CN102884197A - 具有酶预处理的沼气生产方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有酶预处理的沼气生产方法，所述方法包括如下步骤：提供包含含木素纤维素材料、水和一种或多种酶的浆料；在适当的温度和pH下，允许所述一种或多种酶降解所述含木素纤维素材料；以及以适当的速率和比例向沼气消化池(digester tank)添加经酶降解的材料来将该材料在消化器中有效转化为沼气。

Description

具有酶预处理的沼气生产方法
技术领域
本发明涉及具有酶预处理的沼气生产方法，所述方法包括如下步骤：提供包含含木素纤维素材料、水以及一种或多种酶的浆料；在适当的温度和pH下，允许所述一种或多种酶降解所述含木素纤维素材料；以及以适当的速率和比例向沼气消化池(biogas digester tank)添加经酶降解的材料来将所示材料在消化器中有效转化为沼气。
背景技术
大多数基于天然植物的材料包含显著量的木素纤维素纤维(lignocellulosic fibre)，其在许多生物系统中不可消化或仅可缓慢消化。其结果是，对于许多转化基于植物的材料的生物过程，在处理过程中有显著部分的经处理材料不会被消化或仅被低度消化。
例如，在通常的沼气生产中，将植物生物质(biomass)在厌氧条件下发酵以形成沼气和废料，该废料在较大程度上由几乎完全没有被消化的木素纤维素纤维组成。
本领域中已知从木素纤维素生产发酵产物如乙醇，且其一般包括材料的预处理、水解和发酵。可以水解含木素纤维素原料(feed stock)以释放可发酵糖(WO 2010/000858)。
酶水解不可直接进入木素纤维素结构。因此，预处理所述木素纤维素，其目的是打破木质素密封(lignin seal)并破坏纤维素的晶体结构。这可能导致半纤维素部分的溶解和糖化。然后酶法水解纤维素部分，例如通过纤维素分解酶，该酶将碳水化合物聚合物降解为可发酵糖。
目前还没有将用于从生物质生产沼气的方法最优化以实现理论上全部转化为沼气，剩余有纤维性木素纤维素废料，其完全没有被转化。
发明内容
本发明涉及沼气生产方法，其包括至少一个单独的酶预处理步骤，其中对生物质原材料施行液化、溶解和预糖化，所述原材料如麦秆(straw)、玉米husklage、玉米穗轴(maize cobs)、玉米青贮(maize silage)、来自蔬菜如马铃薯、胡萝卜、豌豆和豆类(bean)的食品处理的固体废物、香蕉皮、橙皮、苹果皮、来自甘蔗的甘蔗渣、糖甜菜浆；还有来自酒精和葡萄酒生产的釜馏物(stillagematerial)以及来自啤酒、威士忌酒和燃料乙醇生产的酒糟(spent grain)，以及棕榈叶(palm fronds)、棕榈果(palm fruits)、棕榈空果串(empty palm fruit bunches)或棕榈残渣(palm residues)。
在酶液化过程中，将多糖溶解并转化为以寡糖为主，所述多糖如淀粉、半纤维素、甘露聚糖和纤维素。将蛋白质水解为以肽为主。将纤维素转化为纤维糊精。
以与成为气体的转化率相符的速率和比例，将液化材料从预处理池输送到沼气消化池中。在液化系统中，将pH保持为与消化池中的pH相同。
在预处理之前或之中，可以进行生物质的碾磨/磨制(milling)，优选湿式研磨(wet grinding)，任选地通过添加依据本发明的酶来促进。调整温度和pH以允许所述酶发挥功能。
可以用碱预洗涤这种生物质，所述碱如苛性碱、石灰或苏打。
本发明的方法提供了几处优点，其包括但不限于：
●沼气消化池中更高的转化率。
●消化池中每单位体积更高的生产率。
●池容量的更低投入。
●每池体积更高的气体生产。
●以更高的干物质浓度更有效的转化木素纤维素材料。
●清除中未转化材料的量减少。
●未转化固体中更高的干物质含量。
●不需要后转化器(post-converter)或贮存池(storage tank)。
●未转化材料更容易脱水。
●气相更容易清洁。
图1描述了本发明的方法原理。
相应地，在第一个方面，本发明涉及具有酶预处理的沼气生产方法，所述方法包括如下步骤：
(a)提供包含含木素纤维素材料、水以及一种或多种酶的浆料；
(b)在适当的温度和pH下，允许所述一种或多种经酶降解的含木素纤维素材料；以及
(c)以适当的速率和比例向沼气消化池添加酶降解材料来将所述材料有效地转化为沼气。
附图说明
图1显示本发明的沼气生产方法原理的概略图(schematic outline)，其包括酶水解预处理步骤。
图2显示实施例4的反应器设置。
图3显示如实施例4公开的，来自生甘蔗渣(raw bagasse)和处理后甘蔗渣的累积甲烷生产。
发明详述
在第一个方面，本发明涉及包括酶预处理步骤的沼气方法，其中将含木素纤维素材料水解和/或液化/溶解。
发明人已发现，在预处理中使含木素纤维素材料受到一种或多种酶活性，能使所述含木素纤维素材料更容易进入沼气方法。
含木素纤维素材料
术语“含木素纤维素材料”的意思是主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。含木素纤维素材料常被称为“生物质”。木本生物质为约45-50%的纤维素、20-25%的半纤维素和20-25%的木质素。草本材料具有更低的纤维素，更低的木质素和更高的半纤维素含量。
纤维素是直链β1->4连接葡萄糖聚合物。它是所有高等植物细胞壁的主成分。在自然界中纤维素以晶体和无定形状态存在。β1->4连结的热力学稳定性和纤维素形成内部氢键的能力给予其很高的其结构强度。通过对糖苷键的水解分裂来将纤维素降解为葡萄糖。
术语半纤维素用于指在木本和草本植物物种中发现与纤维素和木质素关联的广泛多样的杂多糖(heteropolysaccharide)。该糖组分随植物物种而异，但在被子植物(angiosperms)中，主要半纤维素糖为木糖。与纤维素类似，木糖以聚合物的β1->4连接的主链存在。在裸子植物(gymnosperms)中，主要成分的糖为甘露糖。发现阿拉伯糖为一些半纤维素中的侧支(side branch)。
木质素是苯丙烷聚合物。与纤维素和半纤维素不同，木质素不能通过水解解聚。木质素中主要键的分裂需要氧化。
含木素纤维素材料可以为任何含有木素纤维素的材料。在一个优选的实施方案中，该含木素纤维素材料含有至少30wt.-%，优选至少50wt.-%，更优选至少70wt.-%，甚至更优选至少90wt.-%的木素纤维素。要理解的是，所述含木素纤维素材料还可包含其它成分，例如蛋白质类材料(proteinaceousmaterial)、淀粉材料和糖，如可发酵糖和/或不可发酵糖。
含木素纤维素材料一般发现于，例如植物的茎、叶、皮(hull)、外壳(husk)和穗轴或树木的叶、枝和木材。含木素纤维素材料还可以是，但不限于，草本材料、农业废物(agricultural residues)、林业废物(forestry residues)、城市固体废物(municipal solid waste)、废纸以及纸浆和造纸厂废物。要理解的是，含木素纤维素材料可以为植物细胞壁材料的形式，其含有木质素、纤维素和半纤维素的混合基质。
在一个优选的实施方案中，所述含木素纤维素材料为玉米纤维、稻草(ricestraw)、麸皮(wheat bran)、松木、木屑、白杨木(poplar)、甘蔗渣(bagasse)、糖甜菜浆(sugar beet pulp)、纸和纸浆处理废物。
其它实例包括玉米秸秆，玉米纤维，硬木(hard wood)如白杨木和白桦木，软木(softwood)，谷物秆(cereal straw)如小麦秆(wheat straw)、柳枝稷(switchgrass)、芒属植物(Miscanthus)，稻壳(rice hull)，青贮饲料(ensilaged material)如甜菜、饲料甜菜、玉米青贮，或它们的混合物。
在本发明第一个方面的一个优选的实施方案中，通过在步骤(b)过程中连续或逐步向浆料中添加含木素纤维素材料，来调整浆料中含木素纤维素材料的含量。
当材料中具有充足果胶时，自然发生果胶的脱甲基作用，其在一段时间内能使pH降低至酸性条件，低至约pH 6。然而，许多适于木素纤维素生物质材料预处理的酶活性在中性到碱性pH值更有效。因此，如果浆料中包含果胶(pectinaceous)底物，可能需要在一段时间后将pH调高至碱性值。相应地，在底物中果胶降解导致的pH值降至酸性条件后，在添加主要在高于pH 7有活性的细胞壁降解酶之前，将pH调整至中性或碱性条件。用于含有果胶底物的合适酶为，例如，果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)，该酶通过β-消去降解果胶并因此降低粘度；或水解果胶的果胶甲酯酶(methylesterase)(EC 3.1.1.11)。
预处理
可以用任何适当的方式预处理含木素纤维素材料。预处理在酶水解之前或与酶水解同时进行。预处理的目的是降低颗粒大小、分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，并且以这种方式提高水解速率。预处理工艺如湿氧化和碱性预处理靶向木质素，而稀酸和自水解靶向半纤维素。蒸汽爆破(steamexplosion)是靶向木质素的预处理的一个实例。
预处理步骤可以是常规的使用本领域熟知技术的预处理步骤。在一个优选的实施方案中，预处理在含木素纤维素材料和水的浆料中进行。在预处理过程中，含木素纤维素材料可以10-80wt.-%之间的量存在，优选20-70wt.-%之间，特别地30-60wt.-%之间，例如约50wt-%。
在本发明第一个方面的一个优选的实施方案中，在步骤(b)之后但在步骤(c)之前施行固体分离步骤以清除未溶解固体(图1)，并且任选地将此未溶解固体返输到方法的步骤(a)中。
化学、机械和/或生物预处理
依据本发明，可以按照本发明的方法在水解前化学地、机械地和/或生物地预处理含木素纤维素材料。可以单独进行机械预处理(通常称为“物理”预处理)或可以与其它预处理方法组合进行。
优选地，所述化学、机械和/或生物预处理在水解前进行。或者，所述化学、机械和/或生物预处理可与水解同时进行，例如与添加一种或多种水解酶和/或其它酶活性同时，来释放可发酵糖，如葡萄糖和/或麦芽糖。
化学预处理
术语“化学预处理”指任何促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的化学预处理。合适的化学预处理实例包括用如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳的处理。此外，湿氧化和pH受控的水热解(hydrothermolysis)也被认作化学预处理。
