JPH0249590A

JPH0249590A - 耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子とその利用

Info

Publication number: JPH0249590A
Application number: JP63286728A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Ishiwatari; 石渡　健一; Sadao Yoshino; 吉野　節生; Akira Iwamori; 暁岩森; Tadashi Suzuki; 正鈴木; Nobuyoshi Makiguchi; 牧口　信義
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1988-05-09
Filing date: 1988-11-15
Publication date: 1990-02-19
Anticipated expiration: 2010-03-15
Also published as: KR910005627B1; KR900018372A; JPH0722510B2; EP0341674A3; BR8902160A; NZ229029A; AU610395B2; AU3458789A; EP0341674A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、耐熱性トリプトファンシンターゼ（ｔｒｙｐ
ｔｏｐｈａｎ　５ｙｎｔｈａｓｅ）の生産に有用なトリ
プトファンシンターゼ遺伝子とその利用に関するもので
ある。

トリプトファンシンターゼは、いわゆる多機能酵素であ
り、インドールとし一セリンからのし一トリプトファン
合成など種々の反応を触媒する（ＭｉｌｅｓＥ、Ｗ、（
１９７９）　Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、Ｖｏｌ、４９
．ｐ、１２７−１８６）、工業的にも重要な酵素である
。

［従来の技術］従来、微生物由来のトリプトファンシンターゼ遺伝子と
しては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ）　（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、Ｖ、　ｅｔ　
ａｌ、（１９７４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　、Ｖｏｌ、７１．ｐ、３４５５
−３４５９）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｕｓ）　　（Ｈｅｎｎｅｒ、Ｄ、Ｊ、
　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌ、３
４．ｐ１６９−１７７）、ブレビバクテリウム・ラクト
ファメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃ
ｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）　（ＭａｔｓｕｉＪ、　ｅｔ
　ａｌ、’（１９８６）　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、、Ｖｏｌ、５１．ｐ８２３−８２８）、サルモネ
ラ・チフィムリム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ）　（Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ
、（１９８７）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、　Ｖｏ
ｌ、２６２．　ｐ、１０６７Ｂ−１０６８３）、サツカ
ロマイセス０セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　（Ｗａｌｔｚ＋Ａ、ｅｔ　
ａｌ、（１９７Ｂ）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、、Ｖｏｌ、７５．ｐ、６１７２−６１７６）由来の
遺伝子がクローニングされている。

［発明が解決しようとする課題］しかし、これらの常温菌（ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ）由来の
トリプトファンシンターゼ遺伝子を有する組換え体プラ
スミドにより形質転換された微生物の生産するトリプト
ファンシンターゼは、耐熱性などの安定性が必ずしも満
足できるものでなく、例えば、インドールとＬ−セリン
からのＬ−）リプトファン合成反応触媒として工業的に
用いるには、耐熱性などの安定性に、よりすぐれた酵素
が要望されていた。

一方、中等度好熱菌（ｍｏｄｅｒａｔｅ　ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｅ）に属するバチルス・ステアロサーモフィラ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）の生産する酵素は、常温菌の酵素に比べ耐熱
性が高いことが知られている（Ｏｈｓｈｉｍａ＋Ｔ、　
ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ。

Ｖｏｌ、１４１．ｐ４０７−４１１）。

しかし、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由
来の耐熱性トリプトファンシンターゼ遺伝子、その遺伝
子を有する組換え体プラスミドおよびそれにより形質転
換された微生物については、全く知られていない。

［課題を解決するための手段］そこで、本発明者らは、耐熱性のトリプトファンシンタ
ーゼを生産するために鋭意研究した結果、中等度好熱菌
に属するバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由
来の耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする遺伝
子を担うＤＮＡ断片を分離することに成功した。更に、
この耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする遺伝
子の構造を確認し、この遺伝子ＤＮＡをプラスミドベク
ターに連結した新規な組換え体プラスミドおよびそれに
より形質転換された新規な大腸菌を創製し、この大腸菌
が耐熱性のトリプトファンシンターゼを生産することを
見い出し本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば耐熱性トリプトファンシンタ
ーゼの生産に有用なトリプトファンシンターゼ遺伝子、
組換え体プラスミドおよび大腸菌と、この大腸菌を用い
るトリプトファンシンターゼの製造法が提供される。

本発明の、トリプトファンシンターゼ遺伝子は、例えば
、中等度好熱菌であるバチルス・ステアロサーモフィラ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋ｎｏｐ
ｈｉｌｕｓ）の染色体ＤＮＡ上に存在する。バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の例としては、ＩＦｏ
　１２９８３、ＩＰｏ　１３７３７などがある。

