JP5087407B2 - 酸性真菌プロテアーゼ - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２００４年１２月３０日出願、名称「酸性真菌プロテアーゼ（Ａｃｉｄ Ｆｕｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）」なる米国特許仮出願第６０／６４０，３９９号、および、２００５年１月２７日出願、名称「酸性真菌プロテアーゼ（Ａｃｉｄ Ｆｕｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）」なる米国特許仮出願第６０／６４８，２３３号に対する優先権を主張する。なお、これらの出願の内容の全てを参照することにより本明細書に含める。

本発明は、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ、ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼ、およびＰｅｐＡプロテアーゼと表示される酸性プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド；ＮＳＰ２４およびＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼポリペプチド；前記プロテアーゼを含む組成物、および、それらの使用に関する。

プロテアーゼは、ペプチド結合を切断することのできる酵素である。酸性プロテアーゼ（例えば、酸性ｐＨを至適とするプロテアーゼ）は、哺乳類および微生物を含むいくつかの異なる生物体によって生産される。例えば、微生物の酸性プロテアーゼは、細菌株、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の株（ＪＰ０１２４０１８４）、および、真菌株、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．（ＥＰ７２９７８）、Ｓｃｈｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｓｐ．（ＪＰ４８０９１２７３）、Ｓｕｌｐｈｏｌｏｂｕｓ ｓｐ．，Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．（ＷＯ／９０１００７２）、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．（ＪＰ５０１２１４８６およびＥＰ８２３９５）の株によって生産される。

ベルカ（Ｂｅｒｋａ）等「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」（１９９０）９６：３１３は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ由来のアスパラギン酸プロテアーゼ、アスペルギロペプシンＡをコードする遺伝子を開示する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のアスパラギン酸プロテアーゼ、アスペルギロペプシンＯをコードする遺伝子のクローニングは、ベルカ（Ｂｅｒｋａ）等によって記載される「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」（１９９３）１２５：１９５−１９８。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来の酸性プロテアーゼ（ＰｅｐＡ）をコードする遺伝子のクローニングは、ゴミ（Ｇｏｍｉ）等によって開示される「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」（１９９３）５７（７）：１０９５−１１００。

プロテアーゼ、特に酸性プロテアーゼは、産業用途に、例えば、食品および飼料の生産、皮革産業（例えば、生皮の除毛）、タンパクの加水分解産物の生産、および、アルコールの生産、例えば、エタノールの生産、ワインの生産および醸造等広く使われている。

依然として、多種多様な用途、特に食品および飼料産業においてプロテアーゼに対する需要が続いている。

本出願人等は、いくつかの新規プロテアーゼ遺伝子を発見した。そのようなものとして、ＮＳＰ２４プロテアーゼ（配列番号２、または配列番号１０）をコードする新規ｎｓｐ２４遺伝子、ＮＳＰ２５プロテアーゼ（配列番号９）をコードする新規ｎｓｐ２５遺伝子、および、新規ＰｅｐＡプロテアーゼ（配列番号７）をコードする新規ｐｅｐＡ変異遺伝子が挙げられる。

従って、本発明は、ＮＳＰ２４プロテアーゼ、ＮＳＰ２５プロテアーゼ、またはＰｅｐＡプロテアーゼおよびその変異種の、組み換え法による、または、ほぼ純粋な調製をその特徴とする。

本発明のある態様では、プロテアーゼは、配列番号２または配列番号１０（下記の図６に示される）のアミノ酸配列と事実上同じアミノ酸配列を含む、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼポリペプチドは、配列番号８（下記の図５に示される）の核酸によって、あるいは、配列番号８の核酸と事実上同じ核酸配列を持つ核酸によってコードされる。

本発明の別の態様では、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼポリペプチドは、配列番号１０における配列とは最大１０残基アミノ酸配列が異なる。ある実施態様では、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼポリペプチドは、配列番号１０における配列とは、最大１０％の残基のアミノ酸配列が異なる。ある実施態様では、その差は、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼポリペプチドがＮＳＰ２４プロテアーゼの生物学的活性を示せる程度の差であり、例えば、該ＮＳＰ２４プロテアーゼが天然のＮＳＰ２４プロテアーゼの生物学的活性を保てる程度の差である。

本発明のさらに別の態様では、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼポリペプチドは、本明細書に記載されるＮＳＰ２４プロテアーゼ配列の外に、他のＮ−末端および／またはＣ−末端アミノ酸配列も含む。

本発明のさらに別の態様では、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼポリペプチドは、さらに別のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号１または配列番号８の配列をコードするゲノムＤＮＡに対する５´側のゲノムＤＮＡによってコードされる残基に、読み枠内で融合される、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列の全てまたはその断片を含む。

本発明のさらに別の態様では、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼは、第１ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ部分と、第２ポリペプチド部分、例えば、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼとは無関係のアミノ酸配列を持つ第２ポリペプチド部分とを有する、組み換え融合タンパクである。第２ポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、またはポリメラーゼ活性化ドメインであってもよい。本発明のポリペプチドは、複数遺伝子の存在、選択的転写事象、選択的ＲＮＡスプライシング事象、ならびに、選択的翻訳および翻訳後事象の結果生ずるものを含む。このポリペプチドは、システム、例えば、発現ＮＳＰ２４プロテアーゼが天然細胞において発現される場合に見られるのとほぼ同じ翻訳後修飾をもたらす、培養細胞において発現されてもよいし、あるいは、天然細胞で発現された場合に見られる翻訳後修飾の除去をもたらすシステムにおいて発現されてもよい。

さらに別の態様では、本発明は、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ、および、１種以上の添加成分、例えば、担体、希釈剤、または溶媒を含む酵素組成物に関する。添加成分は、インビボ、インビトロ、製薬、または獣医学用途において組成物を有用にするものであってもよい。この態様のある実施態様では、酵素組成物は添加酵素を含む。好ましい実施態様では、添加酵素は、グルコアミラーゼ、アルファ・アミラーゼ、またはそれらの組み合わせである。

さらに別の態様では、本発明は、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％相同な配列を持つアミノ酸配列を含むＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼポリペプチドをコードするヌクレオチドを有するか、または含むほぼ純粋な核酸を提供する。

ある態様では、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼの核酸は、例えば、該ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ遺伝子配列を発現ベクターとしての使用に適しているものとするために、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ遺伝子配列に対して動作的に結合される転写調節配列、例えば、転写プロモーターまたは転写エンハンサー配列の内の少なくとも一つを含む。

さらに別の態様では、本発明のＮＳＰ２４プロテアーゼポリペプチド（例えば、配列番号２）をコードする核酸は、配列番号８由来の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに対応する核酸プローブに対して、より好ましくは、配列番号８由来の２０個の連続ヌクレオチドに対して厳格条件下にハイブリダイズする。

本発明のもう一つの態様は、各種産業場面における、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ（例えば、ＮＳＰ２４）の応用を提供する。例えば、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼは、アルコール燃料およびその他の重要な工業薬品の生産のために農業廃棄物を酵素的に分解するために使用されてもよいし、動物またはヒトの食品生産用途、または洗剤組成物の成分として、皮革処理およびタンパク系繊維の処理用途（例えば、ウールまたはシルク）、バイオマス用途、パーソナルケア用途（皮膚、髪、口内衛生等）、製薬および保健用途、および、上記応用用途に用いられる新規ペプチドの生産用途に使用されてもよい。

さらに別の態様では、本発明は、ｐｅｐＡ変異プロテアーゼ、すなわち、配列番号７を持つＬ３８８Ｍをコードするポリヌクレオチドに関する。ある実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号５の配列を有する。

さらにもう一つの態様では、本発明はＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼに関する。ある実施態様では、ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼは、配列番号９に対して少なくとも８５％の配列相同性を持つ。別の実施態様では、ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼは、配列番号４に対して少なくとも８５％の配列相同性を持つポリヌクレオチドによってコードされる。さらに別の実施態様では、ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼは、親のＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼの生物学的に活性な断片である。

以下、本発明を、下記の定義と実施例のみを用い、参照によって詳細に説明する。本明細書に参照される全ての特許および出版物は、それら特許および出版物の中に開示される全ての配列を含め、参照することによって本明細書に含められる。

本発明の実施において、別様に指示しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の、当業者の能力の範囲内にある通例技術を用いる。このような技術は文献に記載される。例えば、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、サムブルック、フリッチュ、およびマニアチス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）著、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；アウスベル等（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）編、「分子生物学における短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第５版、２００２年；「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、ＩおよびＩＩ巻、ディーエヌ・グローバー（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、１９８５；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、エムジェイ・ゲイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）編、１９８４；マリス（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）等、米国特許第４，６８３，１９５号；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、ビーディー・ヘイムズおよびエスジェイ・ヒギンス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、１９８４；「転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」、ビーディー・ヘイムズおよびエスジェイ・ヒギンス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、１９８４；「動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ）」、アールアイ・フレッシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）著、アラン・アールリス社（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、１９８７；「不動化細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）」、アイアールエル・プレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、１９８６；ビー・パーバル（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）著、「分子クローニングの実技ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ−Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、１９８４；論説「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州；「哺乳類細胞のための遺伝子転送ベクター（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ）」、ジェイエイチ・ミラーおよびエムピー・カーロス（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ）編、１９８７年、コールドスプリングハーバーラボラトリ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１５４および１５５巻、ウー（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．）等編、「細胞および分子生物学における免疫化学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、メイヤーおよびウォーカー（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ）編、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ロンドン、１９８７；「実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｉ−ＩＶ巻、ディーエム・ウェアおよびシーシー・ブラックウェル（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）編、１９８６；「マウス胚の取り扱い手技（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州、１９８６を参照されたい。さらに、プロテアーゼの調製、発現、分離、および使用の方法に関する情報が、米国特許第６，７６８，００１号を参照することによって得られる。なお、この特許文献の全体を、引用することにより本明細書に含める。

本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかとなろう。なお、本発明の実施または試験においては、本明細書に記載されるものと類似の、または等価な、任意の方法および材料の使用が可能であるけれども、好ましい方法および材料が記載される。

別様に定義しない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は全て、本発明の所属する従来技術において通常の錬度を有する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。シングルトン（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）等、「微生物および分子生物学辞典（ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」、ジョンウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９４、および、ヘイルおよびマーカム（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ）、「ハーパーコリンズ生物学辞典（ＨＡＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ）」、ハーパーペレニアル（Ｈａｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ）、ニューヨーク州、１９９１が、当業者には、本発明に使用される用語の多くについて一般的辞典となる。

本明細書に示される見出しは、明細書全体を参照することによって理解することが可能な、本発明の様々な態様または実施態様を限定するものではない。従って、このすぐ後に定義される用語は、本明細書の全体を参照することによってより完全に定義される。

数字の範囲は、その範囲を定義する数字を含める。

別様に指示しない限り、それぞれ、核酸は、左から右へ、５’から３’方向に書かれ、アミノ酸は、左から右へ、アミノからカルボキシル方向に書かれる。

本明細書および付属の特許請求項で使用される、単数形表現「この」および「前記」は、内容が明白に別様に指定しない限り、複数形を含む。従って、「化合物」を含む組成物に対する言及は、２種以上の化合物から成る混合物を含む。さらに、「または」という用語は、内容が明白に別様に指定しない限り、一般に「および／または」を含む意味に使用される。

定義
「プロテアーゼ」は、微生物、例えば、真菌、細菌、または、植物または動物から得られるタンパクまたはポリペプチドの、タンパクまたはポリペプチドドメインであって、タンパク主鎖の様々な位置の内の一つにおけるペプチド結合の切断を触媒する能力を持つドメインである（例えば、Ｅ．Ｃ．３．４）。

「酸性プロテアーゼ」とは、酸性条件下でタンパクを加水分解する能力を持つプロテアーゼを指す。

本明細書で用いる「ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ」とは、生来の、または野生型形態（例えば、図６のタンパク）において、プロテアーゼ活性を持つ酵素、すなわち、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列の誘導体、アミノ酸配列の生物学的に活性な断片に対し、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列相同性を有するプロテアーゼタンパクを意味する。

本明細書で用いる「誘導体」とは、前駆体または親タンパク（例えば、自然のタンパク）から得られるタンパクであって、アミノ酸配列のＣ−およびＮ−末端のいずれかまたは両方に１個以上のアミノ酸を付加することによって、アミノ酸配列におけるいくつかの異なる部位において１個以上のアミノ酸を置換することによって、タンパクの一端または両端においてまたはアミノ酸配列の１箇所以上の部位において１個以上のアミノ酸を欠失させることによって、またはアミノ酸配列の１箇所以上の部位において１個以上のアミノ酸を挿入することによって得られるタンパクを意味する。

本明細書で用いる「自然配列ＮＳＰ２４」または「野生型ＮＳＰ２４配列」とは、自然から得られたＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼと同じアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む。

