ES2329528T3 - Metodo para diseñar mutantes alfa-amilasa con propiedades determinadas. - Google Patents
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Abstract
UN METODO PARA CONSTRUIR UNA VARIANTE DE UNA {AL}-AMILASA ORIGINAL DE TIPO TERMAMIL, QUE PRESENTA ACTIVIDAD {AL}-AMILASA Y AL MENOS UNA PROPIEDAD ALTERADA CON RESPECTO A LA {AL}-AMILASA ORIGINAL, CONSISTE EN I) ANALIZAR LA ESTRUCTURA DE LA {AL}AMILASA ORIGINAL DE TIPO TERMAMIL PARA IDENTIFICAR AL MENOS UN RESTO DE AMINOACIDO O AL MENOS UNA PARTE DE LA ESTRUCTURA DE LA {AL}-AMILASA DE TIPO TERMAMIL QUE SE CONSIDEREN RESPONSABLES DE LA ALTERACION DE LA PROPIEDAD DE LA {AL}-AMILASA ORIGINAL DE TIPO TERMAMIL (EVALUADO TENIENDO EN CUENTA CONSIDERACIONES ESTRUCTURALES O FUNCIONALES), II) CONSTRUIR UNA VARIANTE DE {AL}AMILASA DE TIPO TERMAMIL QUE, COMPARADA CON LA {AL}-AMILASA ORIGINAL DE TIPO TERMAMIL, ESTE MODIFICADA EN EL RESTO DE AMINOACIDO O LA PARTE ESTRUCTURAL IDENTIFICADOS EN I) A FIN DE ALTERAR LA PROPIEDAD, Y III) ANALIZAR LA PROPIEDAD EN CUESTION DE LA VARIANTE DE {AL}-AMILASA DE TIPO TERMAMIL RESULTANTE.
Description
Método para diseñar mutantes de
\alpha-amilasa con propiedades
predeterminadas.
La presente invención se refiere a un método
nuevo para diseñar mutantes de \alpha-amilasa con
propiedades predeterminadas, basándose el método en la estructura
tridimensional hasta ahora desconocida de las
\alpha-amilasas bacteria-
nas.
nas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las \alpha-amilasas
(\alpha-1,4
glucan-4-glucanohidrolasa, EC
3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas capaces de hidrolizar
almidón y otros oligo y polisacáridos
1,4-glucosídicos lineales y ramificados. Casi todas
las \alpha-amilasas estudiadas tienen algunas
regiones conservadas con aproximadamente la misma longitud y
separación. Una de estas regiones se asemeja al sitio de unión de
Ca^{2+} de calmodulina y las otras se estiman necesarias para el
centro activo y/o la unión del sustrato.
Aunque se conoce la secuencia de aminoácidos y
de este modo la estructura primaria de un gran número de
\alpha-amilasas, se ha comprobado que es muy
difícil determinar la estructura tridimensional de todas las
\alpha-amilasas. La estructura tridimensional se
puede determinar mediante análisis cristalográfico de rayos X de
cristales de \alpha-amilasa, pero ha resultado ser
difícil obtener cristales de \alpha-amilasa
adecuados para resolver realmente la estructura.
Hasta ahora sólo se ha determinado la estructura
tridimensional de algunas \alpha-amilasas a alta
resolución. Éstas incluyen la estructura de la TAKA
\alpha-amilasa de Aspergillus oryzae
(Swift et al., 1991), la amilasa ácida de Aspergillus
niger (Brady et al, 1991), la estructura de la
\alpha-amilasa pancreática porcina (Qian et
al., 1993), y la alfa-amilasa de cebada
(Kadziola et al. 1994, Journal of Molecular Biology 239:
104-121, A. Kadziola, Thesis, Dept of Chemistry, U.
of Copenhagen, Denmark). Además, se conoce la estructura
tridimensional de una ciclodextrina glicosiltransferasa (CGTasa) de
Bacillus circulans (Klein et al., 1992) (Lawson et
al., 1994). La CGTasa cataliza el mismo tipo de reacciones que
las \alpha-amilasas y muestra cierta similitud
estructural con las \alpha-amilasas.
Además, se han descrito la cristalización y los
estudios de rayos X preliminares de las
\alpha-amilasas de B. subtilis (Chang et
al. (1992) y Mizuno et al. (1993)). No se ha registrado
ninguna estructura final de B. subtilis. Análogamente, se ha
registrado la preparación de cristales de
\alpha-amilasa de B. licheniformis (Suzuki
et al. (1990), pero no hay informes posteriores disponibles
sobre el análisis cristalográfico de rayos X o la estructura
tridimensional.
Diferentes equipos de investigación han
intentado construir estructuras tridimensionales basándose en las
anteriores estructuras de \alpha-amilasa
conocidas. Por ejemplo, Vihinen et al. (J. Biochem. 107:
267-272, 1990), revela el modelado (o simulación
por ordenador) de una estructura tridimensional de la
\alpha-amilasa de Bacillus
stearothermophilus basándose en la estructura de la TAKA
amilasa. El modelo se usó para investigar consecuencias
estructurales hipotéticas de diferentes mutaciones dirigidas de la
\alpha-amilasa de B. stearothermophilus.
E.A. MacGregor (1987) predice la presencia de
\alpha-hélices y \beta-barriles
en \alpha-amilasas de distintas fuentes,
incluyendo la cebada, el páncreas de cerdo y el Bacillus
amyloliquefaciens, prediciendo algoritmos con base en la
estructura conocida de la TAKA \alpha-amilasa de
A. oryzae y de la estructura secundaria. Además, se predicen
los bucles y subsitios posibles que se pueden encontrar presentes
en, p. ej., la \alpha-amilasa de B.
amyloliquefaciens (con base en una comparación con la secuencia
y la estructura de A. oryzae).
A. E. MacGregor (Starch/Stärke 45 (1993), No. 7,
p. 232-237) presenta una revisión de la relación
entre la estructura y la actividad de enzimas relacionadas con la
\alpha-amilasa.
Hasta ahora, no ha estado disponible ninguna
estructura tridimensional para las
\alpha-amilasas de Bacillus industrialmente
importantes (las cuales se denominan en el contexto presente
"\alpha-amilasas de tipo Termamyl"),
incluyendo la \alpha-amilasa de B.
licheniformis, B. amyloliquefaciens, y B.
stearothermophilus.
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura tridimensional de una
\alpha-amilasa bacteriana de tipo Termamyl se ha
aclarado ahora. Con base en un análisis de dicha estructura es
posible identificar partes estructurales o residuos de aminoácidos
específicos que parezcan ser importantes a partir de
consideraciones estructurales o funcionales para conferir las
diferentes propiedades a las \alpha-amilasas de
tipo Termamyl. Además, al comparar la estructura de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl con estructuras
conocidas de las \alpha-amilasas fúngicas y de
mamíferos mencionadas arriba, se ha descubierto que existen algunas
similitudes entre las estructuras, pero que también existen algunas
diferencias estructurales sorprendentes e imprevistas previamente
entre las \alpha-amilasas. La presente invención
se basa en estas conclusiones.
\newpage
Por consiguiente, en un primer aspecto la
invención se refiere a un método para construir una variante de una
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl, teniendo
esta variante actividad \alpha-amilasa y
dependencia de ión calcio disminuida en comparación con dicha
\alpha-amilasa parental, comprendiendo el
método
- i)
- analizar la estructura de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl con el propósito de identificar al menos un residuo de aminoácido o al menos una parte estructural de la estructura de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl, creyendo que el residuo de aminoácido o la parte estructural es relevante para alterar dicha propiedad de la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl (según se evaluó con base en consideraciones estructurales o funciona- les),
- ii)
- construir una variante de \alpha-amilasa de tipo Termamyl, que en comparación con la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl, se ha modificado en el residuo de aminoácido o parte estructural identificada en i) de manera que altera dicha propiedad, y
- iii)
- analizar la variante de \alpha-amilasa de tipo Termamyl resultante para dicha propiedad.
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo aspecto la presente invención se
refiere a un método para construir una variante de una
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl, teniendo
la variante actividad \alpha-amilasa y
dependencia de ión calcio disminuida en comparación con dicha
\alpha-amilasa parental, comprendiendo el
método
- i)
- comparar la estructura tridimensional de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl con la estructura de una \alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl,
- ii)
- identificar una parte de la estructura de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl diferente de la estructura de la \alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl, y
- iii)
- modificar la parte de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl identificada en ii) por la cual se obtiene una variante de \alpha-amilasa de tipo Termamyl, una o más propiedades por las cuales difiere de la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl.
\vskip1.000000\baselineskip
En un tercer aspecto la invención se refiere a
un método para construir una variante de una
\alpha-amilasa parental de tipo distinto de
Termamyl, teniendo la variante actividad
\alpha-amilasa y dependencia de ión calcio
disminuida en comparación con dicha
\alpha-amilasa parental, comprendiendo el
método
- i)
- comparar la estructura tridimensional de la \alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl con la estructura de una \alpha-amilasa de tipo Termamyl,
- ii)
- identificar una parte de la estructura de la \alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl diferente de la estructura de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl, y
- iii)
- modificar la parte de la \alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl identificada en ii) por la cual se obtiene una variante de \alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl, una o más propiedades por las cuales difieren de la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl.
\vskip1.000000\baselineskip
La propiedad que se puede alterar mediante los
métodos anteriores de la presente invención puede ser, p. ej., la
especificidad de sustrato,
En otros aspectos la invención se refiere a
variantes de una \alpha-amilasa de tipo Termamyl,
a ADN que codifica este tipo de variantes y a métodos para preparar
las variantes. Finalmente, la invención se refiere al uso de las
variantes para diferentes objetivos industriales.
\vskip1.000000\baselineskip
Es bien conocido que varias
alfa-amilasas producidas por el Bacillus spp.
son altamente homólogas en el nivel aminoácido. Por ejemplo, se ha
observado que la \alpha-amilasa de B.
licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID No: 2 (disponible a nivel comercial como
Termamyl®) es homóloga en aproximadamente un 89% a la
\alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens que
comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4 y
homóloga en aproximadamente un 79% a la
\alpha-amilasa de B. stearothermophilus
que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No:
6. Otras \alpha-amilasas homólogas incluyen una
\alpha-amilasa derivada de una cepa de Bacillus
sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todo lo cual
se describe detalladamente en WO 95/26397, y la
\alpha-amilasa descrita por Tsukamoto et
al., 1988, Biochemical and Biophysical Research Communications,
Vol. 151, No. 1. Otras \alpha-amilasas homólogas
incluyen la \alpha-amilasa producida por la B.
licheniformis descrita en EP 252 666 (ATCC 27811), y las
\alpha-amilasas identificadas en WO 91/00353 y WO
94/18314. Otras \alpha-amilasas de B.
licheniformis de tipo Termamyl comerciales son Optitherm® y
Takatherm® (disponibles a través de Solvay), Maxamyl® (disponible a
través de Gist-brocades/Genencor), Spezym AA®
(disponible a través de Genencor), y Keistase® (disponible a través
de Daiwa).
Por la homología sustancial encontrada entre
estas \alpha-amilasas, éstas se consideran parte
de la misma clase de \alpha-amilasas, es decir la
clase de las "\alpha-amilasas de tipo
Termamyl".
Por consiguiente, en el contexto presente, el
término "\alpha-amilasa de tipo Termamyl" se
destina a indicar una \alpha-amilasa que, en el
nivel aminoácido, muestra una homología sustancial con Termamyl®,
es decir la SEC ID No: 2 de la \alpha-amilasa de
B. licheniformis. En otras palabras, una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl es una
\alpha-amilasa, la cual posee la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2, 4 o 6, o la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 1 ó 2 de WO 95/26397 o en
Tsukamoto et al., 1988, o i), que muestra al menos un 60%,
así como al menos un 70%, p. ej. al menos un 75%, o al menos un 80%,
p. ej. al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% de
homología con al menos una de dichas secuencias de aminoácidos y/o
ii) muestra reacción cruzada inmunológica con un anticuerpo dirigido
contra al menos una de dichas \alpha-amilasas,
y/o iii) se codifica por una secuencia de ADN que se hibrida con las
secuencias de ADN que codifican las
\alpha-amilasas especificadas arriba, las cuales
provienen aparentemente de las SEC ID Nos: 1, 3 y 5 de la solicitud
presente, y de la SEC ID No: 4 y 5 de WO 95/26397,
respectivamente.
En relación a la propiedad i), la
"homología" se puede determinar usando cualquier algoritmo
convencional, preferiblemente usando el programa GAP de la versión
7.3 del paquete GCG (Junio 1993), usando valores por defecto para
las penalizaciones de GAP (Genetic Computer Group (1991) Programme
Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison,
Wisconsin, USA 53711).
La propiedad ii) de la
\alpha-amilasa, es decir la reactividad cruzada
inmunológica, se puede evaluar usando un anticuerpo dirigido contra
o reactivo con al menos un epítopo de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl relevante. El
anticuerpo, el cual puede ser o bien monoclonal o policlonal, se
puede producir mediante métodos conocidos en la técnica, p. ej.
como se describe por Hudson et al., 1989. La reacción
cruzada inmunológica se puede determinar usando ensayos conocidos
en la técnica, ejemplos de los cuales son el ensayo de transferencia
de Western o de inmunodifusión radial, p. ej. como se describe por
Hudson et al., 1989. En este aspecto, se ha encontrado
reacción cruzada inmunológica entre las
\alpha-amilasas que tienen las secuencias de
aminoácidos de las SEC ID Nos: 2, 4 y 6, respectiva-
mente.
mente.
La sonda de oligonucleótidos usada en la
caracterización de la \alpha-amilasa de tipo
Termamyl conforme a la propiedad iii) de arriba se puede preparar de
manera adecuada con base en la secuencia de nucleótidos o
aminoácidos completa o parcial de la
\alpha-amilasa en cuestión. Las condiciones
adecuadas para examinar la hibridación implican preremojar en 5xSSC
y prehibridar durante 1 h a -40ºC en una solución de formamida al
20%, una solución de 5xDenhardt, 50 mM de fosfato sódico, a pH 6.8,
y 50 \mug de ADN de timo de ternera sonicado desnaturalizado,
seguido de la hibridación en la misma solución suplementada con 100
\muM de ATP durante 18 h a -40ºC, u otros métodos descritos p. ej.
por Sambrook et al., 1989.
En el contexto presente, "derivada de" se
destina no sólo a indicar una \alpha-amilasa
producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino
también una \alpha-amilasa codificada por una
secuencia aislada de ADN de tal cepa y producida en un organismo
huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el
término se destina a indicar una \alpha-amilasa
que esté codificada por una secuencia de ADN de origen sintético
y/o de ADNc y que tenga las características identificatorias de la
\alpha-amilasa en cuestión. El término se destina
también a indicar que la \alpha-amilasa parental
puede ser una variante de una \alpha-amilasa de
origen natural, es decir una variante que sea el resultado de una
modificación (inserción, sustitución, eliminación) de uno o más
residuos de aminoácidos de la \alpha-amilasa de
origen natural.
\vskip1.000000\baselineskip
La \alpha-amilasa parental
(siendo una \alpha-amilasa de tipo Termamyl o de
tipo distinto de Termamyl) puede ser una
\alpha-amilasa híbrida, es decir una
\alpha-amilasa que comprende una combinación de
secuencias de aminoácidos parciales derivada de al menos dos
\alpha-amilasas.
La \alpha-amilasa híbrida
parental puede aquella que con base en la homología de aminoácido
y/o la reacción cruzada inmunológica y/o la hibridación de ADN
(según se define arriba) pueda ser determinada como perteneciente a
la familia de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl.
En este caso la \alpha-amilasa híbrida se compone
normalmente de al menos una parte de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl y parte(s)
de otra u otras \alpha-amilasas seleccionadas a
partir de las \alpha-amilasas de tipo Termamyl o
las \alpha-amilasas de tipo distinto de Termamyl
de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o de mamífero.
\newpage
De este modo, la
\alpha-amilasa híbrida parental puede comprender
una combinación de al menos dos \alpha-amilasas
de tipo Termamyl, o de al menos una \alpha-amilasa
bacteriana de tipo Termamyl y al menos una de tipo distinto de
Termamyl, o de al menos una \alpha-amilasa de tipo
Termamyl y al menos una fúngica. Por ejemplo, la
\alpha-amilasa parental comprende una parte
C-terminal de una \alpha-amilasa
derivada de una cepa de B. licheniformis y una parte
N-terminal de una \alpha-amilasa
derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o de una cepa de
B. stearothermophilus. Por ejemplo, la
\alpha-amilasa parental comprende al menos 430
residuos de aminoácidos de la parte C-terminal de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis, y, p.
ej. puede comprender a) un segmento de aminoácido correspondiente a
los 37 residuos de aminoácidos del N-terminal de la
\alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens que
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4 y un
segmento de aminoácidos correspondiente a los 445 residuos de
aminoácidos del C-terminal de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis que
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2, o b)
un segmento de aminoácido correspondiente a los 68 residuos de
aminoácidos del N-terminal de la
\alpha-amilasa de B. stearothermophilus que
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 6 y un
segmento de aminoácidos correspondiente a los 415 residuos de
aminoácidos del C-terminal de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis que
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2.
Análogamente, la
\alpha-amilasa híbrida parental puede pertenecer a
una familia de \alpha-amilasas de tipo distinto
de Termamyl, p. ej. la familia de \alpha-amilasas
de tipo Fungamyl. En este caso el híbrido puede comprender al menos
una parte de una \alpha-amilasa perteneciente a
la familia de \alpha-amilasas de tipo distinto de
Termamyl en combinación con una o más partes derivadas de otras
\alpha-amilasas.
