JPS63192388A - 耐熱性プロテア−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、好熱性細菌から得た耐熱性中性プロテアーゼ
遺伝子を遺伝子工学的手法を用い別種の枯草菌へ導入し
て形質転換を行い、該形質転換株を用い、培養炉液を加
熱し宿主菌由来タンパクを熱変性特異的に耐熱性プロテ
アーゼのみを採取する耐熱性プロテアーゼの大量生産に
適する製造法に関する。

［従来の技術］ バチルス属細菌のプロテアーゼは工業用途に広く使用さ
れており、有用なプロテアーゼ及びプロテアーゼ製造法
の開発は産業上重要な意義をもつ。

また好熱性細菌の産する耐熱性中性プロテアーゼは熱に
対してのみならず各種の化学薬品に対しても安定である
し、長期間の使用にも比較的活性が低下しない。そのた
め研究用試薬としてのみでなく、例えば洗剤の中に入れ
洗浄力を高める洗浄用プロテアーゼ、食品加工において
はチーズの製造。

ダイズタンパクの分解など、また皮革のなめし用として
広い分野に亘って使用される。

［発明が解決しようとする問題点］ 従来、耐熱性プロテアーゼはその生産菌（好熱菌の染色
体ＤＮＡに含まれている構造遺伝子（通常１ケ））に基
いて生産される為、該酵素の生産性が低いのが普通であ
る。その欠点を補うため変異操作により高生産株の取得
が試みられたがせいぜい２〜５倍程度の上昇が限界であ
る。

［問題点を解決するための手段及び作用］本発明者らは
、耐熱性プロテアーゼの生産性を上昇させるべく研究の
結果、好熱性細菌由来の耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子
を枯草菌を宿主としてクローン化すると遺伝子が増幅さ
れ、該酵素の生産性を向上するともに、枯草菌で耐熱性
プロテアーゼを生産させることにより枯草菌由来タンパ
ク質を熱失活させ好熱菌由来耐熱性プロテアーゼのみを
選択的にとり出すことを見出し本発明を完成した。

本発明は好熱菌由来耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子を枯
草菌を宿主としてクローン化し遺伝子増幅効果により耐
熱性プロテアーゼの生産性を向上させ熱処理により選択
的に好熱菌由来耐熱性プロテアーゼのみを回収すること
を特徴とする耐熱性プロテアーゼの製造法である。

本発明において用いられる染色体ＤＮＡ供与菌として用
いるバチルス属細菌は、バチルス・ステアロサーモフィ
ルスＭ　Ｋ　−２３２（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌｕｓ）　、　　バチルス・ステア
ロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒＩＩｏｐｈｉｌｕｓ　）ＮＣＡ１５０３（微工
研菌寄第８９７８号）第を例示することができる。

バチルスφステアロサーモフィルスＭＫ−２３２は以下
の様な菌学的性質を有する。

形態 細胞の形　　　杆菌 細胞の大きさ　　ｔ、ｏｘ　　１．２μ×３．０〜５．
０μ多形性　　　　なし 運動性　　　　あり 胞子　　　　　形成する 胞子の形　　　円形 胞子の大きさ　　０．８〜１．０μ×１．２μ抗酸性　
　　　なし ダラム染色　　十 生育状態 ■肉汁寒天平板培養 生育の良否　　　　　良好 コロニーの形　　　　円形 コロニーの表面形状　平滑・重輪 コロニーの隆起状態　扁平 コロニーの周縁　　　金縁 コロニーの内容　　　均一 コロニーの色調　　　クリーム色 コロニーの透明度　　不透明 ■肉汁寒天斜面培養 生育の良否　　　　　良好 コロニーの形　　　　糸状 コロニーの表面形状　平滑 コロニーの透明度　　不透明 コロニーの色調　　　クリーム色 ■肉汁液体培養 表面の生育　　　　　なし 濁度　　　　　　　　やや濁る 沈澱　　　　　　　　粘調 ■肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチン液化　、　　有り、５０℃、５日■リドマスミ
ルク　　　　液化凝固せず生理的性質 硝酸塩の還元　　　　陰性 脱窒反応　　　　　　陰性 ＭＲテスト　　　　　陽性 ｖＰテスト　　　　　陰性 インドールの生成　　陰性 硫化水素の生成　　　陽性 デンプンの加水分解　陽性 クエン酸の利用　　　陰性 無機窒素源の利用 色素の生成　　　　　なし ウレアーゼ　　　　　陰性 オキシダーゼ　　　　　陰性 カタラーゼ　　　　　陽性 生育の範囲　　　　　至適ｐＨ７，０付近５０℃付近が
最適 酸素に対する態度　　陰性 ０−Ｆテスト 糖類から酸及びガス　アラビノース、キシロ−の生成の
存無　　　　ス、マンノース、フラクトース、ガラクト
ースか ら酸を生成するがガスは 生成しない。麦芽糖。

