基团的氧化还原酶。该酶类的系统名称是甘油:NAD+2-氧化还原酶。常用的其他名称包括甘油(glycerin)脱氢酶和NAD+连接的甘油脱氢酶。该酶参与甘油脂代谢。甘油脱氢酶蛋白可以进一步由其氨基酸序列定义。同样地，甘油脱氢酶蛋白可以进一步由编码甘油脱氢酶蛋白的核苷酸序列定义。如上文在定义下详细解释的，由编码酶的核苷酸序列定义的某种甘油脱氢酶蛋白包括(除非另有限制)与编码甘油脱氢酶蛋白的这种核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
编码具有甘油脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列可以是异源核酸序列。具有甘油脱氢酶活性的蛋白质可以是具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的异源蛋白。
如果重组酵母细胞包含编码甘油脱氢酶的一个或多个异源核酸序列，则重组酵母细胞优选地进一步包含合适的辅因子以增强甘油脱氢酶的活性。例如，重组酵母细胞可以包含锌、锌离子或锌盐和/或一种或多种将此等包括在细胞中的途径。
具有甘油脱氢酶活性的异源蛋白的合适的实例分别包括肺炎克雷伯菌、产气肠球菌、阿氏耶尔森菌和大肠杆菌的甘油脱氢酶蛋白。这样的蛋白质的氨基酸序列已经分别由SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40展示。
因此，重组酵母细胞可以包括或可以不包括具有SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和/或SEQ ID NO:40的氨基酸序列的一种或多种适当地异源的甘油脱氢酶蛋白；和/或其功能性同源物，这些功能性同源物包含与SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39和/或SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和/或其功能性同源物，这些功能性同源物包含与SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和/或SEQ ID NO:40的氨基酸序列相比具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失的氨基酸序列，其中更优选地，与SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39和/或SEQ ID NO:40的氨基酸序列相比，这样的功能性同源物的氨基酸序列具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失。
优选的甘油脱氢酶蛋白是由来自大肠杆菌的gldA基因编码的甘油脱氢酶蛋白。SEQ ID NO:40显示了由来自大肠杆菌的gldA基因编码的该优选的NAD+依赖性甘油脱氢酶蛋白的氨基酸序列。大肠杆菌的gldA基因的核酸序列由SEQ ID NO:41展示。
如果重组酵母细胞包含编码甘油脱氢酶的一个或多个异源核酸序列，则因此，重组酵母细胞最优选地包含衍生自大肠杆菌的编码具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的蛋白质(E.C.1.1.1.6)的异源核苷酸序列，任选地针对宿主细胞进行密码子优化，如由SEQ IDNO:41中显示的核酸序列所示例。
因此，优选地，编码具有甘油脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:41的核酸序列；或者
-SEQ ID NO:41的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:41的核酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:41的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:41的核酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:41的核酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个核酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
如果重组酵母细胞包含编码甘油脱氢酶的一个或多个异源核酸序列，则因此，重组酵母细胞最优选地包含衍生自大肠杆菌的编码甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)的一个或多个核苷酸序列，任选地针对宿主细胞进行密码子优化。可以将编码甘油脱氢酶蛋白的这种异源核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中，例如如WO 2015/028583(通过援引并入本文)的实例中所述。
合适的甘油脱氢酶的另外的实例列于表8(a)至8(d)中。在每个表的顶部，提到了且经BLAST的gldA。
表8(a)：BLAST查询-来自大肠杆菌的gldA
描述 同一性(％) 登录号
甘油脱氢酶，NAD[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655] 100 NP_418380.4
甘油脱氢酶[大肠杆菌O127:H6菌株E2348/69] 99 YP_002331714.1
甘油脱氢酶[杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)] 94 WP_006686227.1
甘油脱氢酶[弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)] 92 WP_003840533.1
表8(b)：BLAST查询-来自肺炎克雷伯菌的gldA
表8(c)：BLAST查询-来自产气肠球菌的gldA
表8(d)：BLAST查询-来自阿氏耶尔森菌的gldA