\vskip1.000000\baselineskip
La \alpha-amilasa de tipo
Termamyl que se usó para aclarar la estructura tridimensional que
forma la base para la presente invención consiste en los 300
aminoácidos del N-terminal de la
\alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens (con
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4) y los
aminoácidos 301-483 del extremo del
C-terminal de la \alpha-amilasa de
B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID No: 2. La \alpha-amilasa bacteriana pertenece a
la "familia de \alpha-amilasas de tipo
Termamyl" y la estructura presente se tiene por representativa
para la estructura de cualquier \alpha-amilasa de
tipo Termamyl.
La estructura de la
\alpha-amilasa se resolvió conforme al principio
para los métodos cristalográficos de rayos X dados en
"X-Ray Structure Determination", Stout, G.K.
and Jensen, L.H., John Wiley & Sons, inc. NY, 1989. Las
coordenadas estructurales para la estructura cristalina resuelta de
la \alpha-amilasa a una resolución de 2.2
\ring{A} usando el método de sustitución isomorfo se dan en un
formato PDB estándar (Base de Datos de Proteínas de Brookhaven) en
el Apéndice 1. Se debe entender que el Apéndice 1 forma parte de la
solicitud presente.
Los residuos de aminoácidos de la enzima se
identifican mediante un código de aminoácido de tres letras (letras
mayúsculas).
La estructura de la
\alpha-amilasa se compone de tres dominios
globulares siguiendo el orden A, B, y C con respecto a la
secuencia, la cual se halla aproximadamente a lo largo de una línea
con el orden B, A, C. Los dominios se pueden definir como si fueran
los residuos 1-103 y 206 395 para el dominio, A, los
residuos 104-205 para el dominio B, y los residuos
396-483 para el dominio C, refiriéndose los números
a la \alpha-amilasa de B. licheniformis.
Ésta da lugar a una molécula alargada, siendo el eje el más largo
de aproximadamente 85 \ring{A}. El punto más ancho perpendicular
a este eje es de aproximadamente 50 \ring{A} y abarca el dominio
central A. Los residuos del sitio activo de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis (SEC ID
No: 2) son D323, D231 y E261.
\vskip1.000000\baselineskip
Dominio
A
El dominio A es el dominio más grande y contiene
el sitio activo (compuesto por un clúster de tres residuos de
aminoácidos colocado en el fondo de una hendidura profunda en la
superficie de la enzima). Los dominios A de todas las estructuras
de \alpha-amilasa conocidas tienen el mismo
plegado global, es decir que el barril (beta/alfa)8 con 8
cadenas beta centrales (número 1-8) y 8
\alpha-hélices adyacentes. El
\beta-barril está definido por McGregor Op. Cit.
El extremo C-terminal de la cadena Beta 1 está
conectado a la hélice 1 mediante un bucle denominado bucle 1 y se
crea un modelo idéntico para los otros bucles. Estos bucles muestran
alguna variación en el tamaño y algunos pueden ser bastante
extensos.
Las 8 cadenas Beta centrales en el barril
(beta/alpha)8 se superponen bien entre las diferentes
estructuras de \alpha-amilasa conocidas, y esta
parte de la estructura, incluyendo los alrededores cercanos al
sitio activo localizado en el extremo del
C-terminal de las cadenas Beta, muestra similitud
alta entre las diferentes amilasas.
Los bucles que conectan las cadenas Beta y las
alfa hélices muestran variaciones altas entre las alfa amilasas.
Estos bucles constituyen el contexto estructural del sitio activo y
la mayoría de los contactos del sustrato se encuentran entre los
residuos localizados en estos bucles. Tales características
importantes como la especificidad de sustrato, la unión de
sustrato; el perfil de pH/actividad, el modelo de ruptura de
almidón están determinados por los aminoácidos y las posiciones de
los mismos en estos bucles.
Las diferencias sustanciales entre la estructura
de la \alpha-amilasa de tipo Fungamyl y la
estructura de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl
reveladas aquí, las cuales se encuentran en los bucles 1, 2, 3, y
8, se visualizan en las Figuras.
\vskip1.000000\baselineskip
Dominio
B
Se ha descubierto que la estructura de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl comprende una
estructura de dominio especial en el bucle3 del dominio A, también
llamado dominio B. La estructura del dominio B de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl nunca se había
visto antes en alguna de las \alpha-amilasas
conocidas o proteínas del barril (\beta/alfa) 8.
La estructura del dominio B es un dominio muy
compacto que tiene un número muy alto de residuos cargados. El
dominio B surge como una extensión del bucle entre la cadena 3 y la
hélice 3 del dominio A (mostrada en la Fig. 7) y contiene una
estructura de \beta-hojas de 5 láminas
antiparalelas que contiene al menos una estructura de bucle larga y
que tiene la conectividad -1; +3; -1X; +2 (Richardson, 1981, Adv.
Protein Chem. 34: 167-339).
Las primeras cuatro cadenas del dominio B forman
dos bucles de horquilla que se enrollan el uno alrededor del otro
como dos dedos cruzados (torsión a la derecha). La cadena principal
se incorpora a una \beta-cadena que conecta dos
estructuras de \beta-hoja pequeñas. Después de
hacer un giro en una hoja ésta se repliega y forma una hoja de dos
láminas en contacto con el dominio A y un agujero interno en la
estructura de la \alpha-amilasa. Entonces la
cadena principal se dobla formando una pequeña estructura en capas
casi perpendicular a las dos primeras hojas. Antes de introducir la
hélice 3 encima de la \beta-cadena 3, los
aproximadamente 24 últimos aminoácidos en el dominio B forman dos
sitios de unión de calcio en la región en contacto con el dominio
A.
El dominio B se conecta con el dominio A
mediante dos extensiones peptídicas, las cuales dividen en dos las
áreas de contacto dominio-dominio. El dominio B
está en contacto con el dominio A mediante una región de unión de
calcio y un agujero internamente oculto que contiene aguas. Están
presentes muchos tipos de contactos moleculares. Es posible la
interacción iónica entre el ácido y los aminoácidos básicos, estas
interacciones son muy importantes para la estabilidad general a
alto pH y para mantener intactos los sitios de unión de calcio.
\vskip1.000000\baselineskip
Dominio
C
El dominio C es la parte
C-terminal de la proteína que consiste en los
aminoácidos 394-483. El dominio C está compuesto en
su totalidad por \beta-cadenas que forman una
estructura de hojas independiente de 8 láminas, la cual se repliega
en sí misma, y en esa forma se puede describir como una estructura
\beta-sándwich. La conectividad es +1; +1; +5; -3;
+1; +1; -3 aunque las cadenas 6 y 7 sólo están conectadas con
holgura. Una parte de la 13-hoja forma la interfaz
para el dominio A.
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl es destacable en
tanto en cuanto muestra cuatro sitios de unión de calcio y un sitio
de unión de sodio. En otras palabras, en la estructura se
encuentran presentes cuatro iones calcio y un ión sodio, aunque uno
de los iones calcio muestra una coordinación muy débil. Dos de los
iones calcio forman parte de un clúster lineal de tres iones,
estando atribuido el ión central al sodio, el cual se halla en la
conjunción de los dominios A y B.
Los residuos coordinantes para los iones calcio
entre los dominios A y B son los siguientes (usando la nomenclatura
de fichero Pdb localizada en el mismo Apéndice 1 para los residuos
de aminoácidos y los átomos en el fichero Pdb): para el ión calcio
más cercano al sitio activo (IUM 502 en el fichero Pdb), los
carbonilos de esqueleto de His235 y Asp194, el átomo de cadena
lateral OD1 de los residuos Asp194; Asn102 y Asp200, y una molécula
de agua WAT X3 (átomo OW7). Para el ión sodio (IUM 505), el sitio
de unión incluye el átomo OD2 de Asp194; Asp200; Asp183 y Asp159, y
un carbonilo de esqueleto de Val201. Las coordenadas para el otro
ión calcio entre los dominios A y B son (IUM 501): el átomo OD2 de
Asp204 y Asp159, el carbonilo de esqueleto de Asp183 y A1a181, el
átomo OD1 de Asp202, y una molécula de agua WAT X7 (átomo OW7).
Un ión calcio está localizado entre los dominios
A y C, otro está localizado en el dominio C. El primer ión calcio
mencionado, el cual también es el que está mejor coordinado (IUM
503), incluye un esqueleto de carbonilo de Gly300, Tyr302 y His406,
el átomo OD2/OD1 de Asp430, el átomo OD1 de Asp407, y una molécula
de agua WAT X6 (átomo OW7). El otro sitio de calcio, muy débilmente
coordinado (IUM 504), comprende 4 moléculas de agua WAT X21 (átomo
OW8), X6 (átomo OW6), X9 (átomo OW0) y X28 (átomo OW8), OE1/OE2 de
Glu447 y ODI de
Asn444.
Asn444.
\vskip1.000000\baselineskip
No habiéndose limitado a ninguna teoría se cree
actualmente que se dan interacciones favorables entre una molécula
de sustrato y la enzima (tales como enlaces de hidrógeno y/o una
interacción electroestática fuerte) dentro de una esfera de 4
\ring{A} del sustrato, al unirse a la enzima. Se contempla que los
siguientes residuos de la \alpha-amilasa de B.
licheniformis que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID No: 2 están a una distancia de 4 \ring{A} del sustrato y
por ello se cree que intervienen en interacciones con el
sustrato:
- \quad
- Trp13; Tyr14; Asn17; Asp18; Ser50; Gln51; Ala52; Asp53; Val54; Gly55; Tyr56; Lys70; Arg74; Lis76; Val102; His105; Gly107; Gly108; Ala109; Trp138; Tr163; Asp164; Trp165; Asn172; Glu189; Tyr193; Leu196; Met197; Tyr198; Ala199; Arg229; Asp231; Ala232; Lys234; His235; Glu261; Trp263; His327; Asp328; Gln333; Ser334, y Leu335.
Los residuos de aminoácidos de otra
\alpha-amilasa de tipo Termamyl, los cuales se
considera que están a una distancia de 4 \ring{A} del sustrato, se
pueden identificar fácilmente alineando la secuencia de aminoácidos
de la SEC ID No: 2 con la de la otra
\alpha-amilasa de tipo Termamyl y de ese modo
identificando las posiciones equivalentes a aquellas identificadas
arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a la alta homología entre las diferentes
\alpha-amilasas de tipo Termamyl, se considera
que la estructura resuelta definida por las coordenadas del
Apéndice 1 es representativa para la estructura de todas las
\alpha-amilasas de tipo Termamyl. Una estructura
modelo de otras \alpha-amilasas de tipo Termamyl
se puede construir fácilmente con base en las coordenadas dadas en
el Apéndice 1 adaptadas a la \alpha-amilasa en
cuestión usando un alineamiento entre las secuencias de aminoácidos
respectivas. La creación de una estructura modelo se ejemplifica en
el Ejemplo 1.
Las partes características de la estructura de
la \alpha-amilasa de tipo Termamyl (sitio de
unión de Ca, centro de unión de sustrato, bucles, etc.)
identificadas arriba se pueden identificar fácilmente en otras
\alpha-amilasas de tipo Termamyl basándose en una
estructura modelo (o resuelta) de la
\alpha-amilasa pertinente de tipo Termamyl o
simplemente basándose en un alineamiento entre la secuencia de
aminoácidos de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl
en cuestión con el de la \alpha-amilasa de B.
lichenformis usado aquí para identificar los residuos de
aminoácidos de los elementos estructurales respectivos.
Además, en relación con las variantes de tipo
Termamyl de la invención, las cuales se definen mediante la
modificación de residuos de aminoácidos específicos de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl específica, se
entenderá que las variantes de otra
\alpha-amilasa de tipo Termamyl modificada en una
posición equivalente (según se determina a partir del mejor
alineamiento de secuencias de aminoácidos posible entre las
secuencias respectivas) también se pretenden cubrir. De este modo,
con independencia de si un residuo de aminoácido se identifica aquí
con el fin de definir una parte estructural de una
\alpha-amilasa dada o se usa para identificar una
variante de la \alpha-amilasa, este residuo de
aminoácido se considerará representativo del residuo de aminoácido
equivalente de cualquier otra \alpha-amilasa de
tipo
Termamyl.
Termamyl.
\vskip1.000000\baselineskip
En los métodos según el primer, segundo y tercer
aspecto de la invención, los términos "estructura de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl" y
"estructura de la \alpha-amilasa de tipo
Termamyl" están destinados a indicar la estructura resuelta
definida por las coordenadas presentadas en el Apéndice 1 o una
estructura modelo de una \alpha-amilasa de tipo
Termamyl dada (tal como la \alpha-amilasa de B.
licheniformis) construida con base en la estructura
resuelta.
En la mayoría de los casos la
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl que se
va a modificar conforme a la presente invención es diferente de la
\alpha-amilasa que ya se usó para resolver la
estructura (Apéndice 1). Esto significa que el(los)
residuo(s) aminoácido(s) o parte(s) estructural(es) identificada(s) en la estructura resuelta (Apéndice 1) en la fase i) del método según el primer, segundo o tercer aspecto de la invención se debe traducir en el(los) residuo(s) de aminoácido(s) correspondiente(s) o parte(s) estructural(es) de la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl en cuestión. La "traducción" se realiza convenientemente con base en un alineamiento de secuencias de aminoácidos entre la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl usada para resolver la estructura y la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl en cuestión.
residuo(s) aminoácido(s) o parte(s) estructural(es) identificada(s) en la estructura resuelta (Apéndice 1) en la fase i) del método según el primer, segundo o tercer aspecto de la invención se debe traducir en el(los) residuo(s) de aminoácido(s) correspondiente(s) o parte(s) estructural(es) de la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl en cuestión. La "traducción" se realiza convenientemente con base en un alineamiento de secuencias de aminoácidos entre la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl usada para resolver la estructura y la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl en cuestión.
El análisis o comparación realizado en la fase
i) del método según el primer, segundo y tercer aspecto,
respectivamente, de la invención, se puede realizar usando
cualquier programa de ordenador adecuado capaz de analizar y/o
comparar estructuras de proteína, p. ej. el programa de ordenador
Insight, disponible a través de Biosym Technologies, Inc. Por
ejemplo, el principio básico de la comparación de estructuras es
que las estructuras tridimensionales que se comparan se superponen
con base en un alineamiento de elementos estructurales secundarios
(tales como las 8 \beta-cadenas centrales en el
barril) y las partes que difieren entre las estructuras se pueden
identificar posteriormente con facilidad a partir de la estructura
superpuesta.
La parte estructural que se identifica en la
fase i) de los métodos del primer, segundo y tercer aspecto de la
invención puede estar compuesta de un residuo de aminoácido. No
obstante, normalmente la parte estructural comprende más de un
residuo de aminoácido, que normalmente constituye una de las partes
de la estructura de la \alpha-amilasa de tipo
Termamyl de arriba tal como uno de los dominios A, B, o C, una
interfaz entre cualquiera de estos dominios, un sitio de unión de
calcio, una estructura de bucle, el sitio de unión de sustrato, o
similar.
En el contexto presente el término
"consideraciones estructurales o funcionales" se destina a
indicar que las modificaciones se hacen con base en un análisis de
la estructura o parte estructural pertinente y su impacto
contemplado en la función de la enzima. De este modo se puede usar
un análisis de las estructuras de las diferentes
\alpha-amilasas que hasta ahora se han dilucidado,
opcionalmente en combinación con un análisis de las diferencias
funcionales entre estas \alpha-amilasas, para
asignar propiedades determinadas de las
\alpha-amilasas a partes determinadas de la
estructura de la \alpha-amilasa o para contemplar
tal relación. Por ejemplo, las diferencias en el modelo o
estructura de bucles circundantes del sitio activo pueden suponer
diferencias en el acceso al sitio activo del sustrato y de este
modo a diferencias en la especificidad de sustrato y/o el modelo de
segmentación. Además, se han identificado las partes de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl implicadas o con
la intención de intervenir en la unión de sustrato (y así p. ej. el
modelo de especificidad/segmentación), la unión de ión calcio o
sodio (p. ej. importante para la dependencia de Calcio de la
enzima), y similares (véase más abajo).
La modificación de un residuo de aminoácido o
parte estructural se realiza normalmente mediante modificaciones
adecuadas de una secuencia de ADN que codifica la enzima parental
en cuestión. El término "modificado" según se usa en la fase
ii) en el método según el primer aspecto de la invención pretende
significar lo siguiente: en caso de usarse en relación a un residuo
de aminoácido el término pretende significar la sustitución del
residuo de aminoácido en cuestión por otro residuo de aminoácido.
En caso de usarse en relación a una parte estructural, el término
pretende significar la sustitución de uno o más residuos de
aminoácidos de dicha parte estructural, la adición de uno o más
residuos de aminoácidos a dicha parte, o la eliminación de uno o
más residuos de aminoácidos de dicha parte
estructural.
estructural.
La construcción de la variante de interés se
realiza cultivando un microorganismo que comprende una secuencia de
ADN que codifica la variante bajo condiciones propicias para
producir la variante, y opcionalmente recuperando posteriormente la
variante del caldo de cultivo resultante. Esto se describe más
detalladamente abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer aspecto de la
invención
En una forma de realización del método preferida
según el primer aspecto de la invención, la propiedad de la enzima
parental para ser modificada se selecciona a partir de la
dependencia de calcio, la unión de sustrato, el modelo de
segmentación, la actividad dependiente del pH y similares. Más abajo
se dan ejemplos específicos de cómo cambiar estas propiedades de
una \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl.
