JPH01240184A

JPH01240184A - 耐熱性酸性プロテアーゼ

Info

Publication number: JPH01240184A
Application number: JP6365688A
Authority: JP
Inventors: Sawao Murao; 村尾　澤夫; Masanori Nagao; 長尾　正憲; Keizo Okuni; 大國　啓造
Original assignee: IKEDA SHIYOKUKEN KK
Current assignee: IKEDA SHIYOKUKEN KK
Priority date: 1988-03-18
Filing date: 1988-03-18
Publication date: 1989-09-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規な耐熱性酸性プロテアーゼに関する。

〔従来の技術〕

酸性プロテアーゼはすでに知られており（Ｗ、Ｈ。

Ｃｈａｎｇ等、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、、別、９７５（
１９７６）　）　、また好熱性細菌により生産される耐
熱性プロテアーゼとしてセリンプロテアーゼ（Ｄ、　Ｒ
，Ｄｕｒｈａｎ等、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２７６２（１９８７）　）
及びメタルプロテア−ゼ（Ｓ、Ｅｎｄｏ、Ｊ、Ｆｅｒｍ
ｅｎｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、、並、３４６（１９６２）　
）が知られているが、好熱性細菌により生産される、耐
熱性の酸性プロテアーゼは知られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、新規な耐熱性酸性プロテアーゼを提供
しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、上記の目的を達成すべく、広く天然高温
源から微生物を分離し、酸性プロテアーゼの生産につい
て検索した結果、高熱温泉から分離されたバシルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新菌株が目的とするプロテ
アーゼを生産することを見出し、このプロテアーゼを精
製し、その性質を詳細に検討した結果、これが全く新し
いタイプの耐熱性酸性プロテアーゼであることを確認し
、本発明を完成した。

従って本発明は、次の性質：（１）ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により測定した分子量：約４１，
０００　；　（２）最適作用ｐ１１：約３．０〜３．５
；（３）最適作用温度：約７０℃；（４）ショ糖密度勾
配等電点電気泳動法により測定した等電点：約３、５　
；　（５）　ｐＨ安定性：５０℃にて２４時間処理した
場合、ｐｌ＋２．０〜５．０において比較的安定である
；（６）熱安定性：ｐＨ４にて１０分間処理する場合、
およそ７０℃まで比較的安定である；（７）ペプスタチ
ンＡｃ　、ジアゾアセチル−ＤＬ−ノルロイシンメチル
エステル（？）（ＤＡＮ）　、及び１．２−エポキシ−
３−（ｐ−ニトロフェノキシ）プロパン（ＥＰＮＰ）に
より阻害されない；を有する耐熱性酸性プロテアーゼを
提供する。他の観点において、本発明はバシルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属に属する好熱性細菌によって生産され
る耐熱性酸性プロテアーゼを提供する。本発明はさらに
、バシルス属に属し、耐熱性酸性プロテアーゼを生産す
ることができる微生物を提供する。

（具体的な説明〕本発明のプロテアーゼを製造するための菌株としては、
前記の性質を有する耐熱性酸性プロテアーゼを生産する
ことができる任意の菌株を使用することができ、バシル
ス属に属する好熱性菌株が好ましい。このような菌株は
既存の保存株の中から選択することもでき、又自然界か
ら新たに分離することもできる。例えば、本発明者等は
、酸性の高熱温泉地獄から常法に従って、酸性性環境中
で生育する好熱性細菌を分離し、これらの分離株の耐熱
性酸性プロテアーゼの生産について試験した結果、バシ
ルス属に属する新菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ。

ＭＮ−３２株が目的とする耐熱性酸性プロテアーゼを生
産することを見出した。この菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ。

ＭＮ−３２は微工研菌寄第９８６９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−
９８６９）として、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　ＭＮ−３２株は次の性質を
有する。