シヨ糖、トレハロース。

ソルビット、マンニット。

イノジット、グリセリン。

デンプンから酸もガスも 生成しない。

７％塩化ナトリウム 添加培地での生育　　生成しない。

フェニルアラニンデ アミナーゼチロシン の分解　　　　　　　陰性 カゼインの分解　　　陽性 ０．０２％アシ化ナトリウ ム添加培地での生育　　　生育しない。

バチルス・ステアロサーモフィルスＭＫ−２３２は耐熱
性プロテアーゼを産生ずるが、その性質は以下の通りで
ある。

（１）分子量　３７．０００（ゲル濾過による）（２）
作用温度 カゼインを基質とした活性測定法（１０分間反応後遊離
したチロシン残基量で活性を表示）によると５〜９０℃
の範囲で活性を有する。至適温度は７０〜７５℃で５あ
る。

（３）作用ｐＨ 好適なｐＨは５〜１０であるが、ｐＨ７〜８に至適ｐＨ
を有する中性プロテアーゼである。

（４）熱安定性 ７５℃、３０分（ｐＨ７，５）で９０％以上の活性が残
存する（Ｃａ　Ｃ１２１０ｍＭ存在）。

１００℃、３０分（ｐＨ７，５）では活性は残存しない
。

（５）ｐＨ安定性２５℃２４時間の条件ではｐＨ５〜１
０の範囲でほぼ１００％の活性が残存する。

（６）阻割剤５ｍＭ　　ＥＤＴＡにより失活する。

バチルス・ステアロサーモフィルスＮＣＡｌ３Ｏ３は公
知の菌株であり、その菌学的性質等はジャーナル　オブ
　ゼ　アプライド　バクテリオロジー（Ｊ、Ａｐｐｌ、
Ｂａｃｔ、）　３８巻、３０１〜３０４頁（１９７５）
に記載されている。

バチルス・ステアロサーモフィルスＮＣＡｌ３Ｏ３は昭
和６１年９月２７日付で通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託され微工研菌寄第８９７８号が与え
られている。

バチルス拳ステアロサーモフィルスＮＣＡｌ３Ｏ３の産
生する酵素は下記の様な性質を有する。

（１）　分　　子　　量：　２Ｂ、０００　　　　（Ｓ
Ｏ８−ＰＡＧＥ）（１１）熱安定性：８０℃、３０分の
処理では１００％の残存活性を示す。

９０℃、３０分の処理では１００％の残存活性を示す。

１００℃、３０分の処理では約３０％の残存活性を示す
。

（ｉｌｉ）ｐＨ作用性：カゼインを基質として使用した
蛋白質分解活性の好適ａｌｌは６〜７であり、ｐ夏１７
．０〜７．５に至適ｐＨを有する。

（ｉｖ）Ｉ）Ｈ安定性二３７℃、３０分の処理ではｐＨ
４〜９の範囲で７０％以上の活性を有し安定である。

（Ｖ）至適温度：カゼインを基質として使用した蛋白質
分解活性の適温は３５℃〜８０℃であり、至適温度は３
５℃〜８０℃であり、至適温度は約７０℃である。

（ｖｌ）阻　　　害：　ＥＤＴＡによって阻害される。

一方Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　（ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｔｈｙｌ−
ｓｕＨ’ｏｎｙｌ−Ｈｕｏｒｌｄｅ）によってはほとん
ど阻害を受けない。

（ｖｌｉ）基質特異性 なお、力価及び基質特異性は以下の様にして測定した。

力価の測定法 １ｍｌの２％カゼイン溶液（５０ｍＭ）リス−１ｍ　Ｍ
　　Ｃａ　Ｃｊｌ　２　）に１ｍｌの各試料を加え、一
定時間後に反応停止液（０，３３Ｍ酢酸。

０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍトリクロロ酢酸）
を２　ｍｌ加え室温で３０分間放置した。これをワット
マンＮｏ、１ｉ戸紙でｔ１遇した。

