CN101778945A - 用于产生发酵产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其包括：i)预处理含木素纤维素材料；ii)向包含源自含淀粉材料的可发酵糖的培养基中导入经预处理的含木素纤维素材料；iii)使用发酵生物体进行发酵。

Description

用于产生发酵产物的方法

技术领域

本发明涉及用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法。

发明背景

由于化石燃料有限的储量和对温室气体排放的担忧，人们越来越多地关注可再生能源。

由含木素纤维素的材料产生发酵产物在本领域中已知，并且通常包括预处理、水解和发酵含木素纤维素的材料。然而，预处理导致化合物(例如酚类和呋喃)的释放，所述化合物抑制和/或失活酶的性能，并且对于发酵生物体有毒。可以通过例如洗涤经预处理的含木素纤维素材料而去除有毒化合物，但进行此过程是昂贵和/或繁复的。

因此，需要提供用于从经预处理的含木素纤维素材料(特别是未解毒的经预处理的木素纤维素材料)产生发酵产物的其它方法和工艺。

发明概述

在第一方面，本发明涉及用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其中所述方法包括：

i)预处理含木素纤维素材料；

ii)将经预处理的含木素纤维素材料引入包含源自含淀粉材料的可发酵糖的培养基；和

iii)使用发酵生物体发酵。

在第二方面，本发明涉及用于由含淀粉材料和含木素纤维素材料的组合产生发酵产物的方法，包括步骤：

a)液化含淀粉材料；

b)糖化；和

c)使用发酵生物体发酵。

其中在发酵之前和/或发酵过程中加入经预处理的含木素纤维素材料。

在最后一个方面，本发明涉及用于由含淀粉材料和含木素纤维素材料的组合产生发酵产物的方法，包括步骤：

i)在低于起始糊化温度的温度糖化含淀粉材料；

ii)使用发酵生物体发酵；

其中在发酵之前和/或发酵过程中加入经预处理的含木素纤维素材料。

附图简述

图1显示玉米醪(corn mash)和PCS滤液共发酵的乙醇得率(yield)。以g-乙醇/g-DS表示的得率仅基于玉米醪DS计算，不包括来自PCS滤液的DS。

图2显示在PCS滤液和玉米醪共发酵68小时后通过HPLC确定的乙醇浓度。x-PCS表示向5g-CM中导入的PCS滤液的体积。

发明详述

本发明的方法和工艺可以有利地应用于基于木素纤维素的(即，生物质)乙醇装置(ethanol plant)与例如现有的基于淀粉的乙醇装置共同放置在一起的情况。

产生发酵产物的方法

根据本发明，通过共发酵源自两个单独物料流(two separate stream)的糖而产生发酵产物，即，包含源自含木素纤维素材料的糖的一个物料流，和包含含淀粉材料的另一个物料流。在一个优选实施方案中，在将淀粉转化成期望的发酵产物的工艺中，向糖化步骤和/或发酵步骤或同时糖化和发酵步骤加入源自木素纤维素的糖。源自木素纤维素的糖可以是来自经预处理和/或水解的含木素纤维素材料的液体(例如，滤液)的形式。

根据本发明，将源自淀粉和源自木素纤维素的可发酵糖如葡萄糖的发酵整合。更具体地，将源自含淀粉材料的醪和经预处理和/或水解的含木素纤维素材料共发酵，优选在SSF工艺中共发酵。经预处理的含木素纤维素材料可以是滤液，甚至可以是未洗涤的滤液。例如，滤液可以是将经预处理和/或水解的含木素纤维素材料，例如，经预处理和/或水解的玉米秸秆固-液分离后的液相。

本发明人发现，将发酵来自经预处理的玉米秸秆(PCS液体/滤液)的特别是C6糖与发酵玉米醪整合对发酵末期的乙醇得率没有负面影响。实施例1阐述了这一发现。

因此，在第一方面，本发明涉及从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其中所述方法包括：

i)预处理含木素纤维素材料；

ii)将经预处理的含木素纤维素材料导入包含源自含淀粉材料的可发酵糖的培养基；

iii)使用发酵生物体发酵。

培养基可以是淀粉糖化培养基和/或淀粉发酵培养基。在一个优选的实施方案中，所述方法包括将经预处理的含木素纤维素材料导入同时糖化和发酵培养基，所述培养基包含一种或多种(几种)淀粉降解酶和任选的发酵生物体。

实际发酵可以在将经预处理的木素纤维素材料导入发酵培养基之前或之后开始。在加入共发酵步骤，即，糖化步骤、发酵步骤或同时糖化和发酵步骤之前，优选水解经预处理的含木素纤维素材料。

在优选的实施方案中，在糖化、发酵或同时糖化和发酵之前和/或过程中，从经预处理和/或水解的含木素纤维素材料流去除固体(主要包含木质素和未转化的多糖)。换句话说，在淀粉糖化、发酵和/或同时糖化和发酵过程中加入已去除固体的含木素纤维素材料流。可以用本领域已知的任何合适的方法去除固体。在合适的实施方案中，可通过过滤或者通过使用压滤机和/或离心机等来去除固体。如上所述，本发明的优势之一是经预处理的含木素纤维素材料可以是未解毒的(un-detoxified)，即，经预处理的含木素纤维素材料可包含可能对发酵生物体有毒的化合物。此外，经预处理的含木素纤维素材料还可以包含能使酶失活或至少显著抑制酶性能的化合物，所述酶为例如纤维素酶、半纤维素酶和/或与将经预处理材料水解成糖有关的其它酶，和/或用于将淀粉转化为糖的淀粉降解酶。

源自木素纤维素的物料流中存在哪些有毒和/或抑制性化合物很大程度上取决于使用的预处理方法和实际的含木素纤维素材料。有毒和/或抑制性化合物的实例，即经预处理的木素纤维素降解产物，包括4-OH苯甲醇、4-OH苯甲醛、4-OH苯甲酸、三甲基苯甲醛、2-糠酸、香豆酸、阿魏酸、苯酚、愈创木酚、藜芦醚、焦酚(pyrogallollol)、焦棓酚单甲醚(pyrogallol mono methylether)、香草醇、香草醛、异香草醛、香草酸、异香草酸、高香草酸、藜芦醇、藜芦醛、藜芦酸、2-O-甲基五倍子酸、紫丁香基丙醇、紫丁香基丙醛、紫丁香基丙酸、三甲基五倍子酸、丁香醇、丁香醛、丁香酸、三甲基五倍子酸、高儿茶酚、乙基香草醛、甲氧甲酚(creosol)、对甲基茴香醚、茴香醛、茴香酸、糠醛、羟甲基糠醛、5-羟甲基糠醛、甲酸、乙酸、乙酰丙酸、桂皮酸、松柏醛、异丁子香酚、对苯二酚、和丁子香酚。

根据本发明，在淀粉糖化、发酵或同时糖化和发酵过程中，在合并物料流之前，在两个单独的物料流中处理含淀粉材料和含木素纤维素材料。当物料流合并时，源自木素纤维素的材料可以占合并的发酵培养基总重量的0.1至90wt％，优选1至80wt％，如10至70wt％，特别是20至60wt％，如约50wt％。

引入糖化、发酵或同时糖化和发酵培养基中的、经预处理的、源自木素纤维素材料可以是未洗涤的。通常将经预处理的含木素纤维素材料洗涤或以其它方式解毒，以去除不期望的有毒化合物，但是根据本发明这是不需要的。在特定的实施方案中，材料是未洗涤的经预处理和/或水解的玉米秸秆。

含木素纤维素的材料

本文使用的术语“含木素纤维素的材料”指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。这种材料经常称作“生物质”。

木素纤维素的结构无法直接进行酶水解。因此，含木素纤维素的材料必须预处理，例如，通过在合适的压力和温度条件下酸水解，使木质素的密封结构(lignin seal)断裂并破坏纤维素的晶体结构。这可以引起半纤维素部分的溶解和糖化。然后可以将纤维素部分通过酶法水解，例如，通过纤维素酶进行，以将糖聚合物转化成可发酵的糖，后者可以发酵成为期望的发酵产物，如乙醇。可任选地回收发酵产物，例如，通过蒸馏进行。

含木素纤维素材料可以是包含木素纤维素的任何材料。在优选的实施方案中，含木素纤维素的材料包含至少30wt.％，优选至少50wt.％，更优选至少wt.70％，甚至更优选至少wt.90％的木素纤维素。应理解的是，含木素纤维素的材料还可以包含其他组分，如纤维素材料，包括纤维素和半纤维素，并且还可以包含其他组分，如蛋白质材料、淀粉、糖，如可发酵的糖和/或不可发酵的糖。

通常例如在植物的茎、叶、壳(hull)、外皮(husk)和穗轴或树的叶、枝和木材中发现含木素纤维素的材料。含木素纤维素的材料还可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸，和纸浆和造纸厂残余物。在本文应理解的是，含木素纤维素的材料可以是在混合的基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。

在优选的实施方案中，含木素纤维素的材料选自下列的一种或多种：玉米纤维、稻草、松木、木屑、杨木、甘蔗渣、纸和纸浆加工废物。

合适的含木素纤维素材料的其他实例包括玉米秸秆、玉米穗轴、硬木，如杨木和桦木，软木，谷类秸秆如小麦秸秆，柳枝稷，芒草属(Miscanthus)，稻壳，城市固体废物(MSW)，工业有机废物，办公用纸，或它们的混合物。

在优选的实施方案中，含木素纤维素的材料是玉米秸秆或玉米穗轴。在另一个优选的实施方案中，材料是玉米纤维。

预处理

可以以任何合适的方式预处理含木素纤维素的材料。

预处理可以在水解或(共)发酵之前进行。在优选的实施方案中，在发酵前将经预处理的材料水解，优选酶水解。预处理的目的是分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素以改进水解速率。预处理方法如湿氧化和碱预处理针对木质素释放，而稀酸和自水解针对半纤维素释放。蒸汽爆破(steam explosion)是针对纤维素的预处理的实例。