トリプトファンシンターゼの遺伝子を担うＤＮＡを採取
する方法については、特に限定されないが、例えば、次
のような方法を用いることが出来る。バチルス・ステア
ロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のトリプトファンシンターゼの
遺伝子を担う［ｌＮＡを有している株を培養し、この菌
体からフェノール法（Ｓａｉｔｏ、Ｉ（、ｅｔ　ａｌ、
（１９６３）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ
ｔａ、　Ｖｏｌ、７２．ｐ、６１９−６２９）などによ
り染色体ＤＮＡを抽出、精製する。この染色体ＤＮＡを
適当な制限酵素で切断し、大腸菌内で増殖可能なプラス
ミドベクターにＤＮＡ　リガーゼにより酵素的に接続し
、得られた組換えＤＮＡを用いてトリプトファンシンタ
ーゼ生産能の欠如したトリプトファン要求性大腸菌変異
株を形質転換し、トリプトファン非要求となった菌株を
選択し、この菌株よりバチルス・ステアロサーモフィラ
スのトリプトファンシンターゼの遺伝子を担うＤＮＡを
分離できる。

染色体ＤＮΔの切断に用いる制限酵素は、酵素使用量や
反応時間などを調節して、ＤＮＡの切断の程度を調節す
れば、様々な種類のものが使用可能である。例えば、Ｈ
ｐａ　Ｉ［、Ａｃｃ　Ｉ　、　　５ａＵ３Ａ　Ｉ　、　
ＨｐａＩ、５ｃａｌなどを用いることができる。

プラスミドベクターとしては、大腸菌内で増殖可能なも
のが用いられ、例えば、Ｃｏ１Ｅｌ系のｐＢＲ３２２、
ｐＵ（Ｊ９などが好適に用いられる。

プラスミドベクターは、染色体ＤＮＡを切断した際に用
いた制限酵素またはその制限酵素と同じ接着末端を生じ
させることの出来る制限酵素で切断したのち、染色体Ｄ
Ｎ＾断片にＤＮＡ　リガーゼにより接続される。

ＤＮＡ　リガーゼとしては、Ｔ４ファージ由来のものが
好適に用いられる。

染色体ＤＮＡは、制限酵素で切断したのち、ショ糖密度
勾配遠心、アガロース電気泳動などにより特定の大きさ
の［）ＮＡ断片だけを分画、回収してプラスミドベクタ
ーに接続してもよい。

このようにして得られた染色体ＤＮＡ断片とプラスミド
ベクターとの組換えＤＮＡを大腸菌に導入するには、塩
化カルシウムで菌体を処理する方法（Ｍａｎｄｅｌ、０
．　ｅｔ　ａｌ、（１９７０）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、、Ｖｏｌ、５３．ｐ。

１５９−１６２）などを用いることができる。

トリプトファンシンターゼ生産能の欠如したトリプトフ
ァン要求性大腸菌変異株としては、例えば、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　Ｋ１２　Ｗ３１１０　ＭＴ−１０３４７（ＦＥＲＭ
　Ｐ−９９４０）を用いることができる。

組換え体プラスミドを有する大腸菌から組換え体プラス
ミドを単離するには、アルカリ抽出法（Ｂｒｉｎｂｏｉ
ｍ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、（１９７９）　　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

Ｖｏｌ、７．ｐ１５１３−１５２３）などを用いること
が出来る。

単離された組換え体プラスミドは、塩化カルシウムで菌
体を処理する方法（Ｍａｎｄｅｌ、Ｏ，ｅｔ　ａｌ、（
１９７０）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、５３＋
＋１．１５９〜１６２）などにより、再び大腸菌に導入
することができる。

以上のようにして得られたバチルス・ステアロサーモフ
ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）由来のトリプトファンシンターゼの遺伝
子を担う１１ＮＡをプラスミドベクターに連結した組換
え体プラスミドの例として、ｐｒｓｙｔｏとｐＩＳＹ２
１がある。

ｐｌｓＹｌｏ、ｐｌｓＹ２１をそれぞれ保持する大腸菌
として次の２株が微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。

エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）ＭＴ４０４７１（ＭＴ−１０３４７／ｐｌｓＹ１０
）　　（ＰＥＲＭ　Ｐ−９９４１）エシェリヒア・コリ
　（ｕｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０４
７２（ＭＴ−１０３４７／ｐｌｓＹ２１）　　（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−９９４２）ｐｌｓＹｌｏまたはｐｌｓＹ２１上
のトリプトファンシンターゼ遺伝子の発現効率を高める
には、ｐｌｓＹｌｏまたはｐｌｓＹ２１からトリプトフ
ァンシンターゼ遺伝子部分を切り出し、それを強力なプ
ロモーターを有するベクターのプロモーターの下流に接
続することが有効である。プロモーターの例としては、
ｔｒｐ、１ａｃＵＶ５、ｔａｃ、λ　Ｐ、などがある。

更に、トリプトファンシンターゼ遺伝子の下流にターミ
ネータ−を接続するのが有効なこともある。

このような組換え体プラスミドの例として、ｐＩＳＹ７
３がある。ｐｌｓＹ７３を保持する大腸菌として次の株
が微生物工業技術研究所に寄託されている。

エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｔ）ＭＴ−１０４７４（ＭＴ−１０３４７／ｐｌｓＹ
７３）　　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２７５）トリプトファ
ンシンターゼを製造するには、トリプトファンシンター
ゼの遺伝子を担うＤＮＡをプラスミドベクターに連結し
た組換え体プラスミドで形質転換された大腸菌を培養し
、培養物中にトリプトファンシンターゼを生成させれば
よい。

大腸菌の培養は、常法により行うことができる。すなわ
ち、培地として、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必
要に応じてアミノ酸、ビタミンなどを含むものを用い、
好気的に培養すればよい。

また、必要に応じ、培地に抗生物質、イソプロピル−β
−チオガラクトシド、インドールアクリル酸のような薬
剤を加えることもできる。

このようにして得られた培養物は、そのままトリプトフ
ァンシンターゼの酵素源として使用できるが、粗酵素抽
出液、精製酵素、分離生菌体、分離菌体の処理物なども
酵素源として使用できる。

トリプトファンシンターゼの精製法としては、通常の酵
素精製法を用いることが出来る。また、トリプトファン
シンターゼの精製に際して、菌体破砕液の加熱処理を行
えば、効率よく耐熱性のトリプトファンシンターゼを採
取することが出来る。

［実施例コ以下に実施例で本発明の詳細な説明する。

実施例１（ａ）バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の染
色体ＤＮＡの分離。

バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＦＯ１３７
３７を２！のＬ培地（バクト・トリプトン　Ｌｏｇ／／
！、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５　ｇ／　ｌ
　、　ｐＨ７，２に調整）に植菌し、５５°Ｃで１５時
間振とう培養した後、遠心分離により集菌した。　菌体
を１６０ｎｌの０．１５ＭＮａＣ１−５０ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　（ｐＨ８，０）溶液に懸濁し、１６０　ｍｇのリゾ
チームを加えて３７°Ｃで２０分間、ゆるやかにか（は
んした。

ツイテ、２０χＳＯＳ溶液４ｍｌを加え、６５°Ｃで２
０分間放置した。更に、３　ｍｇのプロティナーゼＫ　
（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を加え、３７°Ｃで１時間放
置した。

０．１５Ｍ　ＮａＣ＋−５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐｉｆ
　８．０）溶液で飽和したフェノール１６０ｍ１！を加
え、ゆるやかにがくはんした後、遠心分離（１０，００
０ｒｐＪ　１５　ｍ１ｎ）　Ｌ、上層を回収する。

この溶液に、２倍量の冷エタノールを加え、ガラス棒に
より繊維状の沈澱を巻取り、７ｏχ、　８０χ、９ｏｚ
のエタノールに順次、数分づつ浸漬した後、乾燥し、０
．１Ｍ　ＮａＣ１−０，１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐ
ｉｆ　７．０）溶液４０ｎｌに溶解した。

１にの粗ＤＮＡ溶液に、６ｍｇ／ｍｊ！のりボヌクレアーゼ
Ａ　（Ｒｉｂｏｉｎｕｌｅａｓｅ　Ａ＋　Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を２００μｌ、１，
０００口／ｌ１１２のりボヌクレアーゼＴＩ（Ｒｉｂｏ
ｉｎｕｌｅａｓｅ　Ｔｌ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ社製）を２００μ！加え、３７°Ｃで１
．５時間放置した。

この溶液に、０．１５Ｍ　ＮａＣ＋−５０ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　（ｐｉｆ　８．０）溶液で飽和したフェノール４０
ｍ　ｌを加え、ゆるやかにかくはんした後、遠心分離（
１０，００Ｏｒｐｍ、　１５ｍ１ｎ）　Ｌ、上層を回収
した。

