MXPA06004463A - Enzimas hibridas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una enzima hibrida que comprende al menos una secuencia de aminoacidos de un modulo de union a carbohidratos y por lo menos el modulo catalitico de una secuencia de aminoacidos de glucoamilasa. La invencion se refiere ademas al uso de la enzima hibrida en el procesamiento de almidon y especialmente la produccion de etanol.

Description

ENZIMAS HIBRIDAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, entre otras cosas, a un híbrido entre por lo menos un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y al menos el módulo catalítico (CM) de una glucoamilasa . La invención se refiere también al uso de la enzima híbrida en un proceso de almidón en el cual almidón granulado es degradado en azúcares, por ejemplo, un jarabe, o el cual se puede usar como nutriente para levaduras en la producción de un producto de fermentación, tal como especialmente etanol . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha descrito un gran número de procesos para convertir almidón en hidrolizados de almidón, tales como maltosa, glucosa o jarabes especializados, ya sea para usarse como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tales como fructosa. La glucosa también puede ser fermentada a etanol u otros productos de fermentación. El almidón es un polímero de alto peso molecular que consiste en cadenas de unidades de glucosa. Normalmente consiste en aproximadamente 80% de amilopectina y 20% de amilosa. La amilopectina es un polisacarido ramificado en el cual las cadenas lineales de residuos de alfa-1 , -D-glucosa son unidos por enlaces alfa-1 , 6-glucosídicos . REF. : 172038 La amilosa es un polisacárido lineal formado de unidades D-glucopiranosa enlazadas juntas por enlaces alfa-1 , 4-glucosídicos . En el caso de convertir almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón es despolimerizado . El proceso de despolimerización convencional consiste en una etapa de gelatinización y dos etapas de proceso consecutivas, llámense un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación. El almidón granulado consiste en gránulos microscópicos, los cuales son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando una suspensión de almidón acuosa se calienta, los gránulos se hinchan y eventualmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" existe un dramático incremento en la viscosidad. Ya que el nivel de sólidos es de 30-40% en un proceso industrial típico, el almidón tiene que ser adelgazado o "licuado" para que pueda ser manejado. Esta reducción en la viscosidad es actualmente obtenida en gran parte por la degradación enzimática. Durante la etapa de licuefacción, el almidón de cadena larga es degradado en unidades ramificadas y lineales más pequeñas (maltrodextrinas) por una alfa-amilasa . El proceso de licuefacción se lleva a cabo típicamente a alrededor de 105-110°C durante aproximadamente 5 a 10 minutos seguido por alrededor de 1-2 horas a temperatura de aproximadamente 95°C.

La temperatura se baja después a 60°C, se agregan una gluco- amilasa o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima de desramificación, tal como una isoamilasa o una pululanasa, y el proceso de sacarificación procede durante alrededor de 24 a 72 horas . Los procesos de conversión de almidón convencionales consumen mucha energía debido a los diferentes requerimientos en términos de temperatura durante las diferentes etapas. Es entonces deseable poder seleccionar y/o diseñar enzimas usadas en el proceso de tal forma que el proceso total pueda llevarse a cabo sin tener que gelatinizar el almidón. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona en un primer aspecto una · enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos. El módulo, catalítico puede ser de preferencia de origen fúngico, bacteriano o vegetal . En aspectos adicionales la invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica para la enzima híbrida del primer aspecto, una construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica para la enzima híbrida en el primer aspecto, un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica para la enzima híbrida del primer aspecto y una célula hospedera transformada con un vector; esta célula hospedera es capaz de expresar la secuencia de ADN que codifica para la enzima híbrida del primer aspecto. En un aspecto final la invención proporciona procesos para producir j árabe o un producto de fermentación a partir de almidón granulado, que comprenden someter el almidón crudo a una alfa-amilasa y a una enzima híbrida que tiene actividad glucoamilasa de la invención en un medio acuoso. Si se desea un producto de fermentación, el proceso incluye la presencia de un organismo de fermentación. BREVE DESCRIPCIÓN ?? LAS FIGURAS La figura 1 compara el rendimiento de etanol por gramo de DS de dos híbridos gluco ilasa-SBM (Módulo de Unión a Almidón) (TEAN-1 y TEAN-3) que comprenden el dominio catalítico de T. emersonii y el SBM de A. niger con la glucoamilasa de Talaromyces emersonix tipo silvestre. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "almidón granulado" se entiende como almidón no cocido crudo, es decir, almidón que no ha sido sometido a una gelatinización. El almidón se forma en plantas como pequeños gránulos insolubles en agua. Estos granulos se conservan en almidones a temperaturas debajo de la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se ponen en agua fría, los gránulos pueden absorber una pequeña cantidad del líquido. Hasta 50°C a 70°C el hinchamiento es reversible, el grado de reversibilidad dependiendo del almidón particular. Con temperaturas más altas comienza un hinchamiento irreversible llamado gelatinización. El término "temperatura de gelatinización inicial" se entiende como la temperatura más baja a la cual comienza la gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua empieza a gelatinizarse entre 50°C y 75°C; la temperatura exacta de la gelatinización depende del almidón específico y se puede determinar fácilmente por el experto en la técnica. De esta manera, la temperatura de gelatinización inicial puede variar de acuerdo con la especie vegetal, la variedad particular de la especie vegetal así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura a la cual la birrefringencia se pierde en 5% de los granulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein. S. y Lii . C, Starch/Stárke, vol . 44 (12) págs. 461-466 (1992) . El término "hidrolizado de almidón soluble" se entiende como los productos solubles del proceso de la invención y pueden comprender mono-, di- y oligosacáridos, tales como glucosa, maltosa, maltodextrinas , ciclodextrinas y cualquier mezcla de éstas. De preferencia al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos 99% de los sólidos secos del almidón granulado se convierten en un hidrolizado de almidón soluble. El término "homología" de polipéptidos se entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede determinarse adecuadamente por medio de programas de computadora conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, E.U.A. 53711) (Meedleman, S. B. y Wunsch, C. D. , (1970), Journal of Molecular Biology, 48r 443-453. Se usan los siguientes escenarios para la comparación de secuencias de aminoácidos: penalidad de creación GAP de 3.0 y penalidad de extensión GAP de 0.1.

Enzimas híbridas Los números de clasificación de enzimas (números EC) referidos en la presente descripción con las reivindicaciones están de acuerdo con las recomendaciones (1992) del Comité de Nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press Inc., 1992. Las enzimas híbridas mencionadas en la presente incluyen especies que comprenden una secuencia de aminoácidos de una glucoamilasa (EC 3.2.1.3) enlazada (es decir, unida covalentemente) a una secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos (CBM) . El término "módulo de unión a carbohidratos" también puede referirse como un ominio de" unión a carbohidratos (CBD) " . Las enzimas híbridas que contienen CBM, así como las descripciones detalladas de la preparación y purificación de las mismas, se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, WO 90/00609, WO 94/24158 y WO 95/16782, asi como Greenwood et al., Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) págs . 1295-1305] . Por ejemplo, se pueden preparar al transformar en una célula hospedera una construcción de ADN que comprenda al menos un fragmento de ADN que codifique para el módulo de unión a carbohidratos ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifique para la glucoamilasa de interés, con o sin su propio módulo de unión a carbohidratos nativo, y cultivando la célula hospedera transformada para expresar el gen fusionado. El producto recombinante resultante (enzima híbrida) -comúnmente referida en la técnica como una "proteína de fusión"- puede describirse por la siguiente fórmula general : A-CBM-MR-X En la fórmula anterior, A-CBM es la región N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos el módulo de unión a carbohidratos (CBM) per se. MR es la región media (el "enlazador" ) y X es la secuencia de residuos de aminoácido de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que codifica para la enzima (u otra proteína) a la cual el CBM va a ser enlazado. La porción A puede estar ya sea ausente (de tal manera que A-CBM sea un CBM per se, es decir, no comprenda residuos de aminoácido que no sean aquellos que constituyan el CBM) o puede ser una secuencia de uno o más residuos de aminoácido (que funcione como una extensión terminal del CBM per se) . El enlazador (MR) puede estar ausente, o ser un enlace, o un grupo de enlace corto que comprenda alrededor de 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, en particular de 2 a 40 átomos de carbono. Sin embargo, el MR es de preferencia una secuencia de aproximadamente 2 a alrededor de 100 residuos de aminoácido, muy preferiblemente alrededor de 2 a 40 residuos de aminoácido tal como de 2 a 15 residuos de aminoácido . La porción X puede constituir ya sea la región N-terminal o C-terminal de la enzima híbrida completa. Será entonces aparente a partir de lo anterior que el CBM en una enzima híbrida del tipo en cuestión puede colocarse C-terminalmente, N-terminalmente o internamente en la enzima híbrida. En la modalidad en la que un CBM es interno en el CBM puede ser enlazado por medio de dos enlazadores.

