KR100838037B1

KR100838037B1 - ｅｎｔＣ 유전자가 불활성화된 Ｌ-트립토판 생산 미생물 및이를 이용한 Ｌ-트립토판 제조방법

Info

Publication number: KR100838037B1
Application number: KR1020060137648A
Authority: KR
Inventors: 이지선; 주재영; 이근철; 최향; 이진호; 박영훈
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-06-12

Abstract

본 발명은 L-트립토판 생산 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 대장균 유래의 이소코리스메이트 신타아제(isochorismate synthase)를 코딩하는 entC 유전자를 불활성화시킴으로써 L-트립토판의 생산효율이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판의 제조방법에 관한 것이다.

L-트립토판, entC, 이소코리스메이트 신타아제, 대장균

Description

ｅｎｔＣ 유전자가 불활성화된 Ｌ-트립토판 생산 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-트립토판 제조방법 {A MICROORGANISM PRODUCING L-TRYPTOPHAN HAVING AN INACTIVATED ENTC GENE AND THE METHOD FOR PRODUCING L-TRYPTOPHAN USING THE SAME}

본 발명은 L-트립토판 생산 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 대장균 유래의 이소코리스메이트 신타아제(isochorismate synthase)를 코딩하는 entC 유전자를 불활성화시킴으로써, L-트립토판의 생산효율이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판의 제조방법에 관한 것이다.

L-트립토판은 필수 아미노산의 일종으로 사료 첨가제 또는 수면 효과나 정신안정효과가 있어 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품 소재 등으로 널리 사용되어 왔다. L-트립토판의 제조 방법에는 화학합성법, 효소 반응법, 미생물에 의한 발효법 등이 있으나, 화학합성법의 경우에는 고온, 고압의 조건이 필요하고 그 산물에 D형, L형이 혼재하기 때문에 정제과정이 쉽지 않다. 효소 반응법의 경우에는, 예를 들어 일본에서 공보된 바 있는 마쓰이 도오아쓰이 특허(대한민국 특허 공고 90- 005773)에서의 효소 반응법의 경우는 기질로 사용되는 인돌과 세린의 가격이 고가일 뿐 만 아니라 효소가 안정하지 못하다는 문제가 있었다.

한편, 종래의 미생물 발효에 의한 L-트립토판의 생산은 대장균과 코리네박테리움 등 다양한 미생물의 영양요구성 균주와 조절 변이 균주에서 이루어져 왔다. 1980년대에 들어서면서 유전자 재조합 기술을 이용하여 우수한 재조합 균주들을 개발하는데 큰 성과를 거두었고, 이는 L-트립토판의 생산에서 높은 수준의 생산성 향상을 가져왔다. 미생물을 이용한 직접 발효법으로 L-트립토판을 생산하는 국내 특허로는 L-트립토판 내성을 갖거나 영양 요구성을 갖는 변이 균주를 이용한 경우 (대한민국 특허 공고 87-1813, 90-8251, 92-7405)와 재조합 균주를 이용한 경우(대한민국 특허 공고 90-5772, 91-5627)가 있다. 이러한 L-트립토판 유사체 내성균주들을 이용한 경우에는 주로 트립토판 생합성 과정에서 대사물질에 의한 피드백 저해(feedback inhibition)를 극복하는 것을 주된 목표로 하였고, 유전자 재조합 균주들의 경우에는 중요한 효소들의 증폭을 통한 트립토판 생산성/수율 향상을 목표로 두었으며 실제로 괄목할 만한 성과를 가져왔다.

그러나 종래의 대장균 인공 변이주를 이용한 L-트립토판 제조방법의 경우에는, L-트립토판 생산성이 낮다는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 유전자 재조합 기술을 통하여 L-트립토판 생산성을 보다 극대할 필요가 있다고 판단하였다.