２倍量の冷エタノールを加え、ガラス棒により繊維状の
沈澱を巻取り、７０　％、　８０χ、　９０χのエタノ
ールに順次、数分づつ浸漬した後、乾燥し、１゜ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）−１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶
液（以下、ＴＥ緩衝液と記す）２０＋／！に溶解した。

このＤＮＡ溶液を、２１のＴＥ緩衝液に対して透析し、
４．５ｍｇの染色体ＤＮＡを含むＴＥ緩衝液を２０ｍｊ
２得た。

（ｂ）染色体ＤＮＡ断片の調製。

（ａ）で調製した染色体ＤＮＡを含むＴＥ緩衝液の内、
１，３５０　ｔｔ　ｌ　（ＤＮＡ　３００ｕｇを含む）
に制限酵素Ｈｐａ　Ｉ［（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ社製）を３０　Ｕｎｉｔｓ加え、１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊＮｐＨ７，５）　、７ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｆｆ１ｚ、７ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む
反応液１，５００μ２で、３７°Ｃで１時間放置して、
染色体ＤＮＡを部分的に切断した。

この溶液に、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノール・クロロ
ホルム（フェノール：クロロホルム＝１：１）を等量加
えて、ゆるやかにかくはんした後、遠心分離（１５，０
０Ｏｒｐｍ、　５　ｍ１ｎ）　シ、上層を回収した。

回収した上層に２倍量の冷エタノールを加え、生じた沈
澱を乾燥後、ＴＥ緩衝液３００μ２に溶解した。このＤ
ＮＡ溶液を１０〜４０χショ糖密度勾配遠心（２０°Ｃ
，’　２６．００Ｏｒｐｍ、　２４ｈｒ）にかけ、およ
そ４〜６　ｋｂと６〜ＬＯｋｂの２つの両分を回収した
。それぞれの両分をＴＥ緩衝液に対して透析した後、エ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液に溶解
した。

（Ｃ）染色体ＤＮＡ断片とプラスミドヘクターの結合。

ｐＵｃ１９（全酒造製）４０ｕｇを、制限酵素Ａｃｃ　
（ｎ。

ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）で完全消化
後、アルカリフォスファターゼ処理した。このプラスミ
ドヘクタ−２０μｇづつと、（ｂ）で調製した染色体Ｄ
ＮＡ断片の各画分をそれぞれ混合し、それぞれ、５ｍＭ
　Ｍｇ−Ｃ１ｚ　、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
Ｍ　ＡＴＰ　、　６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣｊｌ！緩
衝液（ｐＨ７，５）の反応液４＋ｎｊｉ中で、２００Ｕ
ｎｉｔｓのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）により、１６°Ｃ，１６ｈ
ｒ反応させた。

大腸菌の形質転換には、この反応液をそのまま用いた。

（ロ）トリプトファンシンターゼの遺伝子のクローニン
グ。

（Ｃ）で調製した組換え体プラスミドを含む反応液を用
いて大腸菌の形質転換を行った。トリプトファンシンタ
ーゼ生産能の欠如したトリプトファン要求性大腸菌変異
株であるＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｗ３１１０　ＭＴ１０
３４７（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９４０）を５０ｍ　ｌのし培
地（バクト・トリプトン　１０ｇ／４２、酵母エキス５
ｇ／　ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／！、ｐＨ７，２に調整
）に植菌し、３７°Ｃで３時間振とう培養した後、遠心
分離により集菌した。

菌体を０．１Ｍ　ＣａＣ！□溶液２ｍ溶液２定Ｉ！し、
０°Ｃで３０分間放置した後、遠心分離し、０．ＩＭ　
ＣａＣｆｆ１□溶液４０ｍ　ｌに再び懸濁した。

このようにして調製した菌体懸濁液を２０ｍ　１２づつ
２本の試験管に分け、それぞれに、（Ｃ）で調製した反
応液を加えて、Ｏ′Ｃで３時間放置した後、４２°Ｃで
２分間保った。