En otra forma de realización preferida la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl parental que se
modifica es una \alpha-amilasa de B.
licheniformis.
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo y tercer aspecto de la
invención
Una ventaja importante de los métodos según el
segundo y el tercer aspecto de la presente invención es que es
posible adaptar la estructura (o una parte estructural) de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl a la estructura (o
parte estructural) de una \alpha-amilasa de tipo
distinto de Termamyl y viceversa. Por ejemplo, habiendo
identificado una estructura de bucle de la
\alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl, la
cual se cree que es responsable de o contribuye a una propiedad
particular de la \alpha-amilasa de tipo distinto
de Termamyl, es posible reemplazar la estructura correspondiente de
la \alpha-amilasa de tipo Termamyl por dicha
estructura de la \alpha-amilasa de tipo distinto
de Termamyl, o si no existe una estructura correspondiente en la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl, insertar la
estructura en la \alpha-amilasa de tipo Termamyl
de manera que la \alpha-amilasa de tipo Termamyl
variante resultante, por lo que respecta a la parte relevante, se
asemeja a la parte correspondiente de la
\alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl. Al
modificarse dos o más partes de la estructura de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl parental con el
fin de asemejarse a las partes correspondientes de la
\alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl es
posible aumentar la similitud con la
\alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl de la
variante de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl y
así alterar las propiedades de dicha variante en la dirección de
las de dicha \alpha-amilasa de tipo distinto de
Termamyl. Las modificaciones de bucle se tratan de forma mucho más
detallada más
abajo.
abajo.
Normalmente, la modificación a realizar en la
fase iii) del método según el segundo aspecto de la invención se
realiza borrando uno o más residuos de aminoácidos de la parte de
la \alpha-amilasa de tipo Termamyl a modificar con
el fin de adaptar la estructura de dicha parte de la
\alpha-amilasa parental a la parte
correspondiente de la \alpha-amilasa de tipo
distinto de Termamyl; sustituyendo uno o más residuos de
aminoácidos de la parte de la \alpha-amilasa de
tipo Termamyl a modificar por los residuos de aminoácidos que
ocupan posiciones correspondientes en la
\alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl; o
insertando uno o más residuos de aminoácidos presentes en la
\alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl en
una posición correspondiente en la \alpha-amilasa
de tipo Termamyl. Para el método según el tercer aspecto se entiende
la modificación de forma análoga, realizada en la
\alpha-amilasa parental de tipo distinto de
Termamyl preferiblemente a la \alpha-amilasa de
tipo Termamyl.
\newpage
En la fase ii) del método según el segundo o
tercer aspecto de la invención, la parte de la estructura a
identificar es preferiblemente una que según se crea esté en
contacto con el sustrato en la enzima plegada (compárese la
declaración abajo en la sección titulada "El sitio de unión de
sustrato") o implicado en el modelo de especifidad y/o
segmentación de sustrato, y/o uno que esté en contacto con uno de
los iones calcio o sodio y/o uno, el cual esté contribuyendo en el
pH o el perfil de temperatura de la enzima, o uno que de otro modo,
a partir de consideraciones estructurales o funcionales, se
contemple como responsable de diferencias en una o más propiedades
de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl y de la de
tipo distinto de Termamyl.
\vskip1.000000\baselineskip
La \alpha-amilasa de tipo
distinto de Termamyl con la cual se hace la comparación en la fase
i) del método del segundo aspecto de la invención y la cual es la
\alpha-amilasa parental en el método del tercer
aspecto de la invención, puede ser cualquier
\alpha-amilasa que no pertenezca a la familia de
las \alpha-amilasas de tipo Termamyl (según se
define arriba) y, como consecuencia de esto, tenga una estructura
tridimensional diferente. Además, la
\alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl
debería tener, al mismo tiempo que se realiza el método, una
estructura tridimensional dilucidada o contemplada.
La \alpha-amilasa de tipo
distinto de Termamyl puede ser, p. ej., una
\alpha-amilasa fúngica, una
\alpha-amilasa de mamífero o de planta o una
\alpha-amilasa bacteriana (diferente de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl). Ejemplos
específicos de tales \alpha-amilasas incluyen la
TAKA \alpha-amilasa de Aspergillus oryzae,
la \alpha-amilasa ácida de A. niger, la
\alpha-amilasa de Bacillus subtilis, la
\alpha-amilasa pancreática porcina y una
\alpha-amilasa de cebada. Todas estas
\alpha-amilasas han dilucidado estructuras
claramente diferentes de la estructura de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl mostrada
aquí.
Las \alpha-amilasas fúngicas
mencionadas arriba, es decir derivadas de A. niger y A.
oryzae, son altamente homólogas en el nivel aminoácido y
generalmente consideradas pertenecientes a la misma familia de
\alpha-amilasas. En la descripción presente, esta
familia se denomina "\alpha-amilasa de tipo
Fungamyl" y se destina a indicar una
\alpha-amilasa que muestra una alta homología, es
decir de más del 70%, tal como una homología del 80% (según se
define aquí) con la \alpha-amilasa fúngica
derivada de Aspergillus oryzae, comercialmente disponible
como Fungamyl®, y la \alpha-amilasa de
A. niger.
A. niger.
A partir de las ilustraciones incluidas de la
estructura de \alpha-amilasa de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl y una comparación
de dicha estructura con la estructura de una
\alpha-amilasa de tipo Fungamyl es evidente que
existen diferencias más importantes entre las dos estructuras. En
el método de la invención es de interés particular modificar partes
de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl parental que
pertenecen a una región con grandes diferencias con respecto a la
\alpha-amilasa de tipo Fungamyl. En particular,
es de interés modificar la \alpha-amilasa de tipo
Termamyl parental en uno o más de los siguientes bucles: bucle 1,
bucle 2, bucle 3 y/o bucle 8 de la \alpha-amilasa
parental.
En el método del tercer aspecto de la invención
es de interés particular modificar el bucle 1, el bucle 2, el bucle
3 y/o el bucle 8 de la \alpha-amilasa parental de
tipo distinto de Termamyl hasta conseguir mayor semejanza con
respecto a los bucles similares de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl, tal como
Termamyl.
En los siguientes tipos específicos de variantes
se describen los que se han diseñado usando el método de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de cambiar la especificidad de
sustrato de la \alpha-amilasa parental a
modificar es relevante considerar las modificaciones de bucle. Por
ejemplo cambiando una o más de las estructuras de bucle de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl en una mayor
semejanza con respecto a la(s) estructura(s) de bucle
correspondiente(s) de una \alpha-amilasa de
tipo distinto de Termamyl (tal como una
\alpha-amilasa de tipo Fungamyl) se contempla la
posibilidad de cambiar la especificidad de sustrato en la dirección
de la de la \alpha-amilasa de tipo distinto de
Termamyl. A continuación se enumeran diferentes tipos de
modificaciones de bucle de interés. Se entenderá que las variantes
pueden tener otras propiedades cambiadas además de la especificidad
de sustrato modificada. Se entenderá que las siguientes
modificaciones identificadas para una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl específica
pretenden incluir modificaciones correspondientes en otras
posiciones equivalentes de otras \alpha-amilasas
de tipo Termamyl. Además, se entenderá que, normalmente, la
modificación de bucle comprenderá la sustitución de una estructura
de bucle entera o de una parte sustancial de la misma, p. ej., en la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl, con la estructura
de bucle correspondiente (o parte sustancial de la misma) en una
\alpha-amilasa de tipo distinto de Termamyl.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización la invención se
refiere a una variante de una \alpha-amilasa
parental de tipo Termamyl, en cuya variante al menos un residuo de
aminoácido de la \alpha-amilasa parental, el cual
está presente en un fragmento correspondiente al fragmento de
aminoácidos 44-57 de la secuencia de aminoácidos de
la SEC ID No: 4, es decir el bucle 2, se ha delecionado o
sustituido por uno o más residuos de aminoácidos presentes en un
fragmento correspondiente al fragmento de aminoácidos
66-84 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID No: 10, o en el cual se han añadido uno o más residuos de
aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No:
10 o una parte correspondiente de otra
\alpha-amilasa de tipo Fungamyl como molde.
La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC
ID No: 10 es la secuencia de aminoácidos de la
\alpha-amilasa de A. oryzae, es decir una
\alpha-amilasa de tipo Fungamyl. Se entenderá que
los residuos de aminoácidos o los fragmentos encontrados en las
posiciones correspondientes en otras
\alpha-amilasas, en particular en
\alpha-amilasas de tipo Fungamyl, se pueden usar
como molde para construir la variante según la invención. La parte
correspondiente en otras \alpha-amilasas
homólogas se puede identificar fácilmente con base en una
comparación de las secuencias de aminoácidos y/o estructuras
tridimensionales de las \alpha-amilasas
respectivas.
Por ejemplo, la variante puede ser de tal
manera, que cuando la secuencia de aminoácidos de la variante se
alinea más estrechamente con la secuencia de aminoácidos de dicha
\alpha-amilasa parental, ésta ocupa la misma
posición que la parte que se extiende entre el residuo X y el
residuo Y de la SEC ID No: 4, teniendo dicha región al menos un 80%
así como al menos un 90% de homología secuencial con la parte de la
SEC ID No: 10 que se extiende desde el residuo Z al residuo V de la
SEC ID No: 10, siendo X el residuo de aminoácido que ocupa la
posición 44, 45, 46, 47 o 48 de la SEC ID No: 4,
Y el residuo de aminoácido que ocupa la posición
51, 52, 53, 54, 55, 56 o 57 de la SEC ID No: 4,
Z el residuo de aminoácido que ocupa la posición
66, 67, 68, 69 o 70 de la SEC ID No: 10. y
V el residuo de aminoácido que ocupa la posición
78, 79, 80, 81, 82, 83 o 84 de la SEC ID No: 10.
En otras palabras, la variante puede ser de tal
manera, que en la misma se haya sustituido un fragmento de
aminoácidos X-Y de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a o
está dentro del fragmento de aminoácidos 44-57 de la
SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos Z-V,
el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos
66-84 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID No: 10, teniendo en X, Y, Z y V el significado indicado
arriba.
Un ejemplo específico de una variante según esta
forma de realización es una variante de una
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl, en la
cual el fragmento de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, la cual corresponde a los
residuos de aminoácidos 48-51 de la SEC ID No: 4,
se ha sustituido por un fragmento de aminoácidos correspondiente a
los residuos de aminoácidos 70-78 de la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización la invención se
refiere a una variante de una \alpha-amilasa
parental de tipo Termamyl, en cuya variante se ha delecionado o
sustituido al menos uno de los residuos de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, el/los cual(es)
está(n) presentes en un fragmento de aminoácidos correspondiente al
fragmento de aminoácidos 195-202 de la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID No: 4, por uno o más de los residuos de
aminoácidos presente(s) en un fragmento de aminoácidos
correspondiente al fragmento de aminoácidos 165-177
de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en la
cual se han añadido uno o más residuos de aminoácidos adicionales
usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte
correspondiente de otra \alpha-amilasa de tipo
Fungamyl como
molde.
molde.
Por ejemplo, la variante puede ser de tal
manera, que en la misma se haya sustituido un fragmento de
aminoácidos X-Y de la
\alpha-amilasa parental el cual corresponde a o
está dentro del fragmento de aminoácidos 195-202 de
la SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos
Z-V, el cual corresponde a o está dentro del
fragmento de aminoácidos 165-177 de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, donde
X es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 195 o 196 de la SEC ID No: 4,
Y es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 198, 199, 200, 201, o 202 de la
SEC ID No: 4,
Z es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 165 o 166 de la SEC ID No: 10,
y
V es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 173, 174, 175, 176 o 177 de la SEC
ID No: 10.
Expresado de otra forma, la variante según este
aspecto puede ser de tal manera, que, al alinear más estrechamente
la secuencia de aminoácidos de la variante con la secuencia de
aminoácidos de dicha \alpha-amilasa parental de
tipo Termamyl, ésta ocupa la misma posición que la parte que se
extiende entre el residuo X y el residuo Y de la SEC ID No: 4,
teniendo dicha región al menos un 80%, así como un 90% de homología
secuencial con la parte de la SEC ID No: 10 que se extiende desde
el residuo Z hasta el residuo V de la SEC ID No: 10, siendo el
significado de X, Y, Z y V tal y cómo se identifica arriba.
Un ejemplo específico de una variante según esta
forma de realización es una variante de una
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl, en la
cual el fragmento de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, que corresponde a los
residuos de aminoácidos 196-198 de la SEC ID No: 4,
se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a
los residuos de aminoácidos 166-173 de la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización la invención se
refiere a una variante de, una \alpha-amilasa
parental de tipo Termamyl, en cuya variante se ha(n)
delecionado o sustituido al menos uno de los residuos de
aminoácidos de la \alpha-amilasa parental, el/los
cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento
correspondiente al fragmento de aminoácidos 117-185
de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 4, por uno o más de
los residuos de aminoácidos, el/los cual(es) está(n)
presente(s) en un fragmento de aminoácidos correspondiente
al fragmento de aminoácidos 98-210 de la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en la cual se han
añadido uno o más residuos de aminoácidos adicionales usando la
parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte correspondiente de
otra \alpha-amilasa de tipo Fungamyl como
molde.
Por ejemplo, la variante puede ser de tal
manera, que en la misma se haya sustituido un fragmento de
aminoácidos X-Y de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a o
está dentro del fragmento de aminoácidos 117-185 de
la SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos
Z-V, el cual corresponde a o está dentro del
fragmento de aminoácidos 98-210 de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, en cuya variante
X es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 117, 118, 119, 120 o 121 de la SEC
ID No: 4,
Y es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 181, 182, 183, 184 o 185 de la SEC
ID No: 4, Z es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 98, 99, 100, 101, 102 de la SEC ID
No: 10, y
V es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 206, 207, 208, 209 o 210 de la SEC
ID No: 10.
Un ejemplo específico de una variante según esta
forma de realización es una variante de una
\alpha-amilasa parental, en la cual un fragmento
de aminoácidos de la \alpha-amilasa parental, el
cual corresponde a los residuos de aminoácidos
121-181 de la SEC ID No: 4, se ha sustituido por el
fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de
aminoácidos 102-206 de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID No: 10.
En otra forma de realización la invención se
refiere a una variante de una \alpha-amilasa
parental de tipo Termamyl, en cuya variante al menos se ha
delecionado o sustituido uno de los residuos de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, el/los cual(es)
está(n) presente(s) en un fragmento correspondiente al
fragmento de aminoácidos 117-181 de la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID No: 4, por uno o más de los residuos de
aminoácidos, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un
fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de
aminoácidos 98-206 de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID No: 10, o en la cual se han añadido uno o más
residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de
la SEC ID No: 10 o una parte correspondiente de otra
\alpha-amilasa de tipo Fungamyl como molde.
Por ejemplo, la variante puede ser de tal
manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de
aminoácidos X-Y de la
\alpha-amilasa parental, la cual corresponde a o
está dentro del fragmento de aminoácidos 117-177 de
la SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos
Z-V, el cual corresponde a o está dentro del
fragmento de aminoácidos 98-202 de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, en cuya variante
X es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 117, 118, 119, 120 o 121 de la SEC
ID No: 4,
Y es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 174, 175, 176 o 177 de la SEC ID
No: 4,
Z es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 98, 99, 100, 101, 102 de la SEC ID
No: 10, y
V es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 199, 200, 201 o 202 de la SEC ID
No: 10.
\newpage
Un ejemplo específico de una variante según esta
forma de realización de la invención es una variante, en la cual el
fragmento de aminoácidos de la \alpha-amilasa
parental, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos
121-174 de la SEC ID No: 4, se ha sustituido por el
fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de
aminoácidos 102-199 de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID No: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización la presente
invención se refiere a una variante de una
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl,
habiéndose delecionado o sustituido en la variante al menos uno de
los residuos de aminoácidos de la \alpha-amilasa
parental, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un
fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de
aminoácidos 12-19 de la secuencia de aminoácidos de
la SEC ID No: 4, por uno o más de los residuos de aminoácidos,
el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de
aminoácidos que corresponde al fragmento de aminoácidos
28-42 de la SEC ID No: 10, o en la cual se
ha(n) insertado uno o más residuos de aminoácidos adicionales
usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte
correspondiente de otra \alpha-amilasa de tipo
Fungamyl como
molde.
molde.
Por ejemplo, la variante puede ser de tal
manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de
aminoácidos X-Y de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a o
está dentro del fragmento de aminoácidos 12-19 de la
SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos Z-V,
el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos
28-42 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID No: 10, en cuya variante
X es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 12, 13 o 14 de la SEC ID No:
4,
Y es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 15, 16, 17, 18 o 19 de la SEC ID
No: 4,
Z es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 28, 29, 30, 31 o 32 de la SEC ID
No: 10, y
V es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 38, 39, 40, 41 o 42 de la SEC ID
No: 10.
Un ejemplo específico de una variante según este
aspecto de la invención es una variante, en la cual se ha
sustituido el fragmento de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a los
residuos de aminoácidos 14-15 de la SEC ID No: 4,
por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de
aminoácidos 32-38 de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID No: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización la invención se
refiere a una variante de una \alpha-amilasa
parental de tipo Termamyl, habiéndose delecionado o sustituido en la
variante al menos uno de los residuos de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, el cual está presente en
un fragmento correspondiente a los residuos de aminoácidos
7-23 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No:
4, por uno o más residuos de aminoácidos, el/los cual(es)
está(n) presentes en un fragmento de aminoácidos correspondiente a
los residuos de aminoácidos 13-45 de la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en la cual se
ha(n) insertado uno o más residuos de aminoácidos
adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una
parte correspondiente de otra \alpha-amilasa de
tipo Fungamyl como molde.