二羟基丙酮激酶
如上文所指示，重组酵母细胞可以功能性地表达或可以不功能性地表达
-编码具有甘油脱氢酶活性的蛋白质(E.C.1.1.1.6)的核酸序列；
-编码具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核酸序列；以及
-任选地编码具有甘油转运蛋白活性的蛋白质的核酸序列。
也就是说，重组酵母细胞可以功能性地表达或可以不功能性地表达编码二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的一个或多个同源或异源的核酸序列，
具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质在本文中也被称为“二羟基丙酮激酶蛋白”、“二羟基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase enzyme)”或被简称为“二羟基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase)”。二羟基丙酮激酶在本文中缩写为DAK。
二羟基丙酮激酶和编码这种二羟基丙酮激酶的核酸序列的优选物如WO2015028582(通过援引并入本文)中所述。
具有二羟基激酶活性的蛋白质可以适当地属于E.C.2.7.1.28和/或E.C.2.7.1.29的酶类别。因此，重组酵母细胞适当地功能性地表达编码具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质(E.C.2.7.1.28和/或E.C.2.7.1.29)的核酸序列。
在本文中将二羟基丙酮激酶优选地理解为催化以下化学反应的酶(EC2.7.1.29)：
和/或催化以下化学反应的酶(EC 2.7.1.28)：
二羟基丙酮激酶常用的其他名称包括甘油酮激酶、ATP:甘油酮磷酸转移酶和(磷酸化)丙酮醇激酶。应进一步理解，甘油酮和二羟基丙酮是相同的分子。二羟基丙酮激酶蛋白可以进一步由其氨基酸序列定义。同样地，二羟基丙酮激酶蛋白可以进一步由编码二羟基丙酮激酶蛋白的核苷酸序列定义。如上文在定义下详细解释的，由编码酶的核苷酸序列定义的某种二羟基丙酮激酶蛋白包括(除非另有限制)与编码二羟基丙酮激酶蛋白的这种核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
如果存在，则重组酵母细胞优选地功能性地表达编码具有二羟基丙酮激酶活性的天然蛋白的核酸序列。更优选地，编码具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质的核酸序列是天然核酸序列。
酵母包含二羟基丙酮激酶的两种天然同工酶(DAK1和DAK2)。根据本发明，这些天然二羟基丙酮激酶是优选的。优选地，宿主细胞是酿酒酵母细胞；并且优选地，以上天然二羟基丙酮激酶是酿酒酵母细胞的天然二羟基丙酮激酶。酿酒酵母的天然二羟基丙酮激酶蛋白DAK1和DAK2的氨基酸序列已经分别由SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43展示。编码这些天然二羟基丙酮激酶蛋白DAK1和DAK2的核酸序列已经分别由SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48展示。
重组酵母细胞也可以功能性地表达编码具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质的核酸序列，其中核酸序列是异源核酸序列，对应地其中蛋白质是异源蛋白。在实施例中，重组酵母细胞包含编码二羟基丙酮激酶的异源基因。合适的异源基因包括编码来自以下的二羟基丙酮激酶的基因：库德里阿兹威酵母、拜氏结合酵母、乳酸克鲁维酵母、光滑假丝酵母、解脂耶氏酵母、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、解脂耶氏酵母、粟酒裂殖酵母、富氏葡萄孢盘菌和皮炎外瓶霉。优选的具有二羟基丙酮激酶活性的异源蛋白包括分别衍生自肺炎克雷伯菌、解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母的异源蛋白，如分别由SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46所展示。
重组酵母细胞可以包含或可以不包含引起二羟基丙酮激酶过表达(例如，通过过表达编码具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质的核酸序列)的基因修饰。编码二羟基丙酮激酶的核苷酸序列对于细胞可以是天然的或异源的。可以用于在本发明的细胞中过表达二羟基丙酮激酶的核酸序列是例如来自酿酒酵母(DAK1)和(DAK2)的二羟基丙酮激酶基因，如例如以下文献所述：Molin等人,“Dihydroxy-acetone kinases in Saccharomycescerevisiae are involved in detoxification of dihydroxyacetone[酿酒酵母中的二羟基丙酮激酶参与二羟基丙酮的解毒]”(2003),J.Biol.Chem.[生物化学杂志],第278卷:第1415-1423页，将其通过援引并入本文。在优选的实施例中，过表达编码二羟基丙酮激酶的密码子优化的(参见上文)核苷酸序列，例如像编码SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的二羟基丙酮激酶的密码子优化的核苷酸序列。
如上文所指示，编码酿酒酵母中的二羟基丙酮激酶蛋白DAK1和DAK2的天然核酸序列已经分别由SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48展示。
优选地，重组酵母细胞包含增加细胞中任何二羟基丙酮激酶的比活性的基因修饰。例如，重组酵母细胞可以包含编码过表达的一种或多种天然和/或异源二羟基丙酮激酶蛋白(诸如DAK1和/或DAK2)的一个或多个天然和/或异源核酸序列。天然二羟基丙酮激酶(诸如DAK1和/或DAK2)可以例如经由一种或多种基因修饰过表达，使得编码二羟基丙酮激酶的基因的拷贝多于存在于非基因修饰的细胞中的拷贝，和/或可以应用非天然启动子。