遠心分離により集菌し、Ｌ培地を１０ｍ１づつ加えて３
７°Ｃで３０分間培養した後、遠心分離により集菌した
。

菌体をそれぞれ１０ｍｆｆ１の０．８５χＮａＣ１に懸
濁した後、遠心分離により集菌し、それぞれ１ｍｌの０
゜８５χＮａＣｌに懸濁した。

このようにして調製した菌体懸濁液を、１００ｍｇ／２
のアンピシリン、２５ｍｇ／Ｉ２．のイソプロピル−β
チオガラクトシド、Ｌｏｇ／　１のカザミノ酸、１５ｇ
／！の寒天を添加したＶｏｇｅｌとＢｏｎｎｅｒの培地
（ＭｇＳＯｚ７Ｈｚｏ　：０．２ｇ／ｌ、Ｃ４ｔｒｉｃ
　ａｃｉｄ　　−１（ｇｏ　：　２　ｇ／ｆ！、ＫＪＰ
０４：１０ｇ／１．、ＮａＮＨ４ＰＯ４１１１ｚＯ：　
３．５　ｇ／ｌ、Ｇ１ｕｃｏｓｅ　：４ｇ／　ｌ　）に
塗布して、３７°Ｃで２日間培養した。

およそ６〜１（ｌ　ｋｂの染色体ＤＮＡ断片の両分を用
いて調製した組換え体プラスミドで形質転換した大腸菌
を塗布した寒天平板培地には、２２のコロニーが生じた
。この内、代表的なコロニーから分離した大腸菌をエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、）
　ＭＴ−１０４７１と名付け、工業技術院微生物工業研
究所に寄託した（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９４１）。

一方、およそ４〜６　ｋｂの染色体ＤＮＡ断片の両分を
用いて調製した組換え体プラスミドで形質転換した大腸
菌を塗布した寒天平板培地には、２７のコロニーが生じ
た。この内、代表・的なコロニーから分離した大腸菌を
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　ＭＴ−１０４７２と名付け、工業技術院微生物工
業研究所に寄託した（ＩＩＩｌｔＲＭ　Ｐ−９９４２）
。

（ｅ）大腸菌の保持する組換え体プラスミドの分離。

エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）ＭＴ−１０４７１（ＦＥＲ）Ｉ　Ｐ−９９４１）と
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）ＭＴ−１０４７２（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９４２）より
次のような方法により組換え体プラスミドを分離した。

エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）ＭＴ−１０４７１（ＦｔｔＲＭ　Ｐ−９９４１）ま
たは、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０４７２（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９４２
）を５０１１１！のし培地に植菌し、３７°Ｃで１５５
時間振う培養した後、遠心分離により集菌した。

菌体を２ｍｇのリゾチームを含む２ｍＩ！、の５０ｍＭ
　Ｇｌｕｃｏｓｅ−２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ−１０
ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）溶液に懸濁した。

０．２Ｎ　ＮａＯＨ１χＳＤＳ溶液４ｍｊ２を加えて、
かくはんした。３Ｍ　ＣＨｓＣＯＯＮａ　（ｐＨ５，２
）溶液を３ｍ！加え、４°Ｃで５分間時間放置したのち
、遠心分離し、上澄液を回収した。

この溶液に、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノール・クロロ
ホルム（フェノール；クロロホルム−１：１）を等量加
え、ゆるやかにかくはんした後、遠心分離（１０，ＯＯ
Ｏｒｐｍ、　５ｍ１ｎ）　Ｌ、上層を回収した。

回収した上層に２倍量の冷エタノールを加え、生じた沈
澱を乾燥後、ＴＥ緩衝液１ｍＩ！、に溶解した。

このＤＮＡ　溶液に、１ｍｇ／　ｌのリボヌクレアーゼ
Ａ（Ｒｉｂｏｉｎｕｌｅａｓｅ　Ａ、　Ｂｏｅｈｒ’ｒ
ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｒｍ社製）を２０μ℃加え、３
７°Ｃで２０分間放置した。

この溶液に、フェノール・クロロホルム（フェノール：
クロロホルム−１：１）を等量刑え、ゆるやかにかくは
んした後、遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ、５ｍ１ｎ）
Ｌ、上層を回収した。

このＤＮＡ溶液をＢｌｏ−Ｇｅ１　Ａ−５０ｍ（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ社製）によるカラムクロマトグラフィにより精
製し、エタノール沈澱によりプラスミドＤＮＡを回収し
た。

このようにしてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＭＴ−１０４７１（ＦＥＲＭ　Ｐ
−９９４１）とエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０４７２（Ｆｔ！ＲＭ　Ｐ
−９９４２）から約５０μｇづつのプラスミドＤＮＡを
分離し、それぞれ１００μ２のＴＥ緩衝液に溶解した。