依据本发明还考虑其它预处理技术。已显示纤维素溶剂处理将约90%的纤维素转化为葡萄糖。还已显示当破坏木素纤维素结构时，能很大增强酶水解。碱性H2O2、臭氧、有机溶剂(organosolv)(在醇水溶液中使用刘易斯酸、FeCl3、Al2(SO4)3)、甘油、二噁烷、酚或乙二醇属于已知的破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，Bioresource Technology 96(2005),页码673-686)。
用碱的碱性化学预处理也在本发明的范围内，所述碱如NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、消石灰、氨和/或KOH等。在例如WO 2006/110891,WO2006/11899,WO 2006/11900,WO 2006/110901中(其通过提述据此并入)描述了使用氨的预处理过程。还可使用如例如SvenA.Rydholm的“Pulp Processes”，页数583-648，ISBN 0-89874-856-9(1985)描述的牛皮纸制浆(Kraft pulping)过程。在酶处理之前收集并洗涤固体浆(基于干木屑重量约50%)。
湿氧化技术牵涉氧化剂的使用，例如基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲亚砜(Dimethyl Sulfoxide))等处理。化学预处理一般进行1-60分钟，例如从5-30分钟，但可根据待预处理的材料以更短或更长的时间段进行。
由Schell等，(2003)Appl.Biochem and Biotechn.Vol.105-108,p.69-85和Mosier等，Bioresource Technology 96(2005)673-686，以及US公布号2002/0164730(将这些参考文献均通过提述据此并入)描述了其它合适的预处理方法。
机械预处理
术语“机械预处理”指任何促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的机械(或物理)预处理。例如，机械预处理包括各种类型的碾磨/磨制、辐射、气蒸(steaming)/蒸汽爆破和水热解。
机械预处理包括粉碎(comminution)(机械降低大小)。粉碎包括干碾磨、湿碾磨和振动球碾磨(vibratory ball milling)。机械预处理可牵涉高压和/或高温(蒸汽爆破)。在本发明的一个实施方案中，高压意味着压力在从300-600psi的范围内，优选400-500psi，例如约450psi。在本发明的一个实施方案中，高温意味着温度在从约100-300°C的范围内，优选从约140-235°C。在一个优选的实施方案中，机械预处理在蒸汽枪水解仪系统中以分批法进行，该系统使用了如上定义的高压和高温。为此可使用Sunds Hydrolyzer(可从SundsDefibrator AB(Sweden)获得)。
在一个优选的实施方案中，含木素纤维素材料受到辐射预处理。术语“辐射预处理”指任何通过微波的预处理，如由Zhu等，“Production of ethanol frommicrowave-assisted alkali pre-treated wheat straw”于Process Biochemistry 41(2006)869–873描述的；或超声预处理，如由Li等，“A kinetic study onenzymatic hydrolysis of a variety of pulp s for its enhancement with continuousultrasonic irradiation”，于Biochemical Engineering Journal 19(2004)155–164描述的。
在另一个优选的实施方案中，将所述含木素纤维素材料或浆料在步骤(b)之前或之中匀浆化；优选通过碾磨(milling)、湿式碾磨(wet-milling)、研磨(grinding)或湿式研磨(wet-grinding)。
组合的化学和机械预处理
在一个优选的实施方案中，含木素纤维素材料受化学和机械两种预处理。例如，所述预处理步骤可能牵涉稀酸或温和的酸处理以及高温和/或高压处理。化学和机械预处理可按期望顺序或同时进行。
在一个优选的实施方案中，预处理以稀酸和/或温和酸蒸汽爆破步骤进行。在另一个优选的实施方案中，预处理以氨纤维爆破(ammonia fiberexplosion)步骤(或AFEX预处理步骤)进行。
而在另一个优选的实施方案中，在匀浆化之前或同时向含木素纤维素材料或浆料添加碱；优选碱为NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、消石灰(limehydrate)、氨和/或KOH。
生物预处理
术语”生物预处理”指任何促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的生物预处理。已知的生物预处理技术牵涉到应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass，于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh,P.和Singh,A.,1993,Physicochemicaland biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosic biomass:a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for FuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.,eds.,ACS SymposiumSeries 566,American Chemical Society,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewableresources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,ed.,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Olsson,L.和Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；以及Vallander,L.和Eriksson,K.-E.L.,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
酶水解
在将经预处理的含木素纤维素材料发酵之前，将其酶法水解以将特别是半纤维素和/或纤维素分解为可发酵糖。
依据本发明，酶水解以数个步骤施行。待水解的含木素纤维素材料构成步骤(a)浆料的高于2.5%wt-%DS(干固体)，优选高于5%wt-%DS，优选高于10%wt-%DS，优选高于15wt-%DS，优选高于20wt.-%DS，更优选高于25wt-%DS。
在本发明的步骤(b)中，含木素纤维素材料受到一种或数种或所有选自下组的酶活性的作用：淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶和植物细胞壁降解酶。
在一个优选的实施方案中，所述一种或多种酶选自下组：氨肽酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、β-葡聚糖酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、阿魏酸酯酶、脱氧核糖核酸酶、内切纤维素酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶(laccase)、连接酶、脂肪酶、裂合酶(lyase)、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、果胶反式消去酶、果胶乙酯酶(pectin ethylesterase)、果胶甲酯酶(pectin methylesterase)、果胶分解酶、过氧化物酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多聚半乳糖醛酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李葡聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、SPS酶(SPS-ase)、转移酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和木葡聚糖酶。
在另一个优选的实施方案中，所述一种或多种酶为蛋白酶、果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶和/或甘露聚糖酶。
值得注意的是，在将其添加到沼气消化器中时，经预处理的生物质材料应优选具有中性到碱性pH值，认为添加酸性生物质由于抑制通常的产甲烷微生物可能会使沼气转化过程停止。
在第一个方面的方法的一个优选实施方案中，pH在7和10之间，例如从7.6至10；优选从8至10或从8至9，优选约pH 8.5。可使用NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、消石灰、氨和/或KOH调整pH。温度可以在20-70°C之间，优选30-60°C，且更优选40-55°C，如约50°C。在步骤(b)过程中，将细胞壁降解并使纤维素纤丝(cellulosebrils)更易于受到进一步的水解。步骤(b)中的水解可以分批补料法(fed batch process)进行，其中将经预处理的含木素纤维素材料向含有水解酶的溶液中连续/逐渐地或逐步地加料。
在一个实施方案中，在水解步骤(b)中存在果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶和甘露聚糖酶。在一个实施方案中，存在果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶、甘露聚糖酶和纤维素酶。在一个实施方案中，存在果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶。