「生物学的に活性な断片」（例えば、配列番号１０の配列を有するＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼの、生物学的に活性な断片）とは、プロテアーゼ活性を持つが、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼまたはＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼの前駆体または親タンパクの完全配列よりも少ない配列を含む、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼまたはＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼを意味する。

「単離」または「精製」とは、プロテアーゼが天然状態下で関連する天然成分の内の１種以上、またはその全てからプロテアーゼを分離することによってプロテアーゼがその天然状態から変えられていることを指す。

「ＰｅｐＡ」とは、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列相同性を有する酸性プロテアーゼを指す。

「Ｌ３８８Ｍ」とは、配列番号７の配列を持つ変異種ＰｅｐＡを指す。

本明細書で用いる「ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼ」とは、配列番号９および生物学的に活性なその断片に対して、少なくとも８５％の配列相同性を持つプロテアーゼ酵素を意味する。

「ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼに対して無関係な」とは、配列番号１０のＮＳＰ２４プロテアーゼに対して、３０％未満の相同性、２０％未満の相同性、または１０％未満の相同性を持つアミノ酸配列を意味する。

「ペプチド」、「タンパク」、および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では相互交換的に用いられる。

本明細書で用いる、特定されたアミノ酸またはヌクレオチドに関する「パーセント（％）配列同一性」とは、候補配列と対象配列（例えば、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ配列）とを整列し、要すればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を実現したあと、対象配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセントと定義される。なお、どの保存的置換体も配列同一性の一部であるとは見なさない。

本明細書で用いる「アルファ・アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．クラス３．２．１．１）」は、アルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素を指す。これらの酵素はまた、１，４−α−結合Ｄ−グルコース単位を含むポリサッカライドにおける、１，４−α−Ｄ−グルコシド結合の、エキソまたはエンド加水分解を実行するものとしても記載される。これらの酵素を記載するために用いられるもう一つの用語は、「グリコゲナーゼ」である。例示の酵素としては、アルファ−１，４−グルカン４−グルカノヒドラーゼ、グルカノヒドロラーゼが挙げられる。

本明細書で用いる「グルコアミラーゼ」という用語は、アミログルコシダーゼクラスの酵素（例えば、ＥＣ．３．２．１．３、グルコアミラーゼ、１，４−アルファ−Ｄ−グルカングルコヒドラーゼ）を指す。これらは、アミロースおよびアミロペクチン分子の非還元性末端からグルコシル残基を放出する、エキソ活動性酵素である。この酵素はまた、アルファ−１，６、およびアルファ−１，３結合をも加水分解する。もっともアルファ−１，４結合に対するよりもその速度はずっと遅い。

「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関与する調整配列を意味する。

本明細書で用いる「異種プロモーター」は、遺伝子、または精製核酸と天然では関連しないプロモーターである。

本明細書で用いる、ポリペプチドの「精製標本」または「実質的に純粋な標本」とは、該ポリペプチドが天然では共に存在する、細胞、その他のタンパク、脂質、または核酸から分離されたポリペプチドを意味する。

本明細書で用いる「細胞の精製標本」とは、植物または動物細胞の場合、細胞のインビトロ標本を指し、生の、植物または動物細胞全体を指さない。培養細胞または微生物細胞の場合、該標本は、対象細胞の少なくとも１０％、より好ましくは５０％を持つ標本から成る。

「実質的に純粋な核酸」、例えば、実質的に純粋なＤＮＡとは、該核酸の由来する生物体の天然ゲノムにおいて該核酸が直接連結する（例えば、一方は５’末端において、一方は３’末端において）配列、例えば、コード配列のいずれか一端または両端に対し直接連結しない、その一方または両方である核酸である。この用語は、例えば、ベクター、例えば、自律的複製プラスミドまたはウィルスに、または、前核細胞または真核細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる組み換えＤＮＡ、あるいは、他のＤＮＡ配列と独立な分離分子として存在するＤＮＡ（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生産されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）を含む。実質的に純粋なＤＮＡはまた、さらに別のＮＳＰ２４プロテアーゼ配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡを含む。

本明細書で用いる「相同性」とは、二つのポリペプチド分子間、または二つの核酸分子間の配列類似性を指す。二つの比較される配列の両方における一つの位置が、同じ塩基、またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、二つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける一つの位置が、アデニンで占められている場合、これらの分子は、その位置において相同である。二つの配列間の相同性のパーセントは、該二つの配列が共有する、一致または相同位置の数を、比較される位置の数で割り、×１００とした関数である。例えば、二つの配列の位置について、１０の内の６が一致または相同である場合、この二つの配列は６０％相同である。例を挙げると、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同を共有する。一般に、最大の相同性を与えるように二つの配列を整列させて比較を行う。

本明細書で用いる「ベクター」という用語は、核酸を、１種以上の細胞タイプに導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列をさす。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等が挙げられる。

本明細書で用いる「発現ベクター」とは、適切な宿主におけるＤＮＡの発現に影響を及ぼすことが可能な適切な調節配列に動作的に結合するＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築体を意味する。

「発現」という用語は、ポリペプチドが、遺伝子の核酸配列に基づいて生産されるその過程を意味する。

本明細書で用いる「動作的に結合する」とは、調整領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、分泌シグナル、またはエンハンサー領域が、構造遺伝子に付着または結合し、その遺伝子の発現を調節することを意味する。

本明細書で用いる、微生物「由来の」物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはタンパク）とは、その物質が、その微生物に本来属するものであることを意味する。

本明細書で用いる、「微生物」とは、細菌、真菌、ウィルス、原生動物、および他の微生物、すなわち顕微鏡的生物を指す。

本明細書で用いる、「宿主株」または「宿主細胞」は、本発明によるＤＮＡを含む発現ベクターにとって好適な宿主を意味し、前記細胞の子孫を含む。

「糸状真菌」という用語は、全ての、糸状形態の下位区分Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａを指す（アレクソパウロス・シージェイ（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．）（１９６２），「真菌学入門（ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＯＲＹ ＭＹＣＯＬＯＧＹ）」、ウィリー（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク州、および、エインスワースおよびビスビー（ＡＩＮＳＷＯＲＴＨ ＡＮＤ ＢＩＳＢＹ）、「真菌の辞書（ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＴＨＥ ＦＵＮＧＩ）」、９版、（２００１）、カーク（Ｋｉｒｋ）等編、シーエービー・インターナショナルユニバーシティ・プレス（ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ケンブリッジ、英国を参照されたい）。これらの真菌は、キチン、セルロース、および、他の複雑なポリサッカライドによって構成される細胞壁を持つ、植物性菌糸によって特徴づけられる。本発明の糸状真菌は、形態的に、生理的に、かつ遺伝的に、酵母とは異なる。糸状真菌による植物的増殖は、菌糸の延長により、炭素の異化作用は好気性であることを強制される。

本明細書で用いる、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ」または「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ＳＰＰ．」は、以前または現在Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａに分類される、任意の真菌属を指す。

本明細書で用いる「４重欠失」または「４重欠失した」宿主細胞とは、機能的エンドグルカナーゼをコードする少なくとも２個の遺伝子、および、機能的セロビオヒドロラーゼをコードする少なくとも２個の遺伝子を欠失する、トリコデルマ宿主株の細胞から形成された細胞およびプロトプラストの両方を指す。

本明細書で用いる「培養」という用語は、液体または固体媒体中の好適な条件下における微生物細胞集団の増殖を指す。一つの実施態様では、培養は、でん粉基質、例えば、顆粒状でん粉を含む基質の、最終産物（典型的には、血管またはリアクターにおける）への醗酵性生体変換を指す。醗酵は、より単純な有機化合物を生産するために微生物によって行われる、有機物質の酵素的で、かつ嫌気性の分解である。醗酵は嫌気的条件下で起こるが、醗酵はまた酸素の存在下でも起こるので、本用語は、厳密な嫌気的条件のみに限定されることを意図しない。

本明細書で用いる「接触する」という用語は、それぞれの酵素（単複）を、それぞれの基質の十分近くに置くことによって、酵素（単複）が基質を最終産物に変換することを可能とすることを指す。当業者であれば、酵素溶液をそれぞれの基質と混合することが接触に作用する可能性のあることを了解されるであろう。

核酸配列を細胞中に挿入するという背景で用いられる「導入」という用語は、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」を意味し、核酸配列の、真核または前核細胞への取り込みに対する参照を含む。その際、該核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、または、ミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれてもよいし、自律的レプリコンに変換されてもよいし、または、一時的に発現されてもよい（例えば、形質導入ｍＲＮＡ）。

本明細書で用いる、細胞に関して使用される「形質転換された」、「安定に形質転換された」、および「トランスジェニック」という用語は、細胞が、在来型ではない（例えば、異種の）核酸配列を、そのゲノムの中に一体化して、または、複数の世代に渡って維持されるエピソームプラスミドとして有することを意味する。

本明細書で用いる、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと関連して使用される「異種の」という用語は、宿主細胞では天然には見られないポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。

「過剰発現」という用語は、ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入された場合、ポリペプチドを該宿主細胞において発現する過程を意味する。

本明細書に記載するように、本発明の一つの態様は、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼまたはＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼ、および／またはそれらの核酸の等価物をコードするヌクレオチド配列を含む「実質的に純粋な」（または組み換え）核酸を特徴とする。

「等価的」という用語は、機能的に等価な複数のポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を指す。複数の、等価的ヌクレオチド配列は、１個以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失、例えば、対立遺伝子変異において異なる、複数の配列を含む。例えば、ある実施態様では、遺伝コードの縮重のため、等価的ヌクレオチド配列は、配列番号２に示すＮＳＰ２４プロテアーゼをコードするが、配列番号８のヌクレオチド配列と異なる配列を含む。

本明細書で用いる「糖化」という用語は、でん粉をグルコースに変える酵素的転換を指す。

本明細書で用いる「でん粉」とは、アミラーゼとアミロペクチンから構成される、ｘが任意の数である化学式（Ｃ_６Ｈ_１０Ｏ_５）_ｘを持つ、植物の、複雑なポリサッカライド炭水化物から構成される任意の物質を指す。

「顆粒状でん粉」という用語は、調理されていない（生の）でん粉（例えば、ゼラチン化されたことがないでん粉）を指す。

本明細書で用いる「ゼラチン化」という用語は、でん粉分子を調理することによって可溶化し粘調な懸濁液を形成することを意味する。

本明細書で用いる「液化」という用語は、でん粉転換の段階であって、ゲル化でん粉が加水分解されて低分子量の可溶性デキストランを生じる段階を指す。

本明細書で用いる「可溶性でん粉加水分解産物」という用語は、でん粉の加水分解によって得られる可溶性産物であって、モノ−、ジ−、およびオリゴサッカライド（例えば、グルコース、マルトース、および多糖類）を含む産物を指す。

「モノサッカライド」という用語は、ポリマー、例えば、でん粉のモノマー単位であって、重合度（ＤＰ）が１である単位（例えば、グルコース、マンノース、フルクトース、およびガラクトース）を意味する。

「ジサッカライド」という用語は、二つの、共有的に結合するモノサッカライド単位を含む化合物（ＤＰ２）（例えば、スクロース、ラクトース、およびマルトース）を意味する。

用語“ＤＰ３＋”という用語は、３よりも大きな重合度を持つポリマーを意味する。

プロテアーゼと、該プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド
本発明は、ＮＳＰファミリ・プロテアーゼであって、配列番号２のプロテアーゼまたは配列番号１０のプロレアーゼ（図６）に対し、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列相同性を有するプロテアーゼ、例えば、酸性プロテアーゼ、およびさらに酸性真菌プロテアーゼに関する。ある実施態様では、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼは、配列番号１０の配列（成熟タンパク配列）を含むＮＳＰ２４、あるいは、配列番号２のプレタンパク配列とも表示される。

ある実施態様では、本発明は、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼの生物学的活性を持つ断片に関する。ある実施態様では、生物学的活性断片は、少なくとも２５０個のアミノ酸残基、少なくとも３００個のアミノ酸残基、少なくとも３５０個のアミノ酸残基、少なくとも３７５個のアミノ酸残基、および少なくとも４００個のアミノ酸残基を有するプロテアーゼを含む。

別の実施態様では、生物学的活性断片は、図６のタンパク配列（配列番号２または配列番号１０）に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列相同性を有するポリペプチド配列の、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％を含む。ある実施態様では、生物学的活性断片は、配列番号２または配列番号１０を持つ親ＮＳＰ２４プロテアーゼに対し、少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチド配列の、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％を含む。ある実施態様では、生物学的活性断片は、配列番号２または配列番号１０を持つ親ＮＳＰ２４プロテアーゼに対し、少なくとも９９％の配列相同性を有するポリペプチド配列の、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％を含む。