Se debe entender que la enzima híbrida de la invención puede tener más de un CBM, tal como dos o tres CBMs. La modalidad en la que más de un CBM se añade está cubierta: por ejemplo, construcciones en tándem de dos o más CBDs N o C-terminalmente, una construcción que tenga un CBM N-terminal + uno C-terminal. Ejemplos de híbridos contemplados de acuerdo con la invención por lo tanto incluyen también un híbrido de las siguientes fórmulas generales: A-CBM1-MR1-X-MR2-CBM2-B A-CBM1-MR1-B-CBM2-MR2 -X A-CBM1-MR1-CBM2- -MR3 -CBM3-C El CBM1 y CBM2 pueden ser diferentes o los mismos . B y C pueden estar ya sea ausentes (de tal forma que, por ejemplo, B-CBM2 sea un CBM2 per se, es decir, no comprenda residuos de aminoácido que no sean aquellos que constituyan el CBM2) o puede (como A) ser una secuencia de uno o más residuos de aminoácido (que funcione como extensiones terminales del CBM per se) . Los enlazadores pueden estar ausentes o presentes .

Secuencia enlazadora Una secuencia enlazadora puede ser cualquier secuencia enlazadora adecuada. En modalidades preferidas, las secuencias enlazadoras se derivan de la glucoamilasa de Athelia rolfsil, la glucoamilasa de A. Niger, la glucoamilasa de Talaromyces emersonii o la alfa-amilasa de A. kawachii . Ejemplos específicos de estas secuencias enlazadoras incluyen: - enlazador AMG de A. Niger: TGGTTTTATPTGSGSVTSTSKTTATASKTSTSTSSTSA (SEQ ID NO: 20), - enlazador de alfa-amilasa de A. kawachii ·. TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS (SEQ ID NO: 21), - enlazador AMG de Athelia rolfsii : STGATSPGGSSGS (SEQ ID NO: 27), - enlazador de PEPT: PEPTPEPT (SEQ ID NO : 22) . El enlazador también puede ser fragmentos de los enlazadores anteriores . En otra modalidad preferida las enzimas híbridas tienen una secuencia enlazadora que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27 o SEQI ID NO: 22 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.

Módulos de Unión a Carbohidratos (CBM) Un módulo de unión a carbohidratos (CBM) es una secuencia de aminoácidos polipéptidos que se une preferiblemente a un poli- u oligosacárido (carbohidrato) , frecuentemente -pero no necesariamente exclusivamente- a una forma insoluble (incluyendo cristalina) de los mismos. Los CBMs derivados a partir de enzimas de degradación de almidón comúnmente se conocen como módulos de unión a almidón o CBMs (CBMs que pueden ocurrir en ciertas enzimas amilolíticas, tal como en ciertas glucoamilasas , o en enzimas tales como cíclodextrina glucanotransferasas , o en alfa-amilasas) . Asimismo, otras subclases de CBMs podrían abarcar, por ejemplo, módulos de unión a celulosa (CBMs de enzimas celulolíticas) , módulos de unión a quitina (CBMs que ocurren típicamente en quitinasas) , módulos de unión a xilano (CBMs que ocurren típicamente en xilanasas) , módulos de unión a mañano (CBMs que típicamente ocurren en mananasas) . Los SBMs comúnmente se conocen como SBDs (Dominios de Unión a almidón) . Los CBMs pueden encontrarse como partes integrales de grandes polipéptidos o proteínas que consisten en dos o más regiones de secuencias de polipéptidos y aminoácidos, especialmente en enzimas hidrolíticas (hidrolasas) las cuales comprenden típicamente un módulo catalítico que contiene el sitio activo para la hidrólisis de substrato y un módulo de unión a carbohidratos (CBM) para unirse al substrato de carbohidrato en cuestión. Estas enzimas pueden comprender más de un módulo catalítico y, por ejemplo, uno, dos o tres CBMs y opcxonalmente comprender además una o más regiones de secuencias de polipeptidos y aminoácidos que enlacen los CBMs con los módulos catalíticos, una región de éste último tipo normalmente siendo conocida como un "enlazador" . Ejemplos de enzimas hidrolíticas que comprenden un CBM -algunas de las cuales ya se han mencionado arriba- son celulasas, alfa-amilasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranasas , acetilestearasas y quitinasas. Las CBMs también se encuentran en algas, por ejemplo, en el alga roja Porphyra. purpurea en forma de una proteína de unión a polisacáridos no hidrolítica . En proteínas/polipéptidos en los cuales ocurren las CBMs (por ejemplo, enzimas, típicamente enzimas hidrolíticas) , un CBM puede localizarse en el término N o C o en una posición interna. Esa parte de un polipéptido o proteína (por ejemplo, enzima hidrolítica) que constituye un CBM per se consiste típicamente en más de aproximadamente 30 y menos de alrededor de 250 residuos de aminoácido. El "Módulo de Unión a Carbohidratos de la Familia 20" o un módulo CBM-20 está en el contexto de esta invención definido como una secuencia de aproximadamente 100 aminoácidos que tiene al menos 45% de homología al módulo de unión a carbohidratos (CBM) del polipéptido descrito en la figura 1 por Joergensen et al (1997) en Biotechnol . Le . 19:1027-1031. El CBM comprende los por lo menos 102 aminoácidos del polipéptido, es decir, la subsecuencia del aminoácido 582 al aminoácido 683. La numeración de las familias de glicósido hidrolasa aplicada en esta descripción sigue el concepto de Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) servidor CAZy - Carbohidrate-Active Enzymes en URL: afmb . CNRS .mrs . fri-cazy/CAZY/index.html o alternativamente Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohidrate-active enzymes: an integrated datábase approach. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation" . , K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita y T. Kimura eds . , Uni Publishers Co . , Tokio, págs . 15-23 y Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hidrolases and glycosyltransferases : families and functional modules, Current Opinión in Structural Biology 11:593-600. Ejemplos de enzimas que comprenden un CBM adecuado para usarse en el contexto de la invención son alfa-amilasas, alfa-amilasas maltogénicas, celulasas, xilanasas, malanasas, arabinofuranosidasas , acetilesterasas y guitinasas. CBMs adicionales de interés en relación con la presente invención incluyen CBMs que se derivan de glucoamilasas (EC 3.2.1.3) o de CGTasas (EC 2.4.1.19). Los CBMs que se derivan de fuentes fúngicas, bacterianas o vegetales generalmente serán adecuados para usarse en el contexto de la invención. Se prefieren los CBMs de Aspergillus sp., Athelia sp., Talaromyces sp., Bacillus sp., Klebsiella sp. , o Rhizopus sp. Se prefieren los CBMs de origen fúngico. En esta relación, las técnicas adecuadas para aislar los genes relevantes se conocen bien en la técnica . Se prefieren para la invención los CBMs de la Familia de Módulo de Unión a Carbohidratos 20. Una "Familia 20 de Módulo de Unión a Carbohidratos" o un módulo CBM-20 está en el contexto de esta invención definido como una secuencia de aproximadamente 100 aminoácidos que tiene al menos 45% de homología al Módulo de Unión a Carbohidratos (CBM) del polipéptido descrito en la figura 1 por Joergensen et al (1997) en Biotechnol . Lett. 19:1027-1031. El CBM comprende los últimos 102 aminoácidos del polipéptido, es decir, la subsecuencia del aminoácido 582 al aminoácido 683. La numeración de CBMs aplicada en esta descripción sigue el concepto de Coutinho & Henrissat 1999 (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. The modular structure of cellulases and other carbohidrate-active enzymes : an integrated datábase approach. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation" , K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. obayashi, S. arita y T. Kimura eds . , Uni Publishers Co., Tokio, págs . 15-23 o alternativamente: Coutinho, P..M. & Henrissat, B. (1999) servidor Carbohidrate-Active Enzymes en URL: afmb . cnrs-mrs . fri-cazy/CAZY/index.html) . Las CBMs de la Familia 20 de Módulo de Unión a Carbohidratos adecuadas para la invención pueden derivarse de glucoamilasas de Aspergillus awamori (SWISSPROT Q12537) , Asperglllus kawachii (SWISSPROT P23176) , Aspergillus niger (SWISSPROT P04064) , Aspergillus oryzae (SWISSPROT P36914) , de alfa-amilasas de Aspergillus kawachii (EMBL : #AB008370) , Aspergillus nidulans (NCBL AAF17100.1), de beta-amilasas de Bacillus cereus (SWISSPROT P36924) o de CGTasas de Bacillus circulans (SWISSPROT P43379) . Se prefiere un CBM de la alfa-amilas'a de Aspergillus kawachii (EMBL :#AB008370) así como CBMs que tienen al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o incluso por lo menos 99% de homología al CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370) , es decir un CBM que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o incluso por lo menos 99% de homología a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Se prefieren también para la invención los CBMs de la Familia 20 del Módulo de Unión a Carbohidratos que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 3 (CBM de Bacillus flavorthermus) , SEQ ID NO: 4 (CBM de Bacillus sp.) y SEQ ID NO: 5 (CBM de Alcaliphillic Bacillus) . Los CBMs que se prefieren más incluyen los CBMs de la glucoamilasa de Hormoconis sp. tal como de Homoconis resinae (Sin. Hongo Creosote o Amorphotheca resinae) tales como el CBM de SWISSPROT: Q0 045 (SEQ ID NO: 6), de Lentinuta sp., tal como de Lentinula edodes (hongo shiitake) tal como el CBM de SPTREMBL : Q9P4C5 (SEQ ID NO: 7), de Neurospora s . tal como de Neurospora crassa tal como el CBM de SWISSPROT : P14804 (SEQ ID NO: 8), de Talaromyces sp., tal como de Talaromyces byssochlamydioides tal como el CBM de NN005220 (SEQ ID NO: 9), de Geosmlthla sp . , tal como de Geosmithia cylindrospora, tal como el CBM de NN48286 (SEQ ID NO: 10), de Eupenicillium sp. tal como de Eupenicillium ludwigii tal como el CBM de NN005968 (SEQ ID NO: 12), de Aspergillus sp., tal como de Aspergillus japonicus tal como el CBM de NN001136 (SEQ ID NO: 13), de Penicillum sp . , tal conro de Penicillum cf . Miczynskii, tal como el CBM de NN48691 (SEQ ID NO: 14), de Mzl Penicillium sp., tal como el CBM de NN48690 (SEQ ID NO: 15), de Thysanophora s . , tal como el CBM de NN48711 (SEQ ID NO: 16), y de Humicola sp., tal como de Humicola grísea var. Thermoidea tal como el CBM de SPTREMBL :Q12623 (SEQ ID NO : 17) . Los CBMs que se prefieren más incluyen el CBM de glucoamilasa de Aspergillus sp., tal como de Aspergillus Niger, tal como SEQ ID NO: 18, y Athelia sp., tal como de Athelia rolfsii, tal como SEQ ID NO: 19. Se prefiere también para la invención cualquier CBD que tenga al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o incluso por lo menos 99% de homología a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CBD mencionadas arriba.