任选地，可以分离纤维素纤丝并在中性到碱性pH条件下用碱性内切葡聚糖酶组合物处理。在该步骤中，干固体(DS)优选高于10wt.-%DS，优选高于15wt-%DS，优选高于20wt.-%DS，更优选高于25wt-%DS。
pH应在7和10之间，例如从8到9，优选约pH 8.5。在步骤(a)或(b)之前，可以使用NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、消石灰、氨和/或KOH调整pH。温度可在从20-70°C的范围内，优选30-60°C，且更优选40-50°C。
可以用包含纤维素水解活性的纤维素组合物在中性到酸性pH条件下处理纤维素纤丝。优选pH在4-7之间，优选5-7，如约5.5。优选使用磷酸、琥珀酸、盐酸和/或硫酸调整pH。温度优选在从20-70°C的范围内，优选30-60°C，且更优选40-50°C。
酶
即使没有在本方法或本发明方法的上下文中特别提及，要理解的是以“有效量”使用酶(及其它化合物)。
蛋白酶
可使用任何在碱性条件下适用的蛋白酶。合适的蛋白酶包括那些动物、植物或微生物起源的。优选微生物起源。包括化学或基因修饰的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或类胰岛素蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)，特别是那些来自芽孢杆菌属(Bacillus)的，例如新枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Novo)、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。类胰岛素蛋白酶的实例为胰岛素(如猪或牛起源)和WO 89/06270中描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。
优选商业可获的蛋白酶包括以如下商品名销售的那些酶：Novozymes A/S(Denmark)的EverlaseTM、KannaseTM、AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DurazymTM和EsperaseTM，Genencor International的Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect和Purafect OXP以及Solvay Enzymes的Opticlean和Optimase。
半纤维素分解酶
可以使用任何适用于水解半纤维素的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括果胶酸裂合酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylanesterase)、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidases)、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶(exo-galactanase)以及其中两种或更多种的混合物。优选地，用于本发明的半纤维素为内部作用(endo-acting)的半纤维素酶，且更优选地，该半纤维素酶是一种内部作用的半纤维素酶，其具有在高于pH 7的碱性条件下水解半纤维素的能力，优选pH7-10。
在一个实施方案中，半纤维素酶为木聚糖酶。在一个实施方案中，所述木聚糖酶可优选为微生物起源，例如真菌起源(如木霉属(Trichoderma)、多孔菌属(Meripilus)、腐质霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢菌属(Fusarium))或细菌起源(如芽孢杆菌属(Bacillus))。在一个优选的实施方案中，该木聚糖酶来自丝状真菌，优选来自曲霉属菌株，如棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)；或腐质霉属菌株，优选疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)。木聚糖酶可优选为内切-1,4-β-木聚糖酶，更优选GH10或GH11的内切-1,4-β-木聚糖酶。商业上的木聚糖酶的实例包括
Figure BDA00002195606300111
Figure BDA00002195606300112
以及PULPZYMETM HC(来自Novozymes)和GC
Figure BDA00002195606300113
(来自Genencor Int)。
可以有效水解半纤维素的量添加半纤维素酶，例如以总固体(total solids(TS))的从约0.001-0.5wt.-%的量，更优选总固体的从约0.05-0.5wt.-%。
可以1.0-1000FXU/kg干固体的量添加木聚糖酶，优选从5-500FXU/kg干固体，优选从5-100FXU/kg干固体，且最优选从10-100FXU/kg干固体。
或者，可以0.001-1.0g/kg DS底物的量添加木聚糖酶，优选以0.005-0.5g/kg DS底物的量，且最优选从0.05-0.10g/kg DS底物。
果胶分解酶(或果胶酶)
在实践本发明时，可使用任何能降解植物细胞壁果胶组合物的果胶分解酶。合适的果胶酶包括但不限于那些起源于真菌或细菌的酶。也包括化学或基因修饰的果胶酶。优选地，本发明使用的果胶酶为重组产生且为单组分酶。
可根据其优先底物(高甲酯化果胶或低甲酯化果胶及多聚半乳糖醛酸(果胶酸))，以及其反应机制(β-消去或水解)来对果胶酶分类。果胶酶可以主要为内部作用的，在链内的随机位点切割聚合物以产生寡聚物混合物，或者它们可以为外部作用的，从聚合物的一端进攻并产生单体或二聚体。酶命名法(1992)提供酶分类，其包括了几种作用于果胶平滑区域的果胶酶活性，例如果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)、果胶裂合酶(EC 4.2.2.10)、多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、外切多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)、外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)和外切聚α-半乳糖醛酸酶(galacturonosidase)(EC 3.2.1.82)。
在实施方案中，所述果胶酶为果胶酸裂合酶。如本文使用的果胶酸裂合酶酶活性指通过反式消去，催化果胶酸(也称为多聚半乳糖醛酸)中α-1,4-糖苷键的随机分裂。果胶酸裂合酶也被称为多聚半乳糖醛酸裂合酶和多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷(galacturonide))裂合酶。
果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)是通过反式消去，催化果胶酸(也称为多聚半乳糖醛酸)中α-1,4-糖苷键的随机分裂的酶。果胶酸裂合酶还包括多聚半乳糖醛酸裂合酶和多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)裂合酶。
优选果胶酸裂合酶实例为那些从不同细菌属克隆的，如欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和芽孢杆菌属，特别是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(US专利申请6,124,127)，以及从枯草芽孢杆菌(Nasser等，(1993)FEBS Letts.335:319-326)和芽孢杆菌属菌种YA-14(Kim等，(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58:947-949)克隆的。还描述了在pH范围8-10内具有最大活性的果胶酸裂合酶的纯化，所述酶由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(Dave和Vaughn(1971)J.Bacteriol.108:166-174)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)(Nagel和Vaughn(1961)Arch.Biochem.Biophys.93:344-352)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)(Karbassi和Vaughn(1980)Can.J.Microbiol.26:377-384)、芽孢杆菌属菌种(Hasegawa和Nagel(1966)J.Food Sci.31:838-845)和芽孢杆菌属菌种RK9(Kelly和Fogarty(1978)Can.J.Microbiol.24:1164-1172)产生。
优选的果胶酸裂合酶可如US专利申请6,124,127所述从地衣芽孢杆菌获得。
其它果胶酸裂合酶可以是那些包含Heffron等，(1995)Mol.Plant-MicrobeInteract.8:331-334和Henrissat等，(1995)Plant Physiol.107:963-976中公开的果胶酸裂合酶的氨基酸序列的酶。
可使用单个酶或果胶酸裂合酶的组合。优选的适用于本发明的商业果胶酸裂合酶制剂是可从Novozymes A/S获得的
Figure BDA00002195606300121
甘露聚糖酶
在本发明的上下文中，甘露聚糖酶为β-甘露聚糖酶且定义为属于EC3.2.1.78的酶。