根据本发明，预处理步骤可以是使用本领域公知技术的常规预处理步骤。在优选的实施方案中，预处理在含水浆料中发生。在预处理过程中，含木素纤维素的材料可以以10-80wt.％，优选在20-70wt.％，特别是30-60wt.％，如约50wt.％的量存在。

化学、机械和/或生物预处理

根据本发明，含木素纤维素的材料在水解前可以进行通过化学方法、机械方法、生物方法或其任何组合的预处理。机械预处理(经常称作物理预处理)可以单独使用或者与随后或同时进行的水解(特别是酶水解)组合使用。

优选地，在水解前进行化学、机械和/或生物预处理。或者，化学、机械和/或生物预处理可以与水解同时进行，如与一种或多种纤维素酶，或其他酶活性的加入同时进行，以释放例如可发酵糖，如葡萄糖和/或麦芽糖。

在本发明的实施方案中，经预处理的含木素纤维素的材料可以是洗涤的或解毒的。然而，洗涤和解毒不是必须的，在优选的实施方案中可以去除。在优选的实施方案中，经预处理的含木素纤维素材料是未洗涤或未解毒的。

化学预处理

术语“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫和二氧化碳中的一种或多种进行处理。此外，湿氧化和pH受控的水热解(hydrothermolysis)也被认为是化学预处理。

在一个优选的实施方案中，化学预处理是酸处理，更优选地，化学预处理是连续的稀酸和/或弱酸处理，如，用硫酸处理，或者另一种有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或它们的混合物。也可以使用其它酸。弱酸处理指处理pH在pH1-5，优选1-3的范围内。在一个具体的实施方案中，酸浓度在0.1至2.0wt.％酸的范围内，优选硫酸。酸可以接触含木素纤维素的材料，并且混合物可以保持在160-220℃，如165-195℃的温度，接触时间为数分钟到数秒，例如，1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可以加入强酸(如硫酸)用于去除半纤维素。这些强酸增强了纤维素的可消化性。

也期望其它的化学预处理技术。已显示纤维素溶剂处理将约90％的纤维素转化成葡萄糖。也已经显示，当木素纤维素结构被破坏时可极大地增强酶水解。碱性H₂O₂、臭氧、有机溶剂(使用Lewis酸、含水醇中的(Al)₂SO₄、FeCl₃)、甘油、二噁烷、苯酚或乙二醇是已知可以破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686)。

根据本发明也期望用碱(例如，NaOH、Na₂CO₃和/或氨等)进行的碱化学预处理。使用氨的预处理方法在例如WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900、WO 2006/110901中描述，所述文献通过提述并入本文。

湿氧化技术包括使用氧化剂，如亚硫酸基氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲基亚砜)等进行处理。化学预处理通常进行1至60分钟，如从5至30分钟，但是根据要预处理的材料可以处理更短或更长的时间。

合适的预处理方法的其他实例由Schell等，2003，Appl.Biochem and Biotechn.Vol.105-108：69-85，和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，和美国申请公开No.2002/0164730描述，所述文献通过引用提述并入本文。

机械预处理

术语“机械预处理”指可以促进纤维素、半纤维素或木质素从含木素纤维素的材料分离或释放的任何机械(或物理)处理。例如，机械预处理包括各种类型的研磨(milling)、辐照、汽蒸/蒸汽爆破，和水热解。

机械预处理包括粉碎(即，机械减小尺度)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨。机械预处理可以涉及高压和/或高温(蒸汽爆破)。在本发明的一个实施方案中，高压指在300至600psi，优选400至500psi范围，如约450psi的压力。在本发明的一个实施方案中，高温指在约100至300℃，优选约140至235℃范围的温度。在优选的实施方案中，机械预处理是分批工艺的蒸汽枪水解器系统，其使用如上所定义的高压和高温。可以为此使用Sunds Hydrolyzer(可由Sunds Defibrator AB(Sweden)得到)。

组合的化学和机械预处理

在一个优选的实施方案中，进行化学和机械预处理两者。例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高温和/或高压处理。化学和机械预处理可以根据需要顺序或同时进行。

因此，在一个优选的实施方案中，对含木素纤维素的材料进行化学和机械预处理，以促进纤维素、半纤维素或木质素的分离或释放。

在一个优选的实施方案中，预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆破步骤进行。在另一个优选的实施方案中，预处理作为氨纤维爆破步骤(或AFEX预处理步骤)进行。

生物预处理

术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素或木质素从含木素纤维素材料分离或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，1996，Pretreatment of biomass，于Handbookon Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，Physicochemical and biologicaltreatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，1994，Pretreating lignocellulosicbiomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，Baker和Overend编，ACS Symposium Series 566，American ChemicalSociety，Washington，DC，第15章；Gong，Cao，Du和Tsao，1999，Ethanolproduction from renewable resources，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；Vallander和Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosicmaterials：State ofthe art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

水解

在将经预处理的含木素纤维素材料加入/导入/组合入淀粉糖化、发酵或同时糖化和发酵步骤中之前，可以将经预处理的含木素纤维素材料水解，以分解纤维素和半纤维素。

水解过程中的干燥固体含量可在5-50wt.％，优选10-40wt.％，优选20-30wt.％的范围内。在一个优选的实施方案中，水解可以作为补料分批工艺进行，其中将经预处理的含木素纤维素的材料(底物)逐渐补料至例如包含酶的水解溶液。

在一个优选的实施方案中，水解以酶法进行。根据本发明，经预处理的含木素纤维素材料可通过一种或多种水解酶(根据酶命名法为EC 3类)水解，优选选自下组的一种或多种糖酶：纤维素酶、半纤维素酶，淀粉酶如α-淀粉酶和糖产生酶如葡糖淀粉酶、蛋白酶，和酯酶如脂肪酶。例如，在水解和/或发酵过程中可以存在α-淀粉酶、葡糖淀粉酶等，因为含木素纤维素的材料可能包括一些淀粉。

用于水解的酶能直接或间接将糖聚合物转化成可发酵的糖，所述糖能发酵成为期望的发酵产物，如乙醇。

在一个优选的实施方案中，糖酶具有纤维素酶的活性。合适的糖酶在下面的“酶”部分中描述。

通过半纤维素酶和/或酸水解可以使半纤维素聚合物分解，以释放其五碳糖和六碳糖组分。六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，可通过合适的发酵生物体(包括酵母)容易地发酵为，例如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、柠檬酸、延胡索酸等。优选用于乙醇发酵的是酵母，如酵母属的酵母，特别是酿酒酵母菌种的酵母，优选对于高水平乙醇(即，高达，例如，10、12或15vol.％以上乙醇或者更多，如20vol.％以上乙醇)有抗性的菌株。

在一个优选的实施方案中，使用半纤维素酶，优选木聚糖酶、酯酶、纤维二糖酶或其组合水解经过预处理的含木素纤维素材料。

也可以在半纤维素酶和/或纤维素酶的组合，和任选的下面“酶”部分中提及的一种或多种其他酶存在的情况下进行水解。

在一个实施方案中，木糖异构酶可以用于水解经预处理的含木素纤维素材料。木糖异构酶可以将木糖转化成木酮糖，木酮糖可以通过发酵生物体(像酵母属)发酵成为期望的发酵产物。因此，在一个实施方案中，在水解过程中加入木糖异构酶。

酶处理可以在合适的含水环境中，在可由本领域技术人员容易地确定的条件下进行。在优选的实施方案中，在对于所述酶合适的条件，优选最适的条件进行水解。

合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域的技术人员容易地确定。优选地，水解在25-70℃，优选40-60℃，特别是约50℃的温度进行。此工艺优选在pH3-8，优选pH4-6范围内，特别是约pH5的pH进行。水解通常进行12-96小时，优选16-72小时，更优选24-48小时。

发酵

根据本发明，使用至少一种能将可发酵糖如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或间接发酵成为期望发酵产物的发酵生物体，将来自经预处理和/或水解的含木素纤维素材料的糖与获得自含淀粉材料的糖一起共发酵。发酵条件取决于期望的发酵产物，并且能由本领域的普通技术人员容易地确定。

在用酵母进行乙醇发酵的情况中，发酵优选进行1-120小时，优选12-96小时。在一个实施方案中，发酵在20至40℃，优选26至34℃，特别是约32℃的温度进行。在一个实施方案中，pH为pH3-7，优选pH4-6。

在一个优选的实施方案中，(共)发酵作为淀粉同时糖化和发酵(SSF)方法进行，并且将源自木素纤维素的(糖)物料流，优选未洗涤滤液，加入/导入/组合入淀粉SSF方法中。换句话说，在一个优选的实施方案中，没有单独的糖化步骤，意味着发酵生物体和淀粉降解酶(如糖-源产生酶)一起加入。

回收

发酵后，可任选地以任何合适的方式从发酵培养基分离发酵产物。例如，可以蒸馏培养基以提取发酵产物，或者可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取发酵产物。或者可以通过气提回收发酵产物。回收方法是本领域公知的。

发酵产物

本发明可以用于产生任何发酵产物。优选的发酵产物包括醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H₂和CO₂)，抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B₁₂，β-胡萝卜素)；和激素。

其它产物包括可消费的醇工业产品，例如啤酒和葡萄酒；乳制品工业产品，例如发酵的乳制品；皮革工业产品和烟草工业产品。在一个优选的实施方案中，发酵产物是醇，特别是乙醇。根据本发明获得的发酵产物，如乙醇，可以优选用作燃料醇/乙醇。然而，在乙醇的情况中，它还可以用作饮用乙醇。