Los CBMs adecuados y adicionales de la Familia 20 de Módulo de Unión a Carbohidratos pueden encontrarse en el Servidor de Enzimas Activas en Carbohidratos URL: afmb . CNRS-mrs . fri~cazy/CAZY/index.html) . Otros CBMs pueden encontrarse en una glucoamilasa de Mucor circinellides, Rhizopus oryzae, Arxula. adenoninivorans. Una vez que una secuencia de nucleótidos que codifica para la región de unión a substrato (unión a carbohidratos) ha sido identificada, ya sea como ADNc o ADN cromosómico, puede ser manipulada de una variedad de formas para fusionarla a una secuencia de ADN que codifique para la enzima de interés . El fragmento de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de unión a carbohidratos y el ADN que codifica para la enzima de interés se ligan después con o sin ningún enlazador. El ADN ligado resultante puede ser después manipulado de una variedad de formas para lograr la expresión.

Secuencia de glucoamilasas Las glucoamilasas que · son adecuadas como la base para los híbridos CBM/glucoamilasa de la presente invención incluyen, por ejemplo, glucoamilasas derivadas de un organismo fúngico, bacteria o una planta. Las glucoamilasas que se prefieren son de origen fúngico o bacteriano, seleccionadas del grupo que consiste en glucoamilasas de Aspergillus, en particular glucoamilasa ' de A. niger Gl o G2 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102) mostrada en SEQ ID NO: 24), o variantes de la misma, tales como las descritas en WO 92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); la glucoamxlasa de A. awamori (WO 84/02921), A. oryzae (Agrie. Biol .. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-979) , o variantes de o fragmentos de la misma. Otras glucoamilasas incluyen glucoamxlasa de Afc elia rolfsií (patente de E.U.A. No. 4,727,046) mostrada en SEQ ID NO: 26, glucoamilasas de Talaromyces, en particular, derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448) mostrada en SEQ ID NO: 25), Talaromyces leycettanus (patente de E.U.A. No. Re. 32, 153) , Talaromyces duponti, talaromyces thermophilus (patente de E.U.A. No. 4,587,215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridlum, en particular C. thermoamylolytlcum (EP 135,138) y C. thermohydrosulfuricm (WO 86/01831). La glucoamilasa puede estar con o sin su CBM nativo, pero comprende al menos el módulo catalítico (CM) . Una glucoamilasa que se prefiere es la glucoamilasa de A. niger descrita en SEQ ID NO: 24, o una glucoamilasa que tiene más de 50%, tal como 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 6 99% de homología (identidad) con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24.

Se debe entender que la glucoamilasa (módulo catalítico) en una modalidad puede ser un fragmento activo que tenga actividad glucoamilasa. Otra glucoamilasa que se prefiere es la glucoamilasa de Athelia rolfsii mostrada en SEQ ID NO: 26, o una glucoamilasa que tiene más de 50%, tal como 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 6 99% de homología (identidad) con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 25. Una tercera glucoamilasa que se prefiere es la glucoamilasa de Talaromyces emersonii mostrada en SEQ ID NO: 25, o una glucoamilasa que tenga más de 50%, tal como 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de homología (identidad) con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 25.

Híbridos En un aspecto la invención se refiere a una enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa y una segunda secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos. En una modalidad preferida el módulo catalítico es de origen fúngico. En una modalidad que se prefiere más el módulo catalítico se deriva de una cepa de Talaromyces, de preferencia Talaromyces emersonii, una cepa de Aspergillus, de preferencia Aspergillus niger o una cepa de Athelia, de preferencia Athelia rolfsii. En una modalidad preferida la enzima híbrida de la invención comprende un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa derivada de Talaroyces emersonii y un módulo de unión a carbohidratos de Aspergillus niger o Athelia rolfsii. El híbrido puede ser en una modalidad una secuencia enlazadora, de preferencia de Aspergillus niger, Athelia rolfsii, A. kawachii o Talaromyces emersonii entre el módulo catalítico y el módulo de unión a carbohidratos . En una modalidad preferida la enzima híbrida de la invención comprende un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa derivado de Aspergillus niger y un módulo de unión a carbohidratos de Athelia rolfsii o Talaromyces emersonii. El híbrido puede incluir en una modalidad una secuencia enlazadora, de preferencia de Aspergillus niger, Athalia rolfsii, A. kawachii o Talaromyces emersonii entre el módulo catalítico y el módulo de unión a carbohidratos. En otra modalidad preferida la enzima híbrida de la invención comprende un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa derivado de Athelia rolfsii y un módulo de unión a carbohidratos de Aspergillus niger o Talaromyces emersonii . El híbrido puede incluir en una modalidad una secuencia enlazadora, de preferencia de Aspergillus niger, Athalia rolfsii o Talaromyces emersonii entre el módulo catalítico y el módulo de unión a carbohidratos .

Las Aspergillus niger, Athelia rolfsii o Talaromyces emersonii que se prefieren son aquellas mostradas en SEQ ID NOS: 24, 25 y 26, respectivamente. De preferencia, la enzima híbrida comprende una secuencia de CBM que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o incluso por lo menos 99% de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19. Se prefiere todavía más la enzima híbrida que comprende una secuencia de CBM que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 28. En otra modalidad preferida más la secuencia de CBM tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 28, o cualquier otra de las secuencias de CBM; en no más de 10 posiciones de aminoácido, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición. En una modalidad que se prefiere más la enzima híbrida comprende un CBM derivado de una glucoamilasa de Athelia rolfsii, tal como la AMG de Athelia. rolfsii AHU 9627 descrita en la patente de E.U.A. No. 4,727,026 o el CBM de Aspergill s niger. Los híbridos específicos contemplados de acuerdo con la invención incluyen los siguientes : .

Fusión Nombre CM SBM Unión de fusión (inicio a partir del del SBM-subrayado) híbrido SEQ ID NO: 29 ANTE1 AN TE SSVPGTCSATSATGPYSTATNTV PSSGSGSST SEQ ID NO: 30 ANTE2 AN TE SSVPGTCAATSAIGTYSTATNTVWPSSGSGSST SEQ ID NO: 31 ANTE3 AN TE SSVPGTCAATSAIGTYSSVTVTS PSSGSGSST SEQ ID NO: 32 ANAR1 AN AR SSVPGTCSTGATSPGGSSGSVEVTDVYATTVY SQ ID NO: 33 ANAR2 AN AR SSVPGTCAATSAIG YSSV TSWFDVYATTVY SEQ ID NO: 35 ARTE1 AR TE GVSTSCSATSATGPYSTATNTV PSSGSGSSTT SEQ ID NO: 36 ARTE2 AR TE GVSTSCSTGATSPGYSTATNTVWPSSGSGSSTT SEQ ID NO: 37 ARAN1 AR AN GVSTSCAATSAIGTYSSVTVTSWPSIVATGGTT SEQ ID NO: 39 ARAN2 AR AN GVSTSCSTGATSPGYSSVTVTSWPSIVATGGTT SEQ ID NO: 40 ARAN3 AR AN GVSTSCSTGATSPGGSSGSVEVTPSIVATGGTT SEQ ID NO: 41 TEAN1 TE AN SVPAVCAATSAIGTYSSVTVTS PSI ATGGTT SEQ ID NO: 42 TEAN2 TE AN SVPAVCSATSATGPYSSVTVTSWPSIVATGGTT SEQ ID NO: 43 TEAN3 TE AN SVPAVCSATSATGPYSTATNTVWPSIVATGGTT SEQ ID NO: 44 TEAR1 TE AR SSVPAVCSTGATSPGGSSGS EVTFDVYATTVY SEQ ID NO: 45 TEAR2 TE AR SSVPAVCSATSATGPYSSGSVEVTFDVYATTVY SEQ ID NO: 46 TEAR3 TE AR SSVPAVCSATSATGPYSTATNTVWFDVYATTVY CM: módulo catalítico; SBM : módulo de unión a almidón; AN: Aspergillus niger,- TE: Talaromyces emersoni; AR: Athelia rolfsii.

