JP5087407B2 - 酸性真菌プロテアーゼ - Google Patents
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Description
本出願は、2004年12月30日出願、名称「酸性真菌プロテアーゼ(Acid Fungal Protease)」なる米国特許仮出願第60/640,399号、および、2005年1月27日出願、名称「酸性真菌プロテアーゼ(Acid Fungal Protease)」なる米国特許仮出願第60/648,233号に対する優先権を主張する。なお、これらの出願の内容の全てを参照することにより本明細書に含める。
「プロテアーゼ」は、微生物、例えば、真菌、細菌、または、植物または動物から得られるタンパクまたはポリペプチドの、タンパクまたはポリペプチドドメインであって、タンパク主鎖の様々な位置の内の一つにおけるペプチド結合の切断を触媒する能力を持つドメインである(例えば、E.C.3.4)。
本発明は、NSPファミリ・プロテアーゼであって、配列番号2のプロテアーゼまたは配列番号10のプロレアーゼ(図6)に対し、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、および少なくとも99%の配列相同性を有するプロテアーゼ、例えば、酸性プロテアーゼ、およびさらに酸性真菌プロテアーゼに関する。ある実施態様では、NSP24ファミリ・プロテアーゼは、配列番号10の配列(成熟タンパク配列)を含むNSP24、あるいは、配列番号2のプレタンパク配列とも表示される。
a)配列番号2または配列番号10に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、および少なくとも99%の配列相同性を持つNSP24ファミリ・プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド;
b)配列番号2の配列をコードするポリヌクレオチド;
c)配列番号8の配列を持つポリヌクレオチド;
d)NSP24ファミリ・プロテアーゼの生物学的活性断片をコードするポリヌクレオチド;
e)配列番号8に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、および少なくとも99%の配列相同性を持つポリヌクレオチド;
f)配列番号4、配列番号8のDNA配列、または、配列番号4または配列番号8の断片に対応する核酸プローブに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、その際、前記断片は、少なくとも10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または150個の連続ヌクレオチドを有し;
g)配列番号4に対して、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、および少なくとも99%の配列相同性を持つNSP25ファミリ・プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド;
h)配列番号9のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド;
i)配列番号4の配列を持つポリヌクレオチド;
j)NSP25ファミリ・プロテアーゼの生物学的活性断片をコードするポリヌクレオチド;
k)配列番号7の配列、およびその生物学的活性断片をコードするポリヌクレオチド;および、
l)配列番号3または配列番号5の配列を持つポリヌクレオチド。
ある実施態様では、本発明は、本明細書に記載されるDNA構築体およびベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。ある実施態様では、本発明によってカバーされるプロテアーゼ(例えば、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するNSP24ファミリ・プロテアーゼ)をコードするポリヌクレオチドであって、宿主細胞中に導入されるポリヌクレオチドは、異種プロテアーゼをコードし、別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞において過剰発現される内因性プロテアーゼをコードする。ある実施態様では、本発明は、宿主細胞、例えば、細菌および真菌宿主細胞において機能する遺伝子プロモーターの制御下における、異種プロテアーゼ遺伝子の発現、またはプロテアーゼ遺伝子の過剰発現を提供する。