Por ejemplo, la variante puede ser de tal
manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de
aminoácidos X-Y de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a o
está dentro del fragmento de aminoácidos 7-23 de la
SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos Z-V,
el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos
13-45 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID No: 10, en cuya variante
X es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 7 o 8 de la SEC ID No: 4,
Y es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 18, 19, 20, 21, 22 o 23 de la SEC
ID No: 4,
Z es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 13 o 14 de la SEC ID No: 10, y
V es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 40, 41, 42, 43, 44 o 45 de la SEC
ID No: 10.
En una variante específica según esta forma de
realización el fragmento de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a los
residuos de aminoácidos 8-18 de la SEC ID No: 4, se
ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los
residuos de aminoácidos 14-40 de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización la invención se
refiere a una variante de una \alpha-amilasa
parental de tipo Termamyl, habiéndose delecionado o sustituido en la
variante al menos uno de los residuos de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, el cual está presente en
un fragmento correspondiente a los residuos de aminoácidos
322-346 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
No: 2, por uno o más residuos de aminoácidos, el/los
cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de
aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 291 313
de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en la
cual se ha(n) insertado uno o más residuos de aminoácidos
adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una
parte correspondiente de otra \alpha-amilasa de
tipo Fungamyl como
molde.
molde.
Por ejemplo, la variante puede ser de tal
manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de
aminoácidos X-Y de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a o
está dentro del fragmento de aminoácidos 322-346 de
la SEC ID No: 2, por un fragmento de aminoácidos
Z-V, que corresponde a o está dentro del fragmento
de aminoácidos 291-313 de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, en cuya variante
X es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 322, 323, 324 o 325 de la SEC ID
No: 2,
Y es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 343, 344, 345 o 346 de la SEC ID
No: 2,
Z es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 291, 292, 293 o 294 de la SEC ID
No: 10, y
V es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 310, 311, 312 o 313 de la SEC ID
No: 10.
En una variante específica según este aspecto de
la invención, el fragmento de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a los
residuos de aminoácidos 325-345 de la SEC ID No: 2,
se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a
los residuos de aminoácidos 294-313 de la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Es altamente deseable tener la capacidad de
reducir la dependencia de Ca^{2+} de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl. Por consiguiente,
en otro aspecto la invención se refiere a una variante de una
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl, que
muestra actividad \alpha-amilasa y que tiene una
dependencia de Ca^{2+} disminuida en comparación con la
\alpha-amilasa parental. La dependencia de
Ca^{2+} disminuida obtiene como resultado funcional que la
variante muestra una actividad amilolitica satisfactoria en
presencia de una concentración de iones calcio en el medio extraño
inferior a la necesaria para la enzima parental y, por ejemplo, en
consecuencia es menos sensible que la parental en condiciones de
agotamiento de iones calcio tales como los obtenidos en medios que
contienen agentes complejantes de calcio (tales como determinados
constructores de detergente).
La dependencia de Ca^{2+} disminuida de la
variante de la invención se puede conseguir ventajosamente
aumentando la afinidad de unión de Ca^{2+} de la
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl, en otras
palabras cuanto más fuerte sea la unión de Ca^{2+} de la enzima,
menor será la dependencia de Ca^{2+}.
Actualmente se cree que los residuos de
aminoácidos localizados en 10 \ring{A} de un ion sodio o calcio
están implicados en o son importantes para la capacidad de unión de
Ca^{2+} de la enzima.
Por consiguiente, la variante según este aspecto
de la invención es preferiblemente de tal manera, que se haya
modificado en uno o más residuos de aminoácidos presentes en 10
\ring{A} de un ion calcio y/o sodio identificado en la estructura
tridimensional de la \alpha-amilasa de tipo
Termamyl de tal manera que se aumente la afinidad de la
\alpha-amilasa con el calcio.
Los residuos de aminoácidos encontrados dentro
de una distancia de 10 \ring{A} desde los sitios de unión de
Ca^{2+} de la \alpha-amilasa de B.
licheniformis con la secuencia de aminoácidos SEC ID No: 2 se
determinaron según se describe en el Ejemplo 2 y son como
sigue:
- \quad
- V102; I103; N104; H105; K106; R125; W155; W157; i158; H159; F160; D161; G162; T163; Y175; K176; F177; G178; K180; A181; W182; D183; W184; E185; V186; S187; N192; Y193; D194; Y195; L196; M197; Y198; A199; D200; I201; D202; Y203; D204; H205; P206; V208; A209; D231; A232; V233; K234; H235; I236; K237; F238; F240; L241; A294; A295; S296; T297; Q298; G299; G300; G301; Y302; D303; M304; R305; K306; L307; W342; F343; L346; Q393; Y394; Y396; H405; H406; D407; I408; V409; R413; E414; G415; D416; S417; V419; A420; N421; S422; G423; L424; I428; T429; D430; G431; P432; V440; G441; R442; Q443; N444; A445; G446; E447; T448; W449; I462; G475; Y480; V481; Q482; R483.
Con el fin de construir una variante según este
aspecto de la invención es deseable reemplazar al menos uno de los
residuos de aminoácidos anteriormente mencionados (o un residuo de
aminoácido que ocupe una posición equivalente en otra
\alpha-amilasa de tipo Termamyl a la definida por
la SEC ID No: 2), la cual se considere que esté implicada en el
suministro de una unión de calcio no óptima, con cualquier otro
residuo de aminoácido que mejore la afinidad de unión de Ca^{2+}
de la enzima variante. En la práctica, la identificación y
modificación posterior del residuo de aminoácido se realiza
mediante el siguiente método:
- i)
- identificar un residuo de aminoácido en 10 \ring{A} partiendo de un sitio de unión de Ca^{2-} de una estructura de \alpha-amilasa de tipo Termamyl, la cual a partir de consideraciones estructurales o funcionales se estima responsable de una interacción de ion calcio no óptima,
- ii)
- construir una variante en la cual dicho residuo de aminoácido se sustituya por otro residuo de aminoácido el cual partiendo de consideraciones estructurales o funcionales se estima importante para establecer una mayor afinidad de unión de Ca^{2+}, y probar la dependencia de Ca^{2+} de la variante de \alpha-amilasa de tipo Termamyl resultante.
En el contexto presente, el término
"interacción de ión calcio no óptima" se destina a indicar que
el residuo de aminoácido en cuestión se selecciona con base en una
presunción de que el hecho de sustituir dicho residuo de aminoácido
por otro puede mejorar una interacción de unión de ion calcio de la
enzima. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en cuestión se puede
seleccionar con base en una o varias de las siguientes
consideraciones:
- -
- obtener una interacción mejorada entre un ion calcio y un residuo de aminoácido localizado cerca de la superficie de la enzima (según se ha identificado a partir de la estructura de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl). Por ejemplo, si el residuo de aminoácido en cuestión se expone a un solvente circundante, puede ser ventajoso aumentar la protección de dicho residuo de aminoácido con respecto al solvente para proveer una interacción más fuerte entre dicho residuo de aminoácido y un ion calcio. Esta sustitución se puede conseguir reemplazando dicho residuo (o un residuo de aminoácido situado cerca de dicho residuo que contribuye a la protección) por un residuo de aminoácido más voluminoso o de otro modo resultaría en un efecto de protección mejorado.
- -
- estabilizar un sitio de unión de calcio, por ejemplo estabilizando la estructura de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl (p. ej. estabilizando los contactos entre los dominios A, B y C o estabilizando uno o varios de los dominios como tales). Esto, p. ej., se puede conseguir proporcionando una mejor coordinación a las cadenas laterales del aminoácido, las cuales pueden, p. ej., obtenerse mediante la sustitución de un residuo N por un residuo D y/o un residuo Q por un residuo E (p. ej. N104D), p. ej. dentro de 10 \ring{A}, y preferiblemente dentro de 3 o 4 \ring{A}, de un sitio de unión de calcio.
- -
- proteger el sitio de unión de calcio o mejorar la coordinación entre el ión calcio y el sitio de unión de calcio, p. ej. proporcionando una interacción más fuerte entre el ión y el sitio de unión.
Antes de construir realmente una variante de
\alpha-amilasa de tipo Termamyl según los
principios de arriba puede ser conveniente evaluar la modificación
del aminoácido en cuestión por su acomodación dentro de la
estructura de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl,
p. ej. en una estructura modelo de la
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl.
Preferiblemente, el residuo de aminoácido a
modificar está localizado dentro de 8 \ring{A} de un residuo de
sitio de unión de Ca^{2+}, así como dentro de 5 \ring{A} de tal
residuo. Los residuos de aminoácidos dentro de 8 \ring{A} y 5
\ring{A}, respectivamente, se pueden identificar fácilmente
mediante un método análogo usado para identificar residuos de
aminoácidos dentro de 10 \ring{A} (cf. Ejemplo 2).
La mutación siguiente se estima de particular
interés con respecto a disminuir la dependencia de Ca^{2+} de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl:
- \quad
- N104D (de la SEC ID NO 2 de \alpha-amilasa de B. licheniformis, o una mutación equivalente (N a D) de una posición equivalente en otra \alpha-amilasa de tipo Termamyl).
En relación a las sustituciones de relevancia
para la dependencia de Ca^{2+}, algunas otras sustituciones
parecen ser importantes a la hora de estabilizar la conformación de
la enzima (por ejemplo las interacciones de los Dominios
A-B y/o los Dominios A-C
contribuyen a la estabilidad global de la enzima) en tanto en cuanto
éstas pueden, p. ej., aumentar la resistencia de unión o retención
del ión calcio o el ion sodio en o dentro de un sitio de unión de
calcio o sodio, respectivamente, dentro de la
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl.
Es deseable estabilizar el dominio C con el fin
de aumentar la estabilidad y/o termoestabilidad de calcio de la
enzima. A este respecto la estabilización puede resultar en una
estabilización de la unión de calcio de la enzima, y un contacto
mejorado entre el dominio C y el dominio A (importante para la
termoestabilidad). Esto se puede conseguir introduciendo puentes de
cisteína, puentes de sal o un aumento de interacciones de
hidrógeno, hidrofóbicas y/o electroestáticas.
Por ejemplo, el dominio C de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis que
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2 se
puede estabilizar introduciendo un puente de cisteína entre el
dominio A y el dominio C, p. ej. introduciendo las siguientes
mutaciones: A349C+I479C y/o L346C+I430C.
Un puente de sal se puede obtener introduciendo
las siguientes mutaciones:
- N457D, E
- N457D, E+K385R
- F350D, E+I430R,K
- F350D,E+I411R,K
\vskip1.000000\baselineskip
El sitio de calcio del Dominio C se puede
estabilizar sustituyendo los residuos de aminoácidos H408 y/o G303
por cualquier otro residuo de aminoácido. Son de particular interés
las mutaciones siguientes: H408Q, E, N, D y/o G303N,D,Q,E
las cuales pretenden proporcionar una mejor
unión de calcio o protección de depleción de calcio.
Se pueden introducir mutaciones similares en
posiciones equivalentes de otras \alpha-amilasas
de tipo Termamyl.
Otras mutaciones de sustitución (en relación a
la \alpha-amilasa de B. licheniformis, SEC
ID nº. 2) que parecen ser importantes, entre otras cosas, en el
contexto de reducir la dependencia de calcio, incluyen las
siguientes: R23K, H156Y, A181T, A209V y G310D (o mutaciones
equivalentes en posiciones equivalentes en otra
\alpha-amilasa de tipo Termamyl). Las
sustituciones de R214 y P345 por otros aminoácidos también pueden
ser importantes a este
respecto.
respecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estima posible cambiar el pH óptimo de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl o la actividad
enzimática a un pH dado cambiando la pKa de los residuos de sitio
activo. Esto se puede conseguir, p. ej. cambiando la interacción
electroestática o la interacción hidrofóbica entre los grupos
funcionales de las cadenas laterales del aminoácido del residuo de
aminoácido a modificar y de sus alrededores cercanos. Esto se puede
realizar, p. ej., mediante el siguiente método:
- i)
- identificando un residuo de aminoácido en 15 \ring{A} desde un residuo de sitio activo, en particular en 10 \ring{A} desde un residuo de sitio activo, en una estructura de la \alpha-amilasa de tipo Termamyl en cuestión, cuyo residuo se estima que está implicado en interacciones electroestáticas o hidrofóbicas con un residuo de sitio activo,
- ii)
- sustituyendo, en la estructura, dicho residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que cambie el entorno electroestático y/o hidrofóbico de un residuo de sitio activo y evaluando la acomodación del residuo de aminoácido en la estructura,
- iii)
- opcionalmente repitiendo la fase i) y/o ii) hasta que se haya identificado una sustitución de aminoácido alojada en la estructura,
- iv)
- construyendo una variante de \alpha-amilasa de tipo Termamyl resultante de las fases i), ii) y opcionalmente iii) y analizando la actividad enzimática dependiente del pH de interés de dicha variante.
\vskip1.000000\baselineskip
En el método de arriba puede tener particular
relevancia añadir un residuo cargado positivamente dentro de 5
\ring{A} de un glutamato (reduciendo de ese modo la pKa del
glutamato desde aproximadamente 4.5 a 4), o añadir un residuo
cargado negativamente dentro de 5 \ring{A} de un glutamato
(aumentando de ese modo la pKa hasta aproximadamente 5), o hacer
modificaciones similares dentro de una distancia de aproximadamente
5 \ring{A} de una Histidina.
\newpage
En otro aspecto la invención se refiere a una
variante de una \alpha-amilasa de tipo Termamyl
que muestra una actividad mayor a un pH inferior (p. ej. en
comparación con el pH óptimo) que la
\alpha-amilasa parental. En particular, la
variante comprende una mutación de un residuo de aminoácido
correspondiente a al menos una de las siguientes posiciones de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis (SEC ID
No: 2):
- E336; Q333; P331; I236; V102; A232; I103; L196
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes mutaciones son de particular
interés:
- E336R,K
- Q333R,K
- P31R,K
- V102R,K,A,T,S,G;
- I236K,R,N;
- I103K,R;
- L196K,R;
- A232T,S,G;
o cualquier combinación de dos o
más de estas variantes o cualquier combinación de una o más de
estas variantes con cualquiera de las otras variantes descritas
aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto ulterior la invención se refiere
a una variante de una \alpha-amilasa de tipo
Termamyl que tiene una actividad mayor a un pH mayor que la
\alpha-amilasa parental. En particular, la
variante comprende una mutación de un residuo de aminoácido
correspondiente a al menos una de las siguientes posiciones de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis (SEC ID
No: 2):
- N236; H281; Y273
\vskip1.000000\baselineskip
En particular, la variante comprende una
mutación correspondiente a al menos una de las siguientes
mutaciones de la \alpha-amilasa de B.
licheniformis (SEC ID No: 2):
- N326I,Y,F,L,V
- H281F,I,L
- Y273F,W
o cualquier combinación de dos o
más de estas variantes o cualquier combinación de una o más de
estas variantes con cualquiera de las otras variantes descritas
aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mutación que parece ser importante en
relación con la actividad específica de las variantes de la
invención es una mutación correspondiente a la sustitución S187D en
la \alpha-amilasa de B. licheniformis (SEC
ID No: 2).
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto deseado la invención se refiere
a una variante de una \alpha-amilasa parental de
tipo Termamyl, siendo la variante el resultado de uno o más
residuos de aminoácidos que han sido delecionados de, sustituidos o
añadidos a la \alpha-amilasa parental con el fin
de obtener una termoestabilidad aumentada de la variante.
La estructura de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl contiene varios
agujeros internos únicos, los cuales pueden contener agua, y varias
grietas. Para aumentar la termoestabilidad de la
\alpha-amilasa puede ser deseable reducir el
número de agujeros y grietas (o reducir el tamaño de los agujeros o
grietas), p. ej. introduciendo uno o más contactos hidrofóbicos,
preferiblemente conseguidos a base de introducir residuos más
voluminosos, en la proximidad o entorno del agujero. Por ejemplo,
los residuos de aminoácidos que se van a modificar son aquellos
implicados en la formación del agujero.
Por consiguiente, en otro aspecto la presente
invención se refiere a un método para aumentar la termoestabilidad
y/o alterar la temperatura óptima de una
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl,
comprendiendo el método
- i)
- identificar un agujero interno o una grieta de la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl en la estructura tridimensional de dicha \alpha-amilasa,
- ii)
- sustituir, en la estructura, uno o más residuos de aminoácidos alrededor del agujero o grieta identificados en i) por otro residuo de aminoácido que a partir de consideraciones estructurales o funcionales se cree que aumenta la interacción hidrofóbica y ensancha o reduce el tamaño del agujero o grieta,
- iii)
- construir una variante de \alpha-amilasa de tipo Termamyl resultante de la fase ii) y analizar la termoestabilidad y/o temperatura óptima de la variante.
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura usada para identificar el agujero
o grieta de la \alpha-amilasa parental de tipo
Termamyl puede ser la estructura identificada en el Apéndice 1 o
una estructura modelo de la \alpha-amilasa
parental de tipo Termamyl construida sobre la misma.
Se entenderá que el agujero o grieta se
identifica por los residuos de aminoácidos circundantes al
agujero/grieta, y esta modificación de dichos residuos de
aminoácidos son importantes para rellenar o reducir el tamaño del
agujero/grieta. Los residuos de aminoácidos a los que se hace
particular referencia abajo son aquellos que en estructura
cristalina se ha observado que flanquean el agujero/grieta en
cuestión.