Vectores de expresión La presente invención se refiere también a vectores de expresión recombinantes que pueden comprender una secuencia de ADN que codifique para la enzima híbrida, un promotor, una secuencia de péptidos de señal y señales de detección de transcripción y traducción. Los diferentes ADNs y secuencias de control descritos arriba pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que pueda incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ADN que codifique para el polipéptido en estos sitios. Como alternativa, la secuencia de ADN de la presente invención puede ser expresada al insertar la secuencia de ADN o una construcción de ADN que contenga la secuencia en un vector apropiado para su expresión Al crear el vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de tal manera que la secuencia de codificación sea enlazada operablemente con las secuencias de control adecuadas para la expresión, y posiblemente secreción. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) , el cual pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinantes y puede ocasionar la expresión de la secuencia de ADN. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual el vector vaya a ser introducido . Los Vectores pueden ser plásmidos circulares, lineales o cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que exista como una entidad extracromosómica, cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un micromosoma, un cósmido o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando sea introducido en la célula hospedera, sea integrado en el genoma y replicado junto con los cromosomas en los cuales haya sido integrado. El sistema de vector puede ser un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contengan juntos el ADN total que será introducido en el genoma de la célula hospedera, o un transposón.

Marcadores Los vectores de la presente invención contienen de preferencia uno o más marcadores seleccionadles , los cuales permiten una fácil selección de las células transformadas . Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. Ejemplos de marcadores seleccionables para usarse en una célula hospedera de hongo filamentoso pueden seleccionarse del grupo que incluye, pero no está limitado a, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricina acetiltransferasa) , hygB (higromicina fosfotransferasa) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidina-5 '-fosfato descarboxilasa) , sG (sulfato adeniltransferasa) , trpC (antranilato sintasa) y marcadores de resistencia a glufosinato, así como equivalentes de otras especies. Se prefiere usar en una célula de Aspergillus los marcadores amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el marcador bar de Streptomyces hygroscopicus . Además, la selección puede lograrse mediante cotransformación, por ejemplo, como se describe en WO 91/17243, en donde el marcador seleccionable esté sobre un vector separado. Los vectores de la presente invención contienen de preferencia un elemento que permite la integración estable del vector en el genoma de la célula hospedera o la replicación del vector en la célula independiente del genoma de la célula. Los vectores de la presente invención pueden integrarse en el genoma de la célula hospedera cuando sean introducidos .en una célula hospedera. Para la integración, el vector puede basarse en la secuencia de ADN que codifique para el polipéptido de interés o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa. Como alternativa, el vector puede contener secuencias de ADN adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homologa al interior del genoma de la célula hospedera. Las secuencias de ADM adicionales hacen posible que el vector sea integrado en el genoraa de la célula hospedera en una ubicación precisa en el cromosoma. Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener de preferencia un número suficiente de moléculas de ADM, tal como 100 a 1,500 pares de bases, de preferencia 400 a 1,500 pares de bases y muy preferiblemente 800 a 1,500 pares de bases, los cuales sean altamente homólogos con la secuencia objetivo correspondiente para intensificar la probabilidad de la recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa a .la secuencia objetivo en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de ADN de codificación o no codificación. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedera mediante recombinación no homologa. Estas secuencias de ADN pueden ser cualquier secuencia que sea homologa a una secuencia objetivo en el genoma de la célula hospedera, y, además, pueden ser secuencias de codificación o no codificación . Para la replicacion autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicacion que haga posible que el vector se replique autonómicamente en la célula hospedera en cuestión. El episoma que replica al vector plásmido AMA.1 descrito en WO 00/24883 puede usarse. Más de una copia de una secuencia de ADN que codifique para un polipeptido de interés puede insertarse en la célula hospedera para amplificar la expresión de la secuencia de ADN. La amplificación estable de la secuencia de ADN puede obtenerse al integrar por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera usando métodos bien conocidos en la técnica y seleccionando los transformantes. Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos arriba para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención se conocen bien por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York) .

Células hospedera La célula hospedera puede ser de origen fúngico, tal como un hongo filamentoso o de origen de levadura, o de origen bacteriano, tal como de origen de Bacillus. La célula hospedera de la invención, ya sea que comprenda la construcción de ADN o un vector de expresión que comprenda la secuencia de ADN que codifique para la enzima híbrida, se usa adecuadamente como una célula hospedera en la producción recombinante de la enzima híbrida. La célula se puede transformar con un vector de expresión. Como alternativa, la célula puede transformarse con la construcción de ADN de la invención que codifique para la enzima híbrida, conveniententemente al integrar la construcción de ADN (en una o más copias) en el cromosoma hospedera. La integración de la construcción de ADN en el cromosoma hospedera puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, mediante recombinación homologa o heteróloga. En una modalidad preferida, la célula hospedera es un hongo filamentoso representado por los siguientes grupos de Ascomycota, e incluyen, por ejemplo, Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium) , Emericella {=Aspergillus) , Eurotium (=Aspergíllus) . En una modalidad que se prefiere más, el hongo filamentoso incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como la definida por Hawksworth et al . , en, Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de quitina, celulosa, glucano, quitosan, mañano y otros polisacaridos complejos. El crecimiento vegetativo es mediante alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es ¦ obligatoriamente aerobico. En una modalidad que se prefiere más, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de una especie de, pero no limitada a una célula seleccionada del grupo que consiste en una cepa que pertenece a una especie de Aspergillus, de preferencia Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii, o una cepa de Fusarium, tal como una cepa de Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (en el estado perfecto llamada Gribberella zeae, previamente Sphaeria zeae, sinónimo de Gibberella roseum y Gibberella roseum f. sp . cerealis) , o Fusarium sulphureum (en el estado perfecto llamada Gibberella puricaris, sinónimo de Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum y Fusarium roseum var. Graminearum) , Fusarium cerealis (sinónimo de Fusarium crookwellense) o Fusarium venenatum. En una modalidad que se prefiere más, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de una cepa que pertenece a una especie de Aspergillus, de preferencia Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. La célula hospedera puede ser una célula hospedera de hongo filamentoso tipo silvestre o una variante, una mutante o una célula hospedera de hongo filamentoso modificada genéticamente . En una modalidad preferida de la invención la célula hospedera es una proteasa deficiente o una cepa menos de proteasa. También se contemplan específicamente las cepas de Aspergillus, tales como cepas de Aspergillus niger, modificadas genéticamente para romper o reducir la expresión de glucoamilasa, alfa-amilasa estable en ácido, alfa-1 , 6-transglucosidasa y actividades proteasa. En otra modalidad preferida, la célula hospedera fúngica es una célula de levadura. "Levadura" según se usa en la presente, incluye levadura ascosporógena (Endomicetales) , levadura basidiosporógena y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos (Blastomicetes) . Ya que la clasificación de una levadura puede cambiar en el futuro, para el propósito de esta invención, las levaduras serán definidas como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. y Davenport, R. . , eds, Soc . App . Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980). En una modalidad que se prefiere todavía más, la célula hospedera de levadura es una célula hospedera de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia. En una modalidad que se prefiere más, la célula hospedera de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasiii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra modalidad que se prefiere más, la célula hospedera de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otra modalidad que se prefiere más, la célula hospedera de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

Transformación de las células hospedera fúnglcas Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que incluya la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células hospedera de Aspergillus se describen en EP 238 023 y Telton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156 y WO 96/00787. Las levaduras pueden transformarse usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymolgy, volumen 194, págs . 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163 y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Aislamiento y clonación de una secuencia de ADN Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ADN que codifique para un polipéptido de interés se conocen en la técnica e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico, la preparación a partir de ADNc o una combinación de los mismos. La clonación de las secuencias de ADN de la presente invención a partir de este ADN genómico se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el tamiz de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con estructuras y características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Pueden usarse otros procedimientos de amplificación de ADN tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR) , transcripción activada y ligada (LAT) y amplificación a base de secuencias de ADN (NASBA) .

Secuencia de ADN aislada La presente invención se refiere, entre otras cosas, a una secuencia de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, en donde el módulo catalítico (sic) . El término "secuencia de ADN aislada" según se usa en la presente se refiere a una secuencia de ADN, la cual está esencialmente libre de otras secuencias de ADN, por ejemplo al menos alrededor de 20% pura, de preferencia al menos aproximadamente 40% pura, preferiblemente al menos alrededor de 60% pura, muy preferiblemente al menos alrededor de 80% pura y más preferiblemente al menos alrededor de 90% pura, determinado por electroforesis en agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ADN aislada puede obtenerse mediante procedimientos de clonación estándares usados en la ingeniería genética para reasignar la secuencia de ADN de su ubicación natural a un sitio diferente en donde será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden incluir escisión y aislamiento de un fragmento de ADN deseado que comprenda la secuencia de ADN que codifique para el polipéptido de interés, inserción del fragmento en una molécula de vector y la incorporación del vector recombinante en una célula hospedera en donde varias copias o clones de la secuencia de ADN serán replicadas. Una secuencia de ADN aislada puede manipularse de una variedad de formas para proporcionar la expresión del polipéptido de interés. La manipulación de la secuencia de ADN antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. ' Las técnicas para modificar secuencias de ADN utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.