发酵生物体

术语“发酵生物体”指任何适于产生期望发酵产物的生物体，包括细菌和真菌生物体，如酵母和丝状真菌。特别合适的发酵生物体能够发酵，即，将糖(如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖)直接或间接转化为期望的发酵产物。发酵生物体的实例包括真菌生物体如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株如树干毕赤酵母CBS 5773或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；假丝酵母属(Candida)，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)、阿糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、Candida sonorensis、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)或博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的菌株。其他发酵生物体包括发酵单孢菌属(Zymomonas)的菌株、汉逊酵母属(Hansenula)，特别是多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fagilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的菌株，和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。

优选的细菌发酵生物体包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单孢菌属，特别是运动发酵单孢菌(Zymomonasmobilis)的菌株，发酵杆菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵杆菌(Zymobactorpalmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)的菌株和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77：61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosaccharolyticum)或马瑞氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)的菌株。也预期乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株，如谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)、热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。

在一个实施方案中，发酵生物体是C6糖发酵生物体，例如酿酒酵母的菌株。

与源自木素纤维素的材料的发酵相关，期望C5糖发酵生物体。大多数C5糖发酵生物体也发酵C6糖。C5糖发酵生物体的实例包括毕赤酵母属，如树干毕赤酵母菌种的菌株。还已知C5糖发酵细菌。一些酿酒酵母菌株也发酵C5(和C6)糖。能发酵C5糖的酵母属菌种的遗传修饰的菌株的实例包括例如Ho等，1998，Applied and Environmental Microbiology，p.1852-1859和Karhumaa等，2006，Microbial Cell Factories 5：18中涉及的菌株。

在一个实施方案中，向发酵培养基中加入发酵生物体，使得活的发酵生物体(如酵母)计数在每毫升发酵培养基10⁵至10¹²，优选10⁷至10¹⁰的范围内，特别是约5×10⁷。

商业上可得到的酵母包括，例如，RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)、FALI(可从Fleischmann’s Yeast，USA获得)、SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)、BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North AmericanBioproducts Corporation，GA，USA获得)、GERT STRAND(可从Gert StrandAB，Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。

含淀粉材料

含淀粉材料可以是任何合适的含淀粉材料。

如下所述，淀粉可以是液化的糊化的淀粉或未糊化的淀粉(例如，未烹制的(uncooked)粒状淀粉)。

实际的起始材料通常根据期望的发酵产物选择。适用于本发明的方法或工艺的含淀粉材料的实例包括块茎、根、茎、整谷粒、玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、高粱、稻、豌豆、菜豆(bean)或甘薯，或其混合物，或谷类、含糖原材料，如糖蜜、果实材料、甘蔗或糖用甜菜、马铃薯，或其混合物。预期的材料是蜡质(waxy)和非蜡质的玉米和大麦。

术语“粒状淀粉”指生的未烹制淀粉，即，在谷类、块茎或谷粒中存在的天然形式的淀粉。淀粉在植物细胞中以不溶于水的小颗粒形成。当放入冷水中时，淀粉颗粒可以吸收少量的液体并膨胀。在高达50℃至75℃的温度，膨胀可以是可逆的。然而，对于更高的温度，开始称为“胶凝化/糊化”的不可逆膨胀。待处理的粒状淀粉可以是高度精制的淀粉质量，优选至少90％，至少95％，至少97％或至少99.5％纯，或者其可以是更粗制的含淀粉材料，其包含研磨的整谷粒，所述研磨的整谷粒包括非淀粉部分如胚芽(germ)残余物和纤维。

含淀粉材料的分级(fractionation)

在一个实施方案中，含淀粉材料可分成一个或多个组分，包括纤维、胚芽，和淀粉和蛋白质的混合物(胚乳)。根据本发明，分级可以使用任何合适的技术或设备进行。例如，Satake Corporation(Japan)已制造了适于将植物材料如玉米分级的系统。

胚芽和纤维组分可以从胚乳的剩余部分分级得到。在本发明的一个实施方案中，含淀粉材料是植物胚乳，优选玉米胚乳。此外，可以降低胚乳的粒度，并与较大块的经分级的胚芽和纤维组分合并用于发酵。

可以使用设备完成分级，例如，美国申请公开No.2004/0043117中公开的设备，所述文献通过提述并入本文，其教导了设备及其用于分级的用途。用于分级的合适的方法和设备包括筛子、筛分和淘洗(elutriation)。合适的设备还包括摩擦研磨机(friction mill)，如水稻或谷粒抛光研磨机(例如，由SatakeCorporation(Japan)，Kett或Rapsco，TX，USA制造的那些)。

降低含淀粉材料的粒度

可以优选降低含淀粉材料的粒度，以打开结构并暴露更大的表面积。这可以通过研磨完成。根据本发明优选两种研磨方法：湿磨和干磨。在干磨中，研磨并使用完整的核。湿磨可以很好地分离胚芽和粗粉(即，淀粉颗粒和蛋白质)。干磨和湿磨都是淀粉加工领域中公知的，并且根据本发明是同样预期的。用于降低含淀粉材料的粒度的其他期望技术的实例包括乳化技术和旋转脉冲。

在一个实施方案中，含淀粉材料可以将粒度减小至0.05-3.0mm，或者使含淀粉材料的至少30％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％可通过具有0.05至3.0mm筛孔，优选0.1-0.5mm筛孔的筛网。

通过向常规基于淀粉方法加入经预处理的含木素纤维素材料而产生发酵产物的方法

在这个方面本发明涉及由含淀粉材料和含木素纤维素材料的组合产生发酵产物的方法，包括如下步骤：

a)液化含淀粉材料；

b)糖化；和

c)使用发酵生物体发酵；

其中在发酵之前和/或发酵过程中加入经预处理的含木素纤维素材料。

应理解的是，在合并物料流之前，在两个单独的物料流中处理含淀粉材料和含木素纤维素材料。在一个优选的实施方案中，将源自木素纤维素的材料引入发酵，使其占合并的发酵培养基总重量的0.1至90wt.％，优选1至80wt.％，如10至70wt.％，特别是20至60wt.％，如约50wt.％。

在一个优选的实施方案中，在存在一种或多种α-淀粉酶的情况下进行步骤a)。α-淀粉酶可以优选为细菌或真菌来源的。α-淀粉酶的实例在下面的“α-淀粉酶”部分中描述。

此外，糖化步骤b)或同时的步骤b)和c)(即，SSF)，优选在存在一种或多种糖-源产生酶如特别是葡糖淀粉酶的情况下进行。发酵步骤c)或同时的步骤b)和c)优选在存在酵母，优选酵母属的菌株，如酿酒酵母的菌株的情况下进行。合适的发酵生物体列于上面的“发酵生物体”部分中。

期望的发酵产物是乙醇。发酵产物(特别是乙醇)可以任选地在发酵后回收，例如通过蒸馏回收。

合适的含淀粉起始材料列于上面的“含淀粉材料”部分中。期望的酶列于下面的“酶”部分中。

在一个特定的实施方案中，该方法在步骤a)之前还包括如下步骤：

1)减小含淀粉材料的粒度，优选通过碾磨进行；和

2)形成包含含淀粉材料和水的浆料。

含水浆料可以包含10-55wt.％，优选25-40wt.％，更优选30-35wt.％含淀粉材料。在本发明的这个方面，将浆料加热至糊化温度之上，任选地可在这个时间点加入α-淀粉酶，以开始液化(稀释)。然后浆料可以经过喷射蒸煮(jet-cook)，使浆料在经过步骤a)中的α-淀粉酶处理之前进一步糊化。

更特定地，可以以三步热浆法进行液化。将浆料加热至60-105℃，优选80-95℃，并可加入α-淀粉酶开始液化(稀释)。在一个实施方案中，然后使浆料在95-140℃，优选105-125℃的温度喷射蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别是约5分钟。将浆料冷却至60-105℃，并加入(更多的)α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化步骤可在3-7的pH，特别是在4至6的pH，尤其是在4至5的pH进行。

可以使用本领域公知的条件进行步骤b)中的糖化。例如，完全的单独的糖化步骤可以持续多至约24小时至约72小时。在一个实施方案中，在30-65℃，通常约60℃的温度进行约40-90分钟的预糖化，然后在同时糖化和发酵步骤(即，SSF)中的发酵过程中进行完全的糖化。糖化通常在30-65℃，通常约60℃的温度，和在4-5的pH，通常在约pH4.5进行。

发酵产品(特别是乙醇)产生过程中，最广泛使用的步骤是同时糖化和发酵(SSF)步骤，其中没有糖化的保留阶段，表示发酵生物体，如酵母，和酶可以一起添加。SSF可通常在25℃-40℃，如29℃-35℃，如30℃-34℃，如约32℃的温度进行。换句话说，步骤b)中的糖化和步骤c)中的发酵可以顺序或同时进行，优选同时进行。

在一个优选的实施方案中，经预处理的含木素纤维素材料在加入淀粉糖化、发酵或同时糖化和发酵步骤之前水解。合适的预处理方法如上面的“预处理”部分所述。

经预处理的木素纤维素材料在发酵前可以通过用一种或多种水解酶(根据酶命名法为EC3类)处理而进一步水解，优选使用一种或多种糖酶，如纤维素酶或半纤维素酶，或者它们的组合。合适的水解酶的实例可以在下文找到。

发酵前优选从经预处理和/或水解的含木素纤维素材料去除固体。因此，向糖化步骤b)、发酵步骤c)，或同时糖化和发酵步骤加入已去除固体的经预处理和/或水解的含木素纤维素材料。可以用本领域已知的任何合适的方法从经预处理的含木素纤维素材料去除固体。例如，可通过过滤，使用压滤机和/或离心机等来去除固体。如上所述，经预处理的含木素纤维素材料可以是未解毒的，如未洗涤的。