これとは別にカゼイン溶液に反応停止液を入れ、試料を
加えン濾過したものを基準としてＡ　　　を７５ｎｔｉ 測定し、チロシン溶液を基準としたＡ　　の検ロア５ 線を作成してプロテアーゼ活性を測定した。１単位は３
７℃で１分間１μＣのチロシン相当物質をトリクロロ酢
酸可溶性区分に遊離させる酵素量とした。

基質反応性 各Ｆｌｕｆｆ白質に対する各プロテアーゼの分解能力を
カゼインを１００％として示した。酵素反応の活性測定
は２％基質を用い一定時間反応後トリクロロ酢酸で反応
を停止し遊離のチロシン量を測定した。

また、宿主の枯草菌としてはバチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｌｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｍ　Ｔ　−２
などが挙げられる。

耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子をクローン化する方法と
しては、ショット・ガン法により、また枯草菌の形質転
換はコンピテントセル法により行うことができる。

本発明の方法によると、例えばバチルス・ステ吐旦お）
の耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子をショット・ガン法に
よりベクター・プラスミドであるｐＴＢ５３　（カナマ
イシン耐性及びテトラサイクリン耐性）に組込んだ後、
得られた組換えプラスミドを用いてコンピテント・セル
法により枯草菌に形質転換することにより耐熱性プロテ
アーゼ高生産株を得ることができる。

耐熱性中性プロテアーゼ生産菌からの染色体ＤＮＡの調
整はフェノールを用いる５ａｌｔｏ−旧ｕｒａ法（ＢＩ
ｏｃｈｌａ、Ｂｌｏｐｔｙｓ、Ａｃｔａ、７２６１９．
’６３）あるいはクロロホルム・イソアミルアルコール
を用いるＭａｒａ＋ｕｒ法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、　
３２０Ｂ、　’８１）　　あるいは密度傾ばいにより分
離するＶａｒｒｉｃｋ法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２．６°７５）　
　等の通常用・いられる方法で実施可能である。

調製された供与染色体ＤＮＡは次いでベクターと連結す
る為に切断される。供与染色体ＤＮＡの切断は通常制限
エンドヌクレアーゼを用いる方法により実施される。こ
の場合耐熱性プロテアーゼ遺伝子に切断部位をもたない
１１１ＩＪ限エンドヌクレアーゼであれば如何るものも
使用可能であり、また部分的にしか切断を起さない反応
条件を用いるならば全ての種類の制限エンドヌクレアー
ゼが使用可能である。このように制限エンドヌクレアー
ゼは用いる条件に応じて種々のものが選択可能であるが
ベクターとの連結の容易さからは用いようとするベクタ
ーに唯一切断部位を有するものが望ましい。ベクターと
しては宿主として用いるバチルス属細菌中で復製可能な
ものであればプラスミドあるいはファージの区別なく使
用可能である。特に特定の制限エンドヌクレアーゼによ
る唯一の切断部位を有し、抗生物質耐性等のマーカーを
有するものが、供与染色体ＤＮＡとの結合および形質転
換株選択の判断の容易さから望ましい。このようなプラ
スミドの例としてはバチルスΦステアロサーモフィルス
（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｌ
ｌｕｓ）由来のカナマイシン耐性、テ゛トラサイクリン
耐性マーカーを有するｐＴＢ１９．ｐＴＢ５３（Ｊ。

Ｂａｅｔθｒ１０１　、ユ旦１０９１（１９８１））　
　スタフィＯニア−／カル耐性マーカーを有するｐｃ１
９４．ｐｃ２２１゜ｐ　Ｃ２３２（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、ＳｃＩ　ＵＳＡ７４１６８０（１９７７）
）カナマイシン耐性マーカーを有するｐＵＢｌｌ　０　
Ｕ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１３４８１８（１９７８）
）等を挙げることができる。特に低コピー・プラスミド
ベクターであるｐＴＢ１９．ｐＴＢ５３は枯草菌中で安
定に保持される為、好適なベクターとなり得る。