本発明は、組み換え遺伝子工学の分野における通例技術に依存する。本発明に使用される一般的方法を開示する基本的教科書としては、サムブルック(Sambrook)等の「分子クローニング、実験室マニュアル(“Molecular Cloning,A Laboratory Manual”)」第2版、1989年;クリーグラー(Kriegler)、「遺伝子の転送と発現、実験室マニュアル(“Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual”)」、および、アウスウーベル(Ausubel)等、「分子生物学における最新プロトコール(“Current Protocols in Molecular Biology”)」(1994)が挙げられる。
本発明のタンパクは、ベクター、例えば、その発現が遺伝子プロモーター配列によって制御される遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換された細胞を培養することによって生産される。本発明は、タンパク、例えば、本発明によってカバーされるプロテアーゼの細胞内および/または細胞外生産を強化するのに特に有用である。前記遺伝子の発現にとって好適な条件とは、本発明の、誘導飼料組成物を培養物に供給することを含む。タンパク生産のための最適条件は、宿主細胞の選択、および、発現されるプロテアーゼタンパクの選択と共に変動する。そのような条件は、当業者であれば、通例の実験または最適化によって簡単に確認される。
宿主細胞および形質転換細胞は、通常の栄養媒体中で培養することが可能である。形質転換された宿主細胞用の培養媒体は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択するために適当に修飾してもよい。特異的培養条件、例えば、温度、pH等は、発現のために選択された宿主細胞のために使用されるものであってよく、当業者には明白である。さらに、好ましい培養条件は、科学的文献、例えば、サムブルック(1982)上記;キーサー・ティー、エムジェイ・ビブ、エムジェイ・バットナー、ケーエフ・チェイター、およびディーエー・ホップウッド(Kieser,T,MJ.Bibb,MJ.Buttner,KF.Chater,and D.A.Hopwood)(2000)「ストレプトミセス遺伝学実技(“PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS”)」John Innes Foundation,Norwich、英国;ハーウッド(Harwood)等(1990)「バチルスのための分子生物学的方法(“MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS”)」、John Wiley、および/または、米国基準株保存機関(ATCC;www.atcc.org)に見出すことが可能である。真菌宿主細胞、例えば、Trichoderma細胞中の、安定な形質転換細胞は、それらがより急速な成長速度を持つこと、または、固相の培地において、ギザギザではなく、滑らかな輪郭を持つ円形コロニーを形成することによって、不安定な形質転換細胞とは一般的に区別される。
形質転換宿主細胞によって生産される、本発明によってカバーされるポリペプチド、例えば、配列番号10に対し少なくとも80%の配列同一性を持つポリペプチドは、通例の過程、例えば、遠心またはろ過によって、培養液から宿主細胞を分離すること、または、要すれば、細胞を破壊して、細胞分画と残留物から上清を取り出すことを含む過程によって、培養液から回収してもよい。ある場合には、澄明化後、上清またはろ液のタンパク様成分を、塩、例えば、硫酸アンモニウムを用いて沈殿させる。次に、この沈殿したタンパクを可溶化し、各種クロマトグラフィー手法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびその他の従来技術で認知済みの手法によって精製してよい。ペプチドおよびタンパクに対する抗体は、動物、例えば、ウサギまたはマウスを免疫化し、従来法によって抗NSP24プロテアーゼ抗体を回収することによって製造される。