細胞の形態　　　　　　　　桿状ダラム染色　　　　　　　　バリアプル胞子　　　　　
　　　　　　十運動性　　　　　　　　　　十増殖特性　　　　　　　　　好気性増殖ｐＨ２，５〜７．５増殖温度　　　　　　　　　４１℃〜７０’Ｃグルコー
スからの酸生成　　十グルコースからのガス生成　− Ｎｏ、からＮｏ、への還元　　　十カゼイン分解　　　　　　　十ゼラチン分解　　　　　　　十澱粉分解　　　　　　　　　十Ｇ＋Ｃ含量　　　　　　　　６５％ユビキノンタイプ　　　　　Ｑ７以上の性質から、この菌株はバシルス属に属する。バシ
ルス属に属する中等度の好熱菌で酸性側で生育するもの
としてはバシルス・アシドカルプリウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）が知られている
が、本件発明のＭＮ　−３２株は硝酸塩の還元性、Ｇ＋
Ｃ含量、ユビキノンタイプ等の点で前記公知株とは異り
、新菌株であると思われる。

本発明のプロテアーゼを製造するために生産菌株を培養
するための培地としては、バシルス属細菌を培養するた
めの常用の培地を用いることができる。この様な培地に
は通常、有機窒素／炭素源として大豆タンパク、カゼイ
ン等のタンパク質やペプトン等が単独で又は組み合わせ
て用いられ、これらの合計濃度は通常０．５〜３％であ
る。

また、プロテアーゼの生産性を向上させるために酵母エ
キスや肉エキスを０．１〜０．３％程度加える事が好ま
しい。培地にはさらに必要に応じて澱粉やグルコース等
の炭素源を加える事もできる。

培地にはさらに、無機成分、例えば塩素イオン、硫酸イ
オン、リン酸イオン等の陰イオン成分、及びナトリウム
、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、銅、マン
ガン、亜鉛等の金属陽イオン成分を加えることが好まし
く、これらは具体的にはＮａＣｌ　、　ＫＩＩｚＰＯ４
９ＭｇＳ０４４ＨｚＯ、ＣａＣｌ　ｚ　、　ＦｅＳＯ４
・６Ｈ２０、Ｃ’ｕＳＯ４・５）１ｚＯ、ＭｎＳＯ４，
ＨｚＯ、Ｚｎ５Ｏａ４Ｈｚθ等の形で添加される。培地
中でのこれらの濃度はその種類により異るが、通常０．
５％〜０．０００１％程度である。培地は酸性とし、好
ましくはｐＨ３〜４、例えばおよそｐｏ３．５とする。

培地は好気的条件下で行う。固体培地上で培養を行うこ
ともできるが、目的とするプロテアーゼを有利に製造す
るには液体培養を行うのが好ましく、この場合には振と
う、通気、攪拌等の常用手段により好気的条件を確保す
る。培養温度は約５０℃〜６５℃、好ましくは５５℃〜
６０℃である。培養は、目的とするプロテアーゼの蓄積
量が最高となる時点で終了するのが好ましく、培養時間
に通常４０〜５０時間である。

培養が終了した後、本発明の耐熱性酸性プロテアーゼの
回収・精製を行う。この方法として、培養物から酵素を
精製するための任意の常法を用いることができる。例え
ば、本発明の酵素は菌体外に分泌されるから、培養終了
後の培養液を遠心離、濾過等の常用の菌体分離法により
処理して菌体を除去し、目的のプロテアーゼを含有する
上清又は濾液を得る０次に、硫酸アンモニウム等による
塩析、アセトン、エタノール等を用いる溶剤沈澱等によ
って酵素蛋白質を濃縮する０次に、カラムクロマトグラ
フィー、例えばＤＥＡＥ−セファロース、セファデック
ス等を用いるカラムクロマトグラフィーにより一層精製
することができる。精製された酵素は結晶化、凍結乾燥
等により固体生成物として採取することができる。