以下の組換え体プラスミドの解析においては、上記よう
にして得たプラスミドを使用した。

（ｆ）組換え体プラスミドの解析。

エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｔａ　ｃｏｌ
ｉ）ＭＴ−１０４７１（ＰＥＲＭ　Ｐ−９９４’ｌ）か
ら分離した組換え体プラスミドをｐＩｓＹｌｏと名付け
た。この組換え体プラスミドは約１２．２ｋｂの大きさ
であり、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨ４ｎｄ　Ｉｆで切断す
ると、約９．５　ｋｂのＤＮＡ挿入断片が認められた。

エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）　ＭＴ−１０４７２（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９４２）
から分離した組換え体プラスミドをｐｒｓｙ２ｔと名付
けた。この組換え体プラスミドは約７．３ｋｂの大きさ
であり、制限酵素ＥｃｏＲ１と旧ｎｄｌ［［で切断する
と、約４．６　ｋｂのＤＮＡ挿入断片が認められた。

ｐｌｓＹｌｏとｐｌｓＹ２１の制限酵素切断地図を第１
図と第２図に示した。第１図と第２図より、ｐｌｓＹ２
１に挿入されているＤＮＡ断片はｐｌｓＹｌｏに挿入さ
れているのＤＮＡ断片の一部であることがわかる。

次にｐＩｓＹｌｏとｐＩｓＹ２１に挿入されているＤＮ
Ａ断片が、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
のＤＮＡ断片であることを次のように、サチン法（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）により確認した。

サチン法は、常法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　ｅｔ　ａ
ｌ、（１９Ｂ２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、
）に従った。

バチルス・ステアロサーモフィラス　（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＩＦＯ１３
７３７の染色体ＤＩＩＩＡを（ａ）と同様に調製した。

また、組換え体プラスミドｐｌｓＹ１０およびｐＩＳＹ
２１を（ｅ）と同様に調製した。

染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロー
ス電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターに移
行させた。

組換え体プラスミドｐＩｓＹ１０およびｐＩｓＹ２１は
、ＥｃｏＲＩと旧ｎｄｎｌでダブルダイジエスチョンし
たのち、挿入ＤＮＡ断片のみを回収し、３２Ｐでラベル
した。

３２ＰでラベルしたＤＮＡをプローブとし、ニトロセル
ロースフィルター上の染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションを行った。

オートラジオグラフィーを行ったところ、染色体ＤＮＡ
には、ｐＩｓＹｌｏおよびｐＩｓＹ２１由来の何れのプ
ローブに対しても反応する断片が存在した。

すなわち、ｐＩｓＹＩＯとρｌ５Ｙ２１４こ挿入されて
いるＤ）１Ａ断片が、バチルス・ステアロサーモフィラ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）の染色体ＤＮＡ断片であることが確認された
。

（ｇ）形質転換の再現性の確認（ｅ）で分離した組換え体プラスミドｐｌｓＹ１０およ
びｐｌｓＹ２１によりトリプトファンシンターゼ生産能
の欠如したトリプトファン要求性大腸菌変異株であるＥ
、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｗ３１１０　ＭＴ−１０３４７（
ＦＥＲＭ　Ｐ−９９４０）を（ｄ）と同様に形質転換し
、それぞれ１００ｍｇ／　ｌのアンピシリンを含むし培
地寒天平板に塗布した。生じたコロニーからそれぞれ２
０個を選び、トリプトファンの要求性を調べたところ、
いずれもトリプトファンの要求性が、消失しており、ｐ
ＴｓＹｌｏおよびｐｌｓＹ２１上にトリプトファンシン
ターゼの遺伝子を担うＤＮＡが存在することが確認され
た。

０′Ｉ）サブクローニングとＤＮＡ断片の解析ｐｌｓＹ
２１に挿入されているバチルス・ステアロサーモフィラ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）の染色体ＤＮＡ由来の断片は、約４．６ｋｂ
であり、その詳細な制限酵素切断地図を第３図に示した
。ｐｌｓＹ２１の挿入ＤＮＡ断片からその一部が欠如し
た種々のＤＮＡ断片を調製し、それぞれリガーゼにより
発現ベクターｐＫＫ２２３−３　（ファルマシア社製）
のｔａｃプロモーターの下流のポリリンカ一部に挿入し
た。