ベクターとしてファージを用いる場合もそのファージＤ
ＮＡが宿主とするバチルス属細菌で複製可能であれば如
何るものでもよい。このようなファージの例としてφ１
．φ３Ｔ、　　φ１５０゜ρ１１等を挙げることができ
る。

切断された供与染色体ＤＮＡを上記ベクターに挿入し結
合させる為には供与染色体とベクターとを同一の制限エ
ンドヌクレアーゼで切断し、その後ＤＮＡリガーゼを用
いて結合する方法が一般的である。

このようにして得られる組換体ＤＮＡ分子（供与染色体
ＤＮＡ切断とベクターとの結合体）は次に宿主である枯
草菌に導入される。目的とする耐熱性プロテアーゼを選
択的に多量に培養液中に蓄積せしめるため、菌体外酵素
蓄積量の低い枯草菌を宿主として用いればよい。特に組
換体選択の際、容易に組換体のみ選択できることから宿
主菌のプロテアーゼ欠損株が望ましい。

このようにして選ばれた宿主菌である枯草菌への組換体
ＤＮＡ分子を導入して形質転換を行わせるためには、コ
ンピテント細胞を用いる形質転換法（Ｍｏ１．Ｇｏｎ、
Ｇｏｎｅｔ、　１８７２５１（１９７９））　　あるい
はプロトプラストを用いる形質転換法（Ｍｏ１．　Ｇｅ
ｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　１８８　ｌ１ｌ（１９７９））を用いる
ことで実施可能である。　得られる形質転換株から目的
とする耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含む供与染色体
ＤＮＡ切断が導入された微生物を選択分離するには、特
定の方法を必要としないがベクターが有する抗生物質耐
性等のマーカーの発現により一時選択を実施し、更に宿
主のプロテアーゼ活性の変化を指標に選択する方法が容
易である。

選択された形質転換株を用いて目的とする耐熱性中性プ
ロテアーゼを培養液中に蓄積せしめるには何ら特定の方
法を要しない。

即ち培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に
必要に応じてビタミン等の微量栄養素ヲ含有する通常の
ものを用いることができる。培養は好気的条件で培地の
ｐＨ及び温度を適宜調節しながら耐熱性プロテアーゼが
蓄積するまで実施される。

培養後の培養液からの耐熱性中性プロテアーゼの回収は
６０℃以上、好ましくは６５℃以上で目的とする耐熱性
中性プロテアーゼが失活を起さない温度で１０〜２０分
熱処理を施すことにより宿主である枯れ草菌由来のタン
パク質を熱失活させ遠心で除去することにより特異的に
耐熱性中性プロテアーゼのみ回収することが可能である
。

以上詳述したように本発明においては、任意の好熱性細
菌染色体ＤＮＡ供与菌とし、該供与菌の生産する菌体外
耐熱性中性プロテアーゼを任意に選んだ宿主菌である枯
草菌を用いて耐熱性中性プロテアーゼのみを製造し得る
利点を有する。従って本発明においては染色体ＤＮＡ供
与菌として耐熱性中性プロテアーゼ高生産性の好熱性細
菌を選び、また宿主菌の枯草菌として菌体外酵素をほと
んど蓄積しないバチルス属細菌を選ぶことにより目的と
する耐熱性中性プロテアーゼを多量に且つ混在酵素の混
入を低く押えて製造することが可能となる。

以上のように耐熱性中性プロテアーゼの生産性の改良お
よび精製工程の簡略化によるプロテアーゼの製造に及ぼ
す寄与は大きい。

［実施例］ 以下により、実施例に本発明を更に説明する。

実施例１ （１）　ＭＫ−２３２株染色体ＤＮＡの調製バチルスや
ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｖｏｐｈｌｌｕｓ）　Ｍ　Ｋ　−２３２株を
１００　ｍｌＬ培地を含む５００　ｍｌ容量フラスコ中
で１夜５５℃で培養した。遠心集菌倹約２０ｍ１のＴＥ
緩衝液（１０ｍＭ）リス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，５
）で洗浄し、次いで６　ｍｌの１５％シヨ糖−５０ｍＭ
）リス（ｐＨ８，５）−５０ｍＭＥＤＴＡ−１ｍｇ／ｍ
ｌリゾチームに懸濁し、水中で３０分間静置した。これ
に５　ｍｌの２％ザルコシルー５０ｍＭ）リス（ｐＨ８
，５）−５０ｍＭＥＤＴＡを添加し、室温で約１５分間
放置して完全に溶菌させた。次いで、５０ｍ１容量フラ
スコにＣｓＣ１１１，Ｏｇ入れ、更に前記溶菌液１２ｍ
１を加えた。その後１０ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロマ
イド液０．６ｍｌを加えた。この液を２本の遠心管に分
注し、ＲＰ６５Ｔローター（日立製作新製）で超遠心場
で分離した。超遠心終了後、ＤＮＡ区分を注射針で抜き
取り、ｎ−ブタノールで３回抽出を繰り返してエチジウ
ムブロマイドを除去した。