已在数种芽孢杆菌属生物中鉴定了甘露聚糖酶。例如，Talbot等，Appl.Environ.Microbiol.,Vol.56,No.11,pp.3505-3510(1990)描述了来自嗜热脂肪芽胞杆菌的β-甘露聚糖酶，其具有最适pH为5.5-7.5。Mendoza等，World J.Microbiol.Biotech.,Vol.10,No.5,pp.551-555(1994)描述了来自枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶，其在pH 5.0和55°C具有最佳活性。JP-03047076公开了来自芽孢杆菌属菌种的β-甘露聚糖酶，其具有最适pH为8-10。JP-63056289描述了碱性、热稳定的β-甘露聚糖酶的产生。JP-08051975公开了来自嗜碱芽孢杆菌属菌种AM-001的碱性β-甘露聚糖酶。在WO 97/11164中公开了来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的纯化的甘露聚糖酶。WO 94/25576公开了来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的酶，CBS 101.43，其显示甘露聚糖酶活性，以及WO 93/24622公开了从里氏木霉(Trichoderma reesei)分离的甘露聚糖酶。
甘露聚糖酶可来自芽孢杆菌属菌株，例如具有作为GENESEQP登记号AAY54122储存的序列的氨基酸序列或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。合适的商业甘露聚糖酶制剂是由Novozymes A/S生产的
Figure BDA00002195606300131
阿魏酸酯酶
在本发明上下文中，阿魏酸酯酶定义为属于EC 3.1.1.73的酶。
合适的阿魏酸酯酶制剂可从Malabrancea如P.cinnamomea获得，例如一种包含如下阿魏酸酯酶的制剂，该阿魏酸酯酶具有欧洲专利申请号07121322.7中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。
另一种合适的阿魏酸酯酶制剂可从青霉属(Penicillium)如橘灰青霉(P.aurantiogriseum)获得，例如一种包含如下阿魏酸酯酶的制剂，该阿魏酸酯酶具有欧洲专利申请号0815469.7中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。合适的商业阿魏酸酯酶制剂是由Novozymes A/S生产的
Figure BDA00002195606300132
碱性内切葡聚糖酶
术语“内切葡聚糖酶”的意思是内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(glucanohydrolase)(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合β-1,3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β-1,4键、以及其它含有纤维质组分的植物材料的内切水解。碱性内切葡聚糖酶为在碱性条件下具有活性的内切葡聚糖酶。
在一个优选的实施方案中，内切葡聚糖酶可来自木霉属菌株，优选里氏木霉菌株；腐质霉属菌株，例如特异腐质霉(Humicola insolens)菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)菌株，优选Chrysosporium lucknowense菌株。
在一个优选的实施方案中，内切葡聚糖酶可来自Bacillus akibai的菌株。
在一个实施方案中，碱性内切葡聚糖酶组合物为商业可获产品
Figure BDA00002195606300133
和
Figure BDA00002195606300134
(Novozymes A/S,Denmark)之一。所述酶可以1-100g/kg纤维素的剂量应用。
酸性纤维素分解活性
如本文使用的术语“酸性纤维素分解活性”理解为在pH低于6具有活性的包含具有纤维二糖水解酶活性的酶(EC 3.2.1.91)，如，纤维二糖水解酶I和/或纤维二糖水解酶II以及内切葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)和/或β-葡糖苷酶活性(EC 3.2.1.21)。
在一个优选的实施方案中，纤维素分解活性可以为真菌起源的酶制剂的形式，例如来自木霉属菌株，优选里氏木霉菌株；腐质霉属菌株，例如特异腐质霉菌株；或金孢子菌属菌株，优选Chrysosporium lucknowense菌株。
在优选的实施方案中，纤维素分解酶制剂含有一种或多种下列活性：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I和II以及β-糖苷酶活性。
在一个优选的实施方案中，纤维素分解酶制剂是WO2008/151079中公开的组合物，其通过提述据此并入。在一个优选的实施方案中，纤维素分解酶制剂包含具有纤维素分解增强活性的多肽，优选家族GH61A多肽，优选那些在WO 2005/074656(Novozymes)中公开的。纤维素分解酶制剂可进一步包含β-葡糖苷酶，例如来自木霉属、曲霉属或青霉属菌株的β-葡糖苷酶，其包括同时待决申请US 60/832,511(Novozymes)中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。在一个优选的实施方案中，纤维素分解酶制剂还可包含CBH II酶，优选土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在另一个优选的实施方案中，纤维素分解酶制剂还可包含纤维素分解酶；优选那些来自里氏木霉或特异腐质霉的。
纤维素分解酶组合物还可包含WO 2005/074656公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；β-葡糖苷酶(例如US 60/832,511和PCT/US2007/074038中公开的融合蛋白)，以及来自里氏木霉的纤维素分解酶。纤维素分解酶组合物。
在另一个优选的实施方案中，纤维素分解组合物包含WO 2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；β-葡糖苷酶(例如US60/832,511和PCT/US2007/074038中公开的融合蛋白)，土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)，以及来自里氏木霉的纤维素分解酶制剂。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物是商业可获的产品CELLUCLASTTM 1.5L,CELLUZYMETM(Novozymes A/S,Denmark)或ACCELLARASETM 1000(Genencor Int,Inc.,USA)。
纤维素分解活性剂量可以在每克总固体(TS)从0.1-100FPU的范围内，优选每克TS 0.5-50FPU，特别是每克TS 1-20FPU。
纤维素分解增强活性
术语“纤维素分解增强活性”在本文定义为一种生物活性，其增强通过具有纤维素分解活性的蛋白质进行的木素纤维素衍生材料的水解。就本发明而言，在如下条件下通过测量用纤维素分解蛋白从木素纤维素衍生材料例如经预处理的含木素纤维素材料的水解中还原糖(reducing sugars)的增加或纤维二糖和葡萄糖总合的增加，来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS(经预处理的玉米秸秆)中的纤维素，其中总蛋白由80-99.5%w/w纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素分解蛋白和0.5-20%w/w纤维素分解增强活性蛋白组成，在50°C进行1-7天，与用相等的总蛋白上样而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)的对照水解相比。
具有纤维素分解增强活性的多肽增强由具有纤维素分解活性的蛋白催化的木素纤维素衍生材料的水解，其通过将达到同样水解程度需要的纤维素分解酶量减少，优选至少0.1倍，更多至少0.2倍，更优选至少0.3倍，更优选至少0.4倍，更优选至少0.5倍，更优选至少1倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，更优选至少10倍，更优选至少20倍，甚至更优选至少30倍，最优选至少50倍，且甚至最优选至少100倍。
在一个优选的实施方案中，在纤维素分解酶和具有增强活性的多肽组合的存在下，进行水解和/或发酵。在一个优选的实施方案中，具有增强活性的多肽是家族GH61A多肽。WO 2005/074647公开了来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽和其多核苷酸。WO 2005/074656公开了来自嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽和其多核苷酸。U.S.公布申请序列号2007/0077630公开了来自里氏木霉的具有分解增强活性的分离的多肽和其多核苷酸。
α-淀粉酶
依据本发明可使用任何α-淀粉酶，例如真菌、细菌或植物起源的。在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意思是在以有效量添加时，在3到7范围内的pH具有最适活性，优选从3.5到6，或更优选从4-5。
细菌α-淀粉酶
依据本发明的细菌α-淀粉酶优选来自芽孢杆菌属。
在一个优选的实施方案中，芽孢杆菌属α-淀粉酶来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，但也可来自其它芽孢杆菌属菌种。考虑的α-淀粉酶具体实例包括WO 99/19467中SEQ ID NO:4所示地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中SEQ ID NO:5所示解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶和WO 99/19467中SEQ ID NO:3所示嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述据此并入)。在一个实施方案中，α-淀粉酶可以是分别与WO 99/19467中SEQ ID NOS:1,2或3所示任一序列具有至少60%，优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度的酶。