これらの組換え体プラスミドにより、トリプトファン要
求変異株である、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＭＴ−１０３４７（ｔｒｐＡＢ
−）　、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ）　ＡＴＣＣ−２３７１７（ｔｒｐＡ−）　
、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｔ）　ＡＴＣＣ−２３７１８（ｔｒｐＢ−）をそれぞ
れ形質転換した。これらの形質転換株のトリプトファン
要求性が消失するか否かを調べることにより、ｔｒｐＡ
およびｔｒｐＢ遺伝子のおおよその位置を決定し第３図
に示した。ｐｌｓＹ２１の挿入ＤＮＡ断片の中で、ｔｒ
ｐＡおよびｔｒｐＢ遺伝子が含まれると思われるのがＥ
ｃｏＲＩＨ４ｎｄＩ［Ｉ断片約２．５　ｋｂである。こ
の断片をｐＫＫ２２３３のポリリンカ一部をＳｍａ　Ｉ
　−１１ｉｎｄｌｌで切断したものに挿入した組換え体
プラスミドがｐｌｓＹ７３である。ｐｌｓＹ７３の制限
酵素地図を第４図に示した。

ｐｌｓＹ７３を保持する大腸菌として次の株が微生物エ
フ業技術研究所に寄託されている。

エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）ＭＴ−１０４７４（ＭＴ−１０３４７／Ｉ）ＩＳ
Ｙ７３）　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２７５）ｐｌｓＹ７３
のＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎｄｌ［ｌ挿入ＤＮＡ断片約２．５
ｋｂについて、第５図に示した方針によりＭ１３ｍｐ系
のヘクター（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８３）　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。

１ｏｇｙ、Ｖｏｌ、１０１．ｐ、２０〜７Ｂ）を用いる
ジデオキシ法（Ｓａｇｅｒ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、（１９
７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ、Ｖｏｌ、７４．ｐ、５４６３〜５４６７）
と第６図に示した方針によりマクサム・ギルバート法（
Ｍａｘａｍ、八、）Ｉ。

ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、（１９８０）　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ、６５．ｐ
、４９９−５６０）でＤＮＡ塩基配列を決定した。

その結果第７図に示したＤＮＡ塩基配列が得られた。こ
の塩基配列中には、１７９番目と１３７４番目の塩基か
ら始まり、それぞれｔｒｐＢとｔｒｐＡに相当する２つ
のオープンリーディングフレームが確認された。２つの
オープンリーディングフレームは１７ｂｐを共有してい
た。第８図に、ｔｒｐＢのアミノ酸配列を、第９図に、
ｔｒｐＡのアミノ酸配列を示した。

（ｉ）トリプトファンシンクーゼの製造エシェリヒア・
コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＭＴ−
１０４７１（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９４１）　、エシェリヒ
ア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｍ
Ｔ−１０４７２（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９４２）およびエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
　ＭＴ−１０４７４（Ｆ［！ＲＭ　Ｐ−１０２７５）を
、１００ｍｇ／　ｌのアンピシリン、２５ｍｇ／　Ｉ！
、のイソプロピル−β−チオガラクトシド、１０ｇ／　
１のカザミノ酸を添加したＶｏｇｅｌとＢｏｎｎｅｒの
培地（ＭｇＳＯ４・７１１２０　：　０．２ｇ／ｌ、Ｃ
１ｔｒｉｃ　ａｃｉｄ　−ＮＨ０：２ｇ＃！、Ｋ２１１
ＰＯ４：１０ｇ／ｌ、ＮａＮＨ４ＰＯ４・４Ｈ２０：３
．５ｇ／Ｉｌ、　Ｇｌｕｃｏｓｅ　：４ｇ／ｌ　）　５
０　ｍｌにそれぞれ植菌し、３７°Ｃで２４時間振とう
培養した後、遠心分離により集菌した。

この菌体を洗浄後、０．１ｍＭのピリドキサールリン酸
を含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，
８）１０ｍｊ２に懸濁した。超音波処理により無細胞抽
出液を調製し、Ｙａｎｏｆｓｋｙらの方法（Ｙａｎｏｆ
ｓｋｙ、　Ｃ，ｅｔａｌ、（１９６２）Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、５＋ｐ、７９
４〜８０６）によりトリプトファンシンターゼ活性を測
定した。

比較のため、宿主として用いたＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　
Ｗ３１１０　ＭＴ−１０３４７を、同じ培地（ただし、
トリプトファンを２０ｍｇ／　１添加）で培養して、そ
のトリプトファンシンターゼ活性を同様に測定した。

各菌株のトリプトファンシンターゼ活性を第１表に示し
た。なお、トリプトファンシンターゼ活性の１　ｕｎｉ
ｔは、３７°Ｃで２０分間反応させた際に０．１μｍｏ
＋　のトリプトファンを生成する酵素量である。