Construcción de ADN La presente invención se refiere, entre otras cosas, a una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico que tiene una actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos . En una modalidad el módulo catalítico es de origen fúngico. "Construcción de ADN" se define en la presente como una molécula de ADN, ya sea de una sola o de doble hebra, la cual es aislada de un gen que ocurre naturalmente o la cual ha sido modificada para contener segmentos de ADN, los cuales se combinan o se yuxtaponen de una manera, y los cual de otra manera no podrían existir en la naturaleza. El término construcción de ADN es sinónimo del término cásete de expresión cuando la construcción de ADN contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia de codificación de la presente invención.

Métodos de producción Un híbrido de la invención puede producirse usando cualquier método, por ejemplo, que comprenda (a) cultivar una célula hospedera bajo condiciones que conduzcan a la producción del híbrido y (b) recuperando el híbrido. En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del híbrido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse mediante cultivo en matraz de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, intermitentes, y alimentación intermitente o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales llevados a cabo en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el híbrido sea expresado y/o aislado. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles a partir de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la Colección Americana de Tipos de Cultivo) . Si el híbrido es secretado en el medio nutriente, puede ser recuperado directamente del medio. Si el híbrido no es secretado, puede ser recuperado de los lisados de células . El híbrido puede detectarse usando métodos conocidos en la técnica que sean específicos para el híbrido. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un substrato de enzima. Por ejemplo, un ensayo de enzima puede usarse para determinar la actividad del híbrido como el descrito en la presente.

El híbrido resultante puede recuperarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, el híbrido puede recuperarse a partir del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no están limitados a, centrifugación, filtración extracción, secado por rocío, evaporación o precipitación. El híbrido de la presente invención se puede purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no están limitados a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfogue isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) .

Procesamiento del almidón La enzima híbrida del primer aspecto de la invención se puede usar en un proceso para producir jarabe o un producto de fermentación, tal como especialmente etanol, en el que el almidón granulado se trate en un medio acuoso con una enzima híbrida de la invención que tenga actividad glucoamilasa . La enzima híbrida que tiene actividad glucoamilasa en una modalidad se puede añadir en una cantidad de 0.02-20 AGU/g DS, de preferencia 0.1-10 AGU/g DS, tal como alrededor de 0.1, 0.3, 0.5, 1 ó 2 AGU/g DS , tal como entre 0.1-0.5 AGU/g DS. El almidón granulado puede someterse además a una alfa-amilasa, de preferencia una como la descrita a continuación.

Alfa-amilasa La alfa-amilasa puede de acuerdo con la invención ser de cualquier origen. Se prefieren las alfa-amilasas de origen fúngico o bacteriano. La alfa-amilasa puede ser una alfa-amilasa de Bacillus, tal como, derivada de una cepa de B. licheniformis, B. amyloliquef ciens, B. stearothermophilus y B. subtillis . Otras alfa-amilasas incluyen las alfa-amilasas derivadas de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todas las cuales se describen en detalle en WO 95/26397 y la alfa-amilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and biophysical Research Communications, 151 (1988), p gs . 25-31. Otras variantes e híbridos de alfa-amilasa se describen en WO 96/23874, WO 97/41213 y WO 99/19467. Otra alfa-amilasa incluye las alfa-amilasas derivadas de una cepa de Aspergillus, tales como alfa-amilasas de Aspergillus oryzae y Aspergillus niger. En una modalidad preferida la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida. En una modalidad más preferida la alfa-amilasa ácida es una alfa-amilasa acida fúngica o una alfa-amilasa ácida bacteriana. Muy preferiblemente, la alfa-amilasa ácida es una alfa-amilasa fúngica ácida derivada del género Aspergillus . Una amilasa fúngica ácida disponible comercialmente es SP288 (disponible de Movozymes A/S, Dinamarca) . En una modalidad preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida. El término "alf -amilasa ácida" significa una alfa-amilasa (E.C. 2.2.1.1) que se añade en una cantidad efectiva y tiene actividad a un pH en la escala de 3.0 a 7.0, de preferencia de 3.5 a 6.0 o muy preferiblemente de 4.0-5.0. Una alfa-amilasa ácida fúngica que se prefiere es una alfa-amilasa tipo Fungamyl . En la presente descripción, el término "alfa-amilasa tipo Fungamyl°" indica una alfa-amilasa que exhibe una alta homología, es decir, más de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% de homología (identidad) a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 10 en WO 96/23874. De preferencia, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, de preferencia del género Aspergillus, de preferencia de la especie Aspergillus niger. En una modalidad preferida la alfa-amilasa fúngica ácida es una de A. niger descrita como "AMYA_ASPING" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL con el número de registro primario P56271. También se contemplan las variantes de esta alfa-amilasa fúngica acida que tengan al menos 70% de identidad, tal como al menos 80% o incluso por lo menos 90% de identidad, tal como al menos 95%, 96%, 97%, 98% o por lo menos 99% de identidad con la misma. La amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa maltogénica" (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, E.C. 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilos y amilopectina en maltosa en la configuración alfa. Una alfa-amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus cepa NCIB 11837 está disponible comercialmente de Novozymes A/S con el nombre comercial NOVAMYL™. Las alfa-amilasas maltogénicas se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,598,048, 4,604,355 y 6,162,628, las cuales se incorporan en la presente a manera de referencia. De preferencia, la alf -amilasa maltogénica se usa en un proceso de hidrólisis de almidón crudo, como el descrito, por ejemplo, en WO 95/10627, la cual se incorpora a manera de referencia en la presente. Cuando se usa la alfa-amilasa, por ejemplo, como una enzima generadora de maltosa, se pueden añadir alfa-amilasa fúngicas en una cantidad de 0.001-1.0 AFAU/g de DS, de preferencia de 0.002-0.5 AFAU/g de DS, preferiblemente 0.02-0.1 AFAU/g de DS . Las composiciones comerciales preferidas que comprenden alfa-amilasa incluyen MYCOLASE de DSM (Gist Brocades) , BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X y SA SUPER, SA EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEYME FRED, SPEZYME™ AA AND SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.)/ y la alfa-amilasa ácida fúngica vendida con el nombre comercial SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca) . La alfa-amilasa puede añadirse en cantidades como las conocidas bien en la técnica. Cuando se mide en unidades AAU, la actividad alfa-amilasa ácida está presente de preferencia en una cantidad de 5-50,0000 AAU/kg de DS, en una cantidad de 500-50,000 AAU/kg de DS o muy preferiblemente en una cantidad de 100-10, 000 AAU/kg de DS, tal como 500-1,000 AAU/kg de DS. Las alfa-amilasas ácidas fúngicas se añaden de preferencia en una cantidad de 10-10,000 AFAU/kg de DS, en una cantidad de 500-2,500 AFAU/kg de DS, o muy preferiblemente en una cantidad de 100-1,000 AFAU/kg de DS, tal como alrededor de 500 AFAU/kg de DS .

Proceso El proceso de la invención comprende en una modalidad la hidrólisis de una suspensión de almidón granulado, en particular hidrólisis de almidón granulado en un hidrolizado de almidón soluble a una temperatura debajo de la temperatura de gelatinización inicial del almidón granulado . La suspensión de almidón granulado que se someterá a un proceso de la invención puede tener 20-55% de sólidos secos de almidón granulado, de preferencia de 25-40% de sólidos secos de almidón granulado, muy preferiblemente 30-35% de sólidos secos de almidón granulado. Luego de haber sido sometido al proceso del séptimo aspecto de la invención, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o de preferencia al menos 99% de los sólidos secos del almidón granulado se convierten en un hidrolizado de almidón soluble. De acuerdo con la invención el proceso se lleva a cabo a una temperatura debajo de la temperatura de gelatinización inicial. De preferencia, la temperatura a la cual los procesos se llevan a cabo es de entre 30-60°C, por lo menos 30 °C, por lo menos 31° C, por lo menos 32°C, por lo menos 33°C, por lo menos 34°C, por lo menos 35°C, por lo menos 36°C, por lo menos 37°C, por lo menos 38°C, por lo menos 39°C, por lo menos 40°C, por lo menos 41°C, por lo menos 42°C, por lo menos 43°C, por lo menos 44°C, por lo menos 45°C, por lo menos 46°C, por lo menos 47°C, por lo menos 48°C, por lo menos 49°C, por lo menos 50°C, por lo menos 51°C, por lo menos 52°C, por lo menos 53°C, por lo menos 54°C, por lo menos 55°C, por lo menos 56°C, por lo menos 57°C, por lo menos 58°C, por lo menos 59°C o de preferencia por lo menos 60°C. El pH al cual el proceso del séptimo aspecto de la invención se lleva a cabo puede estar en la escala de 3.0 a 7.0, de preferencia de 3.5 a 6.0 o muy preferiblemente de 4.0-5.0. El almidón granulado que se procesará en el proceso de la invención puede obtenerse en particular de tubérculos, raíces, tallos, legumbres, cereales o grano entero. Más específicamente el almidón granulado puede obtenerse de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, una especie de sorgo, sagú, mandioca, tapioca, arroz, chícharo, frijol, plátano o papa. Se contemplan especialmente los tipos cerosos y no cerosos de almidón de maíz y cebada. El almidón granulado que se procesará puede ser un almidón altamente refinado, de preferencia al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o por lo menos 99.5% puro o puede ser un almidón más crudo que contenga materiales que comprendan granos enteros molidos incluyendo fracciones que no sean almidón tales como residuos de germen y fibras. La materia prima, tal como grano entero, se muele para abrir la estructura y permitir un proceso adicional . Se prefieren dos procesos de molienda de acuerdo con la invención: molienda en húmedo y en seco. En la molienda en seco el grano en seco se muele y se usa. La molienda en húmedo da una buena separación del germen y la harina (gránulos de almidón y proteína) y está dentro de pocas excepciones aplicadas en ubicaciones en las que el hidrolizado de almidón se usa en la producción de jarabes. La molienda tanto en seco como húmeda se conocen bien en la técnica de procesamiento de almidón y se contempla igualmente para el proceso de la invención.