ある実施態様では、生物学的活性断片は、生体内に存在する断片、例えば、翻訳後処理によって生ずる断片、または、選択的スプライシングを受けたＲＮＡの翻訳によって生ずる断片である。断片は、天然または内在細胞において、例えば、翻訳後処理の結果、例えば、アミノ末端シグナル配列除去の結果として発現されるものを始め、発現システム、例えば、ＣＨＯ細胞において発現されるものも含む。ある好ましい断片は、タンパク分解による切断、または選択的スプライシング事象によって生じた断片、例えば、活性断片である。ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼのようなプロテアーゼは、ある範囲の生理学的性質を示すことがよくあり、かつ、そのような性質は、分子の異なる部分に由来することがあるのであるから、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼの有用断片または類縁体は、ＮＳＰ２４プロテアーゼ活性に関する任意の生物学的アッセイにおいて生物学的活性を示すものである。

ある実施態様では、生物学的活性断片は、配列番号２または配列番号１０を持つＮＳＰ２４のプロテアーゼ活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％を含む。ある好ましい実施態様では、断片または類縁体は、任意のインビボまたはインビトロのＮＳＰ２４プロテアーゼアッセイにおいて、ＮＳＰ２４プロテアーゼ（配列番号２または配列番号１０）のプロテアーゼ活性の少なくとも４０％、または少なくとも９０％を持つ。

ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼまたはＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼの断片は、当業者に既知の方法によって生成することが可能である。候補断片が、プロテアーゼの生物学的活性を示す能力は、本明細書に記載するように、当業者に既知の方法によって評価することが可能である。さらに、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼおよびＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼであって、該ペプチドの生物学的活性に必要とされない残基を含むもの、または、選択的ｍＲＮＡスプライシング、または、タンパクの選択的プロセシングによって生じるものも含まれる。

ある実施態様では、本発明によって被われるプロテアーゼは、配列番号２または配列番号１０を持つプロテアーゼの誘導体である。誘導体は、配列番号１０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、および９９％の配列相同性を持ってもよい。

本発明はまたプロテアーゼ類縁体を含む。類縁体とは、ペプチドの安定性を増す修飾を伴うものである。そのような類縁体は、例えば、ペプチド配列の中に、１個以上の非ペプチド結合（ペプチド結合を置換する）を含んでもよい。さらに含まれるのは、天然のＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸、または非天然性または合成アミノ酸、例えば、βアミノ酸、および環状類縁体を含む類縁体である。類縁体は、天然のプロテアーゼと、例えば、ＮＳＰ２４またはＮＳＰ２５タンパクと、アミノ酸配列において、または、配列を含まないやり方で、または、その両方において異なっていてもよい。非配列修飾は、本発明に含まれるプロテアーゼの、インビトロまたはインビボにおける、化学的誘導体形成を含む。非配列修飾としては、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、またはグリコシル化における変化が挙げられる。

さらに別の実施態様では、本発明はＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼを含む。ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼは、配列番号９（図９）の成熟タンパク配列、またはその生物学的に活性な断片に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を持つ酸性プロテアーゼである。一つの特異的ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼは、配列番号９を持つＮＳＰ２５と表示されるプロテアーゼである。ある実施態様では、ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼは、配列番号９に対し少なくとも９０％の配列相同性を有する配列の、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を含む、プロテアーゼの生物学的活性断片である。別の実施態様では、ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼは、配列番号９に対し少なくとも９５％の配列相同性を有する配列の、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％を含む、プロテアーゼの生物学的活性断片である。

本発明による酸性プロテアーゼは、酸性条件下でタンパクを加水分解することが可能なプロテアーゼであるが、ある実施態様では、プロテアーゼ活性のための至適ｐＨは、ｐＨ３．０から５．５の範囲にある。ある実施態様では、プロテアーゼ活性のための至適ｐＨ範囲は、ｐＨ３．０と５．０の間にあるが、別の実施態様では、プロテアーゼ活性のための至適ｐＨ範囲は、ｐＨ３．０と４．５の間にある。

本発明によるプロテアーゼ、例えば、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼまたはＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼは、アミノ酸置換、例えば、Ｌ−アミノ酸による置換であって、一つのアミノ酸が別の生物学的に類似のアミノ酸によって置換される「保存的アミノ酸置換」を含んでもよい。保存的アミノ酸置換とは、置換されるアミノ酸の、全体的電荷、疎水性／親水性、および／または、立体的広がりを保存する置換である。保存的置換の例として、下記の基の間の置換が挙げられる。すなわち、Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ、およびＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒである。誘導体は、例えば、１から１０個までのアミノ酸残基が異なっていてもよい。例えば、６−１０、５、４、３、２、または１個のアミノ酸残基が異なっていてもよい。表１は、従来技術で認められたアミノ酸置換の例を示す。さらに、置換は、プロテアーゼ生物活性を消滅させることのない、１個以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、または挿入によって行われてもよい。

ある実施態様では、本発明のプロテアーゼは内在配列である。このような内在配列は、天然から単離することが可能であり、あるいは、組み換えまたは合成手段によって製造することが可能である。この「内在配列」という用語は、ＮＳＰ２４またはＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼの天然に見られる短縮形または分泌形（例えば、生物学的活性断片）、および、天然に見られる変異形（例えば、選択的スプライシングを受けた変異形）を特に含む。

ある実施態様では、本発明の酸性プロテアーゼは、配列番号７に対して、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を持つＰｅｐＡプロテアーゼである。ある実施態様では、プロテアーゼは、配列番号７の配列を持ち、“Ｌ３８８Ｍ”と表示される。さらに別の実施態様では、プロテアーゼは、配列番号５、または配列番号３の配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる。

本発明はまた、本発明に含まれるプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリヌクレオチドは下記を含む。すなわち、
ａ）配列番号２または配列番号１０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列相同性を持つＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号２の配列をコードするポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号８の配列を持つポリヌクレオチド；
ｄ）ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼの生物学的活性断片をコードするポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号８に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列相同性を持つポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号４、配列番号８のＤＮＡ配列、または、配列番号４または配列番号８の断片に対応する核酸プローブに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、その際、前記断片は、少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１５０個の連続ヌクレオチドを有し；
ｇ）配列番号４に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列相同性を持つＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号９のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号４の配列を持つポリヌクレオチド；
ｊ）ＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼの生物学的活性断片をコードするポリヌクレオチド；
ｋ）配列番号７の配列、およびその生物学的活性断片をコードするポリヌクレオチド；および、
ｌ）配列番号３または配列番号５の配列を持つポリヌクレオチド。

遺伝子コードには縮重があるために、ある特定のアミノ酸をコードするのに１種を超えるコドンが使用される場合がある。従って、異なるいくつかのＤＮＡ配列が、同じアミノ酸配列を持つポリペプチド、例えば、配列番号２のポリペプチドをコードする可能性がある。本発明は、同じポリペプチドをコードする複数のポリペプチドをカバーする。

核酸は、該核酸の１本鎖型が、適当な温度およびイオン強度条件下において別の核酸とアニールすることが可能である場合、その他方の核酸配列にたいしてハイブリダイズすることが可能である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、低度、中等度、高度、および、極めて高度の厳格条件下におけるハイブリダイゼーションに関して従来技術でよく知られる（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（１９８９）、上記、特に９および１１章参照）。一般に、ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチドプローブと相同的ＤＮＡ配列を含み、これらは、相補的ポリヌクレオチドの広範な塩基対合によって安定な二本鎖ハイブリッドを形成する（さらに、８章および、「遺伝子クローニング入門（Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」、ティーエー・ブラウン（Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ）、（１９９５）、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、ロンドンを参照されたい）。ある実施態様では、プローブおよび相同配列を有するフィルターは、２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約６０℃（中等厳格度）、６５℃（中等／高等厳格度）、７０℃（高等厳格度）、および約７５℃（極高等厳格度）における０．５％ＳＤＳで洗浄してもよい（「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州、１９８９、６．３．１−６．３．６、なお、この文献を引用することにより本明細書に含める）。

本発明に含まれるものは、対立遺伝子変異；自然突然変異；誘発突然変異；配列番号２、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０のポリペプチドをコードする核酸に対して、高または低厳格条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク、および、配列番号２または配列番号１０を持つＮＳＰ２４プロテアーゼに対する抗血清によって、特にＮＳＰ２４プロテアーゼの活性部位または結合ドメインに対する抗血清によって特異的に結合されるポリペプチドである。ある実施態様では、本発明のＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼをコードする核酸、例えば、配列番号２のＮＳＰ２４プロテアーゼをコードする核酸は、配列番号８から得られる少なくとも１２、１５、または２０の連続ヌクレオチドに対応する核酸に対して高度の厳格条件下にハイブリダイズする。

本発明の核酸およびポリペプチドは、本明細書に開示される配列とは、開示の配列における配列誤差のために異なるものも含む。

ＤＮＡ配列の相同性は、二つのＤＮＡ配列間の同一性の程度によって決められる。複数のポリペプチド配列またはヌクレオチド配列について、相同性または同一性パーセントが、コンピュータを用いて求められてもよい。配列整列を実行し、配列同一性を定める方法は当業者には既知であり、不要な実験を行うことなく実行が可能であり、同一性値の計算も明確に獲得することが可能である。例えば、アウスウーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等編、（１９９５）、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９章、（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨーク州；および、デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）（１９７８）「タンパク科学および構造アトラス５（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５）」、別冊３（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｇ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい。複数の配列を整列し、配列同一性を求めるためにはいくつかのアルゴリスムが利用可能であり、例えば、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）等（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整列アリゴリスム；スミス（Ｓｍｉｔｈ）等（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局部的相同性アルゴリスム；ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性探索法；スミス・ウォーターマン法（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）、および、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＢＬＡＳＴＸアルゴリスム（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０を参照）が挙げられる。これらのアルゴリスムを用いるコンピュータプログラムも利用が可能であり、例えば、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、またはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２６６：４６０−４８０（１９９６））；またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴアルチュル等上記、ＦＡＳＴＡ、および、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）パッケージ、バージョン８、マジソン、ウィスコンシン州、米国において市販されるＴＦＡＳＴＡ、および、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州によるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラムに納められるＣＬＵＳＴＡＬが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。当業者であれば、比較される複数の配列の長さに渡って最大の整列を実現するのに必要なアルゴリスムを含め、整列を測定するための適切なパラメータを決めることが可能である。配列同一性は、プログラムによって決められるデフォールトパラメータを用いて決められることが好ましい。具体的に言うと、配列同一性は、ＭＳＰＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に搭載されるスミス・ウォーターマン相同性探索アルゴリスムによって求めることが可能である。このアルゴリスムは、下記の探索パラメータ、すなわち、ギャップ開放ペナルティー１２、およびギャップ延長ペナルティー１によるアフィンギャップ探索を用いる。対合アミノ酸比較は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．マジソン、ウィスコンシン州のＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて実行することが好ましい。このプログラムは、ギャップウェイト１２、長さウェイト２とする、ｂｌｏｓｕｍ６２アミノ酸置換マトリックスを用いる。二つのアミノ酸配列の最適整列に関しては、変異アミノ酸配列の連続セグメントは、参照アミノ酸配列に対して、付加的アミノ酸残基を持ってもよいし、または、アミノ酸残基を欠失させてもよい。参照アミノ酸配列との比較に用いられる連続セグメントは、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含むが、３０、４０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸残基であってもよい。誘導体のアミノ酸配列にギャップを含めたことによって生ずる配列同一性の増加に対する補正は、ギャップペナルティーを割り当てることによって実行される。

ある実施態様では、本発明によってカバーされるプロテアーゼ（例えば、配列番号２の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ）は、細菌、または真菌、例えば、糸状真菌から得られる。ある好ましい糸状真菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＳＰＰ．、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ＳＰＰ．が挙げられる。一つの好ましいＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ＳＰＰ．は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉである。しかしながら、プロテアーゼ、および／または、本発明によるプロテアーゼをコードするＤＮＡは、真菌、例えば、Ａｂｓｉｄｉａ ＳＰＰ．；Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ＳＰＰ．；Ａｇａｒｉｃｕｓ ＳＰＰ．；Ａｎａｅｒｏｍｙｃｅｓ ＳＰＰ．；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＳＰＰ．、例えば、Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａ．ｆｕｍａｒｉｃｕｓ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、およびＡ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ；Ａｅｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ ＳＰＰ．；Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｕｍ ＳＰＰ．；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ＳＰＰ．；Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ＳＰＰ．；Ｄａｃｔｙｌｌｕｍ ＳＰＰ．；Ｆｕｓａｒｉｕｍｕ ＳＰＰ．、例えば、Ｆ．ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｎｓ，Ｆ．ｄｅｃｅｍｃｅｌｌｕｌａｒｅ，Ｆ．ｊａｖａｎｉｃｕｍ、Ｆ．ｌｉｎｉ，Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，およびＦ．ｓｏｌａｎｉ；Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ＳＰＰ．；Ｈｕｍｉｃｏｌａ ＳＰＰ．、例えば、Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ；Ｍｕｃｏｒ ＳＰＰ．；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＳＰＰ．、例えば、Ｎ．ｃｒａｓｓａおよびＮ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ；Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ ＳＰＰ．；Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ ＳＰＰ．；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＳＰＰ．；Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ＳＰＰ．；Ｐｈｌｅｂｉａ ＳＰＰ．；Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ＳＰＰ．；Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ＳＰＰ．；Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ＳＰＰ．；Ｔｒａｍｅｔｅｓ ＳＰＰ．；Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ＳＰＰ．、例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ（ｌｏｎｇｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）およびＴ．ｖｉｒｄｉｅ；およびＺｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ＳＰＰ．のような真菌から得られる。