こうして得られた本発明のプロテアーゼの力価は次のよ
うにして測定する。０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，０）
　中１．３３％ハマルステンカゼインの基質溶液１．５
−を０．５−のサンプル溶液に加え、７０℃にて３０分
間インキュベートする。次に０．４４Ｍトリクロロ酢酸
’１．Ｑ　ｍｌを加えて反応を停止せしめ、室温にて２
０分間置く。次に、東洋濾紙Ｎ［Ｌ２により濾過し、こ
の濾液０．５　ｍｊ、０．４４Ｍ炭酸ナトリウム２．５
　ｍｊ及びフォーリン試薬０．５−を混合し、３７℃に
て２０分間インキュベートして発色を行う。次に、６６
０ｒ＋＋ａにて吸光度を測定する。基質カゼイン溶液と
トリクロロ酢酸溶液の添加順序を逆にして上記の操作を
行うことによりブランクを調製し吸光度を測定する。上
記の条件下で３０分間に吸光度を０．１増加せしめる酵
素活性を１単位とする。

前記のようにして製造された本発明のプロテアーゼは次
の性質を有する。

（１）分子量：　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により測定した分子量は約４１，０００である。

（２）最適作用ｐＨ：種々のｐｌ＋において７０’Ｃに
て３０分間反応を行った場合、およそｐＨ３，０〜３．
４において最高活性を示す。この様子を第１図に示す。

（３）最適作用温度：約７０度である。

（４）等電点ニジ−ＩＩ！密度勾配等電点電気泳動法に
より測定した等電点は約３．５である。

（５）　ｐＨ安定性：酵素を種々のｐＨの緩衝液中に５
０℃にて２４時間保持した後、残存活性をｐＨ３，０，
７０℃、３０分間反応の条件で測定した場合、ｐ１１２
〜５の範囲で安定である。この様子を第２図に示す。

（６）熱安定性：酵素液（ｐＨ４の緩衝液中）を種々の
温度で１０分間保持した後、残存活性をｐｉ３．０・”
５０℃、３０分間反応の条件で活性した場合、７０℃ま
でほぼ安定である。この様子を第３図に示す。

（７）酵素プロテアーゼに対する特異的阻害剤による影
響ＤＡＮ　ＢＦチアゾセチル−ＤＬ−ノルロイシンメチル
エステル）　、ＥＰＮＰ、及び５−ＰＩ　　（ペプスタ
チンＡｃ）のいずれによっても阻害されない。

（８）その他の酵素阻害剤に対する挙動酵素を、ｐＨ５
，０、４０℃にて１時間、各種の酵素阻害剤と共にイン
キュベートし、残存活性をｐＨ３，０，５０℃にて測定
した結果は次の通りであった。

以下ｊ；白阻　害　剤　　　　濃　度　　　残存活性（ｍＭ）　　
　　　（％）無添加　　　　　　　　　　　　　　１００１００Ｐ　
（１）　　　　　　　　１　　　　　　１０１００ＰＣ
（２）　　　　　　　１０　　　　　　９９ＩＡＡ　　
（４）　　　　　　　１０　　　　　　１００ド（２）　ＰＣＭＢ＝　ｐ−クロロメルクリ安息香酸（３
）　ＭＡＰＩ＝微生物アルカリプロテアーゼ阻害剤（Ｌ
−Ｐｈｅ−Ｃｏ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｔ−Ｌ−フェニルア
ラニナール）（４）　ＩＡＡ　＝ヨード酢酸（５）　ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸以上の通り
、いずれの酵素阻害剤によっても阻害を受けなかった。

以上の諸性質から明らかな通り、本発明のプロテアーゼ
は全く新規な酵素である。

゛　次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施Ａ上次の組成二ポリペプトン　　　　　　１．５％酵母エキス　　　　　　　０．１ＮａＣ１Ｏ，３ＫＨｚＰＯａ　　　　　　　　　　０．５Ｍｇ５０４・
７１１□０　　　　　　　０．０５ＣａＣ１ｔ　　　　
　　　　　　Ｏ，０１ｐＨ３，５（２Ｎ−ＨｚＳＯ，）の培地３１を５１のミニジャーファーメンタ−に仕込み
、バシルスｓｐ、　ＭＮ−３２（微工研菌寄第９８６９
号）を接種し、６０℃にて１２時間培養し種母を調製し
た。