Con el fin de llenar (completa o parcialmente)
un agujero fundamental localizado entre los dominios A y B, la
mutación de cualquier otro residuo de aminoácido de un residuo de
aminoácido correspondiente a uno o más de los siguientes residuos
de la \alpha-amilasa de B. licheniformis
(SEC ID No: 2) se contempla:
- L61; Y62; F67; K106; G145; I212; S151; R214; Y150; F143; R146
\vskip1.000000\baselineskip
Es de particular interés una mutación a un
residuo de aminoácido más voluminoso que el residuo de aminoácido
de la enzima parental.
Es de particular interés una variante de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl que comprende una
mutación correspondiente a las mutaciones siguientes (usando la
numeración de la \alpha-amilasa de B.
licheniformis (SEC ID No: 2):
- L61W,V,F;
- Y62W;
- F67W;
- K106R,F,W;
- G145F,W
- I212F,L,W,Y,R,K;
- S151 sustituido por cualquier otro residuo de aminoácido y en particular por F,W,I o L;
- R214W;
- Y150R,K;
- F143W; y/o
- R146W.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de llenar un agujero en la proximidad
de la mutación de sitio activo a cualquier otro residuo de
aminoácido de un residuo de aminoácido correspondiente a uno o más
de los siguientes residuos de la \alpha-amilasa de
B. licheniformis (SEC ID NO 2) se contempla:
- L241; I236.
\vskip1.000000\baselineskip
Es de interés una mutación a un residuo de
aminoácido más voluminoso.
Es de particular interés una variante de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl que comprende una
mutación correspondiente a una o más de las siguientes mutaciones
en la \alpha-amilasa de B.
licheniformis:
- L241I,F,Y,W; y/o
- I236L,F,W,Y
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de llenar un agujero en la proximidad
de la mutación de sitio activo a cualquier otro residuo de
aminoácido de un residuo de aminoácido correspondiente a uno o más
de los siguientes residuos de la \alpha-amilasa de
B. licheniformis (SEC ID No: 2) se contempla:
- L7; V259; F284
\vskip1.000000\baselineskip
Es de interés una mutación a un residuo de
aminoácido más voluminoso.
Es de particular interés una variante de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl que comprende una
mutación correspondiente a una o más de las siguientes mutaciones
en la \alpha-amilasa de B.
licheniformis:
- L7F,I,W
- V259F,I,L
- F284W
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de llenar un agujero en la proximidad
de la mutación de sitio activo a cualquier otro residuo de
aminoácido de un residuo de aminoácido correspondiente a uno o más
de los siguientes residuos de la \alpha-amilasa de
B. licheniformis (SEC ID No: 2) se contempla:
- F350; F343
\vskip1.000000\baselineskip
Es de interés una mutación a un residuo de
aminoácido más voluminoso.
Es de particular interés una variante de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl que comprende una
mutación correspondiente a una o más de las siguientes mutaciones
en la \alpha-amilasa de B.
licheniformis:
- F350W
- F343W
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de llenar un agujero en la proximidad
de la mutación de sitio activo a cualquier otro residuo de
aminoácido de un residuo de aminoácido correspondiente a uno o más
de los siguientes residuos de la \alpha-amilasa de
B. licheniformis (SEC ID No: 2) se contempla:
- L427; V481
\vskip1.000000\baselineskip
Es de interés una mutación a un residuo de
aminoácido más voluminoso.
Es de particular interés una variante de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl que comprende una
mutación correspondiente a una o más de las siguientes mutaciones
en la \alpha-amilasa de B.
licheniformis:
- L427F,L,W
- V481,F,I,L,W
\vskip1.000000\baselineskip
En el proceso de licuefacción de almidón es
deseable usar una \alpha-amilasa capaz de
degradar las moléculas de almidón en oligosacáridos de
ramificaciones largas (como, p. ej. las
\alpha-amilasas de tipo Fungamyl) mejor que los
oligosacáridos de ramificaciones más cortas (como las
\alpha-amilasas de tipo Termamyl convencionales).
Los oligosacáridos resultantes de ramificaciones muy cortas
(precursores de panosa) no se pueden hidrolizar adecuadamente
mediante pululanasas, las cuales se usan después de las
\alpha-amilasas y antes de las amiloglucosidasas
en el proceso de licuefacción. De esta manera, en presencia de
precursores de panosa la acción de la
amilo-glucoamilasa termina con un grado alto de la
dextrina limitante de ramificaciones pequeñas, el trisacárido
panosa. La presencia de panosa disminuye significativamente el
rendimiento de sacarificación y por ello es indeseable.
De esta manera, un objetivo de la presente
invención es cambiar las características de degradación de una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl por las de una
\alpha-amilasa de tipo Fungamyl sin reducir al
mismo tiempo la termoestabilidad de la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl.
Por consiguiente, en otro aspecto la invención
se refiere a una variante de una \alpha-amilasa
de tipo Termamyl que tiene una capacidad reducida para segmentar un
sustrato cercano al punto de ramificación.
La variante se puede construir de manera
adecuada mediante un método que comprende
- i)
- identificar el área de unión de sustrato de la \alpha-amilasa parental de tipo Termamyl en un modelo de la estructura tridimensional de dicha \alpha-amilasa, (p. ej. dentro de una esfera de 4 \ring{A} desde el sitio de unión de sustrato (como se define en la sección de arriba titulada "Sitio de unión de sustrato"),
- ii)
- sustituir, en el modelo, uno o más residuos de aminoácidos del área de unión de sustrato de la grieta identificada en i), que se tiene(n) por responsable(s) del modelo de segmentación de la \alpha-amilasa parental, por otro residuo de aminoácido que a partir de consideraciones estructurales se cree que resulta en un modelo de segmentación de sustrato alterado, o borrar uno o más residuos de aminoácidos del área de unión de sustrato que se considera que introduce(n) interacciones favorables para el sustrato o añadir uno o más residuos de aminoácidos en el área de unión de sustrato que se considera que introduce(n) interacciones favorables para el sustrato, y
- iii)
- construir una variante de \alpha-amilasa de tipo Termamyl resultante de la fase ii) y analizar el modelo de segmentación de sustrato de la variante.
\vskip1.000000\baselineskip
Es de particular interés una variante que
segmente un sustrato de amilopectina, a partir del extremo
reductor, más de una unidad de glucosa del punto de ramificación,
preferiblemente más de dos o tres unidades de glucosa del punto de
ramificación, es decir a una distancia mayor desde el punto de
ramificación que la obtenida usando una
\alpha-amilasa de B. licheniformis de tipo
salvaje.
Residuos de particular interés en relación con
este aspecto de la invención corresponden a los siguientes residuos
de la \alpha-amilasa de B. licheniformis
(SEC ID No: 2): V54; D53; Y56; Q333; G57, y las variantes según
este aspecto comprenden preferiblemente una mutación en uno o más
de estos residuos.
En particular, la variante comprende al menos
una de las siguientes mutaciones, que se espera prevenga(n)
la segmentación próxima al punto de ramificación:
- V54L,I,F,Y,W,R,K,H,E,Q
- D53L,I,F,Y,W
- Y56W
- Q333W
- G57 todos los residuos de aminoácidos posibles
- A52 residuos de aminoácidos más grandes que A, p. ej. A52W,Y,L,F,I.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización más la invención se
refiere a una variante de una \alpha-amilasa
parental de tipo Fungamyl, habiéndose delecionado o sustituido en
la variante al menos uno de los residuos de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, el/los cual(es)
está(n) presente(s) en un fragmento de aminoácidos
correspondiente a los residuos de aminoácidos
291-313 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
No: 10, por uno o más de los residuos de aminoácidos, el/los
cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de
aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos
98-210 de la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID No: 4, o donde se ha(n) insertado uno o más
residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la
SEC ID No: 4 o una parte correspondiente de otra
\alpha-amilasa de tipo Termamyl como molde.
Por ejemplo, la variante puede ser de tal
manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de
aminoácidos X-Y de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a o
está dentro del fragmento de aminoácidos 117-185 de
la SEC ID No: 10, por un fragmento de aminoácidos
Z-V, el cual corresponde a o está dentro del
fragmento de aminoácidos 98-210 de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4, en cuya variante
X es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 117, 118, 119, 120 0 121 de la SEC
ID No: 10,
Y es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 181, 182, 183, 184 0 185 de la SEC
ID No: 10,
Z es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 98, 99, 100, 101 o 102 de la SEC
ID No: 4, y
V es un residuo de aminoácido correspondiente al
aminoácido que ocupa la posición 206, 207, 208, 209 o 210 de la SEC
ID No: 4.
Un ejemplo específico de una variante según este
aspecto de la invención es uno, en el que el fragmento de
aminoácidos de la \alpha-amilasa parental, el cual
corresponde a los residuos de aminoácidos 121-181
de la SEC ID No: 10, se ha sustituido por el fragmento de
aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos
102-206 de la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID No: 4.
Otro ejemplo de una variante según este aspecto
de la invención es uno, en el que el fragmento de aminoácidos de la
\alpha-amilasa parental, el cual corresponde a
los residuos de aminoácidos 121-174 de la SEC ID No:
10, se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos
correspondiente a los residuos de aminoácidos
102-199 de la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID No: 4.
En otra forma de realización la invención se
refiere a una variante de una \alpha-amilasa
parental de tipo Fungamyl, en la cual se ha delecionado un fragmento
de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos
181-184 de la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID No: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede preferir que la variante de la
invención o preparada conforme al método de la invención comprenda
una o más modificaciones además de las resumidas arriba. De esta
manera, puede ser ventajoso que uno o más residuos de prolina
presentes en la parte de la variante de
\alpha-amilasa que se ha modificado se
sustituya(n) por un residuo distinto de prolina, el cual
puede ser cualquiera de los residuos distintos de prolina de origen
natural posibles, y el cual es preferiblemente una alanina,
glicina, serina, treonina, valina o leucina.
Análogamente, puede ser preferible sustituir ése
o más residuos de cisteina presentes en los residuos de
aminoácidos, con los cuales se modifica la
\alpha-amilasa parental, por unos residuos
distintos de cisteína tales como serina, alanina, treonina,
glicina, valina o leucina.
Además, la variante de la invención se puede
modificar bien como única modificación o en combinación con
cualquiera de las modificaciones descritas arriba de modo que se
sustituya uno o más Asp y/o Glu presentes en un fragmento de
aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos
185-209 de la SEC ID No: 8 por un Asn y/o Gln,
respectivamente. También es de interés la modificación de uno o más
de los residuos de Lys presentes en la
\alpha-amilasa de tipo Termamyl
sustituido(s) por un Arg presente en un fragmento de
aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos
185-209 de la SEC ID No: 8 sustituido por un Asn
y/o un Gln, respectivamente.
Se entenderá que, conforme a la presente
invención, se pueden preparar variantes que lleven dos o más de las
modificaciones descritas arriba. Por ejemplo, se pueden preparar
variantes que comprendan una modificación en la región del bucle 1
y el bucle 2, una modificación en el bucle 2 y el bucle 3 limitado,
una modificación en el bucle 1, el bucle 2, el bucle 3 y el bucle 8,
etc.
Además, puede ser ventajoso introducir
mutaciones puntuales en cualquiera de las variantes descritas
aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
[0151] Se conocen en la técnica diferentes
métodos para introducir mutaciones en genes. Después de una breve
discusión sobre el cierre de secuencias de ADN que codifican
\alpha-amilasas, se discutirán los métodos para
generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia que
codifica la \alpha-amilasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN que codifica una
\alpha-amilasa parental se puede aislar a partir
de cualquier célula o microorganismo que produzca la
\alpha-amilasa en cuestión, usando diferentes
métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar, se debería
construir un ADN genómico y/o biblioteca de ADNc usando ADN
cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la
\alpha-amilasa objeto de estudio. Después, si se
conoce la secuencia de aminoácidos de la
\alpha-amilasa, se pueden sintetizar sondas
oligonucleótidas homólogas y marcadas y usarlas para identificar
clones que codifiquen \alpha-amilasas a partir de
una biblioteca genómica obtenida a partir del organismo en
cuestión. De forma alternativa, una sonda de oligonucleótidos
marcada que contiene secuencias homólogas a un gen de \alpha-
amilasa conocido se podría usar como sonda para identificar clones
que codifiquen \alpha-amilasas, usando unas
condiciones de hibridación y de lavado de menor astringencia.
Otro método más para identificar clones que
codifiquen la \alpha-amilasa incluiría insertar
fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un
plásmido, transformar bacterias de \alpha-amilasa
negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante, y después
fijar las bacterias transformadas sobre agar que contenga un
sustrato para la \alpha-amilasa, de ese modo
permitiendo a los clones expresar la
\alpha-amilasa que se va a identificar.
De forma alternativa, la secuencia de ADN que
codifica la enzima se puede preparar sintéticamente mediante
métodos estándar establecidos, p. ej. el método de fosforamidita
descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método
descrito por Matthes et al. (1984). En el método de
fosforamidita, se sintetizan oligonucleótidos, p. ej. en un
sintetizador de ADN automático, se purifican, anillan, ligan y
clonan en vectores apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen mezclado genómico y sintético, mezclado sintético y de ADN o
mezclado genómico y de ADNc, preparado mediante la ligadura de
fragmentos de origen sintético genómico o de ADN (según convenga,
los fragmentos correspondientes a diferentes partes de la secuencia
completa de ADN), conforme a técnicas estándar. La secuencia de ADN
también se puede preparar mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo según se
describe en US 4.683.202 o en R.K. Saiki et al. (1988).
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez que se ha aislado una secuencia de ADN
que codifica \alpha-amilasas, y se han
identificado sitios deseables para la mutación, se pueden introducir
mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos
oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean
los sitios de mutación deseados; se insertan nucleótidos mutantes
durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método específico,
se crea un fragmento monocatenario de ADN, el cual conecta la
secuencia que codifica la \alpha-amilasa, en un
vector que soporta el gen de la \alpha-amilasa.
Después se anilla el nucleótido sintético, el cual soporta la
mutación deseada, a una parte homóloga del ADN monocatenario. El
espacio restante se llena después con ADN polimerasa I (fragmento
Klenow) y el constructo se liga usando T4 ligasa. Un ejemplo
específico de este método está descrito en Morinaga et al.
(1984). US 4.760.025 expone la introducción de oligonucleótidos que
codifican mutaciones múltiples realizando alteraciones menores del
casete. No obstante, se puede introducir una variedad incluso mayor
de mutaciones en cualquier momento mediante el método de Morinaga,
ya que se puede introducir una multitud de oligonucleótidos, de
diferentes longitudes.
Otro método para introducir mutaciones en
secuencias de ADN que codifican \alpha-amilasas
está descrito en Nelson y Long (1989). Esto implica la generación
en 3 fases de un fragmento de PCR que contenga la mutación deseada
introducida usando una cadena de ADN sintetizada químicamente como
uno de los cebadores en las reacciones de la PCR. A partir del
fragmento generado mediante PCR, se puede aislar un fragmento de
ADN que soporte la mutación mediante segmentación con endonucleasas
de restricción y reinsertarlo en un plásmido de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
La mutagénesis aleatoria se realiza de manera
adecuada bien como mutagénesis aleatoria localizada o específica de
una región en al menos tres partes del gen que traduce a la
secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen
entero.
Para la mutagénesis aleatoria específica de una
región con el propósito de mejorar la termoestabilidad de una
\alpha-amilasa parental de tipo Termamyl, se
pueden seleccionar apropiadamente las posiciones de codón
correspondientes a los siguientes residuos de aminoácidos de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis (SEC ID
No: 2):
\vskip1.000000\baselineskip
- I428-A435
- T297-L308
- F403-V409
\newpage
Para mejorar la estabilidad entre el dominio
A y B:
- D180-D204
- H156-T163
- A232-F238
\vskip1.000000\baselineskip
Con el propósito de conseguir una unión mejorada
de un sustrato (es decir, una unión mejorada de una especie de
carbohidrato, tal como la amilosa o la amilopectina) en una
variante de \alpha-amilasa de tipo Termamyl, una
especificidad de sustrato modificada (p. ej. mayor) y/o una
especificidad modificada (p. ej. mayor) con respecto a la
segmentación (hidrólisis) del sustrato, parece que las siguientes
posiciones de codón para la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID No: 2 en particular (o posiciones de codón equivalentes para
otra \alpha- amilasa parental de tipo Termamyl en el contexto de
la invención) se pueden seleccionar apropiadamente:
- 13-18
- 50-56
- 70-76
- 102-109
- 163-172
- 189-199
- 229-235
- 360-264
- 327-335
\vskip1.000000\baselineskip
La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN
que codifica una \alpha-amilasa parental que se va
a realizar conforme a la fase a) del método de la invención
descrito anteriormente se puede realizar convenientemente usando
cualquier método conocido en la técnica.
Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria se puede
realizar usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado,
usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de
ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis
aleatoria se puede realizar usando cualquier combinación de estos
agentes mutagenizantes.
El agente mutagenizante puede ser, p. ej., de
tal manera que induce transiciones, transversiones, inversiones,
aleatorización, deleciones, y/o inserciones.
Ejemplos de un agente mutagenizante físico o
químico adecuado para el propósito presente incluyen irradiación
ultravioleta (UV), hidroxilamina,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil
metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y
análogos de nucleótidos.
Cuando se usan tales agentes, la mutagénesis se
realiza normalmente incubando la secuencia de ADN que codifica la
enzima parental que se va a mutagenizar en presencia del agente
mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas para la
mutagénesis que va a tener lugar, y seleccionando el ADN mutado que
tenga las propiedades deseadas.