芽孢杆菌属α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体，特别是在WO 96/23873,WO 96/23874,WO 97/41213,WO 99/19467,WO 00/60059和WO 02/10355(所有文件通过提述据此并入)中任何一个描述的。US专利号6,093,562,6,297,038或US专利号6,187,576(其通过提述据此并入)公开了具体考虑的α-淀粉酶变体，其包括在位置R179到G182有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO 1996/023873公开的双缺失参见例如，页码20，1-10行(其通过提述据此并入)，优选与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO:3中所述野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，对应于σ(181-182)，或者将WO 99/19467(其参考通过提述据此并入)中SEQ ID NO:3用于编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选为芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 99/19467中公开的SEQ IDNO:3所述野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，具有对应于σ(181-182)的双缺失且进一步包含N193F取代(也称为I181*+G182*+N193F)。
在一个实施方案中，细菌α-淀粉酶剂量为每克DS 0.0005-5KNU的量，优选每克DS 0.001-1KNU，例如每克DS约0.050KNU。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括来自曲霉属菌株的α-淀粉酶，例如，米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)和川地曲霉(Aspergillis kawachii)α-淀粉酶。
优选酸性真菌α-淀粉酶为类Fungamylα-淀粉酶，其来自米曲霉菌株。依据本发明，术语"类Fungamylα-淀粉酶"指与WO 96/23874的SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高度同一性的α-淀粉酶，即至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
另一个优选酸性α-淀粉酶来自黑曲霉菌株。在一个优选的实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的在Swiss-prot/TeEMBL数据库中初级登记号P56271下以“AMYA_ASPNG”公开且在WO 89/01969中描述的(实施例3–通过提述并入)一种酶。来自黑曲霉的商业可获的酸性真菌α-淀粉酶为SP288(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
其它考虑的野生型α-淀粉酶包括那些来自根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属(Meripilus)的菌株的，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO2004/055178通过提述并入)或巨多孔菌(Meripilus giganteus)菌株。
在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶来自川地曲霉并由Kaneko等，J.Ferment.Bioeng.81:292-298(1996)“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase fromAspergillus kawachii."公开；且还以EMBL:#AB008370公开。
真菌α-淀粉酶还可为包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即非杂合的)或其变体。在一个实施方案中，野生型α-淀粉酶来自川地曲霉菌株。
依据本发明，酸性α-淀粉酶可以0.001-10AFAU/g DS的量添加，优选从0.01-5AFAU/g DS，特别是0.3-2AFAU/g DS或0.001-1FAU-F/g DS，优选0.01-1FAU-F/g DS。
商业α-淀粉酶产品
优选包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM(Gist Brocades)的MYCOLASETM,BANTM,TERMAMYLTM SC,FUNGAMYLTM,LIQUOZYMETM X,LIQUOZYMETM SC和SANTM SUPER,SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000,DEX-LOTM,SPEZYMETM FRED,SPEZYMETM AA，和SPEZYMETM DELTA AA(Genencor Int.)，以及以商品名SP288销售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
碳水化合物源生成酶
术语“碳水化合物源生成酶”包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖的生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖的生产者)及支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。碳水化合物源生成酶能产生碳水化合物，碳水化合物可被所述发酵生物用作能量来源，例如，在本发明方法中用于生产发酵产物如乙醇时。可将生成的碳水化合物直接或间接转化成期望的发酵产物，优选为乙醇。依据本发明，可以使用碳水化合物源生成酶的混合物。具体考虑的混合物是至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是酸性淀粉酶，甚至更优选为酸性真菌α-淀粉酶的混合物。在本发明的一个实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)和葡糖淀粉酶活性(AGU)之间的比例(即每AGU的FAU-F)可以在0.1和100之间，特别是2和50之间，例如在从10-40的范围内。
葡糖淀粉酶
依据本发明使用的葡糖淀粉酶可来自任何合适的来源，例如，来自微生物或植物。优选葡糖淀粉酶为真菌或细菌起源，其选自下组的酶：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等，(1984),EMBO J.3(5),p.1097-1102)，或它们的变体，如那些在WO 92/00381,WO 00/04136和WO01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的；WO 84/02921公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4),p.941-949)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等，(1996),Prot.Eng.9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，(1995),Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等，(1994),Biochem.J.301,275-281)；二硫键(disulphide bonds),A246C(Fierobe等，(1996),Biochemistry,35,8698-8704)；和在位置A435和S436引入脯氨酸残基(Pro residues)(Li等，(1997),Protein Eng.10,1199-1204)。
其它葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(以前命名为Corticiumrolfsii)葡糖淀粉酶(参见US专利号4,727,026和Nagasaka,Y.等，(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii”,Appl Microbiol Biotechnol 50:323-330)、踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来自埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(US再版专利号32,153)、Talaromycesduponti、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(US专利号4,587,215)。
考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自如下的葡糖淀粉酶：梭菌属(Clostridium)，特别是高温产淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和高温产硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)以及瓣环栓菌(Trametes cingulata)、纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)；和大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，全部都在WO 2006/069289公开；或PCT/US2007/066618公开的Peniophora rufomarginata；或它们的混合物。依据本发明还考虑杂合葡糖淀粉酶。WO 2005/045018公开了杂合葡糖淀粉酶实例。具体实例包括实施例1的表1和4公开的杂合葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述据此并入)。