Producción de un producto de fermentación En un aspecto final la invención se refiere al uso de la enzima híbrida que tiene actividad glucoamilasa en un proceso para la producción en un producto de fermentación, especialmente etanol. El proceso comprende someter almidón granulado en medio acuoso a una alfa-amilasa y una enzima híbrida de la invención en presencia de un organismo de fermentación. La alfa-amilasa puede ser cualquiera de las alfa-amilasas , de preferencia una mencionada arriba. Se prefieren las alfa-amilasas fúngicas ácidas, especialmente de origen de Aspergillus. Un organismo de fermentación que se prefiere es levadura. De preferencia el proceso comprende fermentar con levadura llevado a cabo simultáneamente con la hidrólisis de suspensión de almidón granulado con alfa-amilasa y la enzima híbrida de la invención. La fermentación se lleva a cabo en forma simultánea con la hidrólisis a una temperatura de entre 30°C y 35°C, y muy preferiblemente entre 31°C y 34°C.

"Organismo de fermentación" se refiere a cualquier microorganismo adecuado para usarse en un proceso de fermentación deseado. Los organismos de fermentación adecuados de acuerdo con la invención son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tales como glucosa y/o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de organismos de fermentación incluyen organismos fúngicos, tales como levadura. La levadura que se prefiere incluye cepas de Sacchromyces spp., y en particular Sacchromyces cerevisiae. La levadura comercialmente disponible incluye, por ejemplo, RED STAR®Lesaffre Etanol Red (disponible de Red Star/Lesaffre, E.U.A.), FALI (disponible de Fleischmann' s Yeast, una división de Burns Philp Food Inc., E.U.A.), SUPERSTART (disponible de Alltech) , GERT STRAND (disponible de Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM Specialties) .

Uso de un híbrido de la invención En un aspecto final la invención se refiere al uso de una enzima híbrida de la invención para producir un producto de fermentación, tal como especialmente etanol, o jarabe, de preferencia glucosa o maltosa. Un híbrido de la invención se puede usar en un proceso de la invención. La invención descrita y reclamada en la presente no debe ser limitada en alcance por las modalidades específicas descritas aquí, toda vez que estas modalidades están diseñadas como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualquier modalidad equivalente está destinada a estar dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Estas modificaciones también se intenta que estén dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . En caso de conflicto, la presente descripción incluyendo las definiciones será de utilidad. Varias referencias y un listado de secuencias se citan en la presente, cuyas descripciones se incorporan a manera de referencia en sus totalidades.

MATERIALES Y MÉTODOS Levadura : RED STAR®/Lesaffre Etanol Red (disponible de Red Star/Lesaffre, E.U.A.).

Actividad alfa-amilasa estable en ácido Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la actividad de cualquier alfa-amilasa estable en ácido puede medirse en AFAU (Unidades de Alfa-amilasa Fúngica Acida) , las cuales se determinan en relación a un parámetro de enzima. 1 FAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5.260 mg de materia seca de almidón por hora bajo las condiciones estándares mencionadas abajo. La alfa-amilasa estable en ácido, una endo-alfa- 5 amilasa (1 , 4-alfa-D-glucan-glucano-hidrolasa, E.C. 3.2.1.1) hidroliza los enlaces alfa-1, 4-glucosidicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con diferentes longitudes de cadena. La intensidad de color formada con yodo es directamente 10 proporcional a la concentración de almidón. La actividad amilasa se determina usando colorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón bajo las condiciones analíticas especificadas . ALFA-AMILASA ? ALMIDÓN + YODO >- DEXTRINAS + OLIGOSACÁRIE 40°, pH 2.5 ? = 590 nm azul/violeta t = 23 seg. decoloración Condiciones estándares/condiciones de reacción: 0 Substrato : almidón sol e, aprox. 0.17 g/L Regulador de pH: citrato, aprox. 0.03 M Yodo (12) : 0.03 g/L CaC12 : 1.85 ttiM pH: 2.50 ± 0.05 5 Temperatura de incubación: 40°C Tiempo de reacción: 23 segundos Longitud de onda: 590 nm Concentración de enzimas: 0.025 AFAU/mL Escala de trabajo de enzimas: 0.01-0.04 AFAU/mL Un documento EB-SM-0259.02/01 que describe este método analítico en más detalle está disponible bajo pedido de Novozymes A/S, Dinamarca, este documento se incluye en la presente a manera de referencia.

Actividad glucoamilasa La actividad glucoamilasa puede medirse en Unidades AmiloGlucosidasa (AGU) . La AGU se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándares de 37°C, pH 4.3, substrato: maltosa 23.2 M, regulador de pH: acetato 0.01 M, tiempo de reacción 5 minutos . Se puede usar un sistema autoanalizador. Mutarotasa se añade al reactivo de glucosa deshidrogenasa de tal manera que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierta en beta-D-glucosa . La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con beta-D-glucosa en la reacción mencionada arriba, formando NADH el cual se determina usando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original .

Un documento (EB-SM-Q131.02/01) que describe este método analítico en más detalle está disponible bajo pedido de Novozymes A/S, Dinamarca, y este documento se incorpora en la presente a manera de referencia .

Manipulaciones de ADN A menos que se indique lo contrario, las manipulaciones y transformaciones de ADN se llevaron a cabo usando métodos estándares de biología molecular como los descritos en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel , P. M. Et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R . , y Cutting, S. M. (eds . ) .

EJEMPLOS Ej emplo 1 Construcción y expresión de hxbridos dominio catalítico de glucoamilasa-dominio de unión a almidón Plásmidos que expresaban 18 híbridos de AMG diferentes (tabla 1) se construyeron entre los dominios catalíticos (CD) y los dominios de unión a almidón (SBD) de glucoamilasa de Aspergillus niger (AN) , Talaromyces emersonii (TE) y Althea rolfsil (AR) . Los plásmidos se transformaron en Saccharomyces cerevisiae para la expresión de proteínas recombinantes , o los híbridos de glucoamilasa construidos posteriormente fueron reclonados en Aspergillus niger y en vector de expresión para la expresión de las proteínas híbridas en A. niger.

Tabla 1 Uniones de fusión en híbridos de glucoamilasa Fusión Nombre CD SBD Unión de fusión (inicio de SBD- del subrayado) plásmido SEQ ID NO: 29 ?????1 AN TE SSVPGTCSATSATGPYSTATNTV PSSGSGSST SEQ ID NO: 30 pANTS2 AN TE SSVPGTCAATSAIG YSTATNTVWPSSGSGSST SEQ ID NO: 31 ?????3 AN AR SSVPGTCAATSAIGTYSSVTVTS PSSGSGSST SEQ ID NO: 32 pANARl AN AR SSVPGTCSTGATSPGGSSGSVEVTFDVYATTVY SEQ ID NO: 33 pANAR2 AN AR SSVPGTCAATSAIGTGSSGSVEVTFDVYATTVY SEQ ID NO: 34 pANAR3 AN AR SSVPGTCAATSAIG YSSVTV SWFDVYATTVY SEQ ID NO: 35 pARTEl AR TE GVSTSCSATSATGPYSTATNT PSSGSGSSTT SEQ ID NO: 36 pARTE2 AR TE GVSTSCSTGATSPGYSTATNTVWPSSGSGSSTT SEQ ID NO: 37 pARTE3 AR TE GVSTSCSTGATSPGGSSGSVEVTPSSGSGSSTT SEQ ID NO: 38 pARANl AR AN GVSTSCAA SAIGTYSSVTVTSWPSIVATGGTT SEQ ID NO: 39 pARAN2 AR AN GVSTSCSTGATSPGYSSVTVTSWPSIVATGGTT SEQ ID NO: 40 pARAIO AR AN GVSTSCSTGATSPGGSSGSVEVTPSIVATGGTT SEQ ID NO: 41 pTEANl TE AN VPAVCAATSAIGTYSSVTVTS PSIVATGGTT SEQ ID NO: 42 pTEAN2 TE AN SVPAVCSATSATGPYSSVTVTSWPSIVATGGTT SEQ ID NO: 43 pTEARl TE AR SSVPAVCSTGATSPGGSSGSVEVTFDVYATTVY SEQ ID NO: 44 pTEARl TE AR SSVPAVCSTGATSPGGSSGSVEVTFDVYATTVY SEQ ID NO: 45 pTEAR2 TE AR SSVPAVCSATSATGPYSSGSVEVTFDVYATTVY SEQ ID NO: 46 pTEAR3 TE AR SSVPAVCSATSATGPYSTATNTV FDVYATTVY Procedimientos experimentales Cepas bacterianas y fungicas y plásmidos DH10B de E. coli (mcrA (rr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZM15 lacX74 deo recAlendal araD139 (ara, leu) 7697 galU gal , rpsL nupG) , Saccharomyces cerevisiae I VScl (MATa, his3Dl, leu2, trpl-289, ura3-52) y el vector promiscuo pYES2 del plásmido de E. coli/levadura fueron comprados de Invitrogen Inc. (San Diego, CA) .