ある実施態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明のプロテアーゼを含む組成物を指向する。本発明による組成物および応用において有用なプロテアーゼの、ある非限定的例としては、例えば、NSP24ファミリ・プロテアーゼまたはNSP25ファミリ・プロテアーゼ、さらに詳細には、配列番号2に対して少なくとも85%の配列同一性を持つNSP24ファミリ・プロテアーゼ、または、その生物学的に活性な断片、例えば、配列番号10に対して少なくとも90%の配列同一性を持つプロテアーゼが挙げられる。ある実施態様では、この酵素組成物は、単一酵素成分プロテアーゼ組成物である。ある実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼを産業および商業用途に用いる方法を指向する。組成物および産業用途に関する下記の説明は、例示的であって、非内包的であることが意図される。
本明細書に記載される酵素は、植物材料、例えば、コーン、小麦、モロコシ、大豆、カノーラ油、ひまわり油、または、上記植物材料の内の任意の複数の混合物、または、ニワトリ、ブタ、反芻動物、水産養殖、およびペット用の植物タンパク供給源を含んでもよい。性能パラメータ、例えば、成長、飼料摂取、および飼料効率ばかりでなく、均一性の改善、動物舎におけるアンモニア濃度の低下、およびその結果として得られる、動物の福祉と健康状態の改善ももたらされることが考慮される。
食物タンパクの加水分解産物は、市場において、小さいが、重要な部分を占める。この調製品は、術後患者、または、消化系が損なわれた個人のために使用される。加水分解産物は、それ自体比較的未精製の調製品として与えられる(クレッグ(Clegg)、1978、「新しいタンパク食品の生化学的側面(”Biochemical Aspects of New Protein Food“)」ジェイ・アドゥラー−ニッセン、ビーオー・エッガム、エル・マンク、およびエイチエス・オルセン(J,Adler−Nissen,B.O.Eggum,L,Munk,& H.S.Olsen)編、p.109−117、Pergamon,オックスフォード)。あるいは、静脈投与用の高度に精製されたアミノ酸混合物として投与される。ミルクタンパクの酵素加水分解産物は、食事調製品として従来から運用されている。
皮革製造産業は、生皮を洗浄し、脱毛し、最後にそれを鞣し、乾燥することを含む一連の工程に依存する。酵素処理は、脱毛工程において重要な役割を担う。すなわち、この工程は、タンパク分解酵素を与えることによって実現されるが、本発明のペプチドは加水分解するので、現在皮革製造に使用される哺乳動物のプロテアーゼの有効な代替品となる。両方とも、高いタンパク分解活性を持ち、かつ、低pHでも効率が高いからである。
本明細書に記載されるプロテアーゼは、ウール製品に対し所望の性質を付与するために、その工業的処理に使用される。一つの実施態様では、本発明は、織物処理用の組成物を提供する。この組成物は、例えば、シルクまたはウールを処理するために使用することが可能である(例えば、RE216,034;欧州特許EP134,267;米国特許US4,533,359;欧州特許EP344,259を参照されたい)。
本発明はまた、本発明のプロテアーゼ(単複)を含む洗浄組成物にも関する。この洗浄組成物は、洗浄組成物に一般に使用される添加物をさらに含んでもよい。これらは、漂白剤、界面活性剤、油脂、酵素、および漂白触媒の中から選んでもよいが、ただしこれらに限定されない。当業者には、組成物に含めるにはどの添加物が好適であるかは直ちに明白であろう。本明細書に提示されるリストは、決して網羅的なものではなく、好適な添加物の例示としてのみ受け取るべきである。また、当業者には、酵素、および、組成物における他の成分、例えば、界面活性剤と適合する添加物のみを使用すべきであることは直ちに明白であろう。
タンパク原材料の酵素的加水分解は、結果としてしばしば、苦味ペプチドの形成をもたらす(クレッグ(Clegg)1978)。タンパク加水分解産物に見られる苦味ペプチドは、無視できない実際的問題を生ずる。例えば、様々なタイプのチーズの熟成、および、食品としてのタンパク加水分解産物の生産に認められる問題がそれである。加水分解産物の苦味は、通常、特定のペプチド、特に、高い割合の疎水性アミノ酸を含むペプチドによる。苦味は、苦いペプチドの完全な、または部分的加水分解によって効果的に緩和される。従って、本明細書に記載される酵素は、食物の苦味除去に使用される。本発明の酵素、または酵素組成物は、食品のために、タンパクおよび/またはタンパク加水分解産物の苦味緩和のために使用されてもよい。