还考虑与上述任何葡糖淀粉酶显示高度同一性的葡糖淀粉酶，即与上述成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
包含葡糖淀粉酶的商业可获组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER,SANTM EXTRA L,SPIRIZYMETM PLUS,SPIRIZYMETM FUEL,SPIRIZYMETM B4U和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM 300(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900,G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
在一个实施方案中，葡糖淀粉酶可以0.0001-20AGU/g DS的量添加，优选0.001-10AGU/g DS，特别是介于0.01-5AGU/g DS，例如0.1-2AGU/g DS。
沼气
依据本发明，术语“沼气”意指在常规厌氧发酵器即主消化器(primarydigestor)中获得的气体。沼气的主成分是甲烷，并且在本申请和权利要求中，术语“沼气”和“甲烷”可互换使用。
主消化器
本申请和权利要求中的术语“主消化器”意指一种容器，在其中进行厌氧发酵并产生沼气。
在本文中描述和要求保护的发明在范围上并不受本文公开的特定实施方案所限，这是因为这些实施方案的意图为说明本发明的数个方面。任何等价的实施方案应认为在本发明的范围内。事实上，除本文中显示和描述的那些之外，数种对本发明的修改从前述的描述而言对本领域技术人员将显而易见。上述修改亦意欲符合所附权利要求的范围。在出现冲突的情况下，以包括定义在内的本公开为准。
本文引用各种参考文献，其公开内容通过提述全部并入。通过以下实例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
材料和方法
使用滤纸试验(Filter Paper Assay)(FPU assay)的纤维素酶活性
1.方法来源
1.1本方法在Adney,B.和Baker,J.1996.Laboratory Analytical Procedure,LAP-006,National Renewable Energy Laboratory(NREL)的名为“Measurementof Cellulase Activities”的文件中公开。所述方法基于IUPAC方法来测量纤维素酶活性(Ghose,T.K.,Measurement of Cellulse Activities,Pure&Appl.Chem.59,pp.257-268,1987)。
2步骤
2.1除了如下所述在显色(color development)后使用96孔板读出吸光度值，本发明如Adney和Baker，1996，见上，描述的进行。
2.2酶试验管：
2.2.1在试管(13X100mm)底部加入卷起的滤纸条(#1Whatman；1X6cm；50mg)。
2.2.2向试管添加0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.80)1.0mL。
2.2.3将含有滤纸和缓冲液的试管在50°C(±0.1°C)循环水浴中温育5min。
2.2.4温育后，向试管添加柠檬酸盐缓冲液中的酶稀释液0.5mL。酶稀释液设为将产生略高于或低于2.0mg葡萄糖的目标值的值。
2.2.5通过轻轻涡旋振荡(vortex)3秒将试管内容物混合。
2.2.6涡旋振荡后，将试管在50°C(±0.1°C)循环水浴中温育60mins。
2.2.7紧接60min的温育之后，将试管从水浴中取出，并在每一试管中添加3.0mL的DNS试剂以终止反应。将试管涡旋振荡3秒来混合。
2.3空白和对照
2.3.1通过向试管中添加1.5mL的柠檬酸盐缓冲液来制备反应物空白。
2.3.2通过将卷起的滤纸条置入试管底部并添加1.5mL的柠檬酸盐缓冲液来制备底物对照。
2.3.3通过将1.0mL的柠檬酸盐缓冲液与0.5mL适当的酶稀释液混合，为每一酶稀释液制备酶对照。
2.3.4反应物空白、底物对照和酶对照以和酶试验管相同的方法测定，并一同完成。
2.4葡萄糖标准
2.4.1制备100mL的葡萄糖储液(10.0mg/mL)，并以5mL等分试样(aliquot)冷冻。在使用之前，将等分试样融化并涡旋振荡以混合。
2.4.2储液稀释液在柠檬酸盐缓冲液中如下制备：
G1=1.0mL储液+0.5mL缓冲液=6.7mg/mL=3.3mg/0.5mL
G2=0.75mL储液+0.75mL缓冲液=5.0mg/mL=2.5mg/0.5mL
G3=0.5mL储液+1.0mL缓冲液=3.3mg/mL=1.7mg/0.5mL
G4=0.2mL储液+0.8mL缓冲液=2.0mg/mL=1.0mg/0.5mL
2.4.3通过向1.0mL的柠檬酸盐缓冲液添加0.5mL的各稀释液来制备葡萄糖标准管。
2.4.4葡萄糖标准管以和酶试验管相同的方法测定并一同完成。
2.5显色
2.5.1在60min温育和DNS添加之后，将所有试管在水浴中一同煮沸5mins。
2.5.2煮沸后，立即将其在冰/水浴中冷却。
2.5.3冷却后，简短地涡旋振荡试管并使浆沉积。然后通过将来自试管的50微升加入96孔板中的200微升双蒸水中来稀释每个试管。将每孔混合，并在540nm读出吸光度。
2.6计算(在NREL文件中给出实例)
2.6.1通过对四个标准(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5mL)相对A540作图来制作葡萄糖标准曲线。其使用线性回归来拟合(Prism软件)，并使用针对该直线的等式来确定每个酶试验管产生的葡萄糖。
2.6.2制作产生的葡萄糖(mg/0.5mL)相对于总酶稀释液的图，其中Y轴(酶稀释液)为log标度。
2.6.3在产生刚好高于2.0mg葡萄糖的酶稀释度和产生刚好低于该值的酶稀释度之间描绘一条线。从这条线，确定会产生正好2.0mg葡萄糖的酶稀释度。
2.6.4如下计算滤纸单位/mL(FPU/mL)：
FPU/mL=0.37/产生2.0mg葡萄糖的酶稀释度
木糖/葡萄糖异构酶试验(IGIU)
1IGIU为在标准分析条件下，以1微摩每分钟的起始速率将葡萄糖转化为果糖的酶量。
标准条件：
葡萄糖浓度：     45%w/w
pH:              7.5
温度：           60°C
Mg2+浓度：       99mg/l(1.0g/l MgSO4*7H2O)
Ca2+浓度：       <2ppm
活化剂，SO2浓度：100ppm(0.18g/l Na2S2O5)
缓冲液，Na2CO3，浓度：2mM Na2CO3
纤维素分解活性(EGU)
纤维素分解活性可以内切葡聚糖酶单位(EGU)测量，在pH 6.0以羧甲基纤维素(CMC)为底物测量。
制备底物溶液，其在pH 6.0的0.1M磷酸盐缓冲液中含有34.0g/L CMC(Hercules 7LFD)。将待分析的酶样品溶解于相同缓冲液。将5ml的底物溶液和0.15ml的酶溶液混合并转移到振动粘度计(vibration viscosimeter)(例如来自Sofraser,France的MIVI 3000)，并在40°C恒温30分钟。
1EGU定义为在这些条件下，将粘度降低至一半的酶量。应调整酶样品的量来提供反应混合物中的0.01-0.02EGU/ml。
果胶酸裂合酶活性(APSU)
果胶酸裂合酶催化多聚半乳糖醛酸中双键的形成。通过光度计在235nm的测量来测定形成的双键数量。1APSU(嗜碱(alkalophile)果胶酸裂合酶单位)定义为在标准条件下，每分钟产生等同于1μmol不饱和双半乳糖醛酸的C=C双键的酶量：
温度：        37.0°C±0.5°C
pH:           10.00±0.05
波长：        235nm在1cm比色杯中
温育时间：    10min.
测量时间：    30min.
酶浓度范围：  0.05-0.15APSU/mL
定量范围：    1.25APSU/g
范围：        [50；150]mAPSU/mL
其它方法
干物质：Mettler Toledo HR 73卤素水分干燥器(Halogen Moisture dryer)BRIX：来自Bilingham&Stanley Ltd的RFM830数字折光计(Digitalrefractometer)
pH：WTW pH计(pH-meter)
碾磨：“咖啡”研磨器(”coffee”grinder)Bosch型号KM13(E nr:MKM 6003FD9512)，进行2分钟
HPLC：Waters 717自动采样器(Autosampler)、Waters 515泵和Waters 2414折光率检测器(Refractive index detector)。使用柱型Bio-rad(Animex HPX-87H300-7.8mm),Cat no.125140。使用葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、木糖和麦芽四糖的标准品。
实施例中使用的酶
果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)制剂来自芽孢杆菌属菌种，并可作为3000L从诺维信获得，具有3000APSU/g组合物的活性。
内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)组合物来自Bacillus agaradhaerens，并可作为
Figure BDA00002195606300232
从诺维信获得。