宿主細胞
ある実施態様では、本発明は、本明細書に記載されるＤＮＡ構築体およびベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。ある実施態様では、本発明によってカバーされるプロテアーゼ（例えば、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ）をコードするポリヌクレオチドであって、宿主細胞中に導入されるポリヌクレオチドは、異種プロテアーゼをコードし、別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞において過剰発現される内因性プロテアーゼをコードする。ある実施態様では、本発明は、宿主細胞、例えば、細菌および真菌宿主細胞において機能する遺伝子プロモーターの制御下における、異種プロテアーゼ遺伝子の発現、またはプロテアーゼ遺伝子の過剰発現を提供する。

ある好ましい宿主細胞としては糸状真菌細胞が挙げられる。糸状真菌宿主細胞の非限定的例として、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ＳＰＰ．（例えば、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅおよびＴ．ｒｅｅｓｅｉ、これらは、以前Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍとして分類されていた、Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａの無性形である）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＳＰＰ．、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ＳＰＰ．（例えば、Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ．ｇｒｉｓｅａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＳＰＰ．（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｏｒｚｙａｅ、および、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ＳＰＰ．（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＳＰＰ．、Ｈｙｐｏｃｒｅａ ＳＰＰ．、およびＭｕｃｏｒ ＳＰＰ．が挙げられる。さらに別の宿主細胞として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＳＰＰ．（例えば、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｒｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＢ．ｂｒｅｖｉｓ）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＳＰＰ．（例えば、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ（ＴＫ２３およびＴＫ２１））が挙げられてもよい。

分子生物学
本発明は、組み換え遺伝子工学の分野における通例技術に依存する。本発明に使用される一般的方法を開示する基本的教科書としては、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等の「分子クローニング、実験室マニュアル（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”）」第２版、１９８９年；クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）、「遺伝子の転送と発現、実験室マニュアル（“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”）」、および、アウスウーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等、「分子生物学における最新プロトコール（“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”）」（１９９４）が挙げられる。

例えば、糸状真菌の遺伝子プロモーター配列を含む異種遺伝子は、通常、複製および／または発現のために、宿主細胞、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ細胞に変形導入される前に、中間ベクターにクローンされる。これらの中間ベクターは、通常、前核細胞性ベクター、例えば、プラスミド類、またはシャトルベクターである。

クローンされた遺伝子の高レベル発現を実現するためには、異種遺伝子は、プロモーターから、天然遺伝子の場合とほぼ同じ距離離れた位置に置かれることが好ましい。しかしながら、従来技術で知られるように、この距離における若干の変動は、プロモーター機能の損失を招くこと無く容認することが可能である。

当業者であれば、天然のプロモーターは、その機能を変更することなく、１個以上のヌクレオチドの代置、置換、付加、または除去することによって修飾することが可能であることを知っている。本発明の実施は、プロモーターに対するそのような変更を含むが、そのような変更によって制限されない。

発現ベクター／構築体は、通常、該異種配列の発現に必要な全ての付加的要素を含む、転写単位または発現カセットを含む。従って、ある典型的発現カセットは、異種核酸配列に動作的に結合するプロモーターと転写物の効率的アデニル化に必要なシグナル、リボソーム結合部位、および翻訳終止を含む。カセットの付加的要素としては、エンハンサー、および、もしも構造遺伝子としてゲノムＤＮＡが使用されるのであれば、機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロンが挙げられる。

本発明の実施は、遺伝子構築体におけるプロモーターの選択によって制限されない。しかしながら、例示のプロモーターとしては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１、ｅｇ２、ｅｇ３、ｅｇ５、ｘｌｎ１、およびｘｌｎ２プロモーターがある。さらに、Ａ．ａｗａｍｏｒｉおよびＡ．ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）のプロモーター（ヌンベルク（Ｎｕｎｂｅｒｇ）等（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３１５）、およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓのアセタミナーゼのプロモーターも、ベクターへの使用が可能である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに使用されるベクターのための好ましいプロモーターは、ＡｐｒＥプロモーターであり；Ｅ．ｃｏｌｉに使用される好ましいプロモーターは、Ｌａｃプロモーターであり；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに使用される好ましいプロモーターはＰＧＫ１であり；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに使用される好ましいプロモーターはｇｌａＡであり；かつ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ用として好ましいプロモーターはｃｂｈ１である。

プロモーター配列の外に、発現カセットは、効率的な終止を実現するために、構造遺伝子の下流に転写終止領域を含まなければならない。終止領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよいし、あるいは、異なる遺伝子から得てもよい。

本発明においては、真菌のものであればいずれのターミネーターも機能性を持つと考えられるが、ある好ましいターミネーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ遺伝子（イェルトン・エム（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ）等、（１９８４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ８１：１４７０−１４７４；ムラニー・イージェイ（Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．）等、（１９８５）ＭＧＧ１９９：３７−４５）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ遺伝子（ヌンベルク・ジェイエイチ（Ｎｕｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：２３０６；ベール・イー（Ｂｏｅｌ，Ｅ）等、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１５８１−１５８５）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、およびＭｕｃｏｒ ｍｉｈｅｉのカルボキシルプロテアーゼ遺伝子（ＥＰＯ公報第０２１５５９４号）、のターミネーターが挙げられる。

遺伝子情報を細胞に輸送するために使用される、特定の発現ベクターは、特に決定的に重要とはならない。真核細胞または前核細胞における発現のために使用される通例のベクターの内の任意のものが使用可能である。標準的細菌性発現ベクターとしては、バクテリオファージλおよびＭ１３の外に、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２準拠プラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、および、融合発現システム、例えば、ＭＢＰ、ＧＳＴ、およびＬａｃＺが挙げられる。分離に好都合の方法を実現するために、組み換えタンパクに対してエピトープタグ、例えば、ｃ−ｍｙｃを付加することも可能である。好適な発現および／または統合ベクターの例は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等（１９８９）上記；ベネットおよびラシュア（Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｌａｓｕｒｅ）編「真菌における遺伝子操作の進歩（“Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ“）」（１９９１）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．７０−７６およびｐｐ．３９６−４２８、および同書の中に引用される論文；米国特許第５，８７４，２７６号；および、真菌遺伝子保存センターの真菌株カタログ（ＦＧＳＣ、ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ．）の中に挙げられている。有用なベクターは、ＰｒｏｍｅｇａおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手することが可能である。ある、有用な特異的ベクターとして、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１００、ｐＤＯＮ^ＴＭ２０１、ｐＥＮＴＲ^ＴＭ、ｐＧＥＮ^（Ｒ）３Ｚ、およびｐＧＥＮ^（Ｒ）４Ｚが挙げられる。しかしながら、本発明は、等価的機能を果たし、現に従来技術に知られる、または、これから知られるようになる他の形態の発現ベクターも含むことが意図される。従って、本発明のＤＮＡ配列の発現には、多種多様の宿主／発現ベクターの組み合わせの採用が可能である。例えば、有用な発現ベクターは、染色体の、非染色体の、および合成のＤＮＡ配列のセグメント、例えば、ＳＶ４０および既知の細菌プラスミドの既知の各種誘導体から構成されてもよい。プラスミドとしては、例えば、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＢｂ９、ｐＵＣ１９、およびそれらの誘導体を含む、Ｅｃｏｌｉ由来のプラスミド、さらに広い宿主範囲を持つプラスミド、例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ，例えば、ラムダファージの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、およびその他のＤＮＡファージ、例えば、Ｍ１３、および、糸状の、１本鎖ＤＮＡファージ、酵母プラスミド、例えば、２．ｍｕプラスミドまたはその誘導体が挙げられる。

ある実施態様では、発現ベクターは選択可能なマーカーを含む。選択可能なマーカーとしては、抗菌剤耐性を付与するものが挙げられる。栄養マーカー、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、およびｐｙｒ４のような従来技術で既知のマーカーを含む栄養マーカーも本発明において使用される。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの形質転換に有用なマーカーは、従来技術で既知である（例えば、フィンケルスタイン（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ）、６章、「糸状真菌の生物工学」、フィンケルスタイン等、ＥＤＳ Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、ボストン、マサチューセッツ州（１９９２）、および、キングホーン（Ｋｉｎｇｈｏｒｎ）等、（１９９２）、「糸状真菌の応用分子遺伝学（”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ“）」Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、ロンドンを参照されたい）。ある実施態様では、発現ベクターはまた、レプリコン、組み換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能とする、抗生物質耐性をコードする遺伝子、および、異種配列の挿入を可能とするために、非必須領域に独特の制限部位を含んでもよい。選ばれる、特定の抗生物質耐性遺伝子は決定的に重要ではなく、従来技術で既知の多くの耐性遺伝子の内のいずれものでも好適である。前核細胞配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉにおけるＤＮＡの複製または統合を妨げないように選択されることが好ましい。

本発明の形質転換法によって、形質転換ベクターの一部または全てが、宿主細胞、例えば、糸状真菌宿主細胞のゲノムの中に安定的に統合される。しかしながら、自己複製、染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換も本発明の範囲内である。

大量のプロテアーゼを発現する、細菌および糸状真菌（例えば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞系統を生み出すために、多くの標準的トランスフェクション法を用いることが可能である。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのセルラーゼ産生株の中にＤＮＡ構築体を導入するための公表された方法のいくつかを述べると、ロリート、ヘイエス、ジピエルト、およびハーマン（Ｌｏｒｉｔｏ，Ｈａｙｅｓ，ＤｉＰｉｅｒｔｏ ａｎｄ Ｈａｒｍａｎ）、（１９３３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４９−３５６；ゴールドマン、バンモンターギュ、およびヘレラ・エストレヤ（Ｇｏｌｄｍａｎ，ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ ａｎｄ Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）（１９９０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９−１７４；および、ペンチラ、ナバレイネン、ラット、サルミネン、およびノウレス（Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｒａｔｔｏ，Ｓａｌｍｉｎｅｎ ａｎｄ Ｋｎｏｗｌｅｓ）（１９８７）Ｇｅｎｅ ６：１５５−１６４が挙げられる。さらに、米国特許第６，０２２，７２５号、米国特許第６，２６８，３２８号、およびネバライネン（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ）等、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの分子生物学、および、同種および異種遺伝子の発現に向けたその応用（“Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ“」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，レオンおよびベルカ（Ｌｅｏｎｇ ａｎｄ Ｂｅｒｋａ）編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，ニューヨーク州（１９９２）ｐｐ１２９−１４８を参照されたい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓについては、イェルトン、ヘイマー、およびティンバーレイク（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｈａｍｅｒ，ａｎｄ Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ）（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４を；Ｆｕｓａｒｉｕｍについては、ベイジャー、ポディラ、およびコラッツクディ（Ｂａｊａｒ，Ｐｏｄｉｌａ，ａｎｄ Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ）（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８２０２−８２１２を；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓについては、ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）等、１９８５、「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの遺伝子操作：実験室マニュアル（”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ“）」、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ、英国、およびフェルナンデス・アバロス（Ｆｅｎｒｎａｎｄｅｚ−Ａｂａｌｏｓ）等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４９：１６２３−１６３２（２００３）；および、Ｂａｃｉｌｌｕｓについては、ブリジディ、デロッシ、ベルタリニ、リッカルディ、およびマッテウッツィ（Ｂｒｉｇｉｄｉ，ＤｅＲｏｓｓｉ，Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，Ｒｉｃｃａｒｄｉ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ）（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５−１３８）が挙げられる。

しかしながら、宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための、よく知られた過程の内の任意のものの使用が可能である。そのような過程としては、リン酸カルシウムの使用、トランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ、リポソーム、マイクロインジェクション、プラスマベクター、ウィルスベクター、および、クローンされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ，合成ＤＮＡ、または、他の外来遺伝物質を、宿主細胞に導入するための、その他の、既知の、任意の方法（例えば、サムブルック等、上記参照）が挙げられる。さらに、米国特許第６，２５５，１１５号に記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介トランスフェクション法も使用される。使用される特定の遺伝子工学過程は、少なくとも１個の遺伝子を、該遺伝子を発現することが可能な宿主細胞に適切に導入することが可能でありさえすればよい。一つの実施態様では、本発明は、本発明によってカバーされるプロテアーゼ（例えば、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ）を生産するための方法に関する。この方法は、プロテアーゼ、例えば、ＮＳＰファミリ・プロテアーゼをコードする核酸に対して動作的に結合するプロモーターを含むポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すること、プロテアーゼの発現と生産のために好適な培養条件下に宿主細胞を培養すること、および、前記プロテアーゼを生産することを含む。ある好ましい実施態様では、プロテアーゼは、配列番号２、または配列番号１０、またはそれらの生物学的活性を持つ断片に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼである。