Cuando la mutagénesis se realiza usando un
oligonucleótido, el oligonucleótido puede estar dopado o adicionado
con los tres nucleótidos no parentales durante la síntesis del
oligonucleótido en las posiciones que se van a cambiar. El dopaje o
adicionado se puede hacer de tal manera que se eviten codones para
aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o adicionado se
puede incorporar en el ADN que codifica la enzima amilolítica
mediante cualquier técnica publicada, usando p. ej. PCR, LCR o
cualquier ADN polimerasa y ligasa.
Cuando se usa una mutagénesis generada por PCR,
se somete a PCR a un gen tanto químicamente tratado como no tratado
que codifica una enzima de \alpha-amilasa parental
bajo condiciones que aumentan la desincorporación de nucleótidos
(Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, págs.
11-15).
Para la mutagénesis aleatoria del ADN que
codifica la enzima amilolítica se puede usar una cepa mutágena de
E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133,
1974, págs. 179-191), de S. cereviseae o
cualquier otro organismo microbiano p. ej. transformando un
plásmido que contenga la enzima parental en la cepa mutágena,
madurando la cepa mutágena con el plásmido y aislando el plásmido
mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado se puede transformar
posteriormente en el organismo de expresión.
La secuencia de ADN que se va a mutagenizar
puede estar presente convenientemente en una biblioteca genómica o
de ADNc obtenida a partir de un organismo que expresa la enzima
parental amilolítica. De forma alternativa, la secuencia de ADN
puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o
un bacteriófago, el cual como tal se puede incubar con o de otro
modo exponer al agente mutagenizante. El ADN que se va a
mutagenizar también puede estar presente en una célula huésped o
bien integrándose en el genoma de dicha célula o estando presente
en un vector albergado por la célula. Finalmente, el ADN que se va
a mutagenizar puede estar en forma aislada. Se entenderá que la
secuencia de ADN que se va a someter a mutagénesis aleatoria es
preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.
En algunos casos puede ser conveniente
amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la fase de
expresión (b) o la fase de selección (c). Tal amplificación se
puede realizar conforme a métodos conocidos en la técnica, siendo
el método actualmente preferido la amplificación generada por PCR
usando cebadores oligonucleótidos preparados a partir del ADN o de
la secuencia de aminoácidos de la enzima parental.
Después de la incubación con o la exposición al
agente mutagenizante, el ADN mutado se expresa cultivando una
célula huésped adecuada que lleve la secuencia de ADN bajo
condiciones que permitan tener lugar a la expresión. La célula
huésped usada para este propósito puede ser de tal manera que se
haya transformado con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente
presente en un vector, o de tal manera que haya llevado la
secuencia de ADN que codifica la enzima parental durante el
tratamiento de la mutagénesis. Ejemplos de células huéspedes
adecuadas son los siguientes: bacterias gram positivas tales como
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus,
Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus
alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,
Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus
thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces
murinus; y bacterias gram negativas tales como E.
coli.
La secuencia de ADN mutada puede comprender
además una secuencia de ADN que codifique funciones que permitan la
expresión de la secuencia de ADN mutada.
Mutagénesis aleatoria localizada: la
mutagénesis aleatoria se puede localizar ventajosamente en una
parte de la \alpha-amilasa parental en cuestión.
Esto puede ser, p. ej., ventajoso cuando determinadas regiones de
la enzima se han identificado como particularmente importantes para
una propiedad dada de la enzima, y cuando al modificarse se prevea
como resultado una variante con propiedades mejoradas. Tales
regiones se pueden identificar normalmente cuando la estructura
terciaria de la enzima parental se ha dilucidado y relacionado con
la función de la enzima.
La mutagénesis localizada aleatoria se realiza
convenientemente usando técnicas de mutagénesis generadas por PCR
como se ha descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada
conocida en la técnica. De forma alternativa, se puede aislar la
secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN que
se va a modificar, p. ej. insertándose en un vector adecuado, y
dicha parte se puede someter posteriormente a mutagénesis usando
cualquiera de los métodos de mutagénesis tratados
anteriormente.
Con respecto a la fase de selección en el método
de la invención mencionado anteriormente, ésta se puede realizar
convenientemente mediante un ensayo de filtro basado en el
siguiente principio:
Se incuba un microorganismo capaz de expresar la
enzima mutada amilolítica de interés en un medio adecuado y bajo
condiciones adecuadas para la enzima que se va a segregar, estando
el medio provisto de un filtro doble que comprende un primer filtro
de enlace proteínico y en lo alto de éste un segundo filtro que
muestra una capacidad baja de unión de proteínas. El microorganismo
está localizado en el segundo filtro. Después de la incubación, se
separa el primer filtro, el cual comprende enzimas segregadas a
partir de los microorganismos, del segundo filtro, el cual
comprende los microorganismos. El primer filtro se somete a la
selección de la actividad enzimática deseada y se identifican las
correspondientes colonias microbianas presentes en el segundo
filtro.
El filtro usado para unir la actividad
enzimática puede ser cualquier filtro de unión de proteínas p. ej.
de nilón o nitrocelulosa. El filtro que está en lo alto y que
transporta las colonias del organismo de expresión puede ser
cualquier filtro que tenga poca o ninguna afinidad con las
proteínas de unión p. ej. el acetato de celulosa o el
Durapore^{TM}. El filtro se puede pretratar con cualquiera de las
condiciones que se van a usar para la selección o se puede tratar
durante la detección de actividad enzimática.
La actividad enzimática se puede detectar
mediante un colorante, una fluorescencia, una precipitación, un
indicador de pH, una absorbencia de IR o cualquier otra técnica
conocida para detectar actividad enzimática.
El compuesto detector se puede inmovilizar
mediante cualquier agente inmovilizador p. ej. agarosa, agar,
gelatina, poliacrilamida, almidón, papel de filtro, tela; o
cualquier combinación de agentes inmovilizadores. La actividad
\alpha-amilasa se detecta mediante amilopectina
marcada como Cibacron Red, la cual se inmoviliza en agarosa. Para
seleccionar variantes con estabilidad aumentada térmica y con pH
alto, se incuba el filtro con variantes de
\alpha-amilasa enlazadas en un tampón a pH 10.5 y
60º o 65ºC durante un tiempo específico, se lava brevemente en agua
desionizada y se coloca en la matriz de agarosa de amilopectina
para la detección de actividad. Se observa actividad residual en
forma de tisis de Cibacron Red mediante la degradación de
amilopectina. Las condiciones se han elegido de tal manera que
apenas se puede detectar la actividad debido a la
\alpha-amilasa que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No:1. Las variantes estabilizadas
muestran, bajo las mismas condiciones, una intensidad del color
aumentada debido a un incremento de la liberación de Cibacron
Red.
Para seleccionar variantes con una actividad
óptima a una temperatura inferior y/o sobre un rango de
temperaturas más amplio, el filtro con variantes enlazadas se
coloca directamente en la placa de sustrato de Cibacron Red de
amilopectina y se incuba a la temperatura deseada (p. ej. 4ºC, -
10ºC o 30ºC) durante un tiempo específico. Después de esta
actividad temporal apenas se pueden detectar debido a la
\alpha-amilasa que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 1, mientras que las variantes
con actividad óptima a menor temperatura mostrarán un incremento de
tisis de amilopectina. Antes de la incubación sobre la matriz de
amilopectina, se puede llevar a cabo una incubación en toda clase de
medios deseados, p. ej. en soluciones que contengan Ca^{2+},
detergentes, EDTA u otros aditivos pertinentes, con el fin de
seleccionar la dependencia modificada o la reacción de las
variantes en cuestión con tales aditivos.
\vskip1.000000\baselineskip
La evolución de las variantes de la invención se
puede realizar de manera adecuada determinando la actividad de
degradación de almidón de la variante, por ejemplo, madurando
células huéspedes transformadas con una secuencia de ADN que
codifica una variante en una placa de agarosa que contiene almidón e
identificando células huéspedes degradantes de almidón. También se
pueden realizar ensayos sobre propiedades alteradas (incluyendo
actividad específica, especificidad de sustrato, modelo de
segmentación, termoactivación, pH óptimo, dependencia de pH,
temperatura óptima, y cualquier otro parámetro) conforme a métodos
conocidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la invención, una secuencia de ADN que
codifica la variante producida mediante los métodos anteriormente
descritos, o mediante cualquier método alternativo conocido en la
técnica, se puede expresar, en forma de enzima, usando un vector de
expresión que incluya normalmente secuencias de control que
codifiquen un promotor, operador, sitio de unión de ribosomas, señal
de inicio de traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios
genes
activadores.
activadores.
El vector de expresión recombinante que lleva la
secuencia de ADN que codifica una variante de
\alpha-amilasa de la invención puede ser cualquier
vector que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN
recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de
la célula huésped en la cual se va a introducir éste. De este modo,
el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un
vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación
del cual es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un
plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico,
minicromosoma o un cromosoma artificial. De forma alternativa, el
vector puede ser de tal manera que, al introducirse en una célula
huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica
junto con el/los cromosoma(s) en los cuales se ha
integrado.
En el vector, la secuencia de ADN debería estar
conectada operativamente a una secuencia promotora adecuada. El
promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad
transcripcional en la célula huésped de elección y que pueda
derivarse de genes que codifican proteínas ya sean homólogas o
heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados
para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica
una variante de \alpha-amilasa de la invención,
especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón
lac de E. coli, los promotores del gen de agarasa dagA
de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de
\alpha-amilasa (amyL) de Bacillus
licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica
(amyM) de Bacillus stearothermophilus, los promotores
de la \alpha-amilasa (amyQ) de Bacillus
amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y
xylB de Bacillus subtilis etc. Para la transcripción
en un huésped fúngico, son ejemplos de promotores útiles aquellos
derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de A. oryzae,
la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la
\alpha-amilasa neutra de A. niger, la
\alpha-amilasa estable en ácido de A.
niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de
Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae,
la triosafosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa
de
A. nidulans.
A. nidulans.
El vector de expresión de la invención también
puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en
eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas
a la secuencia de ADN que codifica la variante de
\alpha-amilasa de la invención. Las secuencias de
terminación y poliadenilación pueden derivarse de manera adecuada
de las mismas fuentes que el promotor.
El vector también puede comprender una secuencia
de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en
cuestión. Son ejemplos de secuencias de este tipo los orígenes de
replicación de los plásmidos pUC19; pACYC177; pUB110; pE194, pAMB1
y pIJ702.
El vector también puede comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto
en la célula huésped, tal como los genes dal de B.
subtilis o B. licheniformis, o uno que confiera
resistencia antibiótica así como a la ampicilina, canamicina,
cloranfenicol o tetraciclina. Además, el vector puede comprender
marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS,
argB, niaD y sC, un marcador originando resistencia a la
higromicina, o la selección se puede realizar mediante
cotransformación, p. ej. como se describe en WO
91/17243.
91/17243.
Aunque la expresión intracelular puede ser
ventajosa en algunos aspectos, p. ej. al usar ciertas bacterias
como células huéspedes, se prefiere generalmente que la expresión
sea extracelular. En general, las \alpha-amilasas
de Bacillus mencionadas aquí comprenden una preregión que
permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de
cultivo. Si se desea, esta preregión puede sustituirse por una
preregión diferente o secuencia señal, llevada a cabo
convenientemente mediante la sustitución de las secuencias de ADN
que codifican las respectivas pre-
regiones.
regiones.
Los procedimientos usados para enlazar el
constructo de ADN de la invención que codifica una variante de
\alpha-amilasa, el promotor, terminador y otros
elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados
que contienen la información necesaria para la replicación, son
bien conocidos por las personas expertas en la técnica (cf., por
ejemplo, Sambrook et al. (1989)).
La célula de la invención, bien comprendiendo un
constructo de ADN o bien un vector de expresión de la invención tal
como se ha definido anteriormente, se usa ventajosamente como
célula huésped en la producción recombinante de una variante de
\alpha-amilasa de la invención. La célula se puede
transformar con el constructo de ADN de la invención que codifica
la variante, integrando convenientemente el constructo de ADN (en
una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración se
considera generalmente como una ventaja en tanto en cuanto la
secuencia de ADN es más probable que se mantenga estable en la
célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma
huésped se puede realizar según métodos convencionales, p. ej.
mediante recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa,
la célula se puede transformar con un vector de expresión como se
describe anteriormente en relación con los diferentes tipos de
células huéspedes.
La célula de la invención puede ser una célula
de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero
preferiblemente es una célula microbiana, p. ej. una célula
bacteriana o fúngica (incluyendo la levadura).
Son ejemplos de bacterias adecuadas bacterias
gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus
lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o
Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o
bacterias gram negativas tales como E. coli. La
transformación de las bacterias se puede efectuar, por ejemplo,
transformando el protoplasto o usando células competentes de una
manera conocida per se.
El organismo de levadura se puede seleccionar
favorablemente de unas especies de Saccharomyces o
Schizosaccharomyces, p. ej. Saccharomyces cerevisiae.
El hongo filamentoso puede pertenecer ventajosamente a una especie
de Aspergillus, p. ej. Aspergillus oryzae o
Aspergillus niger. Las células micóticas se pueden
transformar mediante un proceso que implica la formación de
protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de la
regeneración de la pared celular de una manera conocida per
se. Un procedimiento adecuado para transformar células
huéspedes de Aspergillus está descrito en EP 238 023.
En otro aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un método para producir una variante de
\alpha-amilasa de la invención, comprendiendo el
método el cultivo de una célula huésped como se describe
anteriormente bajo condiciones propicias para la producción de la
variante y la recuperación de la variante a partir de las células
y/o el medio de cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede
ser cualquier medio convencional adecuado para madurar la célula
huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante de
\alpha-amilasa de la invención. Medios adecuados
se encuentran disponibles a través de proveedores comerciales o se
pueden preparar según recetas publicadas (p. ej. como se describe
en catálogos de la American Type Culture Collection).
La variante de \alpha-amilasa
segregada a partir de las células huéspedes se puede recuperar
convenientemente a partir del medio de cultivo mediante
procedimientos bien conocidos, incluyendo la separación de las
células del medio mediante centrifugado o filtración, y la
precipitación de componentes proteínicos del medio mediante una sal
tal como sulfato de amonio, seguida por el uso de procedimientos
cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico,
la cromatografía de afinidad, o similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes de
\alpha-amilasa de esta invención poseen
propiedades valiosas teniendo en cuenta diferentes aplicaciones
industriales. En particular las variantes enzimáticas encuentran
aplicaciones potenciales como componentes para composiciones para
el lavado de la ropa, para el lavado de la vajilla y para
detergentes de limpieza de superficie duras, pero también pueden ser
útiles en la producción de edulcorantes y etanol a partir de
almidón y para el desencolado textil. Las condiciones para los
procesos de conversión de almidón convencionales y/o los procesos
de sacarificación y licuefacción se describen por ejemplo en la
patente estadounidense No: 3.912.590 y las publicaciones de patentes
EP Nos. 252.730 y 63.909.
Producción de edulcorantes a partir de
almidón: un proceso "tradicional" para la conversión de
almidón en jarabes de fructosa consiste normalmente en tres
procesos enzimáticos consecutivos, es decir, un proceso de
licuefacción seguido de un proceso de sacarificación y un proceso
de isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón se
degrada a dextrinas mediante una \alpha-amilasa
(p. ej. Termamyl^{TM}) a valores de pH entre 5.5 y 6.2 y a
temperaturas de 95-160ºC durante un periodo de
aprox. 2 h. Con el fin de asegurar una estabilidad óptima de la
enzima bajo estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de
iones libres de calcio).
Después del proceso de licuefacción las
dextrinas se convierten en dextrosa mediante la adición de una
glucoamilasa (p. ej. AMG^{TM}) y una enzima desramificante, tal
como una isoamilasa o una pululanasa (p. ej. Promozyme^{TM})
Antes de esta fase se reduce el pH a un valor por debajo de 4.5,
manteniendo la temperatura alta (por encima de 95ºC), y se
desnaturaliza la actividad \alpha-amilasa
licuefactante. La temperatura se baja a 60ºC, y se añaden la
glucoamilasa y la enzima desramificante. El proceso de
sacarificación procede durante 24-72 horas.
Después del proceso de sacarificación el pH se
aumenta a un valor en el rango de 6-8,
preferiblemente a pH 7.5, y el calcio se retira mediante un
intercambio iónico. El jarabe de dextrosa se convierte después en
jarabe rico en fructosa usando, p. ej., una glucosaisomerasa
inmovilizada (tal como Sweetzyme^{TM}).
Se podrían obtener al menos 3 mejoras
enzimáticas de este proceso. Cada una de las tres mejoras se
podrían ver como beneficios a nivel individual, pero se puede
emplear cualquier combinación (p. ej. 1+2, 1+3, 2+3 o 1+2+3):
\vskip1.000000\baselineskip
Mejora
1
Se requiere la adición de calcio libre para
asegurar adecuadamente una alta estabilidad de la
\alpha-amilasa, pero el calcio libre inhibe
fuertemente la actividad de la glucosaisomerasa y hace falta
eliminarlo, por medio de una operación única cara, llegando hasta
un punto que reduce el nivel de calcio libre por debajo de
3-5 ppm. Se podrían obtener ahorros sobre el coste
si se pudiera evitar tal operación y el proceso de licuefacción se
podría realizar sin añadir iones calcio libre.
Para conseguir esto, se requiere una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl menos dependiente
de calcio que sea estable y muy activa en concentraciones bajas de
calcio libre (< 40 ppm). Tal \alpha-amilasa de
tipo Termamyl debería tener un pH óptimo a un pH en el rango de
4.5-6.5, preferiblemente en el rango de
4.5-5.5.