纤维素组合物A包含来自里氏木霉的纤维素分解酶、WO2005/074656公开的GH61A多肽、和米曲霉β-葡糖苷酶(在WO2008/057637公开的融合蛋白中)。WO2008/151079公开了纤维素组合物A。纤维素组合物A具有180FPU/g组合物的活性。
纤维素组合物B包含来自芽孢杆菌属菌种的碱性内切纤维素酶并可作为
Figure BDA00002195606300241
从诺维信获得，具有320000ECU/g组合物的活性。
阿魏酸酯酶组合物还包含碱性纤维素酶。该组合物来自腐质霉属并可作为具有90EGU/g组合物活性的
Figure BDA00002195606300242
从诺维信获得。
甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)组合物包含具有40MIUM/g组合物活性的甘露聚糖酶。
实施例1：用于沼气生产的生物质原材料的酶液化
在碱性条件下施行洗涤过程，其目的是除去木质素的可溶部分并泡涨生物质材料。洗涤过程中除去的碱性可溶化合物包括对于在后续处理过程中使用的微生物和酶的不想要的抑制性物质。在洗涤过程中或洗涤之后，使用细胞壁降解酶来酶法液化生物质材料并打开生物质的强硬(recalcitrant)结构，这样可以更容易消化纤维素和其它可发酵材料。
木素纤维素材料的主要结构多糖一般的组成为纤维素、半纤维素(富含中性糖)、含有D-半乳糖醛酸残基的果胶材料和甘露聚糖，其在不同植物物种中以不同比例与木质素组合存在。
1.使用咖啡研磨器Bosch KM13(E nr:MKM 6003FD 9512)将200g麦秆材料碾磨2分钟。使用2000mL的1.2%NaOH并在室温缓慢搅拌2小时来制备磨碎麦秆浆料。
2.将该材料倒在具有网孔大小为0.295mm的分离筛(screen sieve)上，使用约30L的自来水在筛上洗涤该材料并用勺按压。
3.使用Mettler Toledo HR 73卤素水分干燥器测定滤饼(press cake)的干物质含量为9.44%w/w。
4.使用WTW pH计将滤饼的pH测量为8.3。
5.制备具有6.7%w/w干物质的浆料2000g并分入4个反应器，各含500g，并将反应器置于50°C水浴中。
6.将表2显示的每克经洗涤生物质中计算的酶剂量用于每个反应器中的预处理水解反应。
7.为了通过分析验证酶水解正在进行，在0；10；60；120和180分钟提取样品。
8.直接分析样品的pH。在将10mL样品以3800xG离心10分钟之后，测量%固相；表3-5显示结果。
9.使用Mettler Toledo HR 73卤素水分干燥器分析上清的%干物质；表3-5显示结果。
10.使用由Waters 717自动采样器、Waters 515泵和Waters 2414折射率检测器组成的系统对上清进行HPLC。使用柱型Bio-rad(Animex HPX-87H300-7.8mm；Cat no.125140)。使用葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、木糖和麦芽四糖的标准品。注意：产生两种迄今为止尚未鉴定的上清(工作处于进行中)。表4-5显示结果。
Figure BDA00002195606300251
表1.所用酶产品的活性。
Figure BDA00002195606300252
表2.试验中每克生物质(干物质)使用的活性。
  反应器编号   pH   %固相   上清的%干物质
  1   8.2   20   2.0
  2   8.2   25   1.1
  3   8.2   18   1.1
  4   8.3   18   0.8
表3.反应180分钟后的直接测量。
Figure BDA00002195606300261
表4.反应器1号对时间的测量。
表5.反应180分钟后HPLC数据，g/L。
碱洗生物质(麦秆材料)的半纤维素水解显示(一种果胶分解酶系统)含有一种重要的活性谱(spectrum)，其在pH=8-8.5的碱性区域内增强细胞壁降解效果。还显示上清的%干物质和所有化合物总和(g/L)合理地很好相关。
当包括BioPrep时，以显著更高的量产生主要为DP4。当包括
Figure BDA00002195606300264
342时，以比使用其他酶系统更高的量产生未鉴定的寡糖。对于葡萄糖生产，没有一个使用的酶系统对纤维素微原纤维具有显著糖化效果，其揭示所述酶系统主要为细胞打开者(cell opener)。
溶解的干物质量、高分子量化合物(DP4)量、所有DP之和的值与在这种预处理步骤中应用果胶分解酶系统
Figure BDA00002195606300271
时发现的高干物质含量一致。
实施例2：麦秆生物质材料的酶消化
1.使用咖啡研磨器Bosch KM13(E nr:MKM 6003FD 9512)碾磨200g的麦秆材料2分钟。使用2000mL的1.2%NaOH并在室温缓慢搅拌2小时来制备磨碎麦秆的浆料。
2.将材料倒在具有网孔大小为0.295mm的分离筛上，使用约15L的自来水在筛上洗涤该材料并用勺按压。
3.使用WTW pH计将滤饼的pH测量为8.1。
4.制备具有6.27%w/w干物质的浆料2000g并分入4个反应器，各含500g，并将反应器置于50°C水浴。
5.上表1显示了试验中使用的酶产品的活性。
6.将表6显示的每克经洗涤生物质中计算的酶剂量用于预处理。
7.在每个反应器中使用表6显示的剂量进行水解反应。
8.为了通过分析验证酶水解正在进行，在0；10；60；120和180分钟提取样品。
9.直接分析样品的pH。在将10mL样品以3800xG离心10分钟之后，测量%固相；表8-10显示结果。
10.使用来自Billingham and Stanley Ltd的RFM830数字折光计分析上清的°Brix。表8-10显示结果。
11.使用由Waters 717自动采样器、Waters 515泵和Waters 2414折光率检测器组成的系统对上清进行HPLC。使用柱型Bio-rad(Animex HPX-87H300-7.8mm；Cat no.125140)。使用葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、木聚糖和麦芽四糖的标准。表8-10显示了结果。
Figure BDA00002195606300281
表6.试验中每克生物质(干物质)使用的活性。
Figure BDA00002195606300282
表8.反应180分钟后的直接测量。
Figure BDA00002195606300283
表9.反应器5号对时间的测量。
Figure BDA00002195606300284
表10.反应180分钟后的HPLC数据，g/L。
当
Figure BDA00002195606300285
以相同剂量用于碱洗生物质(麦秆材料)的半纤维素水解时，所有4个试验都显示高溶解效果。溶解的碳水化合物比Pulpzyme稍多。然而，Pulpzyme HC释放稍多的葡萄糖和DP4。
实施例3：麦秆生物质材料的酶消化
1.使用咖啡研磨器Bosch KM13(E nr:MKM 6003FD 9512)碾磨200g麦秆材料2分钟。使用2000mL的1.2%NaOH并在室温缓慢搅拌2小时来制备磨碎麦秆的浆料。
2.将材料倒在具有网孔大小为0.295mm的分离筛上，使用约30L的自来水在筛上洗涤该材料并用勺按压。
3.使用WTW pH计将滤饼的pH测量为7.8。
4.制备具有6.26%w/w干物质的浆料2000g并分入4个反应器，各含500g，并将反应器置于50°C水浴。
5.上表1显示了试验中使用的酶产品活性。
6.将表11显示的每克经洗涤的生物质中计算的酶剂量用于每个反应器中的水解预处理。
7.为了通过分析验证酶水解正在进行，在0；10；60；120和180分钟提取样品。表12-14显示结果。
8.直接分析样品的pH。在将10mL样品以3800xG离心10分钟之后，测量%固相。表12-14显示结果。
9.使用来自Billingham and Stanley Ltd的RFM830数字折光计(Digitalrefractometer)分析上清的°Brix。表12-14显示结果。
10.使用由Waters 717自动采样器、Waters 515泵和Waters 2414折光率检测器组成的系统对上清进行HPLC。使用柱型Bio-rad(Animex HPX-87H300-7.8mm)，Cat no.125140。使用葡萄糖、麦芽糖、麦芽三塘、木聚糖和麦芽四糖的标准。表12-14显示结果。
表11.试验中每克生物质(干物质)使用的活性。
Figure BDA00002195606300301
表12.反应180分钟后的直接测量。
Figure BDA00002195606300302
表13.反应器10号相对时间的测量。
Figure BDA00002195606300303
表14.反应180分钟后的HPLC数据，g/L。
概括而言，从三个实施例中，可以得出结论，即反应器1号中使用的酶组合看来是迄今最佳的剂量，如下表15所示。没有其它细胞壁降解活性存在时，不具有显著的效果。Pulpzyme具有良好效果，特别是在DP4的释放上。
Figure BDA00002195606300311
表15.关于碱细胞壁打开的最好结果
实施例4.来自甘蔗的甘蔗渣的酶液化和消化
在碱性条件下洗涤木素纤维素材料以除去木质素的可溶化合物并泡涨剩余材料。洗涤过程中除去的可溶化合物包括抑制沼气消化器中微生物生长的酶抑制剂和材料。在洗涤过程后，湿磨并使用细胞壁降解酶酶法液化所述生物质材料。打开生物质的强硬结构，这样可以更容易地将纤维素、半纤维素和其它可发酵材料水解并消化成沼气。
在试验工厂(pilot plant)中进行的过程：
1.在搅拌容器中，将由1-2cm的片组成的5kg生甘蔗渣在50°C悬浮于22.5升自来水(city water)中。
2.添加0.6kg 50%NaOH。结果产生浓度为1.2%的NaOH。
3.温和搅拌下，在50°C施行碱处理2小时。
4.使用具有40μ目筛孔的Algaier VTS 600振动滚筒筛分机(vibratingtumbler screen)施行湿筛。收集固相。
5.使用100L自来水(40-50°C)洗涤固相并重筛。
6.重复该步骤直到pH为约8.5且大多数色泽已被除去。
7.向经洗涤的浆添加水直到总体积为100L并通过搅拌悬浮。在再循环过程中，将材料泵过有齿胶体磨(toothed colloid mill)(Fryma磨类型MZ 110，调整开口为1mm)一次。该操作持续约30分钟。