Construcciones de ADN Las manipulaciones de ADM se llevaron a cabo esencialmente como se describe en Sambrook, et al., (1989) Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, y en Dan Burke, Dean Dawson, Tim Stearns (2000) Methods in Yeast Genetics : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Las endonucleasas de restricción y la T4 aADN ligasa fueron de New England Biolabs . La Pwo ADN polimerasa (Boehringer Mannheim) fue usada esencialmente como se describe por el proveedor. Para las reacciones de per SOE alrededor de 100 ng de cada fragmento deseado se purificaron en gel, se mezclaron y se sometieron a 25 ciclos de per sin añadir ningún cebador. Las reacciones se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y las bandas de ADN que migraban en los tamaños esperados se cortaron en gel, se purificaron mediante columnas centrifugas y se usaron como plantilla en una nueva reacción de per usando los cebadores de flanqueo. El plásmido pSteD226 se construyó en dos etapas: primero la secuencia de codificación de la glucoamilasa de Talaromyces emersonií (SEQ ID NO: 80) se clonó como un fragmento Hindlll-Xbal en pYES2 para crear pSteD212. Posteriormente, el fragmento Agel-Hindlll de pSteD212 que contenía el promotor inducible por galactosa se reemplazó con un fragmento Agel-Hindlll que contenía el promotor TPI constitutivo (Alber y Kawasaki (1982) Nucleotide sequence of the trióse phosphate isomerase gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Appl . Gen., 1:419-434) para crear p'SteD226. Se construyó el plásmido pLacl02 al clonar la secuencia de codificación de la forma Gl de la glucoamilasa de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 81) en el vector promiscuo de levadura/E. coli pMT742 como un fragmento de EcoRI-HinDIII. Para la amplificación de CD y SBD's se emplearon las siguientes plantillas de ADN : plásmido pLAcl02 que portaba el ADNc que codifica para la forma Gl de glucoamilasa Gl de A. niger; plásmido pSteD226 que porta el ADNc que codifica para la forma Gl de glucoamilasa de T. emersonií; ADNc sintetizado de A.- rolfsii que contiene la forma Gl de la glucoamilasa de A. rolfsii.

Los oligonucleótidos usados para amplificar los productos de per de CD y SBD se listan en la tabla 2 y la tabla 3 respectivamente . Los productos de PCR SOE se purificaron mediante electroforesis en gel y columnas centrífugas Qiagen, se digirieron con HindIIIIXbal y se ligaron en HindIIIIXbal cortada y pSteD226 purificado con gel . Después de las reacciones nocturnas de ligación se sometrieorn a electroforesis en DH10B y se pusieron sobre placas de agar LB complementadas con 100 micro g/ml de ampicilina (Sigma) . Los transformantes se purificaron en la placa y los plásmidos se extrajeron para la determinación de la secuencia. La integridad del fragmento Hindi-Xbal clonado completo se verificó mediante análisis de restricción y determinación de la secuencia de AD . Los plásmidos seleccionados se transformaron después en levadura competente InvScl y se colocaron sobre medios selectivos. Los transformantes de levadura se purificaron hasta obtener colonias individuales y las alícuotas se almacenaron a -80°C en glicerol al 15%.

Tabla 2 Oligonucleótidos usados para amplificar los dominios catalíticos de glucoamilasa; sitio HnDIII localizado en el cebador f d subrayado; iniciador ATG mostrado en negritas Plantilla Cebador fwd (listado 5'-3') Cebador rev. Producto de PCR pLac 102 TCGTAAGCTTCACCATGTCGTTCC ACAGGTGCCGGGCACGCT AN1 GATCTCTACTCGCC (SEQ ID NO: 47) GCTGGC (SEQ ID NO: 48) pLacl02 TCGTAAGCTTCACCATGTCGTTCC GGTACCAATGGCAGATGT AN2 GATCTCTACTCGCC (SEQ ID NO: 48) GGCCGC (SEQ ID NO: 49) pLacl02 TCGTAAGCTGGCACCATGTCGTTCC CCACGAGGTGACAGTCAC AN3 GATCTCTACTCGCC (SEQ ID NO: 48) ACTGCTG (SEQ ID NO: 50) pSteD226 TGCAAAGCTTCACCATGGCGTCCC GCAGACGGCAGGGACGCT TE1 TCGTTGCTGG (SEQ ID NO: 51) GCTTGC (SEQ ID NO: 52) pSteD226 TGCAAAGCTTCACCATGGCGTCCC TGGGCCCGTGGCAGAGGT TE2 TCGTTGCTGG (SEQ ID NO: 51) GGCAGAG (SEQ ID NO: 53) pSteD226 TGCAAAGCTTCACCATGGCGTCCC CCAGACGGTGTTGGTAGC TE3 TCGTTGCTGG (SEQ ID NO: 1) CGTGCT (SEQ ID NO: 54) AR ADNc AAGAAAGCTTCACCATGTTTCGTT GCAGGAGGTAGAGACTCC AR1 CACTCCTGGCCTTGGC (SEQ ID NO: 55) CTTAGCA (SEQ ID NO: 56) AR ADNc AAGAAAGCTTCACCATGTTTCGTT ACCCGGGCTTGTAGCACC AR2 CACTCCTGGCCTTGGC (SEQ ID NO: 55) AGTCGAG (SEQ ID NO: 57) AR ADNc AAGAAAGCTTCACCATGTTTCGTT AGTGACCTCGACACTACC AR3 CACTCCTGGCCTTGGC (SEQ ID NO: 55) CGAGGAG (SEQ ID NO: 58) Tabla 3 Oligonucleótidos usados para amplificar los Dominios de Union a Almidón de glucoamilasa ; el sitio XbaJ localizado en el extremo 5 ' de los cebadores inversos está subrayado Plantilla Cebador fwd (listado 5'-3') Cebador rev. Producto (listado 5'-3') de PCR plAC102 GCAAGCAGCGTCCCTGCCGTCT TAGTATCTAGATCACCGC TEANsbdl GCGCGGCCACATCTGCCATTGG CAGGTGTCAGTCACCG TACC (SEQ ID NO: 59) (SEQ ID NO: 60) pLacl02 CTCTGCCACCTCTGCCACGGGC TAGTATCTAGATCACCGC TEANsbd2 CCATACAGCAGTGTGACTGTCAC CAGGTGTCAGTCACCG CTCG (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 60) pLacl02 AGCACGGCTACCAACACCGTCT TAGTATCTAGATCACCGC TEANsbd3 GGCCGAGTATCGTGGCTACTGG CAGGTGTCAGTCACCG CGC (SEQ ID NO: 62) (SEQ ID NO: 60) pLacl02 TGCTAAGGGAGTCTCTACCTCCT TAGTATCTAGATCACCGC ARANsbdl GCGCGGCCACATCTGCCATTGG CAGGTGTCAGTCACCG TACC (SEQ ID NO: 63) (SEQ ID NO: 60) pLacl02 CTCGACTGGTGCTACAAGCCCG TAGTATCTAGATCACCGC ARANsbd2 GGTTACAGCAGTGTGACTGTCAC CAGGTGTCAGTCACCG CTCG (SEQ ID NO: 64) (SEQ ID NO: 60) plací 02 CTCGACTGGTGCTACAAGCCCG TAGTATCTAGATCACCGC ARANsbd3 GGTTACAGCAGTGTGACTGTCAC CAGGTGTCAGTCACCG CTCG (SEQ ID NO: 65) (SEQ ED NO: 60) pSteD226 TGCTAAGGGAGTCTCTACCTCCT TACCTCTAGAATCGTCAC ARTEsbdl GCTCTGCCACCTCTGCCACGGG TGCCAACTATCGTCAAGA CCCAT (SEQ ID NO: 66) ATGG (SEQ ID NO: 67) pSteD226 CTCGACTGGTGCTACAAGCCCG TACCTCTAGAATCGTCAC ARTEsbd2 GGTTACAGCACGGCTACCAACA TGCCAACTATCGTCAAGA CCGTC (SEQ ID NO: 68) ATGG (SEQ ID NO: 67) pSteD226 CTCCTCGGGTAGTGTCGAGGTC TACCTCTAGAATCGTCAC A TEsbd3 ACTCCAAGCTCTGGCTCTGGCA TGCCAACTATCGTCAAGA GCTCA (SEQ ID NO: 69) ATGG (SEQ ID NO: 67) pSteD226 GCCAGCAGCGTGCCCGGCACCT TACCTCTAGAATCGTCAC ANTEsbdl GTTCTGCCACCTCTGCCACGGG TGCCAACTATCGTCAAGA C (SEQ ID NO: 70) ATGG (SEQ ID NO: 67) pSteD226 GCGGCCACATCTGCCATTGGTA TACCTCTAGAATCGTCAC ANTEsbd2 CCTACAGCACGGCTACCAACAC TGCCAACTATCGTCAAGA CGTC SEQ ID NO: 71) ATGG (SEQ ID NO: 67) pSteD226 CAGCAGTGTGACTGTCACCTCGT TACCTCTAGAATCGTCAC ANTEsbd3 GGCCAAGCTCTGGCTCTGGCAG TGCCAACTATCGTCAAGA CTC (SEQ ID NO: 72) ATGG (SEQ ID NO: 67) AR ADNc GCAAGCAGCGTCCCTGCCGTCT CGGCCCTCTAGAATCGTC TARsbdl GCTCGACTGGTGCTACAAGCCC ATTAAGATTCATCCCAAGT GGGTG (SEQ ID NO: 73) GTCTTTTTCGG (SEQ ID NO: 74) AR ADNc CTCTGCCACCTCTGCCACGGGC CGGCCCTCTAGAATCGTC TEARsbd2 CCAGGCTCCTCGGGTAGTGTCG ATTAAGATTCATCCCAAGT AGTC (SEQ ID NO: 75) GTCTTTTTCGG (SEQ ID NO: 67) AR ADNc AGCACGGCTACCAACACCGTCT CGGCCCTCTAGAATCGTC TEARsbcB GGTTCGACGTTTACGCTACCACA ATTAAGATTCATCCCAAGT GTAT (SEQ ID NO: 76) GTCTTTTTCGG (SEQ ID NO: 67) AR ADNc GCCAGCAGCGTGCCCGGCACCT CGGCCCTCTAGAATCGTC ANARsbdl GTTCGACTGGTGCTACAAGCCC ATTAAGATTCATCCCAAGT GGGTG (SEQ ID NO: 77) GTCTTTTTCGG (SEQ ID NO: 67) AR ADNc GCGGCCACATCTGCCATTGGTA CGGCCCTCTAGAATCGTC ANARsbd2 CCGGCTCCTCGGGTAGTGTCGA ATTAAGATTCATCCCAAGT GGTC (SEQ ID NO: 78) GTCTTTTTCGG (SEQ ID NO: 67) ADNc AR CAGCAGTGTGACTGTCACCTCGT CGGCCCTCTAGAATCGTC ANARsbcB GGTTCGACGTTTACGCTACCACA ATTAAGATTCATCCCAAGT GTATA (SEQ TD NO: 79) GTCTTTTTCGG (SEQ ID NO: 67) Fusión de dominios catalíticos y dominios de unión a almidón mediante PCR de SOE (Empalme por Extensión de Traslape) La PCR de SOE, como la descrita en los procedimientos experimentales, se empleó para generar las fusiones CD-SBD deseadas. Las combinaciones de productos de PCR usadas en las reacciones SOE y los híbridos de SOE resultantes se listan en la tabla 4.