\vskip1.000000\baselineskip
Mejora
2
El grado de formación de productos de Maillard
indeseados durante el proceso de licuefacción depende del pH. Un pH
bajo favorece una formación reducida de productos de Maillard. De
este modo sería deseable poder reducir el pH del proceso de un pH
de aproximadamente 6.0 a un valor de pH de aproximadamente 4.5;
desafortunadamente, lo que es comúnmente sabido, las
\alpha-amilasas de tipo Termamyl termoestables no
son muy estables a pH bajo (es decir a pH < 6.0) y su actividad
específica es generalmente baja.
Lograr los objetivos mencionados arriba requiere
una \alpha-amilasa de tipo termamyl que sea
estable a pH bajo en el rango de 4.5-5.5 y en
concentraciones de calcio libre en el rango de 0-40
ppm, y que mantenga una actividad específica alta.
\vskip1.000000\baselineskip
Mejora
3
Se ha expuesto previamente (patente US
5.234.823) que sacarificando con glucoamilasa de A. niger y,
pululanasa de B. acidopullulyticus, la presencia de
actividad \alpha-amilasa residual del proceso de
licuefacción puede llevar a rendimientos más bajos de la dextrosa
si la \alpha-amilasa no se inactiva antes de la
fase de sacarificación. Esta inactivación se puede efectuar
normalmente ajustando el pH por debajo de 4.3 a 95ºC, antes de
reducir la temperatura a 60ºC para la sacarificación.
La razón de este efecto negativo en el
rendimiento de la dextrosa no se entiende completamente, pero se
asume que la \alpha-amilasa licuefactante (por
ejemplo Termamyl^{TM} 120 L de B. licheniformis) genera
"dextrinas límite" (las cuales son sustratos pobres para la
pululanasa de B. acidopullulyticus) mediante la
hidrolización de los enlaces
1,4-alfa-glucosídicos situados cerca
y en ambos lados de los puntos de ramificación en la amilopectina.
La hidrólisis de estas dextrinas límite mediante la glucoamilasa
lleva a un aumento del trisacárido panosa, el cual sólo se
hidroliza lentamente mediante la glucoamilasa.
El desarrollo de una
\alpha-amilasa termoestable que no padezca de esta
desventaja sería una mejora significante del proceso, en tanto en
cuanto no se requeriría la fase de inactivación separada.
Si se desarrolla una
\alpha-amilasa de tipo Termamyl estable a pH bajo,
una alteración de la especificidad podría ser una ventaja necesaria
en combinación con una estabilidad aumentada a pH bajo.
La metodología y los principios de la presente
invención hacen posible diseñar y producir variantes según la
invención que tengan las propiedades requeridas según se describe
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la invención, la
\alpha-amilasa puede ser normalmente un componente
de una composición de detergente. Como tal, se puede incluir en la
composición de detergente en forma de un granulado no polvoriento,
en un líquido estabilizado, o en una enzima protegida. Los
granulados no polvorientos se pueden producir, p. ej. como se
describe en US 4.106.991 y 4.661.452 (ambas de Novo Industri A/S) y
opcionalmente se pueden revestir mediante métodos conocidos en la
técnica. Son ejemplos de materiales de revestimiento ceroso los
productos de poli(etileno óxido) (polietilenglicol, PEG) con
pesos molares medios de 1000 a 20000, nonilfenoles etoxilados con
entre 16 y 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes etoxilados
grasos donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en
el cual hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes
grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos
grasos. Se dan ejemplos de materiales de revestimiento filmógeno
adecuados para su aplicación mediante técnicas de lecho fluidizado
en la patente GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas se
pueden, por ejemplo, estabilizar añadiendo un poliol tal como
propilenoglicol, azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido
bórico conforme a métodos establecidos. Otros estabilizadores
enzimáticos se conocen bien en la técnica. Las enzimas protegidas
se pueden preparar según el método descrito en EP 238.216.
La composición de detergente de la invención
puede estar en cualquier forma conveniente, p. ej. de polvo,
gránulos, pasta o líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso,
conteniendo normalmente hasta un 70% de agua y un
0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.
La composición de detergente comprende uno o más
surfactantes, cada uno de los cuales puede ser aniónico, no iónico,
catiónico, o zwitteriónico. El detergente normalmente contendrá un
0-50% de surfactante aniónico tal como
alquilbencenosulfonato lineal (LAS),
alfa-olefinsulfonato (AOS), alquil sulfato (sulfato
de alcohol graso) (AS), etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES), alcano
sulfonatos secundarios (SAS), ésteres metílicos de ácido
alfa-sulfo graso, ácido alquil o alquenilsuccínico
o jabón. También puede contener un 0-40% de
surfactante no iónico tal como alcohol etoxilato (AEO o AE),
etoxilatos de alcohol carboxilado, etoxilato de nonilfenol,
alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida
de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, o
polihidroxi alquil amida de ácido graso (p. ej. como se describe en
WO 92/06154).
La composición de detergente puede comprender
adicionalmente otra u otras enzimas, tales como lipasa, cutinasa,
proteasa, celulasa, peroxidasa, p. ej., lacasa.
El detergente puede contener un
1-65% de un constructor de detergente o agente
complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato,
citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido
etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido
dietilenotriaminopentaacético (DTMPA), ácido alquil- o
alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicato estratificado (p.
ej. SKS-6 de Hoechst). El detergente también puede
estar no-construido, es decir esencialmente libre de
constructor de detergente.
El detergente puede comprender uno o más
polímeros. Son ejemplos la carboximetilcelulosa (CMC), la
poli(vinilpirrolidona) (PVP), el polietilenoglicol (PEG), el
alcohol poli(vinílico) (PVA), policarboxilatos tales como
poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros
de lauril metacrilato/ácido acrílico.
El detergente puede contener un sistema
blanqueante que puede comprender una fuente de H_{2}O_{2} tal
como perborato o percarbonato la cual se puede combinar con un
activador blanqueante formador de perácido tal como la
tetraacetiletilenodiamina (TAED) o el
nonanoiloxibenceno-sulfonato (NOBS). De forma
alternativa, el sistema blanqueante puede comprender ácidos de
peróxido de p. ej. la amida, la imida, o de tipo sulfona.
Las enzimas de la composición de detergente de
la invención se pueden estabilizar usando agentes estabilizantes
convencionales, p. ej. un poliol tal como propilenoglicol o
glicerol, azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o
un derivado de ácido bórico como p. ej. un éster de borato
aromático, y la composición se puede formular según se describe en
p. ej. WO 92/19709 y WO 92/19708.
El detergente también puede contener otros
ingredientes de detergentes convencionales tales como p. ej.
acondicionadores de tela incluyendo las arcillas, reforzadores de
espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de
supensión de suciedad, agentes de reposición antisuciedad, tintes,
bactericidas, blanqueadores ópticos, o
perfumes.
perfumes.
\newpage
El pH (medido en solución acuosa en la
concentración de uso) será normalmente neutro o alcalino, p. ej.
7-11.
Las formas particulares de composiciones de
detergente dentro del campo de la invención incluyen:
1) Una composición de detergente formulada en
forma de granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
2) Una composición de detergente
formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al
menos 600 g/l que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
3) Una composición de detergente
formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al
menos 600 g/l que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4) Una composición de detergente
formulada como un granulado con una densidad en masa de al menos
600 g/l que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5) Una composición de detergente
líquida acuosa que
comprende
\newpage
6) Una composición de detergente
líquida acuosa estructurada que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
7) Una composición de detergente
formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al
menos 600 g/l que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
8) Una composición de detergente
formulada en forma de granulado que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
9) Una composición de detergente
formulada en forma de granulado que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
10) Una composición de detergente
líquida acuosa que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
11) Una composición de detergente
líquida acuosa que
comprende
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
12) Una composición de detergente
formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al
menos 600 g/l que
comprende
13) Formulaciones detergentes según
se describe en 1) - 12) donde todo o parte del
alquilbencenosulfonato lineal se sustituye por
(C_{12}-C_{18}) sulfato de
alquilo.
\newpage
14) Una composición de detergente formulada en
forma de granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que
comprende
15) Una composición de detergente
formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al
menos 600 g/l que
comprende
16) Formulaciones detergentes según
se describe en 1) - 15) las cuales contienen un perácido
estabilizado o encapsulado, bien como un componente adicional o
como un sustituto para los sistemas blanqueantes ya
especificados.
17) Composiciones de detergente según se
describe en 1), 3), 7), 9) y 12) donde el perborato se sustituye
por percarbonato.
18) Composiciones de detergente según se
describe en 1), 3), 7), 9), 12), 14) y 15) las cuales contienen
adicionalmente un catalizador de manganeso. El catalizador de
manganeso puede ser, p. ej., uno de los compuestos descritos en,
"Efficient manganese catalysts for
low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp.
637-639.
19) Composición de detergente formulada en forma
de líquido detergente no acuoso que comprende un líquido no iónico
surfactante tal como, p. ej., alcohol primario lineal alcoxilado,
un sistema constructor (p. ej. fosfato), enzima y alcali. El
detergente también puede comprender un surfactante aniónico y/o un
sistema blanqueador.
La variante de \alpha-amilasa
de la invención se puede incorporar en concentraciones
convencionalmente empleadas en detergentes. Se contempla
actualmente que, en la composición de detergente de la invención, la
\alpha-amilasa se puede añadir en una cantidad
correspondiente a 0,00001-1 mg (calculada como
proteína enzimática pura) de \alpha-amilasa por
litro de solución de lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
La composición de detergente para el lavado de
la vajilla comprende un surfactante que puede ser aniónico, no
iónico, catiónico, anfotérico o una mezcla de estos tipos. El
detergente contendrá un 0-90% de surfactante no
iónico tal como los alcoholes de cadena lineal propoxilados
etoxilados poco o nada espumantes.
La composición de detergente puede contener
sales constructoras de detergente de tipo orgánico y/o inorgánico.
Los constructores de detergente se pueden subdividir en los tipos
de los que contienen fósforo y los que no contienen fósforo. La
composición de detergente contiene normalmente un
1-90% de constructores de detergente.
Ejemplos de constructores de detergente
alcalinos inorgánicos con fósforo, en caso de haberlos, incluyen
las sales hidrosolubles en especial los pirofosfatos de metal
alcalino, ortofosfatos, y polifosfatos. Un ejemplo de constructor de
detergente orgánico alcalino con fósforo, en caso de haberlo,
incluye las sales hidrosolubles de fosfonatos. Ejemplos de
constructores inorgánicos sin fósforo, en caso de haberlos,
incluyen carbonatos de metal alcalino hidrosolubles, boratos y
silicatos así como los diferentes tipos de silicatos de alumino
insolubles en agua cristalinos o amorfos de los cuales son las
zeolitas las más representativas.
Ejemplos de constructores orgánicos adecuados
incluyen el metal alcalino, el amonio y amonio sustituido, los
citratos, los succinatos, los malonatos, los sulfonatos de ácido
graso, los carboximetoxi succinatos, los poliacetatos de amonio,
los carboxilatos, los policarboxilatos, los aminopolicarboxilatos,
los poliacetil carboxilatos, y los polihidroxsulfonatos.
Otros constructores orgánicos adecuados incluyen
los polímeros de mayor peso molecular y los copolímeros sobre los
que se sabe tienen propiedades constructoras, por ejemplo un ácido
poliacrílico apropiado, copolímeros de ácido polimaléico y
poliacrílico/polimaléico y sus sales.
La composición de detergente para el lavado de
la vajilla puede contener agentes blanqueadores del tipo de la
clorina/bromina o del tipo del oxígeno. Ejemplos de blanqueadores
inorgánicos de tipo clorina/bromina son el litio, el hipoclorito y
el hipobromito de sodio o de calcio así como el fosfato de trisodio
clorurado. Ejemplos de blanqueadores orgánicos de tipo
clorina/bromina son las imidas de N-bromo y
N-cloro heterocíclicas tales como los ácidos
ticloroisocianúrico, tribromoisocianúrico, dibromoisocianúrico y
dicloroisocianúrico, y las sales derivadas de los mismos con
cationes solubilizantes en agua tales como el potasio y el sodio.
Los compuestos de hidantoina también son apropiados.
Los blanqueadores de oxígeno se prefieren, por
ejemplo en forma de una persal inorgánica, preferiblemente con un
precursor blanqueador o en forma de compuesto de ácido de peróxido.
Son ejemplos típicos de compuestos blanqueadores de peróxido
adecuados los perboratos de metal alcalino, ambos tetrahidratos y
monohidratos, los percarbonatos de metal alcalino, los persilicatos
y los perfosfatos. Los materiales activadores preferidos son la TAED
y el triacetato de glicerol.
La composición de detergente para el lavado de
la vajilla de la invención se puede estabilizar usando agentes
estabilizantes convencionales para la(s) enzima(s),
p. ej. un poliol tal como p. ej. propilenglicol, azúcar o un alcohol
de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido
bórico, p. ej. un éster de borato aromático.
La composición de detergente para el lavado de
la vajilla de la invención también puede contener otros
ingredientes de detergente convencionales, p. ej. material
defloculante, material de relleno, depresores de espuma, agentes
anticorrosivos, agentes de supensión de suciedad, agentes
secuestrantes, agentes de reposición antisuciedad, agentes
deshidratadores, tintes, bactericidas, fluorescentes, espesantes y
perfumes.
Finalmente, la variante de
\alpha-amilasa de la invención se puede usar en
detergentes convencionales para el lavado de la vajilla, p. ej. en
cualquiera de los detergentes descritos en cualquiera de las
publicaciones de patentes siguientes: EP 518719; EP 518720; EP
518721; EP 516553; EP 516554; EP 516555; GB 2200132; DE 3741617; DE
3727911; DE 4212166; DE 4137470; DE 3833047; WO 93/17089; DE
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EP 414197; US
5240632.
5240632.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La homología global de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis (en lo
sucesivo referida como TERM) con otras
\alpha-amilasas de tipo Termamyl es alta y la
similitud del porcentaje es extremadamente alta. La similitud
calculada entre TERM y BSG (la \alpha-amilasa de
B. stearothermophilus con la SEC ID No: 6), y BAN (la
\alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens con
la SEC ID No: 4) usando el programa GCG del University of Wisconsin
Genetics Computer Group resultó en un 89% y un 78%,
respectivamente. TERM tiene una deleción de 2 residuos entre el
residuo G180 y el K181 en comparación con BAN y BSG. BSG tiene una
deleción de 3 residuos entre el G371 y el I372 en comparación con
BAN y TERM. Además BSG tiene una extensión
C-terminal de más de 20 residuos en comparación con
BAN y TERM. BAN tiene 2 residuos menos y TERM tiene un residuo
menos en el N-terminal en comparación con BSG.
La estructura de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis (TERM) y
de la de B. amyloliquefaciens (BAN), respectivamente, se
modeló en la estructura descrita en el Apéndice 1 aquí. La
estructura de otras \alpha-amilasas de tipo
Termamyl (p. ej. las descritas aquí) se puede construir de forma
análoga.
En comparación con la
\alpha-amilasa usada para dilucidar la presente
estructura, TERM difiere en que le faltan dos residuos más o menos
entre 178-182. Con el fin de compensar ésto en la
estructura modelo, se usó el programa HOMOLOGY de BIOSYM para
sustituir los residuos en posiciones equivalentes en la estructura
(no sólo regiones estructuralmente conservadas) salvo por el punto
de deleción. Se estableció un enlace peptidico entre G17 (G177) y
K180(K180) en TERM(BAN). La estrecha relación
estructural entre la estructura resuelta y la estructura modelo (y
de este modo la validez de la última) está indicada mediante la
presencia de tan sólo muy pocos átomos encontrados demasiado juntos
en el modelo.
A esta estructura muy irregular de TERM se le
añadieron después todas las aguas (605) e iones (4 de calcio y 1 de
sodio) de la estructura resuelta (Apéndice 1) en las mismas
coordenadas que para dicha estructura resuelta usando el programa
INSIGHT. Esto se podría hacer con tan sólo pocas superposiciones, en
otras palabras con un pequeño ajuste. Después se minimizó esta
estructura modelo usando 200 fases de
Steepest-Descent y 600 fases de gradiente conjugado
(véase Brooks et al 1983, J. Computational Chemistry 4,
págs.187-217). La estructura minimizada se sometió
después a dinámica molecular, 5 ps de calentamiento seguido de un
máximo de 200 ps pero más de 35 ps de equilibrado. La dinámica
según funciona con el algoritmo de Verlet y la temperatura de
equilibrado de 300 K se mantuvieron usando el acoplamiento
Behrendsen en un baño maría (Berendsen et. al., 1984, J.
Chemical Physics 81, p. 3684-3690). Se eliminaron
las rotaciones y traducciones a cada picosegundo. La energía
potencial se volvió estable después de aprox. 35 ps de equilibrado.
Se extrajo una estructura de dinámica media y se pudo usar para
análisis
adicionales.
adicionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Las coordenadas del Apéndice 1 se leen en el
programa INSIGHT proporcionado por BIOSYM Technologies. Las
coordenadas espaciales se presentan mostrando los enlaces entre los
átomos. Se presentan los iones así como los átomos de agua. La
parte del paquete de programas del subconjunto de creación se usa
para crear un subconjunto de 10 \ring{A} alrededor de los iones de
calcio y de sodio en la estructura usando el comando ZONE. Todos
los residuos que tienen un átomo dentro de 10 \ring{A} se
compilan y se introducen bajo el comando LIST MOLECULE. Asignándoles
a los iones el nombre de ium en el fichero de coordenadas se
compila un esfera de 10 \ring{A} alrededor de todos los átomos
denominados ium. Los residuos específicos identificados de esta
manera se tratan también arriba en la sección titulada
"Dependencia de Ca^{2+}".