优选地，重组酵母细胞是这样的重组酵母细胞，其中编码具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质的核酸序列的表达在启动子的控制下。启动子可以例如是对于宿主细胞中的另一个基因天然的启动子。
为了过表达编码二羟基丙酮激酶的核苷酸序列，可以将核苷酸序列(待过表达)置于表达构建体中，其中它可操作地连接到合适的表达调控区/序列，以确保在将表达构建体转化至本发明的宿主细胞中后二羟基丙酮激酶的过表达(参见上文)。用于(过)表达编码具有二羟基丙酮激酶活性的酶的核苷酸序列的合适的启动子包括优选地对分解代谢物(葡萄糖)抑制不敏感、在厌氧条件下有活性和/或优选地不需要木糖或阿拉伯糖来诱导的启动子。上文给出了这样的启动子的实例。与除引起过表达的基因修饰外在遗传上相同的菌株相比，被过表达的二羟基丙酮激酶优选地被过表达至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。优选地，与除引起过表达的基因修饰外在遗传上相同的菌株相比，二羟基丙酮激酶在厌氧条件下被过表达至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。应理解，这些过表达水平可以适用于酶活性(细胞中的比活性)的稳态水平、酶蛋白的稳态水平以及细胞中编码酶的转录物的稳态水平。宿主细胞中核苷酸序列的过表达产生至少0.002、0.005、0.01、0.02或0.05U min-1(mg蛋白质)-1的比二羟基丙酮激酶活性，在30℃下在转化宿主细胞的细胞提取物中确定，如例如WO 2013/081456的实例中所述。
最优选的二羟基丙酮激酶蛋白是由来自酿酒酵母的Dak1基因编码的二羟基丙酮激酶蛋白。SEQ ID NO:42显示了由来自酿酒酵母的Dak1基因编码的合适的二羟基丙酮激酶蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:47展示了Dak1基因自身的核酸序列。
如果重组酵母细胞包含编码二羟基丙酮激酶的一个或多个过表达的核酸序列，则重组酵母细胞因此最优选地包含编码衍生自酿酒酵母的二羟基丙酮激酶的一个或多个过表达的核苷酸序列，如由SEQ ID NO:47中显示的核酸序列所示例。
因此，优选地，具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或者
-SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45或SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45或SEQ ID NO:46的氨基酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的氨基酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个氨基酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的蛋白质及其功能性同源物是最优选的。
优选地，编码具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质的核酸序列包含以下或由以下组成：
-SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的核酸序列；或者
-SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的功能性同源物，该功能性同源物与SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性；或者
-SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的功能性同源物，该功能性同源物当与SEQ IDNO:47或SEQ ID NO:48的核酸序列相比时具有一个或多个突变、取代、插入和/或缺失，更优选当与SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的核酸序列相比时具有不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过150个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个或不超过5个核酸突变、取代、插入和/或缺失的功能性同源物。
可以将编码二羟基丙酮激酶蛋白的核酸序列(例如，基因)适当地掺入重组酵母细胞的基因组中。
合适的二羟基丙酮激酶的实例列于表9(a)至9(d)中。在每个表的顶部，提到了在实例中使用且经BLAST的DAK。
表9(a)：BLAST查询-来自酿酒酵母的DAK1
表9(b)：BLAST查询-来自肺炎克雷伯菌的dhaK
描述 同一性(％) 登录号
二羟基丙酮激酶亚基DhaK[肺炎克雷伯菌342] 100 YP_002236493.1
二羟基丙酮激酶亚基K[肺炎克雷伯菌] 99 WP_004149886.1
二羟基丙酮激酶亚基K[产气肠杆菌] 96 WP_020077889.1
二羟基丙酮激酶亚基DhaK[大肠杆菌IAI39] 88 YP_002407536.1
二羟基丙酮激酶，DhaK亚基[大肠杆菌] 87 WP_001398949.1
表9(c)：BLAST查询-来自解脂耶氏酵母的DAK1
表9(d)：BLAST查询-来自粟酒裂殖酵母的DAK1
甘油转运蛋白
重组酵母细胞可以任选地包含(即，可以包含或可以不包含)编码甘油转运蛋白的核苷酸序列。这种甘油转运蛋白可以允许将任何甘油转运至细胞中并且转化为乙醇，甘油是在培养基中外部可获得的(例如，来自玉米醪中的回流)或在内部细胞合成后分泌的。