在糖化、发酵或同时糖化和发酵过程中可以使用一种或多种糖-产生酶。这些酶的实例在下面的“糖-源产生酶”中公开。优选的糖-源产生酶是葡糖淀粉酶。

通过向发酵基于未烹制淀粉的材料的方法中加入经预处理的含木素纤维素材料而产生发酵产物的方法

在这个方面，本发明涉及由含淀粉材料和经预处理的含木素纤维素材料的组合产生发酵产物的方法。该方法在不烹制含淀粉材料(即，未发生糊化)的情况下进行。换句话说，根据本发明的这个方面，在不液化包含含淀粉材料的浆料的情况下产生期望的发酵产物。在一个实施方案中，本发明的方法包括在低于起始糊化温度的温度，在存在如下面的“α-淀粉酶”部分所示例的α-淀粉酶和/或如下面的“糖-源产生酶”部分所示例的糖-源产生酶(优选葡糖淀粉酶)的情况下，糖化(例如，碾磨)含淀粉材料，优选粒状淀粉，以产生能由一种或多种合适的发酵生物体发酵并转化成期望的发酵产物的糖。

因此，在这个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料和含木素纤维素材料的组合产生发酵产物的方法，其包括如下步骤：

i)在低于起始糊化温度的温度糖化含淀粉材料；

ii)使用发酵生物体发酵；

其中在发酵之前和/或发酵过程中加入经预处理的含木素纤维素材料。

应理解的是，在合并物料流之前，在两个单独的物料流中处理含淀粉材料和含木素纤维素材料。在一个优选的实施方案中，将源自木素纤维素的材料导入发酵，使其占(合并的)发酵培养基总重量的0.1至90wt.％，优选1至80wt.％，如10至70wt.％，特别是20至60wt.％，如约50wt.％。

任选地在发酵后回收发酵产物。步骤i)中的糖化和步骤ii)中的发酵可以顺序或同时进行，优选同时进行。在一个优选的实施方案中，经预处理的含木素纤维素材料在加入糖化步骤、发酵步骤或同时糖化和发酵步骤之前水解。在一个优选的实施方案中，经预处理的材料在发酵前通过用一种或多种水解酶(根据酶命名法为EC3类)处理而水解，优选使用一种或多种糖酶，优选纤维素酶或半纤维素酶，或者它们的组合。其它水解酶的实例可以在下文找到。

加入糖化、发酵或同时糖化和发酵前优选从经预处理和/或水解的含木素纤维素材料去除固体。因此，可向糖化步骤i)、发酵步骤ii)，或同时糖化和发酵步骤加入已去除固体的经预处理和/或水解的含木素纤维素材料。可以以任何合适的方式从经预处理的含木素纤维素材料去除固体。例如，可通过过滤，使用压滤机和/或通过离心等来去除固体。如上所述，经预处理的含木素纤维素材料可以是未解毒的，如未洗涤的。在糖化、发酵或同时糖化和发酵过程中可以使用一种或多种糖-产生酶。在加入糖化步骤、发酵步骤或同时糖化和发酵步骤前，可以任何合适的方式预处理含木素纤维素材料。化学、机械和/或生物预处理方法的实例公开在上面的“预处理”部分中。

期望的发酵产物优选乙醇。其它期望的发酵产物的实例可以在上面的“发酵产物”部分中找到。

对于乙醇产生，优选的发酵生物体是酵母，优选酵母属的菌株。其它发酵生物体的实例可以在上面的“发酵生物体”部分中找到。合适的工艺条件在本领域中公知。在一个优选的实施方案中，发酵或同时糖化和发酵在25℃-40℃，如29℃-35℃，如30℃-34℃，如约32℃的温度进行。发酵过程中的pH可以合适地为3-7，优选4-6。发酵可以进行1-120小时，优选12-96小时。合适的含木素纤维素材料和含淀粉材料的实例可在上文找到。

术语“低于起始糊化温度”表示低于使所述淀粉糊化开始的最低温度。在水中加热的淀粉在约50℃-75℃开始糊化；糊化的确切温度依赖于特定的淀粉，可以由技术人员容易地确定。因此，起始糊化温度可以根据植物物种、植物物种的特定品种以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的起始糊化温度可定义为使用Gorinstein.S.和Lii.C.，1992，Starch/

44(12)：461-466所述的方法，5％的淀粉颗粒中双折射消失的温度。

在步骤i)前，可以制备具有含淀粉材料的10-55wt.％的干燥固体(DS)，优选25-40wt.％的干燥固体，更优选30-35％的干燥固体的含淀粉材料(如粒状淀粉)的浆料。可以在这个时间点加入经预处理和/或水解的含木素纤维素材料。浆料还可以包括水和/或工艺水，如稀釜馏物(回流)、洗涤水、蒸发器浓缩物和蒸馏物、来自蒸馏的侧线气提器水，或其它发酵产品工厂工艺水。浆料的组成可以由本领域的技术人员容易地调整。

可通过减小粒度，优选通过干磨或湿磨将粒度减至0.05至3.0mm，优选0.1-0.5mm来制备含淀粉材料。在进行本发明的方法后，含淀粉材料的干燥固体中至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或优选至少99％转化成可溶的淀粉水解物。

根据本发明的这个方面，该方法在低于起始糊化温度的温度进行。当步骤i)中的糖化和步骤ii)中的发酵顺序进行时，温度通常可为30-75℃，优选45-60℃。在一个优选的实施方案中，步骤i)和步骤ii)同时进行。合适的条件如上所述。

在一个优选的实施方案中，将糖水平(如葡萄糖水平)保持在低水平，如6wt.％以下，优选约3wt.％以下，优选约2wt.％以下，更优选约1wt.％以下，甚至更优选约0.5wt.％以下，或者甚至更优选0.25wt.％，如约0.1％以下。通过简单地采用量经过调整的酶和发酵生物体，可以实现这样低水平的糖。本领域的技术人员可容易地确定使用何种量的酶和发酵生物体。还可以选择酶和发酵生物体的采用量，以在发酵培养基中保持麦芽糖的低浓度。例如，麦芽糖水平保持约0.5wt.％以下或约0.2wt.％以下。

酶

如果本发明方法或工艺的上下文中未特别说明，应理解为酶以及其它化合物以“有效量”使用。

纤维素酶

本文使用的术语“纤维素酶”应理解为包含纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，例如纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)。本文使用的短语“纤维素分解酶”应理解为包括纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。

为了有效，纤维素和半纤维素的消化需要几种类型的酶协同作用。需要至少三种类型的酶将纤维素转化成葡萄糖：随机剪切纤维素链的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；从纤维素链末端切割纤维二糖基的纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和将纤维二糖和可溶的纤维糊精转化成葡萄糖的β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。在这三种类型的与纤维素的生物降解有关的酶中，纤维二糖水解酶是降解天然结晶纤维素的关键酶。术语“纤维二糖水解酶I”在本文中定义为纤维素1，4-β-纤维二糖糖苷酶(也称作外切葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或1，4-β-纤维二糖水解酶)活性，如酶类EC 3.2.1.91中所定义的，其通过从链的非还原末端释放纤维二糖，催化纤维素和纤维四糖中1，4-β-D-葡糖苷键的水解。术语“纤维二糖水解酶II活性”的定义相同，只是纤维二糖水解酶II攻击链的还原末端。

包括来自里氏木霉(Trichoderma reseei)、特异腐质霉(Humicola insolens)的CBH I和CBH II和来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶(CELL6A)的CBH II的纤维二糖水解酶的实例如上所述。

纤维二糖水解酶活性可以根据由Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279和由van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters 149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187：283-288所述方法确定。Lever等的方法适于评估玉米秸秆中的纤维素的水解，并且van Tilbeurgh等的方法适于确定对于荧光二糖衍生物的纤维二糖水解酶活性。

内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟甲基纤维素)、地衣淀粉、混合β-1，3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β-1，4键和其它包含纤维素部分的植物材料中1，4-β-D-糖苷键的内切水解。经审定的名称为内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，但是在本说明书中使用缩写术语内切葡聚糖酶。可以使用羧甲基纤维素(CMC)水解，根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法确定内切葡聚糖酶活性。

在优选的实施方案中，内切葡聚糖酶可源自木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporium lucknowens的菌株。

纤维素酶可以包含糖-结合模块(CBM)，其增强酶与含纤维素纤维的结合，并增加酶催化活性部分的功效。CBM定义为具有离散折叠的糖-活性酶中具有糖-结合活性的邻接的氨基酸序列。关于CBM的其它信息，可以参见CAZy互联网服务器(见上文)或Tomme等(1995)于Enzymatic Degradation of InsolublePolysaccharides(Saddler和Penner编)，Cellulose-binding domains：classification andproperties.第142-163页，American Chemical Society，Washington。

在一个优选的实施方案中，纤维素酶可以是如美国申请60/941,251中所定义的组合物，所述文献通过提述并入本文。具体地，在一个实施方案中是实施例1中使用的纤维素酶组合物(纤维素酶制备物A)。在一个优选的实施方案中，包含具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)的纤维素分解制备物优选为WO 2005/074656(通过提述并入本文)中公开的桔橙嗜热霉(Thermoascusaurantiacus)GH61A。纤维素分解制备物可以进一步包含β-葡糖苷酶，如源自木霉属、曲霉属或青霉属的菌株的β-葡糖苷酶，包括美国申请No.11/781,151或PCT/US2007/074038(Novozymes)中公开的特异腐质霉CEL45A内切葡聚糖酶核心/米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。在一个实施方案中，纤维素分解制备物还可以包含CBH II，优选土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在一个实施方案中，纤维素分解制备物还包含纤维素酶酶制备物，优选源自里氏木霉的纤维素酶酶制备物。

术语“β-葡糖苷酶”指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据由Venturi等，2002，J.Basic Microbiol.42：55-66描述的基本方法确定β-葡糖苷酶活性，只是使用如本文所述的不同条件。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在50℃，pH5，由在100mM柠檬酸钠和0.01％

20中作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。

在一个优选的实施方案中，β-葡糖苷酶是真菌来源的，如来自木霉属、曲霉属或青霉属的菌株。在一个优选的实施方案中，β-葡糖苷酶源自里氏木霉，如由bgll基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP 562003的图1)。在另一个优选的实施方案中，β-葡糖苷酶源自米曲霉(根据WO 02/095014，在米曲霉中重组产生)，烟曲霉(根据WO 02/095014的实施例22，在米曲霉中重组产生)或黑曲霉(1981，J.Appl.3：157-163)。