このＤＮＡ試料１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）−０，１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ中で透析し４℃で保存した。

（２）制限酵素処理・リガーゼ処理 枯草菌を宿主として、複製維持できるベクター・プラス
ミドｐＴＢ５３　（前述）を常法により調整した。この
ｐＴＢ５３及び別途調整したＭＫ−２３２株染色体ＤＮ
Ａを制限酵素ｐｓｔＩでそれぞれ完全分解した。反応条
件は次の通りであった。

Ｐｓｔｌ緩衝液（’１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，４）−１
０ｍＭ　　ＭｇＣＪ　２−５０ｍＭ　　ＮａＣ１−１ｍ
Ｍジチオスレイトール）の１０倍濃縮液を使用する（１
０ＸＰｓ　ｔ　Ｉ緩衝液） ＭＫ−２３２ＤＮＡ　　　　　　　３０μＡ１０ＸＰｓ
ｔＩ緩衝液　　　　　１０μｊｌ牛血清アルブミン（５
ａ＋ｇ／ｍｌ）　　　２１ｔ１蒸留水　　　　　　　　
　　　　５６μｍＰｓｔＩ　　　　　　　　　　　　　
２μｍｐＴＢ　５３　　　　　　　　　　２０μＡ１０
ＸＰｓｔｌ緩衝液　　　　　１０μｍ牛血清アルブミン
（５ｍｇ　／　ｍｌ　）　　　　２μｌ蒸留水　　　　
　　　　　　　　６６μオＰｓｔＩ　　　　　　　　　
　　　　２μｍで３７℃、１〜２時間反応させた。

２種のＤＮＡを混合し、５Ｍ酢酸ナトリウムを加え、そ
の後エタノールを０．４５ｍ１加えて１０〜１５分−２
０℃放置後遠心して上澄を捨てた。

沈澱をエタノールで洗って脱水、脱塩し、デシケータで
乾燥した。乾燥物に１０×リガーゼ・バッフｙ（６６０
ｍＭ）リス（ｐＨ７，６）６６ｍＭＭｇＣｊｌ）５ｕｉ
、１００ｍＭジチオスレイトール５ｕ１１．１０ｍＭ　
　ＡＴＰ５．ＣＺｊｌ、蒸留水３４μｍを加えて混合し
た後、ＤＮＡリガーゼ１μｍを加え４℃、１６時間保っ
た。これを次の形質転換に用いた。

（３）コンピテント番セルの調製 り培養地で３７℃−夜培養した培養液をＴＦＩ（Ｓｐｌ
ｚ１ｇｅｎ’ｓ　５ａｌｔ　　Ｘ　１０　（Ｎ　Ｈ４）
　２Ｓ　０４２％。

Ｋ　　ＨＰＯ４１４％、　　ＫＨ２ＰＯ４８％、　Ｎａ
−ｃ１ｔｒａｔｅ１％）２ｍｌ、２％カザミノ酸０．２
ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌアミノ酸液１ｍｌ、蒸留水１４．８
ｍｌ、５％グルコース＋０．２％Ｍ　ｇ　Ｓ　０４２　
ｍｌ　）に植え３時間４５分振とう培養し、Ｔ　Ｆ　ｎ
　（Ｓｐｌｚ１ｇｅｎ’ｓ　５ａｌｔ　　ｘ　１０３．
６ｍ１．２％カザミノ酸０．　１８ｍｌ、　　１ｍｇ／
ｍｌアミノ酸液０．１８ｍ１．蒸留水２８．４４ｍ１．
５％グルコース＋〇、２％Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　３．６　
ｍｌ　）に植え１時間３０分振とう培養しコンピテント
セルを得た。