ある実施態様では、本明細書に記載されるプロテアーゼが合成され精製されたならば、有効量が、パーソナルケア製品に使用される、パーソナルケア組成物(単複)に添加される。パーソナルケア製品は、化粧品、パーソナルケア用途に使用される「大衆薬品」(“OTC”)化合物(例えば、化粧品、スキンケア、口腔ケア、ヘアケア、ネイルケア)に分類される。ある実施態様では、本明細書に記載されるプロテアーゼは、パーソナルケア組成物、例えば、ヘアケア組成物、スキンケア組成物、ネイルケア組成物、化粧組成物、または、それらの任意の組み合わせに添加される。従って、酵素または酵素調製品は、例えば、コンタクトレンズ洗浄液、歯磨き、化粧品、およびスキンケア製品に使用されてもよい。
本明細書に記載されるプロテアーゼは、マルトースまたはフルクトース高濃度シロップの外、他の甘味料の生産にも使用される。醗酵可能な糖類、または糖類に変換が可能な組成物を含む原材料は、通常、でん粉含有植物材料、例えば、根茎、根、茎、穀類の小塊および粒(例えば、コーン、小麦、ミロ、大麦、およびライ麦)、および、糖含有原材料、例えば、砂糖大根、砂糖黍、果実材料、および糖蜜を含むが、ただしこれらに限定されない。
酵素調製品は、他のタンパク分解活性から事実上独立したクローン酵素を用いることが有利な場合、タンパクからペプチドを生産する際に有用であると考えられる。
本発明のプロテアーゼ組成物を用い、でん粉含有基質を醗酵して得られるアルコールの生産は、燃料用アルコールまたは携帯用アルコールの生産を含んでよい。ある実施態様では、酵素組成物は、大麦、モルト、および、その他の、例えば、ビール生産のための原料の酵母醗酵を促進するために使用されてもよい。
T.reesei株QM6aからゲノムDNAを抽出した。T.reeseiゲノムのcontig1−5500に見出されたプロテアーゼ配列候補(Joint Genome Institute(JGI)T.reeseiゲノムv1.0)に基づいて、PCRプライマーを設計した。順行プライマーは、pENTR/Dベクター(Invitrogen)への方向性クローニングのためのモチーフを含んでいた。
T.reesei株QM6aからゲノムDNAを抽出した。T.reeseiゲノムのcontig22−263400に見出されたプロテアーゼ配列候補(JGI T.reeseiゲノムv1.0)に基づいて、PCRプライマーを設計した。順行プライマーは、pENTR/Dベクター(Invitrogen)への方向性クローニングのためのモチーフを含んでいた。
胞子形成中の菌糸から得られた2cm2の寒天プラグを、250mlの、4つの溝を有するバッフルフラスコに納めた50mlのYEGブロスに接種し、37℃で16−20時間200rpmにてインキュベートした。液体容量を50mlの円錐チューブに移し、10分間2500rpmで回転させて菌糸を回収した。上清を吸引除去した。この菌糸ペレットを、40mlのフィルター滅菌β−D−グルカナーゼ(InterSpex Products,Inc.)液を含む、250mlの、0.22μmCAコーニングフィルター瓶に移し、30℃、200rpmで2時間インキュベートした。菌糸を、滅菌Miracloth(CalBiochem,ラホヤ、カリフォルニア州)を通して、50mlの円錐形遠心チューブに集め、2000rpmで5分遠心し、吸引した。ペレットを、50mlの1.2Mソルビトールで一度洗浄し、再び遠心し、吸引し、25mlのソルビトール/CaCl2で洗浄した。ヘモサイトメーターを用いてプロトプラストをカウントし、遠心し、吸引し、1.25×108/mlのプロトプラスト濃度を与えるのに十分な容量のソルビトール/CaCl2に再懸濁させた。形質転換反応当たり200μlの分液を用いた。20μgのDNA(≧1μg/μl)を15mlの円錐形チューブに移し、チューブを氷の上に置いた。200μlのプロトプラストを加えた。50μlのPEGを加え、穏やかに掻き混ぜ、氷上で20分インキュベートした。2mlのPEGをチューブに加え、室温で5分インキュベートした。4mlのソルビトール/CaCl2(合計6.25ml)をチューブに加えた。この形質転換混合物を、各オーバーレイ当たり〜2mlの、3分液に分割した。この2mlを、溶融アセタミドソルビトール上層寒天のチューブに加え、オーバーレイ混合物を、アセタミドを唯一の窒素源として増殖することのできる形質転換体を選ぶためにアセタミドソルビトールプレートの上に注いだ。プレートを、コロニーが出現するまで28−30℃でインキュベートした。形質転換体は、単一コロニーをアセタミド媒体(ソルビトール無添加アセタミドソルビトール処方)にて繰り返し継代することによって精製した。