発現ベクターが細胞に導入された後、そのトランスフェクトされた、または形質転換された細胞は、プロテアーゼ遺伝子のプロモーター配列の制御下に、遺伝子発現を促進する条件下に培養される。大型バッチの形質転換細胞を、後述の実施例３に記載するやり方で培養することが可能である。最後に、産物は、標準技術によって培養物から回収される。

上記から、本明細書の発明は、所望のポリペプチドの発現および分泌増大を実現する。すなわち、該ポリペプチドの発現は、天然プロテアーゼ遺伝子、融合ＤＮＡ配列、および各種異種構築体を含む遺伝子プロモーター配列によって制御される。本発明はまた、このような所望のポリペプチドを高レベルで発現し、分泌するための過程を提供する。

タンパクの発現
本発明のタンパクは、ベクター、例えば、その発現が遺伝子プロモーター配列によって制御される遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換された細胞を培養することによって生産される。本発明は、タンパク、例えば、本発明によってカバーされるプロテアーゼの細胞内および／または細胞外生産を強化するのに特に有用である。前記遺伝子の発現にとって好適な条件とは、本発明の、誘導飼料組成物を培養物に供給することを含む。タンパク生産のための最適条件は、宿主細胞の選択、および、発現されるプロテアーゼタンパクの選択と共に変動する。そのような条件は、当業者であれば、通例の実験または最適化によって簡単に確認される。

所望のプロテアーゼタンパクは、発現後、分離または回収し、精製してよい。所望のタンパクは、サンプルの中に他にどのような成分が存在するかに応じて、当業者に既知の様々なやり方に従って分離または精製してよい。標準的精製法としては、電気泳動的、分子、免疫学的、およびクロマトグラフィック技術、例えば、イオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、およびクロマトフォーカシングが挙げられる。例えば、興味のタンパクは、標準的、所望の抗タンパク抗体カラムを用いて精製してもよい。好適な精製技術に関する一般的案内については、「概観、タンパク精製（”Ｓｃｏｐｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ“）」（１９８２）を参照されたい。必要な精製の程度は、所望のタンパクの用途に応じて変動する。ある実施態様では、精製は必要とされない。

細胞培養
宿主細胞および形質転換細胞は、通常の栄養媒体中で培養することが可能である。形質転換された宿主細胞用の培養媒体は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択するために適当に修飾してもよい。特異的培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞のために使用されるものであってよく、当業者には明白である。さらに、好ましい培養条件は、科学的文献、例えば、サムブルック（１９８２）上記；キーサー・ティー、エムジェイ・ビブ、エムジェイ・バットナー、ケーエフ・チェイター、およびディーエー・ホップウッド（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ，ＭＪ．Ｂｉｂｂ，ＭＪ．Ｂｕｔｔｎｅｒ，ＫＦ．Ｃｈａｔｅｒ，ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ）（２０００）「ストレプトミセス遺伝学実技（“ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ”）」Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ、英国；ハーウッド（Ｈａｒｗｏｏｄ）等（１９９０）「バチルスのための分子生物学的方法（“ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＢＡＣＩＬＬＵＳ”）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、および／または、米国基準株保存機関（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）に見出すことが可能である。真菌宿主細胞、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ細胞中の、安定な形質転換細胞は、それらがより急速な成長速度を持つこと、または、固相の培地において、ギザギザではなく、滑らかな輪郭を持つ円形コロニーを形成することによって、不安定な形質転換細胞とは一般的に区別される。

発現されたポリペプチドの回収およびプロテアーゼの精製法
形質転換宿主細胞によって生産される、本発明によってカバーされるポリペプチド、例えば、配列番号１０に対し少なくとも８０％の配列同一性を持つポリペプチドは、通例の過程、例えば、遠心またはろ過によって、培養液から宿主細胞を分離すること、または、要すれば、細胞を破壊して、細胞分画と残留物から上清を取り出すことを含む過程によって、培養液から回収してもよい。ある場合には、澄明化後、上清またはろ液のタンパク様成分を、塩、例えば、硫酸アンモニウムを用いて沈殿させる。次に、この沈殿したタンパクを可溶化し、各種クロマトグラフィー手法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびその他の従来技術で認知済みの手法によって精製してよい。ペプチドおよびタンパクに対する抗体は、動物、例えば、ウサギまたはマウスを免疫化し、従来法によって抗ＮＳＰ２４プロテアーゼ抗体を回収することによって製造される。

本発明に使用されるアッセイは、ＰＣＴ特許ＷＯ９９３４０１１および米国特許ＵＳＰ６，６０５，４５８に記載されるものを含むが、ただしそれらに限定されない。

組成物および応用
ある実施態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明のプロテアーゼを含む組成物を指向する。本発明による組成物および応用において有用なプロテアーゼの、ある非限定的例としては、例えば、ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼまたはＮＳＰ２５ファミリ・プロテアーゼ、さらに詳細には、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を持つＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ、または、その生物学的に活性な断片、例えば、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つプロテアーゼが挙げられる。ある実施態様では、この酵素組成物は、単一酵素成分プロテアーゼ組成物である。ある実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼを産業および商業用途に用いる方法を指向する。組成物および産業用途に関する下記の説明は、例示的であって、非内包的であることが意図される。

本発明のプロテアーゼを含む組成物は、さらに別の酵素、例えば、グルコアミラーゼ、アルファアミラーゼ、顆粒でん粉加水分解酵素、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼ、ヘミセルラーゼ、オキシダーゼ、およびそれらの組み合わせを含んでもよい。

ある好ましい実施態様では、組成物は、配列番号１０の配列に対し少なくとも約８５％の配列同一性を有する、本発明のプロテアーゼ、およびグルコアミラーゼを含む。グルコアミラーゼは、糸状真菌の供給源、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ、またはＲｈｉｚｏｐｕｓの株から得られた野生型グルコアミラーゼであってもよいし、あるいは、グルコアミラーゼは、タンパク加工されたグルコアミラーゼ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼの変種であってもよい。別の好ましい実施態様では、組成物は、本発明のプロテアーゼおよびアルファアミラーゼを含む。ある実施態様では、アルファアミラーゼは、細菌供給源、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＳＰＰ．、あるいは、真菌供給源、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＳＰＰ．から得られてもよい。ある実施態様では、組成物は、本発明によるプロテアーゼ、およびグルコアミラーゼとアルファアミラーゼの両酵素を含んでもよい。これらの酵素の市販供給源は既知であり、例えば、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．およびＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから入手することが可能である。

いくつかの実施態様では、本発明は、エタノール生産、製パン、フルーツジュース生産、醸造、蒸留、ワイン製造、皮革、油脂、紙およびパルプ、および動物飼料生産における使用を意図している。

別の実施態様では、本発明が考慮の対象とするものは、洗剤およびクリーニング製品の、活性を持つ「生物学的」成分である。この場合、プロテアーゼ、アミラーゼ、およびリパーゼは、タンパク、でん粉、および脂肪の染みを分解するために使用される。本発明の実施態様は、安定性試験を行い、様々な処方で試験することによって、酵素の、洗剤組成物に対する適合性を試験することを含む。

さらに別の実施態様では、本発明は、でん粉を液化および糖化してグルコースに変換するため、および異性化してフルクトースに変換するための酵素的使用を考えた。本発明は、大容量の植物基質、例えば、穀粒（例えば、コーン、小麦、ミロ、ライ麦等）を甘味料、例えば、高濃度フルクトースコーンシロップ、およびマルトースシロップに変換するのに用いてもよい。

本発明の酵素（単数または複数）は、タンパクの消化性を上げるために、食品および家畜飼料産業にも応用される。このプロテアーゼはまた、各種産業用途、特に、織物、リトグラフ、化学的芸術、農業、環境廃棄物変換、バイオパルプ処理、バイオマスの燃料への転換、およびその他の化学的過程（単複）にも使用される。さらに、本プロテアーゼは、保健およびパーソナルケア製品、例えば、化粧品、スキンケア、歯磨き等に使用される。

飼料
本明細書に記載される酵素は、植物材料、例えば、コーン、小麦、モロコシ、大豆、カノーラ油、ひまわり油、または、上記植物材料の内の任意の複数の混合物、または、ニワトリ、ブタ、反芻動物、水産養殖、およびペット用の植物タンパク供給源を含んでもよい。性能パラメータ、例えば、成長、飼料摂取、および飼料効率ばかりでなく、均一性の改善、動物舎におけるアンモニア濃度の低下、およびその結果として得られる、動物の福祉と健康状態の改善ももたらされることが考慮される。

食品
食物タンパクの加水分解産物は、市場において、小さいが、重要な部分を占める。この調製品は、術後患者、または、消化系が損なわれた個人のために使用される。加水分解産物は、それ自体比較的未精製の調製品として与えられる（クレッグ（Ｃｌｅｇｇ）、１９７８、「新しいタンパク食品の生化学的側面（”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｏｄ“）」ジェイ・アドゥラー−ニッセン、ビーオー・エッガム、エル・マンク、およびエイチエス・オルセン（Ｊ，Ａｄｌｅｒ−Ｎｉｓｓｅｎ，Ｂ．Ｏ．Ｅｇｇｕｍ，Ｌ，Ｍｕｎｋ，＆ Ｈ．Ｓ．Ｏｌｓｅｎ）編、ｐ．１０９−１１７、Ｐｅｒｇａｍｏｎ，オックスフォード）。あるいは、静脈投与用の高度に精製されたアミノ酸混合物として投与される。ミルクタンパクの酵素加水分解産物は、食事調製品として従来から運用されている。

筋肉食品、特に肉の酵素による軟化は、市場の大きなセグメントを占めるが、現在、これは、植物プロテアーゼおよびいくつかの微生物酵素によって代表される。魚肉の酵素的熟成および軟化も、多くの国々において相当の重要性を持つ。従って、ここに記載の酵素は、食品において様々な用途に使用される。

さらに、本発明の酵素、または酵素組成物は、例えば、植物タンパク、例えば、大豆、豆、ルピナス、または菜種タンパク、ミルク様カゼイン、獣肉タンパク、または魚肉タンパクからタンパク加水分解産物を製造するのに有用と考えられる。本明細書に記載されるタンパク（単複）は、食品、飼料、または医用製品を製造する際に、可溶性、均一性、または醗酵性の改善、抗原性の低下、加水分解産物の苦味の減少、またはその他の目的のために使用してもよい。本明細書に記載される酵素（単複）は、単独で使用してもよいし、または他のペプチダーゼと、または他の酵素、例えば、エキソペプチダーゼと共に使用してもよい。エキソペプチダーゼ高含有酵素調製品と共に、本明細書に記載される酵素（単複）を使用した場合、それは、タンパク加水分解産物の味を改善する。

さらに、酵素または酵素組成物は、魚肉または獣肉の処理に、例えば、組織および／または粘度を変えるために使用してもよい。

皮革
皮革製造産業は、生皮を洗浄し、脱毛し、最後にそれを鞣し、乾燥することを含む一連の工程に依存する。酵素処理は、脱毛工程において重要な役割を担う。すなわち、この工程は、タンパク分解酵素を与えることによって実現されるが、本発明のペプチドは加水分解するので、現在皮革製造に使用される哺乳動物のプロテアーゼの有効な代替品となる。両方とも、高いタンパク分解活性を持ち、かつ、低ｐＨでも効率が高いからである。

ウールおよびシルク
本明細書に記載されるプロテアーゼは、ウール製品に対し所望の性質を付与するために、その工業的処理に使用される。一つの実施態様では、本発明は、織物処理用の組成物を提供する。この組成物は、例えば、シルクまたはウールを処理するために使用することが可能である（例えば、ＲＥ２１６，０３４；欧州特許ＥＰ１３４，２６７；米国特許ＵＳ４，５３３，３５９；欧州特許ＥＰ３４４，２５９を参照されたい）。

本発明の方法は、線維、例えば、ケラチン線維を含むタンパクを処理するのに用いることが可能である。この方法は、ヒツジ、ヤギ、リャマ、ラクダ、ウサギ等から得られた、ウール、ウール線維、または動物の毛、例えば、アンゴラ、モヘア、カシミヤ、アルパカ、またはその他、商業的に有用な動物毛糸製品を処理するのに好適である。さらに、シルク、くも糸シルク、またはヒトの毛髪も、本発明の方法で処理することが可能である。線維は、線維、トップ、より糸、または織った、または編んだ布または衣類の形を取ってもよい。

洗浄
本発明はまた、本発明のプロテアーゼ（単複）を含む洗浄組成物にも関する。この洗浄組成物は、洗浄組成物に一般に使用される添加物をさらに含んでもよい。これらは、漂白剤、界面活性剤、油脂、酵素、および漂白触媒の中から選んでもよいが、ただしこれらに限定されない。当業者には、組成物に含めるにはどの添加物が好適であるかは直ちに明白であろう。本明細書に提示されるリストは、決して網羅的なものではなく、好適な添加物の例示としてのみ受け取るべきである。また、当業者には、酵素、および、組成物における他の成分、例えば、界面活性剤と適合する添加物のみを使用すべきであることは直ちに明白であろう。