이에 본 발명자들은 L-트립토판 생산성을 증가시키기 위한 연구를 수행한 결과, 대장균에서의 entC 유전자를 불활성화시킴으로써 L-트립토판 생산성이 증가한 다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 entC 유전자가 불활성화된 L-트립토판 생산능 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 L-트립토판 생산 재조합 미생물을 배양하여 L-트립토판을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-트립토판의 생산능을 가진 미생물로서, 상기 미생물내의 entC 유전자를 불활성화시킴으로써 L-트립토판의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용 가능한 L-트립토판 생산 미생물은 그람 음성 (Gram negative) 박테리아 (bacteria)에 속하는 미생물을 사용할 수 있으며, 에세리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 트립토판 유사체인 트립토판 하이드록사메이트 (tryptophan hydroxamate) 내성을 갖는 L-트립토판 생산 대장균 CJ285 (대한민국 특허 공고 10-2005-0059685)을 사용 할 수 있다.

본 발명의 entC 유전자(NCBI gene ID: 16128576)(서열번호 7)는 철 결손 (iron deficiency) 조건에서 합성되는 단백질로 엔테로박틴 (enterobactin) 합성의 시작 단계에 관여하며, 코리스메이트(chorismate)를 이소코리스메이트(isochorismate)로 전환하는 역할을 한다. entC 유전자가 포함된 entCEBA 오페론 은 철이온 흡수 조절단백질 (ferric uptake regulatory protein) 인 Fur에 의해 네거티브 (negative) 하게 조절된다.

본 발명에 있어서, "불활성화"란 세포 내의 활성이 있는 EntC 단백질이 결여되어 있거나 그 단백질의 수준이 감소되도록 유전적인 변이되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 미생물은 L-트립토판을 생산할 수 있는 미생물의 염색체에 존재하는 entC 유전자를 불활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 불활성화 방법에는, 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 EntC를 코딩하는 유전자가 결손된 균주를 선별할 수 있다. 또한, 상기 불활성화 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함된다. 상기 DNA 재조합 기술은 예를 들면, 상기 EntC를 코딩하는 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합 (homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커가 포함될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 불활성화된 entC 유전자 또는 그의 DNA 단편은, 숙주 내의 entC 유전자와 서열 상동성을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이 폴리뉴클레오티드 서열은 이중나선이 절단되어 일어나는 절단 (truncation), 염기가 떨어져 나가서 일어나는 결실(deletion), 하나의 염기가 다른 염기로 바뀌어 일어나는 치환(substitution), 염기가 첨가되어 일어나는 삽입(insertion) 및 말단이 서로 뒤집힌 상태로 삽입됨으로써 일어나는 역 위(insertion)와 같은 돌연변이가 도입되어 nrfE 유전자가 코딩하는 산물을 발현할 수 없는 서열을 의미한다.

상기 불활성화된 entC 유전자 또는 그의 단편을 숙주세포 내로 도입하는 과정은 예를 들면, 형질전환 (transformation), 접합 (conjugation), 형질도입 (transduction) 또는 전기천공 (electroporation)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 불활성화된 entC 유전자 또는 그의 DNA 단편이 형질전환에 의하여 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 불활성화 절차는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 균주의 배양물과 혼합하여 수행할 수 있다. 이 경우, 균주는 천연적으로 DNA 유입에 대해 적합하여(competent) 형질전환될 수 있으나, 사전에 균주를 적절한 방법에 의하여 DNA 유입이 적합하도록 만드는 것이 바람직하다 (LeBlanc 등, Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi 등, J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996 참조). 구체적으로 LB 배지에 대수증식기 초기까지 배양한 균주를 정제수 및 10% 글라이세롤로 세척한 후 높은 농도가 되도록 균주를 농축하여 DNA 유입에 적합하도록 만든다. 상동 재조합을 위하여 entC 유전자 또는 그의 DNA 단편은 게놈 DNA 내의 entC 유전자 일부분을 제거하거나, 외래 DNA 조각을 도입하고, 이 서열의 야생형 염색체 카피를 불활성화 상태로 치환시킨다. 형질전환에 의하여 숙주세포에 도입된 상기 불활성화된 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA 중의 테일 서열과의 상동 재조합에 의하여 야생형 게놈 서열을 불활성화시킬 수 있다. 불활성화 재조합이 이루어졌는지의 여부는 예를 들면, 써던 블로팅에 의해 쉽게 확인할 수 있으며, 더욱 편리하게는 PCR에 의해 검 증할 수 있다.