40mlのβ−D−グルカナーゼ液:600mgのβ−D−グルカナーゼ;400mgのMgSO4.7H2O;および、40mlの1.2Mソルビトール。
アセタミド(Aldrich,99%昇華物)−0.6g/L;CsCl−1.68g/L;グルコース−20g/L;KH2PO4−20g/L;MgSO4*7H2O−0.6g/L;CaCl2*2H2O−0.6g/L;1000X塩(下記参照)−1ml。pHを5.5に調整し、容量を300mlとした。0.22ミクロンフィルターにてフィルター滅菌し、オーブンにて55℃に温めた。
全てTrichoderma reesei株において過剰発現される、PepA(野生型およびL388M)、NSP24、およびNSP25のpH活性プロフィールを、Molecular Probesから入手した蛍光標識カゼインアッセイ(EnzChekプロテアーゼキット緑色蛍光)を用いて求めた。PepA(野生型およびL388M)、およびNSPは、全体醗酵サンプルであり、NSP24は、50%グリセロールに溶解させて安定化した精製サンプルである。これらの酵素を、1.0mg/ml、0.5mg/mlおよび0.25mg/mlに希釈した。蛍光標識基質は、DI H2Oにて0.1mg/mlに希釈した。10mlの基質を、各種pHの50mlバッファーと30μlのDI H2Oに加えた。10mlの酵素を加えて反応を開始し、様々な期間反応させ、100μlの1.0Mリン酸塩をpH10で加えて反応を停止させた。サンプルの蛍光を、SpectraMAX EM蛍光プレートリーダーにおいて、538nm放射線で、485励起、放射カットオフフィルター530nmで測定した。NSP24はpH3.7で最適活性を示し、野生型PepAはpH3.4で最適活性を示し、かつ、L388M pepAは3.5に最適pHを持つ。NSP25は、pH4.6で最適活性を示す。
今日のエタノール産業において使用される標準的プロテアーゼは、Genencor International,Inc.によって市販されるプロテアーゼGC106である。GC106に対するNSP24の機能性を、糖分解、グルコース形成、およびエタノール生産に関して比較した。
ジスチラーゼL−400(ロット#107−04057−901,372 GAU/g)
GC106(ロット#A01−01300−001,1010SAPU/g)
NSP24(ロット#20040423,1165SAPU/g)
Red Star赤酵母
エタノール製造機から得られたマッシュおよび薄い濃度の抽出液(コーン)
方法
マッシュおよび薄い抽出液(バックセットとも呼ばれる、醗酵前)をエタノール製造機から取り出し、掻き混ぜて26.5ブリックスとする。1N HClを用いてpHをpH4.3に調整した。次に、サンプルを、三つの300グラム分液に分割し、32℃の水浴に設置した。平衡後、下記の酵素の組み合わせを加えた。
磨砕コーンの30%DSスラリーを、DI H2Oによって調製した。磨砕コーンは、エタノール産業で使用される#2イェローデントコーンの典型的サンプルである。これは、70%を超えるものが30メッシュ篩を通過するほどに磨砕された。この穀物の水分含量をOHAUS、MB35ハロゲン水分天秤(ニュージャージー州)を用いて測定した。pHは、6N H2SO4を用いて4.2に調整した。醗酵は、0.5kg/MT用量のNSP24の添加、または添加無しで、1.0GAU/g用量のSTARGEN001を添加した100gマッシュを含む125mlフラスコにおいて行われた。
内乳(胚除去コーン、75.8%でん粉、99.5%の粒径<30メッシュ)による29.5%DSマッシュを顆粒状でん粉基質として調製した。各マッシュ100グラムを125mlフラスコに移し、媒体のpHをpH4.5に調整した。プロテアーゼ(NSP24;中性プロテアーゼ(MULTIFECT NEUTRAL,プロテイナーゼ−T);および、アルカリ性プロテイナーゼ(SPEZYME FAN,PROTEX 6L MULTIFECT P−3000、およびプロテイナーゼ−T(Genencor International))を、0.5kg/MTで加え、次いで、STARGEN001(Genencor International)を2.5Kgs/でん粉MT)を加えた。次に、フラスコに0.5mlの20%酵母(Red Starエタノール赤)を接種し、32℃に維持した水浴に移した。フラスコの内容物を連続的に攪拌し、インキュベーション中均等な混合を行った。サンプルを様々な時間間隔で採取し、HPLC分析に供した。72時間醗酵液から得られたDDGSの残留でん粉およびタンパク含量を定量した。エタノール生産の結果を下記の表4に示す。