（４）耐熱性中性プロテアーゼのクローニング前記（２
）のＤＮＡ溶液４０μｍと１　ｍｌのコンピテント・セ
ルを混合し、３７℃、３０分激しく攪拌した。これを遠
心後、３ｍ１Ｌ培地を加え３７℃２時間ゆるやかに攪拌
した。その０．１ｍｌを１％カゼインと共にテトラサイ
クリン（５μｇ　、／　ｍｌ　）またはカナマイシン（
５μｇ　／　ｍｌ　）を含むＬＡプレートにまいた。こ
のプレートを１６時間、３７℃に保ち、ハローを形成す
るコロニーを取得した。

こうして得られた形質転換株をバチルス　ズブチルＸ　
　ＭＴ−２／ＰＴＺ−２３２と命名した。

バチルス　ズブチルス　ＭＴ−２／ＰＴＺ−２３２は昭
和６１年９月３０日付で通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第８９８２号として寄託され
ている。

バチルス　ズブチルス　ＭＴ−２／ＰＴＺ−２３２を培
養して常法によりプラスミドＤＮＡ。

ＰＴＺ−２３２を得た。このプラスミドのバチルス　ス
テアロサーモフィルスＭＫ−２３２由来の耐熱性プロテ
アーゼ構造遺伝子及びその近傍の制限酵素開裂部位を第
１図に示す。

（５）耐熱性プロテアーゼの調製 ＩＪＬ培地に前記（４）より重書したコロニーを植菌し
、３７℃、１６時間振とう培養した。その培養液を遠心
し上清を７０％飽和硫安を用いて塩析した。遠心後、沈
澱物を１０ｍ１の５０ｍＭ）リス（ｐ　Ｈ７、５）　　
　１　ｍ　Ｍ　　Ｃａ　ＣＪ　２を加えた後、６５℃、
１５分熱処理を行った。それを遠心後、上澄を５０ｍＭ
）リス（ｐＨ７，０）−１ｍＭＣａ　Ｃｉ２に対して透
析した。

得られた酵素液についてその酵素活性を測定した。比較
としてバチルス　ステアロサーモフィルスＭＫ−２３２
株及びバチルス　ズブチルスＭＴ−２について同様に培
養し、培養液を処理して酵素活性を測定した。結果を第
１表に示す。

第１表 菌　　　株　　　　　　　　　プロテアーゼ活性　　　
摘　要ＭＴ−２／ＰＴＺ−２３２４９９ バチルス　ステアロサーモフィルス ＭＫ−２３２４２比較例 バチルス　ズブチルス ＭＴ−２０比較例 ＊１単位は３７℃で１分間１μｇのチロシン相当物質を
トリクロロ酢酸可溶区分に遊離させる酵素量とした。

実施例２ バチルス　ステアロサーモフィルスＭＫ−２３２に代え
て染色体ＤＮＡ供与菌としてバチルスステアロサーモフ
ィルスＮＣＡｌ３Ｏ３を用いて実施例１をくりかえし中
性プロテアーゼＮＣＡｌ３Ｏ３を効率よく得た。第２図
形質転換したプラスミドのＮＣＡｌ３Ｏ３構造遺伝子及
びその近傍の制限酵素開裂部位を示す。

［発明の効果］ 本発明による耐熱性プロテアーゼの製造法によれば、従
来の方法で染色体ＤＮＡ供与菌における生産と比べて高
々２〜５倍程度しかあげることのできなかった耐熱性酵
素の生産量を１０倍以上とすることができるとともに、
その精製を極めて効率的に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明で用いることのできる形質転
換体のプラスミドの耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子を説
明する図である。 手続ＩＩ市正書（方勺 昭和６２年　３月２６日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）好熱性細菌由来の耐熱性菌体外中性プロテアーゼ
   構造遺伝子を切断し、得られたＤＮＡ断片をベクターを
   用いる方法で別種の枯草菌（３７℃至適成育温度）を宿
   主として形質転換を行い、該形質転換株から目的とする
   耐熱性菌体外中性プロテアーゼ構造遺伝子断片が導入さ
   れた菌株を選択し遺伝子を増幅させて耐熱性菌体外中性
   プロテアーゼを生産させ、培養液を加熱することにより
   枯草菌由来のタンパク質を熱変性沈澱させ好熱性細菌由
   来の耐熱性菌体外中性プロテアーゼのみを特異的に採取
   することを特徴とする耐熱性プロテアーゼの製造法。