如果存在甘油转运蛋白，则重组酵母优选地包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或其功能性同源物表示的异源甘油转运蛋白的一个或多个核酸序列，该功能性同源物与SEQ ID NO:49和/或SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
在实施例中，重组酵母可以进一步包含编码甘油输出蛋白(例如，FPS1)的或多个内源核苷酸序列的缺失或破坏。
重组表达
重组酵母细胞是这样的重组细胞。也就是说，重组酵母细胞包含在所讨论的细胞中非天然存在的核苷酸序列，或者用该核苷酸序列转化或用该核苷酸序列基因修饰。用于在细胞中重组表达酶以及用于对重组酵母细胞进行另外的基因修饰的技术是本领域技术人员熟知的。典型地，这样的技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。这样的方法例如从标准手册中获知，诸如Sambrook和Russel(2001)“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”[“分子克隆：实验室手册”],(第3版),由Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社]出版，或F.Ausubel等人编辑,“Currentprotocols in molecular biology”[“分子生物学的当前方案”],Green Publishing andWiley Interscience[格林出版公司与美国威立出版公司],纽约(1987)。用于对真菌宿主细胞进行转化和基因修饰的方法从例如EP-A-0635574、WO 98/46772、WO 99/60102、WO 00/37671、WO 90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6265186获知。
发酵方法
本发明进一步提供了用于生产乙醇的方法，该方法包括使用如本说明书中所述的重组酵母细胞转化碳源、优选碳水化合物或另一种有机碳源，从而形成乙醇。
用于该发酵方法的进料适当地包含一种或多种可发酵碳源。可发酵碳源优选地包含一种或多种可发酵碳水化合物或由其组成。更优选地，可发酵碳源包含一种或多种单糖、二糖和/或多糖。例如，可发酵碳源可以包含一种或多种选自由以下组成的组的碳水化合物：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和海藻糖。优选地包含一种或多种碳水化合物或由其组成的可发酵碳源可以适当地从淀粉、纤维素、半纤维素、木质纤维素和/或果胶获得。适当地，可发酵碳源可以呈优选地水性的浆料、悬浮液或液体的形式。
发酵期间可发酵碳水化合物(例如像葡萄糖)的浓度优选地等于或大于80g/L。也就是说，在发酵开始时葡萄糖的初始浓度优选地等于或大于80g/L，更优选等于或大于90g/L，甚至更优选等于或大于100g/L，还更优选等于或大于110g/L，又甚至更优选等于或大于120g/L、等于或大于130g/L、等于或大于140g/L、等于或大于150g/L、等于或大于160g/L、等于或大于170g/L或者等于或大于180g/L。发酵的开始可以是使可发酵碳水化合物与本发明的重组细胞接触的时刻。
可发酵碳源可以通过使淀粉、木质纤维素和/或果胶与酶组合物接触来制备，其中产生一种或多种单糖、二糖和/或多糖，并且其中产生的单糖、二糖和/或多糖随后被发酵以得到发酵产物。
在酶处理前，可以预处理木质纤维素材料。预处理可以包括使木质纤维素材料暴露于酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧，机械粉碎，研磨，碾磨或快速减压，或其任何两种或更多种的组合。通常将该化学预处理与热预处理(例如，在150℃-220℃之间持续1至30分钟)组合。随后，可以对预处理的材料进行酶水解以释放可以根据本发明发酵的糖。这可以用常规方法进行，例如与纤维素酶(例如，一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种β-葡糖苷酶和任选地其他酶)接触。可以在环境温度或更高温度下，在释放足够量的一种或多种糖的反应时间下，用纤维素酶进行转化。酶水解的结果是包含C5/C6糖的水解产物，在本文中称为糖组合物。
在一个实施例中，可发酵碳水化合物是诸如玉米秸秆或玉米纤维水解产物的生物质水解产物或由其组成。这种生物质水解产物反过来可以包含或衍生自玉米秸秆和/或玉米纤维。
在本文中将“水解产物”理解为包含多糖的材料(诸如玉米秸秆、玉米淀粉、玉米纤维或木质纤维素材料)，这些多糖已经通过加水解聚以形成单糖和寡糖。水解产物可以通过含多糖材料的酶水解或酸水解产生。
生物质水解产物可以是木质纤维素生物质水解产物。本文的木质纤维素包括生物质的半纤维素和半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可以在以下列表中找到：果园底料、查帕拉尔群落、磨坊废弃物、城市木材废弃物、市政废弃物、砍伐废弃物、森林抚育间伐废弃物(forest thinning)、短期轮种木本作物、工业废弃物、小麦秸秆、燕麦秸秆、稻秸秆、大麦秸秆、黑麦秸秆、亚麻秸秆、大豆壳、稻壳、稻秸秆、玉米谷蛋白饲料(corn gluten feed)、燕麦壳、甘蔗、玉米秸秆、玉米秆、玉米芯、玉米皮、柳枝稷、芒草、甜高粱、卡诺拉油菜茎、大豆茎、草原禾草、鸭茅状磨擦禾、狐尾草；甜菜渣、柑橘果渣、种子壳、纤维素动物粪便、草坪修剪废弃物(lawn clipping)、棉花、海草、藻类(包括大型藻类和微型藻类)、树木、软木材、硬木材、杨树、松树、灌木(shrub)、草、小麦、小麦秸秆、甘蔗渣、玉米、玉米皮、玉米芯、玉米粒、来自谷粒的纤维、来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物、市政固体废弃物、废纸、庭院废弃物、草本材料、农业残余物、林业残余物、市政固体废弃物、废纸、纸浆、造纸厂残余物、树枝、灌木(bush)、甘蔗、玉米、玉米皮、能源作物、森林、水果、花、谷物、草、草本作物、叶、树皮、针叶、原木、根、幼树、灌木(shrub)、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、藤本植物、甜菜渣、小麦麸皮、燕麦壳、硬木材或软木材、由农业过程产生的有机废弃物材料、林业木材废弃物，或其任何两种或更多种的组合。