Claims (26)
- 配列番号10に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたNSP24ファミリ・プロテアーゼ。
- 配列番号10に対して少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有することを特徴とする、請求項1の単離されたNSP24ファミリ・プロテアーゼ。
- 配列番号10に対して少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を有することを特徴とする、請求項2の単離されたNSP24ファミリ・プロテアーゼ。
- 請求項1乃至3のいずれか1項に記載のNSP24ファミリ・プロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 前記単離されたポリヌクレオチドは、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するNSP24プロテアーゼをコードすることを特徴とする、請求項4の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号8の配列を有することを特徴とする、請求項5の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項4のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項4のポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞。
- 宿主細胞が糸状真菌細胞であることを特徴とする、請求項8の宿主細胞。
- 糸状真菌細胞がAspergillus SPP.、Fusarium SPP.、またはTrichoderma SPP.であることを特徴とする、請求項9の宿主細胞。
- Aspergillusが、A.niger、A.oryzae、A.nidulans、またはA.awamoriであることを特徴とする、請求項10の宿主細胞。
- TrichodermaがT.reeseiであることを特徴とする、請求項10の宿主細胞。
- プロテアーゼを生産する方法であって、
a)配列番号10に少なくとも90%の配列同一性を有するNSP24ファミリ・プロテアーゼをコードする核酸に動作可能的に結合するプロモーターを含むポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入する工程、
b)NSP24ファミリ・プロテアーゼの発現と生産に好適な培養条件の下で宿主細胞を培養する工程、および、
c)前記NSP24ファミリ・プロテアーゼを生産する工程、
を含む前記方法。 - 生産されたプロテアーゼを回収することをさらに含むことを特徴とする、請求項13による方法。
- 請求項1乃至3のいずれか1項に記載のNSP24ファミリ・プロテアーゼを含む酵素組成物。
- 組成物が洗浄組成物であることを特徴とする、請求項15の酵素組成物。
- 洗浄組成物が界面活性組成物であることを特徴とする、請求項16の酵素組成物。
- 組成物がでん粉含有基質加水分解組成物であることを特徴とする、請求項15の酵素組成物。
- 組成物が、動物飼料組成物であることを特徴とする、請求項15の酵素組成物。
- 組成物が、エタノール生産工程に使用されることを特徴とする、請求項15の酵素組成物。
- 組成物が、でん粉糖化工程に使用されることを特徴とする、請求項15の酵素組成物。
- 組成物が、マルトースまたはフルクトースの生産に使用されることを特徴とする、請求項15の酵素組成物。
- 組成物が、パーソナルケア組成物であることを特徴とする、請求項15の酵素組成物。
- グルコアミラーゼをさらに含むことを特徴とする、請求項15の酵素組成物。
- アルファ−アミラーゼをさらに含むことを特徴とする、請求項15の酵素組成物。
- でん粉含有基質を加水分解する方法であって、でん粉含有基質の加水分解に好適な条件下に、でん粉含有基質を、請求項15の酵素組成物と接触させること、および、でん粉含有基質の加水分解物を獲得することを含む前記方法。
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