タンパク、特に、本発明のタンパクは、約０．０１から約５重量％（好ましくは０．１％から０．５％）の濃度で、３．５と７．０の間の酸性ｐＨを持つ、既知の、粉末状および液状界面活性剤として処方することも可能である。ある実施態様では、これらの界面活性洗浄組成物はさらに、他の酵素、例えば、アミラーゼ、さらに別のプロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、または、エンドグリコシダーゼの外に、油脂および安定化剤を含む。ある実施態様では、ｐＨは、４．０と６．５の間、好ましくは４．０と５．６の間である。これは、要求される活性レベルに応じて、その最適ｐＨにより酸性プロテアーゼと呼ばれるが、これらの酵素をｐＨ７−９において使用することも可能である。

通例の洗浄組成物にタンパクを添加することは、何ら特別な使用制限を要求することにはならない。言い換えれば、界面活性剤にとって好適な任意の温度およびｐＨはまた、ｐＨがまた上述の範囲にあり、温度が前述のタンパク変性温度よりも低い限り、本発明の組成物にとって好適である。さらに、本発明のタンパクは、界面活性剤無しで、再び単独で、または、油脂および安定化剤と組み合わせて、洗浄組成物において使用される。

タンパク処理
タンパク原材料の酵素的加水分解は、結果としてしばしば、苦味ペプチドの形成をもたらす（クレッグ（Ｃｌｅｇｇ）１９７８）。タンパク加水分解産物に見られる苦味ペプチドは、無視できない実際的問題を生ずる。例えば、様々なタイプのチーズの熟成、および、食品としてのタンパク加水分解産物の生産に認められる問題がそれである。加水分解産物の苦味は、通常、特定のペプチド、特に、高い割合の疎水性アミノ酸を含むペプチドによる。苦味は、苦いペプチドの完全な、または部分的加水分解によって効果的に緩和される。従って、本明細書に記載される酵素は、食物の苦味除去に使用される。本発明の酵素、または酵素組成物は、食品のために、タンパクおよび／またはタンパク加水分解産物の苦味緩和のために使用されてもよい。

本発明に従ってさらに考慮の対象となるのは、タンパクおよび／またはタンパク加水分解産物から出る遊離アミノ酸の生産である。遊離アミノ酸がグルタミン酸である場合は、それは、食品の風味を強化する。

前記タンパクまたはタンパク分解産物は、動物または植物起源のものであってよい。本発明のある実施態様では、加水分解されるタンパクは、カゼイン、または大豆タンパクである。

タンパクは、チーズのような食品、および、ココアを含む食品を生産するために使用されてもよい。

本明細書に記載される酵素（単複）、本発明のある酵素が濃縮された酵素調製品は、苦味の無いタンパクまたはタンパク加水分解産物に関連して使用されると特に好都合ではあるけれども、本明細書に記載される酵素（単複）は、いくつかの産業用途、例えば、タンパク含有物質、例えば、細胞壁の分解または修飾を含む用途のために使用することが可能である。従って、本明細書に記載される酵素（単複）は、植物細胞壁の分解または修飾を促進する。

本発明の酵素調製品の用量、および、該調製品が使用される、その他の条件は、従来技術で既知の方法に基づいて決められてよい。

タンパク沈殿もまた、ある種の製品、例えば、ビールの場合無視できない問題を構成する場合がある。なぜなら沈殿によって製品が濁るからである。ビールでは、ビールの冷凍保存の際、可溶性タンパクが沈殿すると濁りが生じる。問題は、無視できない経済的重要性を持つが、ビール製造のために好適な生原料を選ぶこととは別に、この問題を回避する現在主流のやり方は、ビールにタンパク分解酵素を添加することである。

パーソナルケア
ある実施態様では、本明細書に記載されるプロテアーゼが合成され精製されたならば、有効量が、パーソナルケア製品に使用される、パーソナルケア組成物（単複）に添加される。パーソナルケア製品は、化粧品、パーソナルケア用途に使用される「大衆薬品」（“ＯＴＣ”）化合物（例えば、化粧品、スキンケア、口腔ケア、ヘアケア、ネイルケア）に分類される。ある実施態様では、本明細書に記載されるプロテアーゼは、パーソナルケア組成物、例えば、ヘアケア組成物、スキンケア組成物、ネイルケア組成物、化粧組成物、または、それらの任意の組み合わせに添加される。従って、酵素または酵素調製品は、例えば、コンタクトレンズ洗浄液、歯磨き、化粧品、およびスキンケア製品に使用されてもよい。

甘味料
本明細書に記載されるプロテアーゼは、マルトースまたはフルクトース高濃度シロップの外、他の甘味料の生産にも使用される。醗酵可能な糖類、または糖類に変換が可能な組成物を含む原材料は、通常、でん粉含有植物材料、例えば、根茎、根、茎、穀類の小塊および粒（例えば、コーン、小麦、ミロ、大麦、およびライ麦）、および、糖含有原材料、例えば、砂糖大根、砂糖黍、果実材料、および糖蜜を含むが、ただしこれらに限定されない。

プレバイオティクス
酵素調製品は、他のタンパク分解活性から事実上独立したクローン酵素を用いることが有利な場合、タンパクからペプチドを生産する際に有用であると考えられる。

適当なタンパク源を加水分解するのに本明細書に記載する酵素（単複）（例えば、精製酵素）を用いることによって、遊離アミノ酸およびペプチドの未精製調製品を生産することが可能となる。この調製品は、成長のためにアミノ酸に対して特異的要求を持つ微生物に対する基質として極めて好適である。

これは、工業的醗酵で使用される相当数の微生物の場合に当てはまる。必要なアミノ酸の補給が、このような醗酵過程の経済的維持にとって重要因子となる場合がよくある。酵素を投与することによって生産されるアミノ酸調製品は、実験室においても、大型の工業規模の醗酵においても基質として好適である。

本明細書に記載される酵素（単複）はまた、機能的ペプチド、前生物的合成品等を生体内で生産するために使用されてもよい。「プレバイオティクス」という用語は、消化管、好ましくは、大腸における１種、または少数種の細菌の成長および／または活性を選択的に刺激することによって宿主に対し有益な影響を及ぼす、食品または飼料組成物を指す。

醗酵およびバイオエタノール
本発明のプロテアーゼ組成物を用い、でん粉含有基質を醗酵して得られるアルコールの生産は、燃料用アルコールまたは携帯用アルコールの生産を含んでよい。ある実施態様では、酵素組成物は、大麦、モルト、および、その他の、例えば、ビール生産のための原料の酵母醗酵を促進するために使用されてもよい。

アミラーゼは、醸造および製パン工業にとって不可欠の酵素である。アミラーゼは、モルト形成、および、添加糖類またはその他の炭水化物が無添加の状態で実行される、ある種の製パン過程において、でん粉を分解するのに必要とされる。これらの酵素の十分な活性度を確保することは、特にモルト調製工業では問題である。生理的に受容可能なシステムによってアミラーゼの活性を十分に増大させる方法は、より速やかなモルト形成を可能とする方法をもたらし、糖の利用可能性が増大することから、炭水化物含量の少ないアルコール飲料、例えば、ビールをもたらす。

ある実施態様では、でん粉含有基質、例えば、穀粒（例えば、コーン、小麦、モロコシ）、小塊、および他の植物残留物の加水分解によって、アルコール、例えばエタノールが生産される。アルコール生産の方法は、「アルコール教科書−飲料、燃料、および工業的アルコール事業の参照資料（“Ｔｈｅ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｅｖｅｒａｇｅ，Ｆｕｅｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，”）」３版、ケーエー・ジャック（Ｋ．Ａ．Ｊａｃｑｕｅｓ）等編、１９９９年、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，英国に記述される。本発明のある実施態様では、プロテアーゼは、糖化および醗酵結合工程、別に糖化・醗酵同時工程とも呼ばれる工程において、組成物の中で、グルコアミラーゼと、かつ要すれば任意にアルファアミラーゼと組み合わせて使用される。「Ｓ．Ｌｅｗｉｓの工業醗酵学（”Ｓ．Ｌｅｗｉｓ ｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ“）」、２．１章「アルコール発酵（”Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｌｃｏｈｏｌ”）」、２版、ティー・ゴッドフリーおよびエス・ウェスト（Ｔ．Ｇｏｄｆｒｅｙ ａｎｄ Ｓ．Ｗｅｓｔ）編、（１９９６）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州を参照されたい。真菌酸性プロテアーゼをグルコアミラーゼと組み合わせて用いた醗酵によってエタノールを生産する方法は既知である。例えば、米国特許ＵＳＰ５，２３１，０１７は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒから得られたプロテアーゼを用いてエタノールを生産する方法であって、液化マッシュを獲得すること、および、醗酵工程と結合させてもよい糖化工程において液化マッシュにプロテアーゼを導入することを含む方法を開示する。ある実施態様では、本発明のプロテアーゼ組成物は、顆粒状でん粉基質による非加熱過程において、アルコール、例えば、エタノールを生産するために用いられる。該過程は、アルコールを生産するために用いられる基質において、でん粉のゲル化温度未満の温度において実行される。でん粉加水分解過程において使用されるプロテアーゼの量は、プロテアーゼの酵素活性に依存する。ある実施態様では、その量は、２０−３３％乾燥固体に調整したスラリー４５０ｇに対するプロテアーゼ２％液の添加量として０．００１から２．０ｍｌの範囲である。その際、スラリーは、糖化時および／または加水分解でん粉における液化マッシュである。他の有用な範囲としては、０．００５から１．５ｍｌ、および０．０１から１．０ｍｌも挙げられる。

プロテアーゼで処理された種子または穀粒は、醗酵過程によって生産されるモルトおよび飲料の生産に有利である。

さらに、穀粉の中のタンパクを加水分解し、後続のアルコール発酵段階を予期してワートの可溶性窒素を濃縮するために、糖化においてもプロテアーゼを使用することが望ましい。穀粒におけるアミラーゼ活性の強化は、モルト形成において重要な発芽の速度と効率を増す。すなわち、酵素活性が強化されたモルトの生産は、でん粉が醗酵可能な炭水化物へ転換される加水分解の強化をもたらすので、アルコール飲料、例えば、ビールおよびスコッチウィスキーの生産における醗酵効率を向上させる。

以下の実施例では、下記の略語が使用される。ｅｑ（当量）、Ｍ（モル）、μＭ（マイクロモル）、Ｎ（規定）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｋｇ（キログラム）、μｇ（マイクログラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、℃（摂氏度）、ｈ（時）、ｍｉｎ（分）、ｓｅｃ（秒），ｍｓｅｃ（ミリ秒）、Ｃｉ（キュリー）、ｍＣｉ（ミリキュリー）、μＣｉ（マイクロキュリー）、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）、Ｔｓ（トシル）、Ｂｎ（ベンジル）、Ｐｈ（フェニル）、Ｍｓ（メシル）、Ｅｔ（エチル）、Ｍｅ（メチル）、ｄｓまたはＤＳ（乾燥固体重量）、ＳＡＰＵ（酸性プロテアーゼ分光光度単位）で、１ＳＡＰＵは、アッセイ条件下、１分当たりカゼイン基質から１マイクロモルのチロシンを解放するプロテアーゼの酵素活性量であり、ＧＡＵ（グルコアミラーゼ単位で、ｐＨ４．２および６０℃において、１時間当たり可溶性でん粉基質から、グルコースとして計算される１ｇの還元性糖を生産する酵素の量と定義される）。

本発明は、下記の実施例においてさらに詳細に記述される。これらの実施例は、いかなる意味でも、請求される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。付属の図面は、本発明の明細および説明の、一体化部分と考慮されるべきことが意図される。引用される参照文献は全て、そこに記載される全てに対する参照によって、それぞれ個別に本明細書に含める。下記の実施例は、本発明を例示するためにであって、請求される本発明を限定するために提示されるものではない。

新規プロテアーゼＮＳＰ２４の、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＤＮＡクローニング
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＱＭ６ａからゲノムＤＮＡを抽出した。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉゲノムのｃｏｎｔｉｇ１−５５００に見出されたプロテアーゼ配列候補（Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉゲノムｖ１．０）に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計した。順行プライマーは、ｐＥＮＴＲ／Ｄベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への方向性クローニングのためのモチーフを含んでいた。

ａｆｐ６ｆプライマーの配列は、ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号１１）であり、ａｆｐ７ｒの配列は、ＴＴＡＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧ（配列番号１２）であった。１．３ｋｂのＰＣＲ産物をゲル抽出（ゲル精製キット、Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙシステムプロコールに従ってｐＥＮＴＲ／Ｄにクローンした。