8.此后通过细胞壁降解酶活性、阿魏酸酯酶、木聚糖酶、果胶酸裂合酶、果胶裂合酶和内切纤维素酶处理醪(mash)。实际添加了
Figure BDA00002195606300312
Figure BDA00002195606300313
和
Figure BDA00002195606300314
9.通过将反应混合物泵过Fryma磨进行酶过程，其以60分钟的时间间隔使用连续再循环，历时总时间段为4小时。图2显示了反应器设置。将Fryma磨调整为在转子(rotor)和定子(stator)之间具有1mm。
10.使用来自商业废物处理工厂(Snertinge,Denmark)的接种物(inoculum)在200mL的嗜热沼气分批反应器中进行沼气试验。反应器中使用1.67g的底物干物质。使用气相色谱仪每天测量甲烷生产一次。图3显示了9天之中累积的甲烷生产。
我们得出结论，即在嗜热分批消化器系统中评估并且与生甘蔗渣的使用相比时，碱性酶预处理给予增加的甲烷生产。
实施例5.粒化麦秆(燃料丸(fuel pills))的酶液化和消化
在试验工厂中进行的过程：
1.将2.5kg粒化麦秆(燃料丸)在40-50°C悬浮于22.5升的自来水中。
2.添加1.85kg 27%NaOH。
3.在温和搅拌过程中，在50°C施行碱处理2小时。测量pH并发现pH值等于12.3。
4.使用具有40微米目筛孔的Algaier VTS 600振动滚筒筛分机施行湿筛。收集固相。
5.使用100L水(40-50°C)洗涤固相并重筛。重复该步骤直到pH为约8.5且大多数色泽已被除去。发现了表16显示的结果。
6.将经洗涤的浆在自来水中调成(slurred)质量为27kg的浆。将其加热至45°C并使用17mL 4N HCl将pH从pH=8.7调整为pH=8.0。
7.在再循环过程中，将浆料在有齿胶体磨(Fryma磨类型MZ 110，调整开口为0.5mm)处理40分钟并通过细胞壁降解酶活性处理。
8.此后通过使用细胞壁降解酶活性、阿魏酸酯酶、木聚糖酶、果胶酸裂合酶、果胶裂合酶和内切纤维素酶处理醪。实际上添加
Figure BDA00002195606300321
Figure BDA00002195606300322
和
Figure BDA00002195606300323
9.反应混合物通过Fryma磨的连续再循环以30分钟的时间间隔进行，历时总时间段为6.5小时。在第一个30分钟内，转子和定子之间的间隙开口为0.4mm，在第二个时间段，间隙为0.35mm，且在第三个时间段，间隙为0.30mm。发现了表17显示的数据。
Figure BDA00002195606300331
表16.筛分结果。
表17.碾磨和反应过程中的反应结果。
使用0.20mm的间隙在第二天早晨进行第四次碾磨。判断粘度显著低于390分钟以后。其清楚的指示获得了显著的液化。
我们得出结论，即麦秆材料的碱性酶预处理显然降低了粘度并打开了材料的结构。因此，当在嗜热分批沼气消化器系统中评估时，会获得增加的甲烷生产。
实施例6.来自糖甜菜浆的沼气生产
在由Nordic Sugar,Nakskov,Denmark提供的预磨样品上对我们的碱性酶系统施行预测试，该碱性酶系统由如下酶组成：
Figure BDA00002195606300341
Figure BDA00002195606300342
和BIOPREP(R)3000L(都来自Novozymes A/S,Denmark)，如下：
1.将10g糖甜菜材料在50°C悬浮于20g水。
2.使用4N NaOH将pH调整为8。
3.对于时间t=0，向混合物中添加酶产品
Figure BDA00002195606300343
Figure BDA00002195606300344
和BIOPREP(R)3000L各0.05g(50μL)。
4.在50°C，反应在振动台上一直进行搅拌的锥形瓶中进行。
5.10分钟之后，取样品0并冷冻用于后面的试验。样品为2mL。再在t=30分钟、60分钟、120分钟和240分钟时取样品。
6.试验如下；下表18显示结果：
a.以14.000RPM离心10分钟。
b.测量°Brix度。
c.测量夸脱比色杯中在235nm处的吸光度。
Figure BDA00002195606300345
表18.碾磨的糖甜菜材料水解反应过程中的反应结果。
当与未预处理的糖甜菜浆相比时，发现在Nordic Sugar和Hohenheim大学开发的测试系统中有显著提高的沼气生产(未显示)。
实施例7：预磨糖甜菜浆的酶水解
本实例示例了基于Nordic Sugar,Nakskov,Denmark提供的预磨糖甜菜浆水解产物的酶法生产，如下：
1.使用HR73卤素水分分析仪测量糖菜浆的干物质含量为：15.01%w/w。
2.在两个烧瓶的每个中，将150g甜菜浆手动混入300mL自来水中。
3.测量pH并调整为约pH=8.5。向每个烧瓶中加入约1.5mL 4N NaOH。使用一个有力搅拌器以150rpm搅拌。烧瓶编号1不添加酶。
4.向烧瓶编号2添加酶。以干物质中0.25%酶产品的剂量使用上述4个酶产品(以及在实施例4,5和6中使用的)中的每一个。基于质量估计反应混合物中的干物质含量且测量浆干物质含量的测量值为5.0%。
干物质质量：150×15.01/100=22.5(g用于剂量的干物质)。其对应于添加的56.3mg~56.3/1.10~50μL。
5.测量pH和°Brix，且反应持续过夜。表19显示了测量结果。
Figure BDA00002195606300351
表19.pH和Brix数据。
两个烧瓶都检测到pH降低，可能由于脱甲基作用。如下表20的HPLC结果所示，在酶反应后在反应混合物中检测到甲醇(烧瓶编号2)。如烧瓶编号2中发现的甲醇释放可能对沼气生产具有有利影响。
Figure BDA00002195606300361
表20.碱性酶处理之后的HPLC结果

Claims (14)

1.一种具有酶预处理的沼气生产方法，所述方法包括如下步骤：
(a)提供包含含木素纤维素材料、水和一种或多种酶的浆料；
(b)在适当的温度和pH下，允许所述一种或多种酶降解所述含木素纤维素材料；以及
(c)以适当的速率和比例向沼气消化池添加经酶降解的材料来将该材料在消化器中有效转化为沼气。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种酶选自下组：淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶和植物细胞壁降解酶。
3.权利要求2的方法，其中所述一种或多种酶选自下组：氨肽酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、β-葡聚糖酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、阿魏酸酯酶、脱氧核糖核酸酶、内切纤维素酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、果胶反式消去酶、果胶乙酯酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多聚半乳糖醛酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李葡聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、SPS酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和木葡聚糖酶。
4.权利要求2的方法，其中所述一种或多种酶为蛋白酶、果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶和/或甘露聚糖酶。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤(b)之前或之中将所述含木素纤维素材料或浆料匀浆化；优选通过碾磨、湿式碾磨、研磨或湿式研磨。
6.权利要求5的方法，其中在匀浆化之前或之时向所述含木素纤维素材料或浆料添加碱；优选所述碱为NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、消石灰、氨和/或KOH。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述浆料中含木素纤维素材料的含量通过在步骤(b)过程中向所述浆料连续或逐步添加含木素纤维素材料来调整。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料构成步骤(a)浆料的2.5%wt-%DS以上，优选5%wt-%DS以上，优选10%wt-%DS以上，优选15wt-%DS以上，优选20wt-%DS以上，更优选25wt-%DS以上。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中步骤(b)在7-10范围内的pH进行；优选8-9；最优选在约8.5。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤(b)在20-70°C范围内的温度进行，优选30-60°C，且更优选40-50°C。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中在步骤(b)之后但在步骤(c)之前施行固体分离步骤以清除未溶解固体(图1)，并且任选地将所述未溶解固体返输到本方法的步骤(a)中。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料在步骤(a)之前已受过微波和/或超声辐射处理。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中在步骤(a)之前已化学地、机械地和/或生物地处理过所述含木素纤维素材料。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料源自玉米秸秆、玉米纤维、硬木、软木、谷物秆、小麦秆、柳枝稷、芒属植物(Miscanthus)、稻壳、城市固体废物、工业有机废物、办公室用纸、甘蔗的甘蔗渣、糖甜菜浆、棕榈叶、棕榈果、棕榈空果串、棕榈残渣或它们的混合物。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130116