藻类(诸如大型藻类和微型藻类)具有以下优点：它们可以包含大量的糖醇(诸如山梨糖醇和/或甘露糖醇)。可以被认为是潜在的可再生原料的木质纤维素通常包含多糖纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖和木葡聚糖)。此外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖在协同作用的不同酶的作用下发生酶水解成为可溶性糖(包括单体和多聚体两者，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸以及其他己糖和戊糖)。此外，果胶和其他果胶物质(诸如阿拉伯聚糖)可以占来自非木本植物组织的典型的细胞壁干质量的相当大的比例(约四分之一至二分之一的干质量可以是果胶)。可以预处理木质纤维素材料。预处理可以包括使木质纤维素材料暴露于酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧，机械粉碎，研磨，碾磨或快速减压，或其任何两种或更多种的组合。通常将这种化学预处理与热预处理(例如，在150℃-220℃之间持续1至30分钟)组合。
用于生产乙醇的方法可以包括好氧增殖步骤和厌氧发酵步骤。更优选地，根据本发明的方法是包括以下步骤的方法：好氧增殖步骤，其中重组酵母细胞的群体增加；以及厌氧发酵步骤，其中通过使用重组酵母细胞群体将碳源转化为乙醇。
在本文中将增殖理解为使得初始重组酵母细胞群体增加的重组酵母细胞生长的过程。增殖的主要目的是使用重组酵母细胞作为活生物体的自然繁殖能力来增加重组酵母细胞的群体。也就是说，增殖是为了生物质的生产，而不是为了乙醇的生产。增殖条件可以包括适当的碳源、通气、温度和营养物添加。增殖是好氧过程，因此增殖罐必须适当通气以维持一定水平的溶解氧。通常通过在进入增殖罐的管道上安装的空气电感器来实现适当的通气，该空气电感器在罐填充时和在再循环期间将空气引入增殖混合物中。增殖混合物保留溶解氧的能力随添加的空气量和混合物稠度变化，这是通常以50:50至90:10之间的醪液与水的比率添加水的原因。“粘稠的”增殖混合物(80:20及更高的醪液与水的比率)通常需要添加压缩空气来弥补降低的保留溶解氧的能力。增殖混合物中溶解氧的量也随气泡尺寸变化，因此一些乙醇工厂通过与空气电感器相比产生更小气泡的喷洒器添加空气。适当的通气以及较低的葡萄糖对于促进增殖期间的好氧呼吸是重要的，使得增殖期间的环境不同于发酵期间的厌氧环境。
在本文中将厌氧发酵过程理解为在厌氧条件下运行的发酵步骤。
厌氧发酵优选地在对于细胞最佳的温度下运行。因此，对于大部分重组酵母细胞，发酵过程在低于约50℃、低于约42℃或低于约38℃的温度下进行。对于重组酵母细胞或丝状真菌宿主细胞，发酵过程优选地在低于约35℃、约33℃、约30℃或约28℃的温度且高于约20℃、约22℃或约25℃的温度下进行。
在根据本发明的方法中，基于木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％。在本文中将乙醇产率定义为理论最大产率的百分比。
根据本发明的方法以及其中适当地包括的增殖步骤和/或发酵步骤可以以分批、补料分批或连续模式进行。也可以应用分步水解和发酵(separate hydrolysis andfermentation，SHF)工艺或同时糖化和发酵(simultaneous saccharification andfermentation，SSF)工艺。
优选的碳源
本发明进一步提供了用于生产乙醇的方法，该方法包括使用如本说明书中所述的重组酵母细胞转化碳源、优选碳水化合物或另一种有机碳源，从而形成乙醇。
根据本发明的重组酵母和方法有利地允许在发酵结束时更少的残余糖和/或更高的乙醇产量更稳健的方法。
因此，有利地，该方法或该方法期间的任何厌氧发酵可以在高浓度的二糖、寡糖和/或多糖存在下进行。寡糖在本文中理解为包含3至30个糖单元、更优选3至10个糖单元和最优选3至5个糖单元的糖。
优选地，用于生产乙醇的方法中的碳源包含一种或多种二糖和/或寡糖。更优选地，基于碳源中存在的糖类的重量，二糖和/或寡糖的总重量百分比等于或大于1％w/w、等于或大于2％w/w、等于或大于3％w/w、等于或大于5％w/w、等于或大于10％w/w或等于或大于20％w/w。最优选地，基于碳源中存在的糖类的重量，二糖和/或寡糖的总重量百分比在等于或大于1％w/w至等于或小于100％w/w的范围内，更优选地在等于或大于2％w/w至等于或小于60％w/w的范围内，以及最优选地在等于或大于5％w/w至等于或小于50％w/w的范围内。
更优选地，碳源是包含以下的碳源：
-葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和/或果糖；以及另外
-麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖和/或潘糖。
更优选地，根据本发明的方法中的碳源包含一种或多种含有α-1,6-糖苷键的化合物。
因此，该方法(对应地其中的任何厌氧发酵步骤)优选使用包含以下的碳源进行：
-以下的麦芽糖浓度：1g/L或更大、2g/L或更大、3g/L或更大、4g/L或更大、5g/L或更大、10g/L或更大、15g/L或更大、20g/L或更大、25g/L或更大、30g/L或更大、40g/L或更大、50g/L或更大、75g/L或更大或100g/L或更大，或者可以例如在1g/L-200g/L、1g/L-100g/L或3g/L-50g/L的范围内；和/或
-以下的异麦芽糖浓度：1g/L或更大、2g/L或更大、3g/L或更大、4g/L或更大、5g/L或更大、10g/L或更大、15g/L或更大、20g/L或更大、25g/L或更大、30g/L或更大、40g/L或更大、50g/L或更大、75g/L或更大或100g/L或更大，或者可以例如在1g/L-200g/L、1g/L-100g/L或3g/L-50g/L的范围内；和/或