次に、このベクターを、化学的にコンピテントとしたＴｏｐ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて形質転換させ、カナマイシン選択した。いくつかの独立クローンから得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化し、適正なサイズの挿入体であることを確認した。いくつかのクローンにおいて、プロテアーゼ遺伝子挿入体の配列を決定した（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）。一つのクローンからのプラスミドＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ＿５５．３を、ｐＴｒｅｘ３ｇ／ａｍｄＳ表示ベクターＤＮＡとのＬＲクロナーゼ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙシステム）に加えた。ｐＴｒｅｘ３ｇベクターは、ｐＵＣ１１８ファージミドベクターであるＥ．ｃｏｌｉのｐＳＬ１１８０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．，ニュージャージー州）に基づくもので、ＷＯ０５／００１０３６に記載される。このＬＲクロナーゼ反応における組み換えによって、表示ベクターのＣｍＲおよびｃｃｄＢ遺伝子は、ｐＥＮＴＲ／Ｄ＿５５．３由来のＴ．ｒｅｅｓｅｉプロテアーゼによって置換された。この組み換えによって、プロテアーゼは、ｃｂｈｌプロモーターと表示ベクターのターミネーターとの間に方向性をもって挿入された。４４および５０ｂｐの組み換え部位配列が、それぞれ、プロテアーゼ遺伝子の上流および下流に留まった。ＬＲクロナーゼ反応液の分液を、化学的にコンピテントとされたＴｏｐ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換させ、一晩培養し、カルベニシリン選択した。いくつかのクローンから得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化し、適正な挿入体サイズを確認した。クローンからのプラスミドＤＮＡ、ｐＴｒｅｘ３ｇ＿５５．３．１をＸｂａｌＩで消化して、ｃｂｈｌプロモーター：ＮＳＰ２４プロテアーゼ：ターミネーター：ａｍｄＳを含む発現カセットを放出させた。この５．８ｋｂのカセットを、標準技術を用いてアガロースゲル抽出によって精製し、市販株ＱＭ６ａから得られたＴ．ｒｅｅｓｅｉ株の中で形質転換させた（ＰＣＴ国際特許ＷＯ０５／００１０３６を参照）。図５、６、および７を参照されたい。

新規プロテアーゼＮＳＰ２５の、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＤＮＡクローニング
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＱＭ６ａからゲノムＤＮＡを抽出した。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉゲノムのｃｏｎｔｉｇ２２−２６３４００に見出されたプロテアーゼ配列候補（ＪＧＩ Ｔ．ｒｅｅｓｅｉゲノムｖ１．０）に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計した。順行プライマーは、ｐＥＮＴＲ／Ｄベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への方向性クローニングのためのモチーフを含んでいた。

ａｆｐ８ｆプライマーの配列は、ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＴＴＧＧＣＡＧ（配列番号１３）であり、ａｆｐ９ｒの配列は、ＣＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号１４）であった。１．２ｋｂのＰＣＲ産物をゲル抽出（ゲル精製キット、Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙシステムプロコールに従ってｐＥＮＴＲ／Ｄにクローンした。次に、このベクターを、化学的にコンピテントとしたＴｏｐ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて形質転換させ、カナマイシン選択した。いくつかの独立クローンから得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化し、適正なサイズの挿入体であることを確認した。いくつかのクローンにおいて、プロテアーゼ遺伝子挿入体の配列を決定した（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）。一つのクローンからのプラスミドＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ＿２２．２を、ｐＴｒｅｘ３ｇ／ａｍｄＳ表示ベクターＤＮＡとのＬＲクロナーゼ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙシステム）に加えた。このＬＲクロナーゼ反応における組み換えによって、表示ベクターのＣｍＲおよびｃｃｄＢ遺伝子は、ｐＥＮＴＲ／Ｄ＿２２．２由来のＴ．ｒｅｅｓｅｉプロテアーゼによって置換された。この組み換えによって、プロテアーゼは、ｃｂｈｌプロモーターと表示ベクターのターミネーターとの間に方向性をもって挿入された。４４および５０ｂｐの組み換え部位配列が、それぞれ、プロテアーゼ遺伝子の上流および下流に留まった。ＬＲクロナーゼ反応液の分液を、化学的にコンピテントとされたＴｏｐ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換させ、一晩培養し、カルベニシリン選択した。いくつかのクローンから得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化し、適正な挿入体サイズを確認した。クローンからのプラスミドＤＮＡ、ｐＴｒｅｘ３ｇ＿２２．２＃１をＸｂａｌＩ（かつ、細菌のバックボーンを消化して小型断片とするためにＥｃｏＲＩ）で消化して（小型断片は電気泳動中カセットから移動して遠ざかった）、ｃｂｈｌプロモーター：ＮＳＰ２５プロテアーゼ：ターミネーター：ａｍｄＳを含む発現カセットを放出させた。この５．７ｋｂのカセットを、標準技術を用いてアガロースゲル抽出によって精製し、市販株ＱＭ６ａから得られたＴ．ｒｅｅｓｅｉ株の中で形質転換させた。形質転換用に用いたプラスミドは、ＮＳＰ２４挿入体が、ＮＳＰ２５配列で置換されたことを除いては、図７に描かれるプラスミドと事実上同じであった。

ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＰＥＧ真菌の形質転換
胞子形成中の菌糸から得られた２ｃｍ^２の寒天プラグを、２５０ｍｌの、４つの溝を有するバッフルフラスコに納めた５０ｍｌのＹＥＧブロスに接種し、３７℃で１６−２０時間２００ｒｐｍにてインキュベートした。液体容量を５０ｍｌの円錐チューブに移し、１０分間２５００ｒｐｍで回転させて菌糸を回収した。上清を吸引除去した。この菌糸ペレットを、４０ｍｌのフィルター滅菌β−Ｄ−グルカナーゼ（ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）液を含む、２５０ｍｌの、０．２２μｍＣＡコーニングフィルター瓶に移し、３０℃、２００ｒｐｍで２時間インキュベートした。菌糸を、滅菌Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，ラホヤ、カリフォルニア州）を通して、５０ｍｌの円錐形遠心チューブに集め、２０００ｒｐｍで５分遠心し、吸引した。ペレットを、５０ｍｌの１．２Ｍソルビトールで一度洗浄し、再び遠心し、吸引し、２５ｍｌのソルビトール／ＣａＣｌ_２で洗浄した。ヘモサイトメーターを用いてプロトプラストをカウントし、遠心し、吸引し、１．２５×１０^８／ｍｌのプロトプラスト濃度を与えるのに十分な容量のソルビトール／ＣａＣｌ_２に再懸濁させた。形質転換反応当たり２００μｌの分液を用いた。２０μｇのＤＮＡ（≧１μｇ／μｌ）を１５ｍｌの円錐形チューブに移し、チューブを氷の上に置いた。２００μｌのプロトプラストを加えた。５０μｌのＰＥＧを加え、穏やかに掻き混ぜ、氷上で２０分インキュベートした。２ｍｌのＰＥＧをチューブに加え、室温で５分インキュベートした。４ｍｌのソルビトール／ＣａＣｌ_２（合計６．２５ｍｌ）をチューブに加えた。この形質転換混合物を、各オーバーレイ当たり〜２ｍｌの、３分液に分割した。この２ｍｌを、溶融アセタミドソルビトール上層寒天のチューブに加え、オーバーレイ混合物を、アセタミドを唯一の窒素源として増殖することのできる形質転換体を選ぶためにアセタミドソルビトールプレートの上に注いだ。プレートを、コロニーが出現するまで２８−３０℃でインキュベートした。形質転換体は、単一コロニーをアセタミド媒体（ソルビトール無添加アセタミドソルビトール処方）にて繰り返し継代することによって精製した。

材料
４０ｍｌのβ−Ｄ−グルカナーゼ液：６００ｍｇのβ−Ｄ−グルカナーゼ；４００ｍｇのＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ；および、４０ｍｌの１．２Ｍソルビトール。

２００ｍｌのＰＥＧ混合液：５０ｇのＰＥＧ４０００（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｐｏｏｌｅ、英国）および１．４７ｇのＣａＣｌ_２．２Ｈ_２ＯをＭｉｌｌｉ Ｑ水にて調製。

ソルビトール／ＣａＣｌ _２ ：１．２Ｍソルビトールおよび５０ｍＭ ＣａＣｌ_２。

ａｍｄＳ選択のために、アセタミドソルビトールプレートおよびオーバーレイを用いた。胞子の精製には、同じプレートを、ソルビトール無しで用いた。

アセタミドソルビトール寒天（プレートおよびトップ寒天）
アセタミド（Ａｌｄｒｉｃｈ，９９％昇華物）−０．６ｇ／Ｌ；ＣｓＣｌ−１．６８ｇ／Ｌ；グルコース−２０ｇ／Ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４−２０ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ−０．６ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ_２＊２Ｈ_２Ｏ−０．６ｇ／Ｌ；１０００Ｘ塩（下記参照）−１ｍｌ。ｐＨを５．５に調整し、容量を３００ｍｌとした。０．２２ミクロンフィルターにてフィルター滅菌し、オーブンにて５５℃に温めた。

７００ｍｌの水に、Ｎｏｂｌｅ寒天（トップ寒天用低温溶融）２０ｇ、およびソルビトール２１８ｇを加え、オートクレーブ滅菌した。この混合物を５５℃に冷却し、フィルター滅菌したアセタミド混合物を加えた。プレートまたはチューブを注いだ。

１０００Ｘ塩−ＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ（０．５ｇ／１００ｍｌ）；ＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ（０．１６ｇ／１００ｍｌ）；ＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ（０．１４ｇ／１００ｍｌ）；ＣｏＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ（０．１ｇ／１００ｍｌ）、および、０．２２ミクロンフィルターにてフィルター滅菌。

じゃがいもデキストロース寒天（ＰＤＡ、Ｄｉｆｃｏ脱水媒体）−２００ｇ／Ｌ温浸によるじゃがいも；デキストロース２０ｇ／Ｌ；および寒天１５ｇ／Ｌを、５０−８０％最終容量のｄＨ_２Ｏ中でよく混ぜわせ、最終的に１００％容量とした。この混合液をオートクレーブ滅菌し、５５℃に冷却し、注いだ。

ｐＨ３．５媒体用の１％スキムミルク寒天を調製するために、ＰＤＡを上記のように調製し、１００ｍｌの溶融ＰＤＡに、１．８ｍｌの１０％酒石酸および１２．５ｍｌの滅菌８％スキムミルクを加え、プレートに注いだ。スキムミルクを事前滅菌するために、８％スキミミルク（Ｄｉｆｃｏ）を１０分、１２２−１２３℃、３２−３５ｐｓｉのチェンバー圧に暴露してオートクレーブした。混合液を取り出し、冷却し、室温に保存した。

形質転換体におけるプロテアーゼ発現は、振とうフラスコにおける３日間の増殖後に評価した。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ培養液（デービス（Ｄａｖｉｓ）等（１９７０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７：７９−１４３）に寒天プラグを接種した。培養物を振とうしながら３０℃で３日間インキュベートした。培養液を、０．２２ミクロンフィルターを通過させ、ろ液を、１％スキムミルク寒天の上にスポット状に投与した。室温で一晩インキュベート後、透明ゾーンが観察された。

ＮＳＰ２４、ＮＳＰ２５、およびＬ３８８Ｍ ＰｅｐＡのｐＨ活性プロフィール
全てＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ株において過剰発現される、ＰｅｐＡ（野生型およびＬ３８８Ｍ）、ＮＳＰ２４、およびＮＳＰ２５のｐＨ活性プロフィールを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手した蛍光標識カゼインアッセイ（ＥｎｚＣｈｅｋプロテアーゼキット緑色蛍光）を用いて求めた。ＰｅｐＡ（野生型およびＬ３８８Ｍ）、およびＮＳＰは、全体醗酵サンプルであり、ＮＳＰ２４は、５０％グリセロールに溶解させて安定化した精製サンプルである。これらの酵素を、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌおよび０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。蛍光標識基質は、ＤＩ Ｈ_２Ｏにて０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した。１０ｍｌの基質を、各種ｐＨの５０ｍｌバッファーと３０μｌのＤＩ Ｈ_２Ｏに加えた。１０ｍｌの酵素を加えて反応を開始し、様々な期間反応させ、１００μｌの１．０Ｍリン酸塩をｐＨ１０で加えて反応を停止させた。サンプルの蛍光を、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ ＥＭ蛍光プレートリーダーにおいて、５３８ｎｍ放射線で、４８５励起、放射カットオフフィルター５３０ｎｍで測定した。ＮＳＰ２４はｐＨ３．７で最適活性を示し、野生型ＰｅｐＡはｐＨ３．４で最適活性を示し、かつ、Ｌ３８８Ｍ ｐｅｐＡは３．５に最適ｐＨを持つ。ＮＳＰ２５は、ｐＨ４．６で最適活性を示す。

実験室醗酵における、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのＮＳＰ２４プロテアーゼの、ＧＣ１０６との比較
今日のエタノール産業において使用される標準的プロテアーゼは、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．によって市販されるプロテアーゼＧＣ１０６である。ＧＣ１０６に対するＮＳＰ２４の機能性を、糖分解、グルコース形成、およびエタノール生産に関して比較した。