在一个优选的实施方案中，纤维分解活性可以源自真菌来源，如木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；或腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。

在一个实施方案中，纤维素分解酶制备物包含WO 2005/074656中公开的具有增强纤维素分解的活性的多肽(GH61A)；纤维二糖水解酶，如土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)，β-葡糖苷酶(例如，美国申请No.60/832,511中公开的融合蛋白)和纤维素分解酶，例如，源自里氏木霉的纤维素分解酶。

在一个实施方案中，纤维素分解酶是商业上可得到的产品

1.5L或CELLUZYME^TM(可由Novozymes A/S，Denmark得到)或ACCELERASE^TM 1000(来自Genencor Inc.，USA)。

可以加入纤维素分解酶以水解经过预处理的含木素纤维素材料。纤维素分解酶的剂量可在0.1-100FPU每克总固体(TS)，优选0.5-50FPU每克TS，特别是1-20FPU每克TS的范围内。在另一个实施方案中，将至少0.1mg纤维素分解酶每克总固体(TS)，优选至少3mg纤维素分解酶每克TS，如5-10mg纤维素分解酶用于水解。

增强纤维素分解的活性

术语“增强纤维素分解的活性”在本文定义为增强具有纤维素分解活性的蛋白对源自木素纤维素材料的水解的生物活性。就本发明而言，通过在如下条件下测量来自源自木素纤维素的材料(例如经过预处理的含木素纤维素材料)通过纤维素分解蛋白的水解的还原糖的增加或总的纤维二糖和葡萄糖的增加来确定增强纤维素分解的活性：1-50mg的总蛋白/g PCS(经过预处理的玉米秸秆)中的纤维素，其中总蛋白含80-99.5％w/w纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素和0.5-20％w/w增强纤维素分解的活性的蛋白，在50℃进行1-7天，与使用相等的总蛋白加载量但不含增强纤维素分解的活性的对照水解相比较(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)。

所述具有增强纤维素分解的活性的多肽以下述方式增强由具有纤维素分解活性的蛋白质催化的源自木素纤维素的材料的水解：降低达到同样水解程度所需的纤维素分解酶量，优选降低至少0.1倍，更优选至少0.2倍、更优选至少0.3倍、更优选至少0.4倍、更优选至少0.5倍、更优选至少1倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少10倍、更优选至少20倍、进一步更优选至少30倍、最优选至少50倍、甚至最优选至少100倍。

在一个优选的实施方案中，在存在与具有增强活性的多肽组合的纤维素分解酶的情况下进行水解和/或发酵。在一个优选的实施方案中，具有增强活性的多肽是家族GH61A多肽。WO 2005/074647公开了具有增强纤维素分解的活性的分离的多肽及其来自土生梭孢霉的多核苷酸。WO 2005/074656公开了具有增强纤维素分解的活性的分离的多肽及其来自桔橙嗜热霉的多核苷酸。美国申请公开No.2007/0077630公开了具有增强纤维素分解的活性的分离的多肽及其来自里氏木霉的多核苷酸。

半纤维素分解酶

在本发明的一个实施方案中，用一种或多种半纤维素酶处理经预处理的木素纤维素材料。

可以使用适用于将半纤维素水解成木糖的任何半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，内切或外切阿拉伯糖酶，外切半乳聚糖酶，或它们的两种或多种的混合物。优选地，用于本发明的半纤维素酶是外-作用(exo-acting)半纤维素酶，并且更优选地，半纤维素酶是能在pH7以下，优选pH3-7的酸性条件下水解半纤维素的外-作用半纤维素酶。适用于本发明的半纤维素酶的实例包括VISCOZYME^TM(可由Novozymes A/S，Denmark得到)。

在一个实施方案中，半纤维素酶是木聚糖酶。在一个实施方案中，木聚糖酶可优选是微生物来源的，如真菌来源的(例如，木霉属、多孔菌属(Meripilus)、腐质霉属、曲霉属、镰孢属)或者来自细菌(例如，芽孢杆菌属)。在一个优选的实施方案中，木聚糖酶源自丝状真菌，优选源自曲霉属，如棘孢曲霉的菌株；或者腐质霉属，优选疏棉状腐质霉的菌株。木聚糖酶可优选为内切-1，4-β-木聚糖酶，更优选为GH10或GH11的内切-1，4-β-木聚糖酶。商业的木聚糖酶的实例包括来自Novozymes A/S，Denmark的BIOFEEDWHEAT^TM和SHEARZYME^TM。

可以以将半纤维素水解成木糖的有效量，如，以总固体(TS)的约0.001至0.5wt.％，更优选TS的约0.05至0.5wt.％的量加入半纤维素酶。

可以以0.001-1.0g/kg DM(干物质)底物的量，优选以0.005-0.5g/kg DM底物，并且最优选0.05-0.10g/kg DM底物的量加入木聚糖酶。

α-淀粉酶

根据本发明可以使用任何α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶是微生物，如细菌或真菌来源的。哪种α-淀粉酶最合适取决于所述的工艺(例如，糊化或未糊化的淀粉)，并能由本领域技术人员容易地确定。

特别地，对于未糊化的淀粉工艺，优选的α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”表示以有效量加入的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其在3至7，优选3.5至6，或更优选4-5范围内的pH具有最适活性。

细菌α-淀粉酶

特别地，对于包括将糊化淀粉液化的工艺，优选细菌来源的α-淀粉酶。

在一个优选实施方案中，α-淀粉酶是芽孢杆菌来源的。芽孢杆菌属α-淀粉酶可优选源自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，但是还可以源自其它芽孢杆菌菌种。期望的α-淀粉酶的特定实例包括WO 99/19467中SEQ ID NO：4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中SEQ ID NO：5所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和WO99/19467中SEQ ID NO：3所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在本发明的一个实施方案中，α-淀粉酶可为与WO 99/19467中SEQ ID NO：1、2或3分别所示的任何序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同一性程度的酶。

芽孢杆菌属α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355中所述的(所有文献通过提述并入本文)。特别期望的α-淀粉酶变体在美国专利No.6,093,562、6,297,038或6,187,576中公开(通过提述并入本文)，而且包括在位置R179至G182缺失一个或两个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO 1996/023873中公开的双缺失——参见例如，第20页，第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467中公开的SEQID NO：3所列出的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或缺失氨基酸R179和G180，使用WO 99/19467中SEQ ID NO：3的编号(通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 99/19467中SEQ ID NO：3所列出的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Δ(181-182)的双缺失，而且还包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。

细菌杂合α-淀粉酶

特别期望的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO 99/19467中SEQ ID NO：4所示)的445个C末端氨基酸残基，和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/194676中SEQ ID NO：5所示)的37个N末端氨基酸残基，具有下述取代中的一个或多个，特别是全部：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：4中的地衣芽孢杆菌编号)。还优选具有下述突变中的一个或多个(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架上的相应突变)的变体：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或在位置176-179缺失两个残基，优选缺失E178和G179(使用WO 99/19467中SEQ ID NO：5的编号方式)。

真菌α-淀粉酶

真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属的菌株的α-淀粉酶，如米曲霉、黑曲霉和川地曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶。

优选的酸性真菌α-淀粉酶是Fungamyl-样α-淀粉酶，其源自米曲霉的菌株。根据本发明，术语“Fungamyl-样α-淀粉酶”表示与WO 96/23874中SEQ IDNO：10所示氨基酸序列的成熟部分显示高度同一性，即，高于70％，高于75％，高于80％，高于85％，高于90％，高于95％，高于96％，高于97％，高于98％，高于99％，或者甚至100％同一性的α-淀粉酶。

另一种优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉菌株。在一个优选实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的α-淀粉酶，其在Swiss-prot/TeEMBL数据库中以初级登录号P56271作为“AMYA_ASPNG”公开，并在WO 89/01969(实施例3)中进行了描述。商业上可得到的源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可从Novozymes A/S，Denmark得到)。

其它期望的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属和多孔菌属的菌株，优选源自微小根毛霉(WO 2004/055178，通过提述并入)或巨多孔菌(Meripilusgiganteus)的菌株的那些α-淀粉酶。

在一个优选实施方案中，α-淀粉酶源自川地曲霉，并由Kaneko等，J.Ferment.Bioeng.81：292-298(1996)，“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase fromAspergillus kawachii″公开；还作为EMBL：#AB008370公开。

真菌α-淀粉酶还可以是包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。

真菌杂合α-淀粉酶

在一个优选实施方案中，真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括WO 2005/003311或美国申请公开No.2005/0054071(Novozymes)或美国申请No.60/638,614(Novozymes)中公开的酶，所述文件通过提述并入本文。杂合α-淀粉酶可以包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，和任选的接头。

期望的杂合α-淀粉酶的特定实例包括美国申请No.60/638,614中实施例的表1至5公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的Fungamyl变体(US 60/638,614中的SEQ ID NO：100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO：101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：96的组合在美国申请No.11/316,535的表5中公开)或作为WO 2006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(US申请No.60/638,614中SEQ ID NO：102)。其它特别期望的杂合α-淀粉酶的实例是美国申请No.11/316,535和WO2006/069290(通过提述并入本文)的实施例4中表3、4、5和6中所列出的酶的任一个。

期望的杂合α-淀粉酶的其它特定实例包括美国申请公开No.2005/0054071中公开的那些酶，包括在15页表3中公开的那些酶，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。

还期望与上述任何α-淀粉酶显示高同一性，即，与成熟酶序列显示多于70％，多于75％，多于80％，多于85％，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或者甚至100％同一性的α-淀粉酶。