Tabla 4 Reacciones de PCR de SOE Ejemplo 2 Evaluación de los híbridos glucoamilasa-SBM en fermentaciones de etanol combustible de 'una etapa7 El rendimiento relativo de los híbridos glucoamilasa-SBM (TEAN-l, TEAN-3) para glucoamilasa de T laromyces emersonii pura se evaluó mediante fermentaciones a pequeña escala. Aproximadamente 380 g de maíz molido (maíz en un molino de martillos a escala piloto a través de un tamiz de 1.65 mm) se añadieron a alrededor de 620 g de agua de la llave. Esta mezcla se completo con 3 mL de penicilina 1 g/L. El pH de esta suspensión se ajustó a 5.0 con 40% de ¾S04. El nivel de sólidos secos- (DS) se determinó por triplicado como de 32%. Aproximadamente 5 g de esta suspensión se añadieron a tubos de 15 mL. Las enzimas usadas en este estudio se detallan a continuación.

Enzima Glucoamilasa de T. emersonii purificada TEAN-l (híbrido de módulo catalítico de T. emersonii y SBM de ?. niger) TEAN-3 (híbrido de módulo catalítico de T. emersonii y SBM de A. niger) Una respuesta a dosis de cuatro dosis se llevó a cabo con cada enzima. Las dosis usadas fueron 0.1, 0.3, 0.6 y 1.0 AGU/g de DS . Se llevaron a cabo seis réplicas de cada tratamiento . Después de la dosificación los tubos se inocularon con 0.04 mL/g de propagado de levadura (levadura Red Star™) que había sido cultivada durante 22.5 horas sobre puré de maíz. Los tubos fueron tapados con un tornillo en la parte superior que había sido perforado con una aguja pequeña para permitir la liberación del gas y se vortexearon brevemente antes .de pesarlos y de la incubación a 32 °C. El progreso de fermentación fue seguido por el pesado de los tubos con el tiempo. Los tubos fueron vortexeados brevemente antes de pesarlos. Se dejó que las fermentaciones continuaran durante aproximadamente 200 horas. El resultado del experimento se muestra en la figura 1. Se puede observar de la figura 1 que los dos híbridos TEAN-1, TEAN-3 dieron un rendimiento de etanol significativamente más alto por g de DS que la glucoamilasa de T. Emersonii tipo silvestre.

Ejemplo 3 Evaluación de los híbridos glucoamilasa-SBM en fermentaciones de etanol combustible de 'una etapaf El rendimiento relativo de los híbridos glucoamilasa-SBM (TEAR-1, TEAR-1) a glucoamilasa de Talaromyces emersonii pura se evaluó mediante fermentaciones a pequeña escala. Aproximadamente 380 g de maíz molido (molido en un molino de martillos a escala piloto a través de un tamiz de 1.65 mm) se añadieron a aproximadamente 620 g de agua de la llave. La mezcla se complementó con 3 mL de penicilina 1 g/L. El pH de esta suspensión se ajustó a 5 con 40% de H2S04. El nivel de sólidos secos (DS) se determinó por triplicado como de 32%. Aproximadamente 5 g de esta suspensión se añadieron a tubos de 15 mL. La respuesta a dosis se llevó a cabo con cada enzima usando 0.3 AGU/g de DS . Después de la dosificación los tubos fueron inoculados con 0.04 mL/g de puré de propagado de levadura (RED STARtm) que había sido cultivado durante 22.5 horas sobre puré de maíz. Los tubos se taparon con un tornillo sobre el cual se había perforado con una aguja pequeña para permitir la liberación del gas y se vortexearon brevemente antes de pesarlos y de incubarlos a 32 °C. El progreso de la fermentación fue seguido por el pesado de los tubos con el tiempo. Los tubos fueron vortexeados brevemente antes de pesarlos. Se dejó que las fermentaciones continuaran durante alrededor de 70 horas. El resultado del experimento se muestra a continuación en la tabla 1: Tabla 1 puede observar de la tabla 1 que los dos híbridos TEA -1, TEAR-2 dieron una actividad relativa significativamente más alta que la glucoamilasa de T. emersonii tipo silvestre. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una enzima híbrida caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos.

2. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos es de origen fúngico, derivada preferiblemente de Aspergillus sp. , Athelia sp. o Talaromyees sp .

3. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos se deriva de Aspergillus kawachii , tal como el CBM que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO : 2 , o la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos (CBM) se deriva de Aspergillus niger, de preferencia el CBM que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 18, o la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos (CBM) se deriva de Athelia sp. , de preferencia de Athelia rolfsii, especialmente la secuencia de aminoácidos de CBM mostrada en SEQ ID NO: 28.

4. La enzima híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el modulo catalítico es una glucoamilasa de origen fúngico, derivada preferiblemente de una cepa de Aspergxllus preferiblemente de una cepa de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae,-especialmente la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 24; Athelia, preferiblemente Athelia rolfsii; especialmente la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 26; Talaromyces, preferiblemente Talaromyces emersonii , especialmente la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 25.

5. Una secuencia de ADN caracterizada porque codifica para la enzima híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Una construcción de ADN caracterizada porque comprende la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 5.

7. Un vector de expresión caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 5.

8. Una célula hospedera caracterizada porque es transformada con el vector de conformidad con l ' reivindicación 7, la célula hospedera es capaz de expresar la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 5.

9. Un proceso para producir jarabe, caracterizado porque comprende someter almidón granulado a la enzima híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en medio acuoso.

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el almidón granulado se somete además a una alfa-amilasa.

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, derivada preferiblemente de un hongo, de preferencia del género Aspergillus, especialmente Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

12. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, caracterizado porque el jarabe es glucosa o maltosa.

13. Un proceso para producir un producto de fermentación, caracterizado porque comprende someter almidón granulado a la enzima híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en medio acuoso en presencia de un organismo de fermentación.

14. El proceso de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque el almidón granulado se somete además a una alf -amilasa .

15. El proceso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la alfa-amilasa es una alfa-amilasa acida, derivada preferiblemente de un hongo, de preferencia del género Aspergillus, especialmente Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

16. El proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porgue el organismo de fermentación es levadura, de preferencia Saccharomyces, especialmente Saccharomyces cerevisiae.

17. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado porque el producto de fermentación es etanol, tal como etanol combustible o potable .

18. Uso de la enzima híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para producir un producto de fermentación o jarabe.

19. El uso de conformidad con la reivindicación 18 para producir etanol .

20. Uso de la enzima híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-17.