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La estructura resuelta muestra muchos agujeros
internos y cavidades. A la hora de analizar este tipo de cavidades
se usa normalmente el programa Connolly (Lee, B. and Richards, F.M.
(1971) J. Mol. Biol. 55,p. 379-400). El programa usa
una sonda con radio para buscar la superficie externa e interna de
la proteína. El agujero más pequeño que se puede observar de esta
manera tiene el radio de la sonda.
Para analizar la estructura resuelta se usó una
versión modificada del programa Connolly incluida en el programa de
INSIGHT. En primer lugar se eliminaron las moléculas de agua y los
iones desfusionando estos átomos de la estructura resuelta. Usando
el comando MOLECULE SURFACE SOLVENT se calculó el área de
superficie accesible del solvente para todos los átomos y residuos
usando un radio de sonda de 1.4 \ring{A}, y se visualizó en la
pantalla de gráficos junto con el modelo de la estructura resuelta.
Las cavidades internas se vieron entonces como superficies de
puntos sin conexiones con la superficie externa.
Se sugieren mutantes para rellenar los agujeros
en la especificación (en la sección titulada "Variantes con
termoestabilidad aumentada y/o temperatura óptima alterada").
Usando las estructuras de construcción de homología y/o las
mutaciones de alineamiento de secuencia para las estructuras
homólogas de TERM y se pueden hacer BSG y BAN.
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Ejemplo
4
Termamyl (SEC ID No: 2) se expresa en B.
subtilis a partir de un plásmido denominado pDN1528. Este
plásmido contiene el gen completo que codifica Termamyl,
amyL, cuya expresión dirige su propio promotor. Además, el
plásmido contiene el origen de replicación, ori, del
plásmido pUB110 y el gen cat del plásmido pC194 que confiere
resistencia al cloranfenicol, pDN1528 se muestra en la Fig. 9.
Se preparó un vector de mutagénesis específico
que contiene una parte más importante de la región codificante de
la SEC ID No: 1. La característica importante de este vector,
denominado pJeEN1, incluye un origen de replicación derivado de los
plásmidos pUC, el gen cat que confiere resistencia al cloranfenicol,
y una versión con desplazamiento del marco de lectura del gen
bla, el tipo salvaje del cual normalmente confiere
resistencia a la ampicilina (fenotipo amp^{R}). Esta versión
mutada resulta en un fenotipo amp^{S}. El plásmido pJeEN1 se
muestra en la Fig. 10, y el origen de replicación de E.
coli, ori, bla, cat, la versión truncada en 5' del gen
de amilasa Termamyl, y los sitios de restricción seleccionados se
indican en el plásmido.
Las mutaciones se introducen en amyL
mediante el método descrito por Deng y Nickoloff (1992, Anal.
Biochem. 200, págs. 81-88) a excepción de que los
plásmidos con el "cebador de selección" (cebador #6616; véase
abajo) incorporados se seleccionan con base en el fenotipo
amp^{R} de las células de E. coli transformadas que
contienen un plásmido con un gen bla reparado, en lugar de
utilzar la selección en la digestión de la enzima de restricción
descrita por Deng y Nickoloff. Los productos químicos y enzimas
usados para la mutagénesis se obtuvieron del equipo de mutagénesis
Chameleon^{TM} de Stratagene (número de fabricación 200509).
Después de la versificación de la secuencia de
ADN en los plásmidos variantes, el gen truncado, el cual contiene
la alteración deseada, se subclona en pDN1528 como un fragmento de
PstI-EcoRI y se transforma en una cepa de
Bacillus subtilis baja en proteasas y amilasas con el fin de
expresar la enzima variante.
La variante de termamyl V54W se construyó usando
el siguiente cebador de mutagénesis (escrito como 5' a 3',
izquierda a derecha):
PG GTC GTA GGC
ACC GTA GCC CCA ATC CGC
TTG
La variante de termamyl A52W + V54W se construyó
usando el siguiente cebador de mutagénesis (escrito como 5' a 3',
izquierda a derecha):
PG GTC GTA GGC
ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT
CG
Cebador #6616 (escrito 5' a 3', izquierda a
derecha; P simboliza un fosfato 5'):
P CTG TGA CTG GTG ACT ACT CAA CCA
AGT
C
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Dos variantes de Termamyl apropiadas con
especificidad alterada se evaluaron mediante la sacarificación de
un sustrato de maltodextrina DE 10 (DE = equivalente de dextrosa)
con la glucoamilasa de A. niger y la pululanasa de B.
acidopulluliticus bajo condiciones en las que la variante
amilasa estaba activa.
Sacarificación: los sustratos para la
sacarificación se prepararon disolviendo 230 g de maltodextrina
desecada atomizada DE 10, preparada a partir de almidón de maíz
común, en 460 ml de agua desionizada en ebullición y ajustando el
contenido de sustancia seca (DS) a aproximadamente un 30% p/p. El
pH se ajustó a 4.7 (medido a 60ºC) y las partes alícuotas del
sustrato correspondientes a 15 g de peso en seco se transfirieron a
matraces de vidrio de tapón azul de 50 ml.
Los matraces se colocaron después en un baño
maría con agitación equilibrado a 60ºC, y se añadieron las enzimas.
El pH se readjustó a 4.7 cuando fue necesario.
Se usaron las siguientes enzimas:
- Glucoamilasa:
- AMG^{TM} (Novo Nordisk A/S); dosificación 0,18 Ag/g DS
- Pululanasa:
- Promozyme^{TM} (Novo Nordisk A/S); dosificación 0,06 PUN/g DS
- \alpha-Amilasas:
- Termamyl^{TM} (novo Nordisk A/S); dosificación 60 NU/g DS
- \quad
- variante de Termamyl V54W; dosificación 60 NU/g DS
- \quad
- variante de Termamyl V54W + A52W; dosificación 60 NU/g DS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras de 2 ml periódicamente. El
pH de cada muestra se ajustó a aproximadamente 3.0, y la muestra se
calentó después en un baño maría a ebullición durante 15 minutos
para inactivar las enzimas. Tras el enfriamiento, las muestras se
trataron con aproximadamente 0,1 g de resina de intercambio iónico
en lecho mezclado (BIO-Rad 501-X
(D)) durante 30 minutos en un mezclador giratorio y después se
filtraron. La composición de carbohidratos de cada muestra se
determinó mediante HPLC. Los siguientes resultados se obtuvieron
después de 72 horas [DP_{n} simboliza un oligómero de dextrosa
(D-glucosa) con n unidades de glucosa]:
Se puede ver en los resultados de arriba que en
comparación con el control (ninguna actividad
\alpha-amilasa presente durante la licuefacción),
la presencia de actividad \alpha-amilasa de las
variantes V54W y V54W + A52W no condujo a niveles elevados de
panosa (DP_{3}). Por el contrario, la actividad de la
\alpha-amilasa Termamyl resultó en niveles más
altos de panosa y en una pérdida posterior del rendimiento de la
D-glucosa (DP_{1}).
Así, si las variantes de
\alpha-amilasa V54W o V54W + A52W se usan para la
licuefacción de almidón, no será necesario inactivar la actividad
\alpha-amilasa residual antes del inicio de la
sacarificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El despliegue de amilasas mediante la exposición
a una fuente de calor o a desnaturalizantes tales como el
hidrocloruro de guanidina está acompañado de una reducción de la
fluorescencia. La pérdida de iones de calcio conduce a un
despliegue, y la afinidad de las \alpha-amilasas
con el calcio se puede medir mediante mediciones de fluorescencia
antes y después de la incubación de cada
\alpha-amilasa (p. ej. a una concentración de 10
\mug/ml) en un regulador (p. ej. 50 mM HEPES, pH 7) con
diferentes concentraciones de calcio (p. ej. en el rango de 1
\alphaM-100 mM) o de EGTA (p. ej. en el rango de
1-1000 \muM) [EGTA = ácido
1,2-di(2-aminoetoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético]
durante un periodo de tiempo suficientemente largo (tal como 22
horas a 55ºC).
La fluorescencia medida F está compuesta
por contribuciones a partir de las formas plegadas y desplegadas de
la enzima. La siguiente ecuación se puede derivar para describir la
dependencia de F en una concentración de calcio ([Ca]):
donde \alpha_{N} es la
fluorescencia de la forma (plegada) nativa de la enzima,
\beta_{N} es la dependencia lineal de \alpha_{N} en el
logaritmo de la concentración de calcio (según se ha observado
experimentalmente), \alpha_{\cup} es la fluorescencia de la
forma desplegada y \beta_{\cup} es la dependencia lineal de
\alpha_{\cup} en el logaritmo de la concentración de calcio.
K_{diss} es la constante de unión de calcio aparente para un
proceso de equilibrio como
sigue:
N-Ca \hskip1cm
\underleftrightarrow{k_{diss}} \hskip1cm U + Ca (N = enzima\
nativa;\ U = enzima\
desplegada)
De hecho, el despliegue procede de forma
extremadamente lenta y es irreversible. El promedio del despliegue
depende de la concentración de calcio, y la dependencia para una
\alpha-amilasa dada proporciona una medida de la
afinidad de unión de Ca de la enzima. Definiendo un conjunto
estándar de condiciones de reacción (p. ej. 22 horas a 55ºC), se
puede hacer una comparación significativa de K_{diss} para las
diferentes \alpha-amilasas. Las curvas de
disociación del calcio para las \alpha-amilasas
en general se pueden ajustar a la ecuación de arriba, permitiendo
determinar los valores correspondientes de K_{diss}.
Los siguientes valores para K_{diss} se
obtuvieron para una \alpha-amilasa parental de
tipo Termamyl que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID No: 1 de WO 95/26397 y para la variante de la misma indicada
según la invención:
Es evidente según lo anterior que la afinidad de
unión de calcio de la variante en cuestión se enlaza con el calcio
significativamente más fuerte que la parental, y de ese modo tiene
una dependencia de calcio correspondientemente menor que la
parental.
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Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad por eventuales errores u
omisiones.
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En las siguientes SEC ID Nos: 1, 3,
5 se ilustra la secuencia codificante 5' y la secuencia 3' de los
genes de \alpha-amilasa pertinentes. La secuencia
5' es la primera parte separada de la secuencia escrita en letras
minúsculas, la secuencia codificante es la parte intermedia de la
secuencia, en la cual la secuencia señal está escrita en letras
minúsculas y la secuencia que codifica la
\alpha-amilasa madura está escrita en letras
mayúsculas, y la secuencia 3' es la tercera parte separada de la
secuencia escrita en letras
minúsculas.
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SEC ID No. 1
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SEC ID NO. 2
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SEC ID No. 3
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\newpage
SEC ID No. 4
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SEC ID No. 5
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SEC ID No. 6
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\newpage
SEC ID No. 10
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Claims (13)
1. Método para producir una variante de una
alfa-amilasa parental que tenga una dependencia de
ion calcio disminuida en relación con la parental, donde la
alfa-amilasa parental tenga la secuencia de las SEC
ID Nos: 2, 4, o 6, o tenga una secuencia con al menos un 60% de
identidad con dicha secuencia, comprendiendo dicho método
- (a)
- modelar la alfa-amilasa parental en la estructura tridimensional representada en el Apéndice para producir una estructura tridimensional de la alfa-amilasa parental;
- (b)
- identificar en la estructura tridimensional obtenida en la fase (a) al menos una parte estructural de la parental donde se prevea que una alteración en dicha parte estructural resulte en dicha dependencia de ion calcio disminuida;
- (c)
- modificar la secuencia de un ácido nucleico que codifica la alfa-amilasa parental para producir un ácido nucleico que codifique una deleción, inserción, o sustitución de uno o más aminoácidos en una posición correspondiente a dicha parte estructural; y
- (d)
- expresar el ácido nucleico modificado en una célula huésped para producir la variante alfa-amilasa,
donde la variante tiene actividad
enzimática alfa-amilasa y tiene dependencia de ion
calcio disminuida en relación con la
parental.
2. Método según la reivindicación 1, donde la
parte estructural se selecciona a partir del grupo que consiste en
el dominio C, la interfaz entre los dominios A y B, la interfaz
entre los dominios A y C, y un sitio de unión de calcio de la
alfa-amilasa parental.
3. Método para construir una variante de una
alfa-amilasa parental que tiene una dependencia de
ion calcio disminuida en relación con la parental, donde la
alfa-amilasa parental tiene la secuencia de las SEC
ID Nos: 2, 4, o 6, o tiene una secuencia con al menos un 60% de
homología con dicha secuencia, comprendiendo dicho método
- (a)
- modelar la alfa-amilasa parental en la estructura tridimensional representada en el Apéndice para producir una estructura tridimensional de la alfa-amilasa parental;
- (b)
- comparar la estructura tridimensional obtenida en la fase (a) con una estructura tridimensional de una alfa-amilasa no relacionada, donde la alfa-amilasa no relacionada difiere de la alfa-amilasa parental en dicha dependencia de ion calcio disminuida;
- (c)
- identificar una parte estructural de la estructura tridimensional obtenida en la fase (a) que sea diferente de la estructura tridimensional de la alfa-amilasa no relacionada y que se prevea como relevante para dicha dependencia de ion calcio disminuida,
- (d)
- modificar la secuencia de un ácido nucleico que codifique la alfa-amilasa parental para producir un ácido nucleico que codifique una deleción, inserción, o sustitución de uno o más aminoácidos en una posición correspondiente a dicha parte estructural; y
- (e)
- expresar el ácido nucleico modificado en una célula huésped para producir la variante alfa-amilasa,
donde la variante tiene actividad
alfa-amilasa y tiene dependencia de ion calcio
disminuida en comparación con la alfa-amilasa
parental.
4. Método según la reivindicación 3, donde, en
la fase (d), la parte estructural de la
alfa-amilasa parental se modifica con el fin de
asemejarse a la parte correspondiente de la
alfa-amilasa no relacionada.
5. Método según la reivindicación 4, donde, en
la fase (d), la modificación es una deleción, sustitución, o
inserción de uno o más residuos de aminoácidos en la
alfa-amilasa parental de modo que la parte
estructural en la variante se corresponde con la parte estructural
en la alfa amilasa no relacionada.
6. Método según la reivindicación 3, donde la
alfa-amilasa no relacionada es una
alfa-amilasa fúngica o una alfa amilasa
mamífera.
7. Método según la reivindicación 6, donde la
alfa-amilasa no relacionada se selecciona a partir
del grupo que consiste en: TAKA alfa-amilasa de
Aspergillus oryzae, alfa-amilasa de A.
niger, alfa-amilasa de Bacillus
subtilis, y alfa-amilasa pancreática
porcina.
8. Método según la reivindicación 3, donde la
alfa-amilasa parental se deriva de una cepa de
Bacillus.
\newpage
9. Método según la reivindicación 8, donde
dicha cepa de Bacillus se selecciona a partir del grupo que
consiste en B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B.
stearothermophilus, y una Bacillus sp alcalofílica.
10. Método según la reivindicación 9, donde la
alfa-amilasa parental se deriva de las cepas de
Bacillus NCIB 12289, NCIB 12512 o NCIB 12513.
11. Método según la reivindicación 3, donde la
parte estructural de la alfa- amilasa parental identificada en la
fase (c) se selecciona a partir del grupo que consiste en los
bucles 1, 2, 3, y 8 de la alfa-amilasa parental.
12. Método para construir una variante de una
alfa-amilasa parental que tiene una dependencia de
ion calcio disminuida de la actividad enzimática o la estabilidad
relativa a la parental, donde la alfa-amilasa
parental tiene la secuencia de la SEC ID Nos: 2, 4, o 6, o tiene
una secuencia con al menos un 60% de homología con dicha secuencia,
comprendiendo dicho método
- (a)
- modelar la alfa-amilasa parental en la estructura tridimensional representada en el Apéndice para producir una estructura tridimensional de la alfa-amilasa parental;
- (b)
- identificar en la estructura obtenida en la fase (a) uno o más residuos de aminoácidos diana dentro de 10 \ring{A} de un sitio de unión de Ca^{2+},
- (c)
- modificar la secuencia de un ácido nucleico que codifica la alfa-amilasa parental para producir un ácido nucleico que codifica una deleción, inserción, o sustitución de uno o más aminoácidos en una posición correspondiente a dicho o dichos residuos diana; y
- (d)
- expresar el ácido nucleico modificado en una célula huésped para producir la variante alfa-amilasa,
donde la variante tiene una
dependencia de ion calcio disminuida de la actividad enzimática o
la estabilidad en comparación con la alfa-amilasa
parental.
13. Método según la reivindicación 12, donde la
alfa amilasa parental tiene la secuencia de la SEC ID No: 2 y el
residuo de aminoácido identificado en la fase (b) se corresponde
con una posición seleccionada del grupo que consiste en: V102,
I103, N104, H105, K106, R125, W155, W157, Y158, H159, F160, D161,
G162, T163, Y175, K176, F177, G178, K180, A181, W182, D183, W184,
E185, V186, S187, N192, Y193, D194, Y195, L196, M197, Y198, A199,
D200, I201, D202, Y203, D204, H205, P206, V208, A209, D231, A232,
V233, K234, H235, I236, K237, F238, F240, L241, A294, A295, S296,
T297, Q298, G299, G300, G301, Y302, D303, M304, R305, K306, L307,
W342, F343, L346, Q393, Y394, Y396, H405, H406, D407, I408, V409,
R413, E414, G415, D416, S417, V419, A420, N421, S422, G423, L424,
1428, T429, D430, G431, P432, V440, G441, R442, Q443, N444, A445,
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