根据本发明，可以以0.1至10AFAU/g DS，优选0.10至5AFAU/g DS，特别是0.3至2AFAU/g DS的量加入酸性α-淀粉酶。

商业α-淀粉酶产品

优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括MYCOLASE(来自DSM)、BAN^TM、TERMAMYL^TM SC、FUNGAMYL^TM、LIQUOZYME^TM X和SAN^TMSUPER、SAN^TM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASE^TM L-40,000、DEX-LO^TM、SPEZYME^TM FRED、SPEZYME^TM AA和SPEZYME^TM DELTA AA(Genencor Int.)，和以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可从NovozymesA/S，Denmark得到)。

糖-源产生酶

短语“糖-源产生酶”包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖产生者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖产生者)。糖-源产生酶能产生糖，所述糖能由所述发酵生物体用作能量-源，例如，当用于本发明的产生发酵产品(如乙醇)的工艺时。产生的糖可以直接或间接转化成期望的发酵产品，优选乙醇。根据本发明，可以使用糖-源产生酶的混合物。特别期望的混合物是至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的混合物，特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶。在本发明的一个实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)和葡糖淀粉酶活性(AGU)之间的比例(AFAU/AGU)可为至少0.1，特别是至少0.16，如在0.12至0.50或更高的范围内。

葡糖淀粉酶

根据本发明使用的葡糖淀粉酶可以源自任何合适的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes，Denmark)中公开的那些；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉葡糖淀粉酶(1991，Agric.Biol.Chem.55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等(1996)，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，1995，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301：275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry，35：8698-8704)；和在位置A435和S436引入Pro残基(Li等(1997)，Protein Engng.10：1199-1204)。

其它葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(过去称作罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利No.4,727,026和Nagasaka等，1998，Purification andproperties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rplfsii，ApplMicrobiol Biotechnol 50：323-330)、踝节菌属葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森踝节菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利No.Re.32,153)、Talaromycesduponti和嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利No.4,587,215)。

期望的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属的葡糖淀粉酶，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)和WO 2006/069289(其通过提述并入本文)中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)。

根据本发明还期望杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的实例例如公开于WO2005/045018中。特定的实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(其通过提述并入本文)。

还期望与上述任何葡糖淀粉酶表现出较高同一性，即，与成熟酶序列显示多于70％，多于75％，多于80％，多于85％，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或者甚至100％同一性的葡糖淀粉酶。

商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L、SPIRIZYME^TM PLUS、SPIRIZYME^TMFUEL、SPIRIZYME^TM B4U和AMG^TM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEX^TM300(来自Genencor Int.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900、G-ZYME^TM和G990ZR(来自Genencor Int.)。

在一个实施方案中，可以以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS的量加入，特别是1-5AGU/g DS，如0.5AGU/g DS的量加入葡糖淀粉酶。

β-淀粉酶

至少根据本发明，β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)是传统上给予外-作用产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物中1，4-α-葡糖苷键的水解。以逐步的方式从非还原链末端连续地去除麦芽糖单元直至分子降解，或在支链淀粉的情况下，直至到达分支点。释放的麦芽糖具有β异头构型，因此命名为β-淀粉酶。

已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，1979，Progress in Industrial Microbiology 15：112-115)。这些β-淀粉酶的特征为具有40℃至65℃范围内的最适温度和4.5至7范围内的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶是来自Novozymes A/S，Denmark的NOVOZYM^TMWBA和来自Genencor Int.，USA的SPEZYME^TM BBA 1500。

产麦芽糖淀粉酶

淀粉酶还可以是产麦芽糖α-淀粉酶。产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽水解酶，E.C.3.2.1.133)能将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。在美国专利No.4,598,048、4,604,355和6,162,628中描述了产麦芽糖淀粉酶，所述专利通过提述并入本文。

在一个优选的实施方案中，可以以0.05-5mg总蛋白质/克DS或0.05-5MANU/g DS的量加入产麦芽糖淀粉酶。

木糖异构酶

木糖异构酶(D-木糖酮异构酶)(E.C.5.3.1.5.)是催化D-木糖到D-木酮糖的可逆异构反应的酶。一些木糖异构酶还可以实现D-葡萄糖到D-果糖的可逆异构化。因此，木糖异构酶有时称作“葡萄糖异构酶”。

本发明的方法或工艺中使用的木糖异构酶可以是具有木糖异构酶活性任何酶，并且可以源自任何来源，优选细菌或真菌来源，如丝状真菌或酵母。细菌木糖异构酶(来源)的实例包括属于链霉菌属、游动放线菌属(Actinoplanes)、芽孢杆菌属和黄杆菌属，和热袍菌属，包括新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana)(Vieille等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5)：1867-1875)和海栖热袍菌(T.maritima)的菌株。

真菌木糖异构酶的实例是担子菌纲来源的菌种。

优选的木糖异构酶来自酵母念珠菌属(Candida)的菌株，优选博伊丁念珠菌(Candida boidinii)的菌株，特别是由例如Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.52(7)：1817-1824公开的博伊丁念珠菌木糖异构酶。木糖异构酶可以优选源自博伊丁念珠菌的菌株(克勒克酵母(Kloeckera)2201)，其作为DSM70034和ATCC 48180保藏，公开于Ogata等，Agric.Biol.Chem.33：1519-1520或Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.52(2)：1519-1520中。

在一个实施方案中，木糖异构酶源自链霉菌属的菌株，例如，源自全部公开于美国专利3,616,221中的鼠灰链霉菌(美国专利4,687,742)；黄微绿链霉菌(S.flavovirens)、白色链霉菌(S.albus)、不产色链霉菌(S.Achromogenus)、多刺链霉菌(S.echinatus)、威德摩尔链霉菌(S.wedmorensis)的菌株。其它木糖异构酶公开于美国专利No.3,622,463、4,351,903、4,137,126和3,625,828、HU专利No.12,415、DE专利2,417,642、日本专利No.69,28,473和WO2004/044129中，每篇文献通过提述并入本文。

木糖异构酶可以是固定化或液体形式。优选液体形式。

加入木糖异构酶以提供0.01-100IGIU每克总固体范围内的活性水平。

商业上可得到的木糖异构酶的实例包括来自Novozymes A/S，Denmark的SWEETZYME^TM T。

蛋白酶

蛋白酶可以是任何蛋白酶，在一个优选的实施方案中，蛋白酶是微生物来源，优选真菌或细菌来源的酸性蛋白酶。

合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，通过在pH 7以下的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。

期望的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉属、毛霉属、根毛霉属、念珠菌属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别期望的是源自黑曲霉(参见，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan 28：216)、斋藤曲霉(参见，例如，Yoshida，1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan 28：66)，泡盛曲霉(Hayashida等，1977，Agric.Biol.Chem.42(5)：927-933)，棘孢曲霉(WO 95/02044)，或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶；和来自微小毛霉(Mucorpusillus)或米黑毛霉的酸性蛋白酶。

还期望中性或碱性蛋白酶，如源自芽孢杆菌属的菌株的蛋白酶。对于本发明特别期望的蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌，并具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。还期望与在Swissport可作为登录号P06832得到的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者特别是至少99％同一性的蛋白酶。此外还期望与WO2003/048353中以SEQ ID NO：1公开的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者特别是至少99％同一性的蛋白酶。

还期望木瓜蛋白酶-样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)中的蛋白酶，如E.C.3.4.22.2(木瓜蛋白酶)，EC 3.4.22.6(糜蛋白酶)，EC 3.4.22.7(萝蘼蛋白酶)，EC 3.4.22.14(奇异果蛋白酶)，EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)，EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜凝乳蛋白酶(caricain))。

在一个实施方案中，蛋白酶是源自曲霉属如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施方案中，蛋白酶源自根毛霉属，优选米赫根毛霉的菌株。在另一个期望的实施方案中，蛋白酶是蛋白酶制备物，优选为源自曲霉属如米曲霉的菌株的蛋白分解制备物和源自根毛霉属优选米赫根毛霉的菌株的蛋白酶的混合物。

天冬氨酸蛋白酶在，例如，Handbook of Proteolytic Enzymes，由Barrett编，Rawlings和Woessner，Academic Press，San Diego，1998，第270章中描述。天冬氨酸蛋白酶的合适的实例包括，例如，在Berka等，1990，Gene 96：313；Berka等，1993，Gene 125：195-198；和Gomi等，1993，Biosci.Biotech.Biochem.57：1095-1100中公开的那些，所述文献通过提述并入本文。

商业上可得到的产品包括

ESPERASE^TM、FLAVOURZYME^TM、PROMIX^TM、

NOVOZYM^TMFM 2.0L，和NOVOZYM^TM 50006(可由Novozymes A/S，Denmark得到)和来自Genencor Int.，Inc.，USA的GC106^TM和SPEZYME^TM FAN。

蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白每g DS，优选0.001至0.1mg酶蛋白每g DS的量存在。或者，蛋白酶可以以0.0001至1LAPU/g DS，优选0.001至0.1LAPU/g DS和/或0.0001至1mAU-RH/g DS，优选0.001至0.1mAU-RH/g DS的量存在。

本文描述和要求的发明并不局限于本文公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案意欲作为对本发明几个方面的说明。任何等同的实施方案意欲落入本发明的范围内。事实上，除了本文显示和描述的之外，由前文所述，本发明的多种修正对于本领域的技术人员是显而易见的。这些修正也意欲落入提出的权利要求的范围。

本文引用了多篇文献，除非特别说明，其中的公开内容通过提述全部并入本文。本发明还通过下述实施例描述，所述实施例不应视为对本发明范围的限定。

材料与方法

材料

酶：

纤维素酶制备物A：包含下述的纤维素分解组合物：具有增强纤维素分解的活性的多肽(GH61A)，所述多肽公开于WO 2005/074656中；β-葡糖苷酶(公开于美国申请No.60/832,511中的融合蛋白)和源自里氏木霉的纤维素分解酶制备物。纤维素酶制备物A公开于美国申请No.60/941,251中。