上記と同一組成の培地１３０１を２００　ｆｆｉのジャ
ーファーメンタ−に仕込み、１２０℃にて３０分間殺菌
した後上記の種母２．６１！を接種し、６０　”Ｃにて
、攪拌１５０ｒｐｎ＋、通気１　ｖｖｍの条件で４８時
間培養した。４８時間の培養でｐＨ６，１となり酵素活
性は４単位／−となった。

培養物を遠心分離し１００７！の上清を得た（活性４単
位／−）。

上清のｐＨをｌＮＨＣｌで４に調整し、５℃下で攪拌し
ながら硫酸アンモニウム、５６．１ｋｇを徐々に加え、
酵素を沈殿させた。２４時間放置した後、遠心分離して
沈殿を集めた。この沈殿を１０ｍＭ、ｐＨ４，７の酢酸
緩衝液４Ｎに溶解し、透析チューブに入れて、４５１の
同緩衝液を外液として２４時間透析した。（外液は４時
間おきに取りかえた。）透析中に生じた沈殿を遠心して
除き、透析内液５．８１を得た（活性は５！単位／−）
。

上記透析内液を４回に分け２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４
，７）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ　−６Ｂ
カラム（７Ｘ２７Ｃ１ｌ）に吸着させ、流出液を２０−
ずつ分取する。１．５１の同緩衝液で洗浄後、食塩濃度
勾配法により溶出し、初流より１０００−〜１６６０ｍ
ｆ　（食塩濃度約０．２Ｍ）の両分を集め、４回合針２
６４０−を得た。このものを限外ろ過して？Ｈｋ＋１し
１８６−とじた。

次に２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ＋　５．５　）で平衡化
したセファデックスＧ−１００カラム（２，４５Ｘ　８
０ｃｍ　）を用いてゲルろ過を行なった。流出液を４Ｍ
Ｉずつ分取し、活性区分１１８０ｍｆｆｉ　（活性８４
単位／−）を得た。

ここで、電気泳動的にほぼ単一なプロテアーゼが得られ
たが、より高純度の酵素標品を得るため高速液体クロマ
トグラフに接続したＴＳＸ　ｇｅｌ　ＤＥＡＥ５Ｐ−カ
ラム（１，６Ｘ１１ＣＩ１１）を用いてさらに精製を行
ない（条件はＤＥＡＥセファロースＣＬ６Ｂカラムの条
件に準じる）　７５０００単位の酵素を得た。

このものを透析脱塩後凍結乾燥し約２５■の電気泳動的
に単一な耐熱性・酸性プロテアーゼが得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素の活性に対するｐ！−１の効果を
示すグラフである。第２図は本発明の酵素のｐｌ＋に対する安定性を示すグ
ラフである。第３図は本発明の酵素の温度に対する安定性を示すグラ
フである。

Claims

【特許請求の範囲】１、次の性質を有する耐熱性酸性プロテアーゼ：（１）
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
た分子量：約４１，０００；（２）最適作用ｐＨ：約３．０〜３．５；（３）最適作用温度：約７０℃ （４）ショ糖密度勾配等電点電気泳動法により測定した
等電点：約３．５；（５）ｐＨ安定性：５０℃にて２４時間処理した場合、
ｐＨ２．０〜５．０において比較的安定である；（６）
熱安定性：ｐＨ４にて１０分間処理する場合、およそ７
０℃まで比較的安定である；（７）ペプスタチンＡｃ、ジアゾアセチル−ＤＬ−ノル
ロイシンメチルエステル（？）（ＤＡＮ）、及び１，２
−エポキシ−３−（ｐ−ニトロフェノキシ）プロパン（
ＥＰＮＰ）により阻害されない。２、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する好熱性細
菌によって生産される耐熱性酸性プロテアーゼ。３、バシルスｓｐ．ＭＮ−３２株（微工研菌寄第９８６
９号により生産される請求項１に記載のプロテアーゼ。４、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属し、耐熱性酸
性プロテアーゼを生産することができる好熱性微生物。５、バシルスｓｐ．ＭＮ−３２（微工研菌寄第９８６９
号）である請求項４に記載の微生物。