材料
ジスチラーゼＬ−４００（ロット＃１０７−０４０５７−９０１，３７２ ＧＡＵ／ｇ）
ＧＣ１０６（ロット＃Ａ０１−０１３００−００１，１０１０ＳＡＰＵ／ｇ）
ＮＳＰ２４（ロット＃２００４０４２３，１１６５ＳＡＰＵ／ｇ）
Ｒｅｄ Ｓｔａｒ赤酵母
エタノール製造機から得られたマッシュおよび薄い濃度の抽出液（コーン）
方法
マッシュおよび薄い抽出液（バックセットとも呼ばれる、醗酵前）をエタノール製造機から取り出し、掻き混ぜて２６．５ブリックスとする。１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨをｐＨ４．３に調整した。次に、サンプルを、三つの３００グラム分液に分割し、３２℃の水浴に設置した。平衡後、下記の酵素の組み合わせを加えた。

ジスチラーゼＬ−４００は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒから得られた液状グルコアミラーゼであり、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．から入手が可能である。酵素添加後、フラスコ当たり、１．００ｇのＲｅｄ Ｓｔａｒ赤酵母を加えた。サンプルを、１６、２４、４０、および４８時間後に取り出し、遠心した。各サンプルの５００μｌを、５０μｌの１．１Ｎ ＮＨ_２ＳＯ_４を含む試験間に移し反応を停止させた。２分後、サンプルを、４．５ｍｌのＤＩ Ｈ_２Ｏで希釈し、混合した。混合後、サンプルを、０．４５ミクロンフィルターに通過させ、ＨＰＬＣバイアルに移し分析した。サンプルは、ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｒｅｚｅｘ ８ｕ）で分析した。結果を、図１−４に示す。ＮＳＰ２４の性能は、ＧＣ１０６にほぼ等しかった。

非加熱過程において磨砕コーンから得られるエタノール収率に及ぼすＮＳＰ２４の作用
磨砕コーンの３０％ＤＳスラリーを、ＤＩ Ｈ_２Ｏによって調製した。磨砕コーンは、エタノール産業で使用される＃２イェローデントコーンの典型的サンプルである。これは、７０％を超えるものが３０メッシュ篩を通過するほどに磨砕された。この穀物の水分含量をＯＨＡＵＳ、ＭＢ３５ハロゲン水分天秤（ニュージャージー州）を用いて測定した。ｐＨは、６Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて４．２に調整した。醗酵は、０．５ｋｇ／ＭＴ用量のＮＳＰ２４の添加、または添加無しで、１．０ＧＡＵ／ｇ用量のＳＴＡＲＧＥＮ００１を添加した１００ｇマッシュを含む１２５ｍｌフラスコにおいて行われた。

４５ｍｌの水に溶解した５ｇのＲｅｄ Ｓｔａｒエタノールレッド乾燥酵母（Ｌｅｓａｆｆｒｅ酵母社、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）を準備し、３２℃水浴で１時間掻き回し、醗酵槽に接種した。０．５ｍｌの酵母スラリーを、各１２５ｍｌフラスコに加えた。フラスコを３２℃水浴に移し、マッシュを穏やかに掻き回した。醗酵中、サンプルを取り出し、ＨＰＬＣ分析に供した（ＨＰＬＣカラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｒｅｚｅｘ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｌｕｍｎ（ＲＨＭ−モノサッカライド）＃００Ｈ０１３２−ＫＯ；カラム温度：６０℃；移動相：０．０１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４；流速：０．６ｍＬ／分；検出器：ＲＩ；および、注入用量：２０μＬ）。醗酵は、７２時間後停止させた。様々のサンプリング間隔における、糖分、乳酸、グリセロール、およびエタノールを含む化合物の生産は、下記の表３に示す通りである。該表において、＋は、ＮＳＰ２４がフラスコに添加されたことを示し、−−は、ＮＳＰ２４がフラスコに添加されなかったことを示す。全てのサンプルについて乳酸が、約０．０１と０．０２％ｗ／ｖにおいて測定され、かつ、ＤＰ−２は０．０であると定量された。全てのサンプルについて、２４時間時、酢酸は約０であり、７１時間では、０．０３と０．０４の間であると定量された。

コーン内乳によるエタノール生産における各種プロテアーゼの比較
内乳（胚除去コーン、７５．８％でん粉、９９．５％の粒径＜３０メッシュ）による２９．５％ＤＳマッシュを顆粒状でん粉基質として調製した。各マッシュ１００グラムを１２５ｍｌフラスコに移し、媒体のｐＨをｐＨ４．５に調整した。プロテアーゼ（ＮＳＰ２４；中性プロテアーゼ（ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ ＮＥＵＴＲＡＬ，プロテイナーゼ−Ｔ）；および、アルカリ性プロテイナーゼ（ＳＰＥＺＹＭＥ ＦＡＮ，ＰＲＯＴＥＸ ６Ｌ ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ Ｐ−３０００、およびプロテイナーゼ−Ｔ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を、０．５ｋｇ／ＭＴで加え、次いで、ＳＴＡＲＧＥＮ００１（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を２．５Ｋｇｓ／でん粉ＭＴ）を加えた。次に、フラスコに０．５ｍｌの２０％酵母（Ｒｅｄ Ｓｔａｒエタノール赤）を接種し、３２℃に維持した水浴に移した。フラスコの内容物を連続的に攪拌し、インキュベーション中均等な混合を行った。サンプルを様々な時間間隔で採取し、ＨＰＬＣ分析に供した。７２時間醗酵液から得られたＤＤＧＳの残留でん粉およびタンパク含量を定量した。エタノール生産の結果を下記の表４に示す。

１）ＮＳＰ２４、２）市販のプロテアーゼＧＣ１０６、および、３）プロテアーゼを含まないジスチラーゼを用いた場合の、糖分解（ＤＰ＋３）％ｗ／ｖを示す（実施例５参照）。 ＮＳＰ２４、ＧＣ１０６、およびジスチラーゼを用いた場合の糖分解（ＤＰ２）％ｗ／ｖを示す。 ＮＳＰ２４、ＧＣ１０６、およびジスチラーゼを用いた場合のグルコース形成（ＤＰ１）を示す。グルコースの量は、ＮＳＰ２４およびＧＣ１０６の両サンプルにおいて、４０時間終了時に残存する量は０．２％ｗ／ｖ未満であり、４８時間終了時には０．１％ｗ／ｖ未満である。一方、４８時間終了時に、％ｗ／ｖで測定したグルコースの量は、ジスチラーゼでは、１．０％ｗ／ｖよりも少し大きい。 ＮＳＰ２４、ＧＣ１０６、およびジスチラーゼにおけるエタノール生産（％ｖ／ｗ）を示す。前記二つのプロテアーゼサンプルを用いることによって生産されるエタノールの速度および量は同じである。一方、ジスチラーゼのエタノール生産は、より低く、速度はより遅かった。 図５Ａは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉから得られたｐＴｒｅｘ３ｇ＿ＮＳＰ２４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ＮＳＰ２４遺伝子配列には下線を施し、遺伝子のイントロン配列候補は、ゴシック体で特定する。プロテアーゼをコードする核酸配列は、配列番号８の配列によって表される。 図５Ｂは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉから得られたｐＴｒｅｘ３ｇ＿ＮＳＰ２４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。 図５Ｃは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉから得られたｐＴｒｅｘ３ｇ＿ＮＳＰ２４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。 図５Ｄは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉから得られたｐＴｒｅｘ３ｇ＿ＮＳＰ２４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。 Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来ＮＳＰ２４の、予想アミノ酸配列（４０７アミノ酸）（配列番号２）（図６Ａ）。シグナルペプチドはゴシック体で示され、プレプロ配列は、ゴシック体および下線で示され、成熟ＮＳＰ２４タンパクは、ＫＹＧＡＰＩＳ．．．で始まり、配列番号１０で表される。 ＮＳＰ２４ヌクレオチド配列で、イントロン候補をゴシック体で特定した配列（図６Ｂ）（配列番号８）を示す。 ｐＴｒｅｘ３ｇ＿ＮＳＰ２４ベクター、および、図５のヌクレオチド配列にそう制限酵素切断部位の位置を示す。 ｐｅｐＡプロテアーゼの核酸配列（配列番号３）を示す。予想イントロンをゴシック体で表す。 図９Ａは、新規ＮＳＰ２５プロテアーゼ（３９９アミノ酸）（配列番号９）をコードする核酸配列（配列番号４）を示す。シグナル配列はゴシック体で表す。 図９Ｂは、新規ＮＳＰ２５プロテアーゼ（３９９アミノ酸）（配列番号９）をコードする核酸配列（配列番号４）を示す。シグナル配列はゴシック体で表す。 新規ｐｅｐＡプロテアーゼ変種（Ｌ３８８Ｍ）（配列番号７）の核酸配列（配列番号５）を示す。図において、下線を施した‘Ａ’は、図８のｐｅｐＡの‘Ｃ’から変化したものである。 発現ベクターｐＳＬ８８９＿ｐｅｐＡを示す。 図１２Ａは、発現ベクターｐＳＬ８９９＿ｐｅｐＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。Ｘｈｏ Ｉの切断部位は、^によって示され、Ｘｂａ Ｉ部位は＊によって示される。ｐｅｐＡのコード配列はゴッシク体で示される。 図１２Ｂは、発現ベクターｐＳＬ８９９＿ｐｅｐＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。 図１２Ｃは、発現ベクターｐＳＬ８９９＿ｐｅｐＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。 図１２Ｄは、発現ベクターｐＳＬ８９９＿ｐｅｐＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。 図１２Ｅは、発現ベクターｐＳＬ８９９＿ｐｅｐＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。 配列番号５によってコードされたタンパクに対するＰｅｐＡ変種、Ｌ３８８Ｍのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。

Claims (26)

1. 配列番号１０に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ。
2. 配列番号１０に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することを特徴とする、請求項１の単離されたＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ。
3. 配列番号１０に対して少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有することを特徴とする、請求項２の単離されたＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼ。
4. 請求項１乃至３のいずれか１項に記載のＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
5. 前記単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＮＳＰ２４プロテアーゼをコードすることを特徴とする、請求項４の単離されたポリヌクレオチド。
6. 配列番号８の配列を有することを特徴とする、請求項５の単離されたポリヌクレオチド。
7. 請求項４のポリヌクレオチドを含むベクター。
8. 請求項４のポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞。
9. 宿主細胞が糸状真菌細胞であることを特徴とする、請求項８の宿主細胞。
10. 糸状真菌細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＳＰＰ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ＳＰＰ．、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ＳＰＰ．であることを特徴とする、請求項９の宿主細胞。
11. Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓが、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、またはＡ．ａｗａｍｏｒｉであることを特徴とする、請求項１０の宿主細胞。
12. ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａがＴ．ｒｅｅｓｅｉであることを特徴とする、請求項１０の宿主細胞。
13. プロテアーゼを生産する方法であって、
    ａ）配列番号１０に少なくとも９０％の配列同一性を有するＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼをコードする核酸に動作可能的に結合するプロモーターを含むポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入する工程、
    ｂ）ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼの発現と生産に好適な培養条件の下で宿主細胞を培養する工程、および、
    ｃ）前記ＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼを生産する工程、
    を含む前記方法。
14. 生産されたプロテアーゼを回収することをさらに含むことを特徴とする、請求項１３による方法。
15. 請求項１乃至３のいずれか１項に記載のＮＳＰ２４ファミリ・プロテアーゼを含む酵素組成物。
16. 組成物が洗浄組成物であることを特徴とする、請求項１５の酵素組成物。
17. 洗浄組成物が界面活性組成物であることを特徴とする、請求項１６の酵素組成物。
18. 組成物がでん粉含有基質加水分解組成物であることを特徴とする、請求項１５の酵素組成物。
19. 組成物が、動物飼料組成物であることを特徴とする、請求項１５の酵素組成物。
20. 組成物が、エタノール生産工程に使用されることを特徴とする、請求項１５の酵素組成物。
21. 組成物が、でん粉糖化工程に使用されることを特徴とする、請求項１５の酵素組成物。
22. 組成物が、マルトースまたはフルクトースの生産に使用されることを特徴とする、請求項１５の酵素組成物。
23. 組成物が、パーソナルケア組成物であることを特徴とする、請求項１５の酵素組成物。
24. グルコアミラーゼをさらに含むことを特徴とする、請求項１５の酵素組成物。
25. アルファ−アミラーゼをさらに含むことを特徴とする、請求項１５の酵素組成物。
26. でん粉含有基質を加水分解する方法であって、でん粉含有基質の加水分解に好適な条件下に、でん粉含有基質を、請求項１５の酵素組成物と接触させること、および、でん粉含有基質の加水分解物を獲得することを含む前記方法。

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