葡糖淀粉酶SF：源自埃默森踝节菌的葡糖淀粉酶，所述酶以WO 99/28448中的SEQ ID NO：7公开，并可由Novozymes A/S，Denmark提供。

酵母

可从Red Star/Lesaffre，USA得到的RED STAR^TM

获得自NREL lot#4(062706)的未洗涤、经酸处理的蒸汽爆破后的PCS

获得自HGF Aberdeen，SD，USA的玉米醪

方法

同一性的确定

参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

两个氨基酸序列之间的同一性程度可通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来测定，采用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分(gappenalty)为10和缺口长度罚分(gap length penalty)为10。配对比对参数是K元组(Ktuple)＝1，缺口罚分＝3，窗口(windows)＝5，并且对角线(diagonals)＝5。

两个核苷酸序列之间的同一性程度通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80：726-730)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来测定，采用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分为10和缺口长度罚分为10。配对比对参数是K元组＝3，缺口罚分＝3，和窗口＝20

使用滤纸试验(FPU试验)测量纤维素酶活性

1.方法来源

1.1在Adney和Baker，1996，Laboratory Analytical Procedure，LAP-006，National Renewable Energy Laboratory(NREL)的题为“Measurement ofCellulase Activities”的文件中公开了所述方法。该方法基于用于测定纤维素酶活性的IUPAC方法(Ghose，1987，Measurement of Cellulase Activities，Pure &Appl.Chem.59：257-268)。

2.步骤

2.1如Adney和Baker，1996，见上文进行所述方法，只是使用96孔板在显色后读出吸光度值，如下所述。

2.2酶试验管：

2.2.1向试管(13X100mm)底部加入一卷滤纸带(#1Whatman；1X6cm；50mg)。

2.2.2向管中加入1.0mL 0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH4.80)。

2.2.3将包含滤纸和缓冲液的管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育5分钟。

2.2.4温育后，向管中加入柠檬酸缓冲液中的0.5mL酶稀释物。设计酶稀释物，以产生略高于和低于2.0mg葡萄糖目标值的值。

2.2.5通过温和地漩涡震荡3秒钟将管内容物混合。

2.2.6漩涡震荡后，将管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育60分钟。

2.2.7在60分钟温育后，立即将管从水浴中移出，并在每个管中加入3.0mL DNS试剂以终止反应。将管漩涡震荡3秒钟混合。

2.3空白与对照

2.3.1通过向试管中加入1.5mL柠檬酸缓冲液制备试剂空白。

2.3.2通过将卷曲的滤纸带放于试管底部并加入1.5mL柠檬酸缓冲液而制备底物对照。

2.3.3通过将1.0mL柠檬酸缓冲液与0.5mL适当的酶稀释液混合，为每种酶稀释液制备酶对照。

2.3.4以与酶试验管同样的方法测试试剂空白、底物对照和酶对照，并与酶试验管一起进行。

2.4葡萄糖标准

2.4.1制备100mL葡萄糖的储存溶液(10.0mg/mL)，并将5mL等分试样冷冻。在使用前，将等分试样解冻并漩涡震荡混合。

2.4.2如下在柠檬酸缓冲液中产生储存溶液的稀释物：

G1＝1.0mL储存溶液+0.5mL缓冲液＝6.7mg/mL＝3.3mg/0.5mL

G2＝0.75mL储存溶液+0.75mL缓冲液＝5.0mg/mL＝2.5mg/0.5mL

G3＝0.5mL储存溶液+1.0mL缓冲液＝3.3mg/mL＝1.7mg/0.5mL

G4＝0.2mL储存溶液+0.8mL缓冲液＝2.0mg/mL＝1.0mg/0.5mL

2.4.3通过向1.0mL柠檬酸缓冲液加入0.5mL每种稀释物制备葡萄糖标准管。

2.4.4以与酶试验管同样的方式测试葡萄糖标准管，并与酶试验管一起进行。

2.5显色

2.5.160分钟温育并加入DNS后，将全部管一起在水浴中煮沸5分钟。

2.5.2煮沸后，立即在冰/水浴中冷却。

2.5.3冷却时，将管短暂漩涡震荡，使浆液沉降。然后通过从管中向96孔板中200微升ddH₂O加入50微升将每个管稀释。混合每个孔，并在540nm读出吸光度。

2.6计算(实例在NREL文件中给出)

2.6.1通过绘制四种标准品(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5mL)相对于A₅₄₀的图而制备葡萄糖标准曲线。使用线性回归(Prism Software)拟合，并使用拟合线的方程确定每个酶试验管产生的葡萄糖。

2.6.2制备产生的葡萄糖(mg/0.5mL)相对于总酶稀释度的图线，Y轴(酶稀释度)为对数坐标。

2.6.3在产生的葡萄糖刚刚超过2.0mg时的酶稀释度和产生的葡萄糖刚刚低于所述量时的酶稀释度之间画一条线。根据这条线，确定产生的葡萄糖恰好为2.0mg时的酶稀释度。

2.6.4如下计算滤纸单位/mL(FPU/mL)：

FPU/mL＝0.37/产生2.0mg葡萄糖的酶稀释度

葡糖淀粉酶活性

可以用AGI单位或葡糖淀粉酶单位(AGU)测量葡糖淀粉酶活性。

葡糖淀粉酶活性(AGI)

葡糖淀粉酶(与淀粉葡糖苷酶等同)将淀粉转化成葡萄糖。通过用于活性测定的葡萄糖氧化酶方法而在本文确定葡萄糖的量。在“Approved methods of theAmerican Association of Cereal Chemists”.Vol.1-2AACC，from AmericanAssociation of Cereal Chemists，2000；ISBN：1-891127-12-8中的76-11部分淀粉-葡糖淀粉酶方法和之后的用葡萄糖氧化酶测定葡萄糖中描述了该方法。

一个葡糖淀粉酶单位(AGI)是在方法的标准条件下每分钟形成1微摩尔葡萄糖的酶量。

标准条件/反应条件：

底物：    可溶性淀粉，浓度约16g干物质/L

缓冲液：  乙酸(盐)，约0.04M，pH＝4.3

pH：      4.3

温育温度：60℃

反应时间：15分钟

反应终止：NaOH至约0.2g/L的浓度(pH～9)

酶浓度：  0.15-0.55AAU/mL.

淀粉应该为Lintner淀粉，其为在实验室用作比色指示剂的稀糊淀粉。通过将天然淀粉的稀盐酸处理使其保持遇碘变蓝的能力而获得Lintner淀粉。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

将Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量，所述标准条件为37℃、pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸(盐)0.1M，反应时间为5分钟。

可使用自动分析系统。向葡萄糖脱氢酶试剂中加入变旋酶，将存在的任何α-D-葡萄糖转化成β-D-葡萄糖。在上述反应中，葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖反应形成NADH，使用光度计在340nm处测定形成的NADH，作为起始葡萄糖浓度的量度。

AMG温育：
		底物：	麦芽糖23.2mM
缓冲液：	乙酸(盐)0.1M
		pH：	4.30±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

颜色反应：
		GlucDH：	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD：	0.21mM
缓冲液：	磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可从NovozymesA/S，Denmark应要求获得，所述文件夹通过提述并入本文。

α-淀粉酶活性

α-淀粉酶活性(KNU)

可以使用马铃薯淀粉作为底物测定α-淀粉酶活性。这种方法基于改性的马铃薯淀粉通过酶的分解，通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来追踪反应。起初，形成蓝-黑色，但是在淀粉分解过程中，蓝色越来越淡，逐渐变成红褐色，可将其与彩色玻璃标准比较。

将一千Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义在标准条件下(即，37℃+/-0.05；0.0003M Ca²⁺；和pH5.6)将5260mg淀粉干物质Merck Amylum solubile糊精化的酶量。

更详细描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可从NovozymesA/S，Denmark应要求获得，所述文件夹通过提述并入本文。

酸性α-淀粉酶活性

根据本发明使用时，任何酸性α-淀粉酶的活性可以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测定。或者酸性酸性α-淀粉酶的活性可以AAU(酸性α-淀粉酶单位)测定。

酸性α-淀粉酶活性(AAU)

可以以AAU(酸性α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其为绝对方法。一个酸性淀粉酶单位(AAU)是在标准化条件下每小时将1g淀粉(100％干物质)转化成产物的酶量，所述产物在与已知强度(strength)的碘溶液反应后在620nm处具有与颜色参照之一等同的发射(transmission)。

标准条件/反应条件：

底物：        可溶性淀粉，浓度约20g DS/L.