第１表菌株　　　酵素活性（Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）ＭＴ−１０４７１２ＭＴ−１０４７２１２ＭＴ−１０４７４６９ＭＴ−１０３４７０また、ＭＴ−１０４７４の無細胞抽出液を６５°Ｃ１１
０分間熱処理した後、トリプトファンシンターゼ活性を
測定したところ、約９０χの酵素活性が残存していた。

〔発明の効果〕

本発明によれば耐熱性トリプトファンシンターゼの生産
に有用な耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする
遺伝子、組換え体プラスミド、それにより形質転換され
た大腸菌およびこの大腸菌を用いるトリプトファンシン
ターゼの製造法が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１閏は、組換え体プラスミドｐｌｓＹ１０の制限酵素
切断地図を示した。第２図は、組換え体プラスミドｐｌ
ｓＹ２１の制限酵素切断地図を示した。第３図は、ｐｌ
ｓＹ２１に挿入されているバチルス・ステアロサーモフ
ィラスの染色体ＤＮＡ由来の約４．６　ｋｂ断片の制限
酵素切断地図とｔｒｐＡおよびｔｒｐＢ遺伝子のおおよ
その位置を示した。第４図は、組換え体プラスミドｐｌ
ｓＹ７３の制限酵素切断地図を示した。第５図は、ジデオキシ法によるＤＮＡ塩基配列決定の方
針を示した。第６図は、マクサム・ギルハト法によるＤ
ＮＡ塩基配列決定の方針を示した。第７図は、Ｈ４ｎｄ
　ＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片約２．５　ｋｂについて、Ｄ
ＮＡ塩基配列を示した。第８図は、ｔｒｐＢのアミノ酸
配列を示した。第９図は、ｔｒｐＡのアミノ酸配列を示
した。第２図第５図第６図

Claims

【特許請求の範囲】１）次のＤＮＡ塩基配列で表されるトリプトファンシン
ターゼ遺伝子。【遺伝子配列があります】２）次のアミノ酸配列で表されるトリプトファンシンタ
ーゼＢ蛋白をコードする遺伝子。【アミノ酸配列があります】（ただし、Ａアラニン、Ｃシステイン、Ｄアスパラギン酸、Ｅグルタミン酸、Ｆフェニルアラニン、Ｇグリシン、Ｈヒスチジン、Ｉイソロ
イシン、Ｋリジン、Ｌロイシン、Ｍメチオニン、Ｎアスパラギン、Ｐプロリン、Ｑグルタミン、Ｒアルギニン、Ｓセリン、Ｔスレオニン、Ｖバリン、Ｗトリプトファン、Ｙチロシンを示す。）３）次のアミノ酸配列で表されるトリプトファンシンタ
ーゼＡ蛋白をコードする遺伝子。【アミノ酸配列があります】（ただし、Ａアラニン、Ｃシステイン、Ｄアスパラギン酸、Ｅグルタミン酸、Ｆフェニルアラニン
、Ｇグリシン、Ｈヒスチジン、Ｉイソロイシン、Ｋリジ
ン、Ｌロイシン、Ｍメチオニン、Ｎアスパラギン、Ｐプロリン、Ｑグルタミン、Ｒアルギニン、Ｓセリン、Ｔスレオニン、Ｖバリン、Ｗトリプトファン、Ｙチロシンを示す。）４）請求項第１項、第２項または第３項記載の遺伝子を
担うＤＮＡをプラスミドベクターに連結した組換え体プ
ラスミド。５）請求項第１項、第２項または第３項記載の遺伝子を
担うＤＮＡをプロモーターの下流に連結した請求項第４
項記載の組換え体プラスミド。６）バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のト
リプトファンシンターゼの遺伝子を担うＤＮＡをプラス
ミドベクターに連結した組換え体プラスミド。７）新規な組換え体プラスミドであるｐＩＳＹ１０。８）新規な組換え体プラスミドであるｐＩＳＹ２１。９）新規な組換え体プラスミドであるｐＩＳＹ７３。１０）請求項第４項から第９項記載の何れかの組換え体
プラスミドで形質転換された大腸菌。１１）新規な大腸菌であるＭＴ−１０４７１。１２）新規な大腸菌であるＭＴ−１０４７２。１３）新規な大腸菌であるＭＴ−１０４７４。１４）請求項第１０項から第１３項記載の何れかの大腸
菌を培養し、培養物中にトリプトファンシンターゼを生
成させることを特徴とするトリプトファンシンターゼの
製造法。