-以下的麦芽三糖浓度：1g/L或更大、2g/L或更大、3g/L或更大、4g/L或更大、5g/L或更大、10g/L或更大、15g/L或更大、20g/L或更大、25g/L或更大、30g/L或更大、40g/L或更大、50g/L或更大、75g/L或更大或100g/L或更大，或者可以例如在1g/L-200g/L、1g/L-100g/L或3g/L-50g/L的范围内；和/或
-以下的潘糖浓度：1g/L或更大、2g/L或更大、3g/L或更大、4g/L或更大、5g/L或更大、10g/L或更大、15g/L或更大、20g/L或更大、25g/L或更大、30g/L或更大、40g/L或更大、50g/L或更大、75g/L或更大或100g/L或更大，或者可以例如在1g/L-200g/L、1g/L-100g/L或3g/L-50g/L的范围内；和/或
-以下的DP4+浓度(即包含4个或更多个单糖(例如葡萄糖)单元的寡糖的总量或浓度)：1g/L或更大、2g/L或更大、3g/L或更大、4g/L或更大、5g/L或更大、10g/L或更大、15g/L或更大、20g/L或更大、25g/L或更大、30g/L或更大、40g/L或更大、50g/L或更大、75g/L或更大、100g/L或更大、200g/L或更大、300g/L或更大、400g/L或更大或500g/L或更大，或者可以例如在1g/L-1000g/L、1g/L-500g/L或3g/L-200g/L的范围内。
为了回收发酵产物，使用现有技术。对于不同的发酵产物，不同的回收方法是适当的。从水性混合物中回收乙醇的现有方法通常使用分级和吸附技术。例如，啤酒蒸馏器可以用于处理在水性混合物中含有乙醇的发酵产物，以产生富含乙醇的混合物，然后对其进行分级(例如，分馏或其他类似技术)。接下来，可以使含有最高浓度乙醇的级分通过吸附剂以从乙醇中除去大部分(如果不是全部的话)剩余的水。在实施例中，除了回收发酵产物之外，可以回收利用酵母。
将在本说明书中引用的所有专利和参考文献都通过援引以其全文并入本文。
实例
提供以下实例仅出于说明目的，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
通用分子生物学技术
除非另有指示，否则使用的方法是标准生化技术。合适的通用方法教科书的实例包括Sambrook等人,Molecular Cloning,a Laboratory Manual[分子克隆，实验室手册](1989)和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学的当前方案](1995),John Wiley&Sons,Inc[约翰·威立父子公司]。
起始菌株
使用Ethanol作为起始菌株制备菌株。Ethanol是可从乐斯福公司(Lesaffre)获得的商业酿酒酵母菌株。
可以遵循的菌株构建方法描述于WO 2013/144257 A1和WO 2015/028582(通过援引并入本文)中。
来自多种目的基因的表达盒可以在转化该酵母后在体内重组到特定基因座处的途径中(US9738890 B2)。用Golden Gate技术将启动子、ORF和终止子序列组装到表达盒中，如Engler等人(2011)所述，并且连接到Bsal消化的骨架载体中，这些骨架载体用用于体内重组步骤的接头修饰表达盒。通过PCR扩增包括接头的表达盒。此外，使用PCR扩增整合基因座的上游和下游部分的5’和3’DNA片段，并且用接头序列进行修饰。在用这些DNA片段转化酵母细胞后，在所需位置进行体内重组并整合至基因组中。CRISPR-Cas9技术用于在整合基因座处产生独特的双链断裂，以将途径靶向该特定基因座(DiCarlo等人,2013,NucleicAcids Res[核酸研究]41:4336-4343以及WO16110512和US2019309268)。从含有natMX标记的多拷贝酵母穿梭载体表达gRNA，natMX标记赋予酵母细胞对抗生物质诺尔丝菌素(NTC)的抗性。该质粒的骨架基于pRS305(Sikorski和Hieter,Genetics[遗传学],1989,第122卷,第19-27页)，包括功能性2微米ORI序列。从具有kanMX标记的pRS414质粒表达化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)CRISPR相关蛋白9(Cas9)(Sikorski和Hieter,1989)，kanMX标记赋予酵母细胞对抗生物质遗传霉素(G418)的抗性。使用gRNA设计工具(参见例如https://www.atum.bio/eCommerce/cas9/input)设计了指导RNA和原型间隔子序列。
表10：实例中使用的酿酒酵母菌株
酶表达菌株的构建
通过用酶表达盒转化酿酒酵母宿主细胞来构建新的酶表达菌株，如下所述。实例中使用的酿酒酵母宿主细胞是Ethanol 其为可从乐斯福公司商购的酿酒酵母菌株。
对编码目的酶的目的基因进行密码子优化，并用酿酒酵母MATα信号序列：(由SEQID NO:05展示)替换天然信号序列。
合成DNA序列是在TWIST公司(美国加利福尼亚州南旧金山94080)或赛默飞世尔公司-基因艺术公司(Thermofisher-GeneArt)(德国雷根斯堡)订购的。
酶表达盒使用Golden Gate克隆进行编译并包含酿酒酵母PGK1启动子(由SEQ IDNO:51展示)、编码目的酶的目的基因(分别为序列列表SEQ ID NO:2、4、59和61)和酿酒酵母ENO1终止子(由SEQ ID NO:52展示)。
用50bp接头2L和2M装饰盒以形成相应的构建体。接头2L具有SEQ ID NO:53的核苷酸序列。接头2M具有SEQ ID NO:54的核苷酸序列。
使用CRISPR-Cas9和INT28原型间隔子(由SEQ ID NO:55展示)，将构建体(各自单独地创建单独的菌株)整合在酿酒酵母宿主细胞染色体IV上YDR345C(HXT3)与YDRT246C(SVF1)之间的INT28基因座处。两个侧翼序列用于靶向INT28处的同源整合：INT28_FLANK5包含与INT28基因座的100bp同源性和独特的50bp接头“2L”(由SEQ ID NO:56展示)，INT28_FLANK3包含与INT28基因座的100bp同源性和独特的50bp接头“2M”(由SEQ ID NO:57展示)。