缓冲液：      柠檬酸(盐)，约0.13M，pH＝4.2

碘溶液：      40.176g碘化钾+0.088g碘/L

自来水        15-20°dH(德国硬度)

pH：          4.2

温育温度：    30℃

反应时间：    11分钟

波长：        620nm

酶浓度：      0.13-0.19AAU/mL

酶工作范围：  0.13-0.19AAU/mL

淀粉应为Lintner淀粉，其为在实验室用作比色指示剂的稀糊淀粉。通过对天然淀粉进行稀盐酸处理而获得Lintner淀粉，使其保持遇碘变蓝色的能力。详细内容可以在EP 0140410中找到，所述文献通过提述并入本文中。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测定酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准确定。1AFAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶，内切-α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域的α-1，4-葡糖苷键，形成不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色强度和淀粉浓度成正比。使用反向比色法在特定的分析条件下测定淀粉浓度的减少作为淀粉酶活性。

λ＝590nm

蓝/紫    t＝23秒      脱色

标准条件/反应条件：

底物：         可溶性淀粉，约0.17g/L

缓冲液：       柠檬酸(盐)，约0.03M

碘(I₂)：                         0.03g/L

CaCl₂：                          1.85mM

pH：                             2.50±0.05

温育温度：                       40℃

反应时间：                       23秒

波长：                           590nm

酶浓度：                         0.025AFAU/mL

酶作用范围：                     0.01-0.04AFAU/mL

更详细描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可从NovozymesA/S，Denmark应要求获得，所述文件夹通过提述并入本文。

木糖/葡萄糖异构酶实验(IGIU)

1IGIU是在标准分析条件下以1微摩尔每分钟的初始速率将葡萄糖转化成果糖的酶量。

标准条件：

葡萄糖浓度：          45％w/w

pH：                  7.5

温度：                60℃

Mg²⁺浓度：            99mg/l(1.0g/l MgSO₄*7H₂O)

Ca²⁺浓度              ＜2ppm

活化剂，SO₂浓度：     100ppm(0.18g/l Na₂S₂O₅)

缓冲液，Na₂CO₃，浓度：2mM Na₂CO₃

蛋白酶活性

蛋白质分析方法(LAPU)

1个亮氨酸氨基肽酶单位(LAPU)是在下述条件每分钟分解1μM底物的酶量：26mM L-亮氨酸-对-硝基苯胺作为底物，0.1M Tris缓冲液(pH8.0)，37℃，10分钟反应时间。

在EB-SM-0298.02/01中描述了LAPU，所述文件夹可以从Novozymes A/SDenmark应要求获得。

蛋白酶分析方法-AU(RH)

可以以变性的血红蛋白作为底物测定蛋白质分解活性。在用于确定蛋白质分解活性的Anson-血红蛋白方法中，消化变性的血红蛋白，并用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用苯酚试剂确定TCA可溶产物的量，所述苯酚试剂与酪氨酸和色氨酸显蓝色。

一个Anson单位(AU-RH)定义为在标准条件(即，25℃、pH5.5和10分钟反应时间)下以初始速率消化血红蛋白的酶量，所述初始速率使得每分钟释放的TCA可溶产物的量与酚试剂形成的颜色和一毫当量(milliequivalent)酪氨酸与酚试剂形成的颜色相同。

AU(RH)方法在EAL-SM-0350中描述，并可以从Novozymes A/S应要求获得。

产麦芽糖淀粉酶活性(MANU)的确定

一个MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位)可以定义为在下述条件每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需的酶量：浓度为10mg麦芽三糖(Sigma M 8378)底物每ml的0.1M柠檬酸(盐)缓冲液，pH5.0，于37℃30分钟。

实施例

实施例1

本实验的目的是研究将经预处理的含木素纤维素材料(在此情况中为PCS滤液)导入基于含淀粉材料的发酵方法(在此情况中为玉米醪发酵(SSF)方法)的影响。

PCS滤液

在pH5(使用1M NH₄OH调节的PCS)和50℃，在批式反应器中将未洗涤、用酸处理的蒸汽爆破的PCS(即，经预处理的玉米秸秆)以15％TS(总固体)水解48小时。以5mg-EP/g-TS(约15mg-EP/g-CEL)的剂量加入纤维素酶制备物A。在水解后，使用玻璃纤维滤纸(Whatman：GF/D)在真空下在Buchner漏斗中过滤PCS水解物，并且最后将滤液无菌过滤。使用HPLC(参见表11)分析PCS滤液(PCS-f)。水解收率表示90％的纤维素转化率(仅为葡萄糖)。

表1-PCS滤液的组成。所有浓度以g/L表示

用31.7％DS(仅来自玉米醪)的玉米醪进行实验室规模的SSF方法，其中根据下述方案(表22)，加入不同体积的PCS滤液。以0.45AGU/g-DS(仅为玉米醪(CM))的剂量加入葡糖淀粉酶SF(825AGU/g)，并在32℃运行SSF。在32℃将RED STAR^TM酵母重新水合30分钟，然后在每批中以约1.2g/L的细胞浓度接种。在顶部钻孔的15mL带螺旋盖的管中运行实验，每种CM/PCS-f组合进行五管实验，仅包含CM的管(未加入PCS-f)作为参照。使用HPLC在SSF进行68小时的过程中测定重量损失。

表2-对于整合的SSF，玉米醪(CM)和测试的PCS的比例

样品	PCS滤液比例
		1	0ml/5g-CM
2	0.5ml/5g-CM
		3	1.0ml/5g-CM
4	1.5ml/5g-CM
		5	2.0ml/5g-CM

样品	PCS滤液比例
		6	2.5ml/5g-CM
7	3.0ml/5g-CM

HPLC分析

使用HPLC分析(Agilent HP-1100系统)，在Biorad HPX-87H有机酸性柱上及RI-检测，确定纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油、乙酸(HAc)和乙醇的浓度。使用已校准的标准品将上述所有化合物定量。

结果

整合发酵的结果作为乙醇产量每玉米醪固体(g-EtOH/g DS)示于图1中，结果基于发酵过程中频繁收集的重量损失数据。图2显示发酵末期的HPLC数据。重量损失数据未考虑由PCS-f加入的葡萄糖，而且HPLC数据未考虑加入PCS所增加的体积。考虑到这两个事实，假设在发酵过程中葡萄糖由PCS-f化学计量转化为乙醇，发现发酵产量(在发酵末期)处于相同的水平(表3)。这些结果表明引入PCS对常规的玉米醪发酵没有负面影响。

表3-发酵末期(68小时)的乙醇浓度。根据稀释度和可能来自PCS葡萄糖的乙醇对浓度进行了修正。参照：无任何PCS-f的玉米醪SSF

PCS液体比例	样品	乙醇(g/L)	相对于参照
				0ml/5gDS	1	111.5	100％
0.5ml/5gDS	2	111.3	100％
				1ml/5gDS	3	111.8	100％
1.5ml/5gDS	4	112.2	101％
				2ml/5gDS	5	112.2	101％
2.5ml/5gDS	6	112.2	101％
				3ml/5gDS	7	112.4	101％

Claims (34)

1.用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其中所述方法包括：

i)预处理含木素纤维素材料；

ii)将经预处理的含木素纤维素材料导入包含源自含淀粉材料的可发酵糖的培养基中；和

ii)使用发酵生物体发酵。

2.权利要求1的方法，其中在糖化、发酵或同时糖化和发酵前，在两个单独物料流中处理含淀粉材料和含木素纤维素材料。

3.权利要求1或2的方法，其中所述培养基是淀粉糖化培养基，淀粉发酵培养基或淀粉同时糖化和发酵培养基。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法包括将经预处理的含木素纤维素材料导入同时糖化和发酵培养基，所述培养基中包含一种或多种淀粉降解酶和任选的发酵生物体。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在将经预处理的木素纤维素材料导入培养基之前或之后开始发酵。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中在发酵或同时糖化和发酵之前水解经预处理的含木素纤维素材料。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中在发酵前和/或发酵过程中从经预处理的含木素纤维素材料中去除固体。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中在糖化、发酵，或同时糖化和发酵的过程中加入已去除固体的、经预处理的含木素纤维素材料。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述经预处理的含木素纤维素材料是未解毒的。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料已经经过化学、机械或生物预处理。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中已经通过用一种或多种纤维素酶或半纤维素酶，或它们的组合处理而水解含木素纤维素材料。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述含淀粉材料是液化的糊化的含淀粉材料。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述液化的糊化的含淀粉材料在发酵前或发酵过程中糖化。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述含淀粉材料是未烹制的含淀粉材料。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中导入发酵培养基的源自木素纤维素的材料是未洗涤的。

16.用于从含淀粉材料和含木素纤维素材料的组合产生发酵产物的方法，包括步骤：

a)液化含淀粉材料；

b)糖化；

c)使用发酵生物体发酵；

其中在发酵之前或发酵过程中加入经预处理的含木素纤维素材料。

17.权利要求16的方法，其中步骤(b)中的糖化和步骤(c)中的发酵是顺序或同时进行的。

18.权利要求16或17的方法，其中在发酵或同时糖化和发酵前水解经预处理的含木素纤维素材料。

19.权利要求16-18中任一项的方法，其中在糖化、发酵或同时糖化和发酵前，在两个单独物料流中处理含淀粉材料和含木素纤维素材料。

20.权利要求16-19中任一项的方法，其中在发酵前从经预处理的含木素纤维素材料中去除固体。

21.权利要求16-20中任一项的方法，其中向糖化步骤b)、发酵步骤c)，或同时糖化和发酵中加入已去除固体的、经预处理的含木素纤维素材料。

22.权利要求21的方法，其中所述经预处理的含木素纤维素材料是未解毒的。

23.权利要求16-22中任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料经过化学、机械或生物预处理。

24.用于从含淀粉材料和含木素纤维素材料的组合产生发酵产物的方法，其包括步骤：

i)在低于起始糊化温度的温度糖化含淀粉材料；

ii)使用发酵生物体发酵；

其中在发酵之前或发酵过程中加入经预处理的含木素纤维素材料。

25.权利要求24的方法，其中步骤i)中的糖化和步骤ii)中的发酵是顺序或同时进行的。

26.权利要求24或25的方法，其中在发酵或同时糖化和发酵之前水解经预处理的含木素纤维素材料。

27.权利要求24-26中任一项的方法，其中在糖化、发酵或同时糖化和发酵之前在两个单独的物料流中处理含淀粉材料和含木素纤维素材料。

28.权利要求24-27中任一项的方法，其中在发酵前通过用纤维素酶或半纤维素酶，或它们的组合处理，来进一步水解经预处理的木素纤维素材料。

29.权利要求24-28中任一项的方法，其中在发酵前从经预处理的含木素纤维素材料去除固体。

30.权利要求24-29中任一项的方法，其中向糖化步骤i)、发酵步骤ii)或同时糖化和发酵中加入已去除固体的、经预处理的含木素纤维素材料。

31.权利要求24-30中任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料经过化学、机械或生物预处理。

32.权利要求24-31中任一项的方法，其中在糖化或同时糖化和发酵过程中使用一种或多种糖-产生酶。

33.权利要求24-32中任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料是未洗涤的。

34.权利要求24-33中任一项的方法，其中所述含淀粉材料是未烹制的粒状淀粉。

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