使用SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的引物的诊断性PCR在正确整合后产生414bp片段。表10列出了构建的菌株及其基因型。
比较实例A：比较菌株A的构建
比较菌株A通过用表达盒转化参考Ethanol构建，该表达盒具有酿酒酵母PGK1启动子(参见SEQ ID NO:51)、编码来自粗环点革菌的葡糖淀粉酶的基因(参见SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4，Pstr_GA.orf_0048)作为目的基因、和酿酒酵母ENO1终止子(参见SEQID NO:52)，并用BsaI位点修饰。
比较实例B：比较菌株B的构建
比较菌株B通过用表达盒转化参考Ethanol 构建，该表达盒具有酿酒酵母PGK1启动子(参见SEQ ID NO:51)、编码来自红褐肉座菌的葡糖淀粉酶的基因(参见氨基酸序列SEQ ID NO:58和核酸序列SEQ ID NO:59，Hjec_GA.orf)作为目的基因、和酿酒酵母ENO1终止子(参见SEQ ID NO:52)，并用BsaI位点修饰。
比较实例C：比较菌株C的构建
比较菌株C通过用表达盒转化参考Ethanol构建，该表达盒具有酿酒酵母PGK1启动子(参见SEQ ID NO:51)、编码来自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶的基因(参见氨基酸序列SEQ ID NO:60和核酸序列SEQ ID NO:61，Tcin_GA.orf)作为目的基因、和酿酒酵母ENO1终止子(参见SEQ ID NO:52)，并用BsaI位点修饰。
实例1：本发明的菌株1的构建
本发明的菌株1通过用表达盒转化Ethanol构建，该表达盒包含酿酒酵母PGK1启动子(参见SEQ ID NO:51)、编码来自胭脂红栓孔菌的葡糖淀粉酶的基因(参见SEQID NO:01和SEQ ID NO:02，Tcoc_dGLA.orf)作为目的基因、和酿酒酵母ENO1终止子(参见SEQ ID NO:52)，并用BsaI位点修饰。
实例2：用实例1的菌株1以及比较菌株A、B和C发酵
上述实例1的菌株1以及比较菌株A、B和C的预培养如下进行：将甘油储备液(-80℃)在室温下解冻，并用于接种在0.5L无挡板摇瓶中的pH为6.0(用2M H2SO4/4N KOH调节)的0.2L补充有2％(w/v)葡萄糖的矿质培养基(如Luttik,MLH.等人(2000)在题为"TheSaccharomyces cerevisiae ICL2 Gene Encodes a Mitochondrial 2-MethylisocitrateLyase Involved in Propionyl-Coenzyme A Metabolism[酿酒酵母ICL2基因编码参与丙酰辅酶A代谢的线粒体2-甲基异柠檬酸裂解酶]"的文章中所述，该文章发表在J.Bacteriol.[细菌学杂志]第182卷,第7007-7013页中)。将预培养物在32℃下孵育16至20小时，并在200RPM下振荡。在通过OD600测量(使用现有的酵母细胞干重(CDW)相比于OD600的校准线)确定CDW后，将与增殖所需的0.5g CDW/升接种物浓度相应的量的预培养物离心(3min，5300x g)，用一样品体积的无菌脱矿质水洗涤一次，再离心一次，并且重悬于增殖培养基中。
上述实例1的菌株1以及比较菌株A、B和C的增殖如下进行：使用补充有1.25g/升(L)尿素(作为氮源)和抗生素混合物(每升玉米醪包含1ml 100μg/L青霉素G和1ml 50μg/L新霉素储备液)的20mL稀释的玉米醪(70％v/v玉米醪：30％v/v脱矿质水)，在100mL无挡板摇瓶中进行增殖步骤。在所有添加后，使用4N KOH/2M H2SO4将pH调节至5.0。如上所述，将所有菌株以0.5g CDW/L接种，并在32℃下以140RPM振荡使所有菌株增殖6小时。在比较菌株A的增殖期间，以0.1g/kg(即0.1mL/L)的剂量加入外部(非原位产生的)葡糖淀粉酶(Spirizyme，可从诺维信公司(Novozymes)商购获得)。在实例1的菌株1以及比较菌株B和C的增殖期间，没有加入外部(非原位产生的)葡糖淀粉酶。
上述实例1的菌株1以及比较菌株A、B和C的主发酵如下进行：在140rpm和32℃下振荡的同时，在配备有压力记录/释放盖(安康科技公司(Ankom Technology)，美国纽约州马西登)的500ml的Schott瓶中使用200ml培养基进行主发酵步骤。发酵期间不控制pH。发酵在66h后停止。用干固体(DS)含量为约33.4％w/w的玉米醪进行发酵。随后，在玉米醪中补充1g/L尿素、和抗生素(新霉素和青霉素G，至最终浓度为50μg/mL和100μg/mL(即分别添加溶液100mg/ml PenG储备液+50mg/ml新霉素储备液))；消泡剂(巴西尔登公司(Basildon)，大约0.5mL/L)。在所有添加后，使用2M H2SO4/4N KOH将pH调节至5.0。从增殖至发酵所需的酵母添加量(pitch)为发酵体积的1.5％。在比较菌株A的主发酵期间，以0.24g/kg(即0.24mL/L)加入外部(非原位产生的)葡糖淀粉酶(Spirizyme，可从诺维信公司商购获得)。在实例1的菌株1以及比较菌株B和C的主发酵期间，没有加入外部(非原位产生的)葡糖淀粉酶。
如下进行发酵的取样：样品仅取自主发酵。在18、24、42、48和66小时取样以评估表达的酶活性对整个发酵过程中糖释放特性的影响。发酵结束于66小时。由于发酵液含有活性葡糖淀粉酶，将50μl的10g/L阿卡波糖储备液添加至大约5g样品中以终止葡糖淀粉酶活性。通过使离心后的澄清上清液通过0.2μm孔径的过滤器，将用于HPLC分析的样品与酵母生物质和不溶性组分(玉米醪)分离。进行HPLC(Aminex)分析。
结论如下：通过HPLC测量发酵结束时(66小时)的残余糖(mg/L)。结果总结在下表11中。发现实例1的菌株产生来自胭脂红栓孔菌的葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶有利地具有1,4-水解活性和1,6-水解活性两者。如表11中展示，异麦芽糖(异麦芽糖由通过α-1,6-糖苷键连接的两个葡萄糖分子组成)和麦芽糖(麦芽糖由通过α-1,4-糖苷键连接的两个葡萄糖分子组成)两者均减少。实例1的菌株的残余糖总和最低。
表11：通过HPLC测量的发酵结束时(66小时)的残余糖(mg/L)

Claims (19)

1.一种重组酵母细胞，其包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述编码蛋白质的核苷酸序列是SEQ IDNO:02的核苷酸序列或与SEQ ID NO:02的核苷酸序列具有至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组酵母细胞，其中所述蛋白质是具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的重组酵母细胞，其中所述具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质可水解或破坏α-1,6-糖苷键。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞包含用于功能性地表达在形成非天然氧化还原汇的代谢途径中起作用的蛋白质的一种或多种基因修饰。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞功能性地表达：
-编码具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质的核苷酸序列；和/或
-编码具有磷酸核酮糖激酶(PRK)活性的蛋白质的核苷酸序列；和/或
-任选地编码具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)活性的蛋白质的一种或多种分子伴侣的核苷酸序列。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞功能性地表达：
-编码包含磷酸转酮酶活性的蛋白质(EC 4.1.2.9或EC 4.1.2.22，PKL)的核苷酸序列；和/或
-编码具有磷酸转乙酰酶(PTA)活性的蛋白质(EC 2.3.1.8)的核苷酸序列；和/或
-编码具有乙酸激酶(ACK)活性的蛋白质(EC 2.7.2.12)的核苷酸序列。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞功能性地表达编码包含NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质(EC 1.2.1.10)的核苷酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞进一步包含编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性的蛋白质的核苷酸序列和/或编码具有甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的蛋白质的核苷酸序列的缺失或破坏。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞进一步功能性地表达：
-编码具有甘油脱氢酶活性的蛋白质(E.C.1.1.1.6)的核苷酸序列；
-编码具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核苷酸序列；和/或
-任选地编码具有甘油转运蛋白活性的蛋白质的核苷酸序列。
11.一种优选纯化和/或分离的蛋白质，其包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ IDNO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的蛋白质，其中所述蛋白质是具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质。
13.一种套装盒，其包含：
-第一重组酵母细胞，其包含编码第一蛋白质的第一核苷酸序列，该第一蛋白质包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列或与SEQ ID NO:01的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及
-第二重组酵母细胞，其包含编码具有1,4-水解葡糖淀粉酶活性的第二蛋白质的第二核苷酸序列，其中优选地该第二蛋白质包含或具有SEQ ID NO:03的氨基酸序列或与SEQ IDNO:03的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的重组酵母、根据权利要求11至12中任一项所述的蛋白质或根据权利要求13所述的套装盒在用于生产乙醇的方法中的用途。
15.一种用于生产乙醇的方法，所述方法包括使用根据权利要求1至10中任一项所述的重组酵母、根据权利要求11至12中任一项所述的蛋白质或根据权利要求13所述的套装盒转化碳源、优选碳水化合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括以0.05g/L或更低的浓度外部加入葡糖淀粉酶，该浓度表示为以克为单位的葡糖淀粉酶的总量/升含碳源的进料。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述方法在没有外部加入任何葡糖淀粉酶的情况下进行。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述碳源包含一种或多种二糖和/或寡糖。
19.根据权利要求18所述的方法，其中二糖和/或寡糖的总重量百分比为基于所述碳源中存在的糖类的重量等于或大于1％w/w。
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