본 발명은 또한, entC 유전자가 불활성화된 미생물을 배양하고 이를 이용하여 L-트립토판을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 L-트립토판을 생산하는 방법에서, 상기 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.

상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176) 에 개시되어 있다.

상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로 서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한 상기 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 기간은 원하는 L-트립토판의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

배양물로부터의 L-트립토판의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

이하 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1 : entC 가 불활성화된 재조합 L-트립토판 생산 균주의 제작

본 실시 예에서는 대장균의 entC 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다.

entC 유전자 (NCBI gene ID: 16128576)(서열번호 7)는 엔테로빅틴 합성의 시작 단계에 관여하며, 코리스메이트를 이소코리스메이트로 전환하는 역할을 하기 때문에 entC를 불활성시키면 코리스메이트가 이소코리스메이트로 전환되는 것을 막아 세포내 코리스메이트 농도를 증가 시켜 L-트립토판의 생산성을 향상시켜줄 것으로 예상되어 선정하였다.

이를 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소 (lambda Red recombinase) 를 이용한 돌연변이 제작 기법인 1단계 불활성화 (one step inactivation) 방법을 사용하였다 (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5). 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커로는 pKD3의 클로람페니콜(chloramphenicol) 유전자를 사용하였다.

양쪽에 상기의 entC 유전자의 일부를 포함하고, 중간에 클로람페니콜 내성 유전자를 갖는 DNA 단편을 얻기 위해, pKD3 플라스미드를 주형으로 PCR HL 프리믹스 키트 (PCR HL premix kit, BIONEER사 제품)를 사용하여 중합효소 연쇄반응법(polymerase chain reaction, 이하 PCR법이라 칭함) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories] 을 수행하였다. 이 때 사용한 프라이머는 상기 entC 유전자의 일부분과 pKD3 유전자의 클 로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 표 1의 프라이머 1과 프라이머 2이며, 조건은 변성 (denaturation) 94℃ 30초, 어닐링 (annealing) 55℃ 30초, 신장 (polymerization) 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 젤 (agarose gel) 에서 전기 영동 후 원하는 크기의 밴드 (약 1100 염기쌍) 를 용리하여 얻었다.

프라이머 1	5'- cctgaatcctggcagtgtgtaggatggagctgcttc-3'(서열번호 1)
프라이머 2	5'- gttcgcggtcgaacggcatatgaatatcctccttag -3'(서열번호 2)

또한, 대장균 entC 유전자의 5' DNA 단편을 얻기 위해, 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 PCR HL 프리믹스 키트를 사용하여 PCR법을 수행하였다. 이 때 사용한 프라이머는 표 2의 프라이머 3과 프라이머 4이며, 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 30초를 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동 후 원하는 크기의 밴드 (약 270 염기쌍) 를 용리하여 얻었다.

프라이머 3	5'- atgaattcgtcactggctgagg -3'(서열번호 3)
프라이머 4	5'- gggatccactgccaggattcagg -3'(서열번호 4)

또한, 대장균 entC 유전자의 3' DNA 단편을 얻기 위해, 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 PCR HL 프리믹스 키트를 사용하여 PCR법을 수행하였다. 이 때 사용한 프라이머는 표 3의 프라이머 5과 프라이머 6이며, 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 30초를 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동 후 원하는 크기의 밴드 (약 200 염기쌍) 를 용리하여 얻었다.

프라이머 5	5'- actggatccgttcgaccgcgaac -3'(서열번호 5)
프라이머 6	5'- aaagcttcaacatggtag -3'(서열번호 6)

여기에서, 프라이머 1과 프라이머4의 20 쌍의 염기서열이 상보적 (complementary)이며, 프라이머 2와 프라이머 5의 20 쌍의 염기서열이 상보적이기 때문에, 프라이머 1, 2를 이용하여 얻어진 단편, 프라이머 3, 4로 얻어진 단편, 프라이머 5,6으로 얻어진 단편들은 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 얻어진 각각의 PCR 단편들을 프라이머 없이 PCR HL 프리믹스 키트를 사용하여 PCR법으로 5회 증폭한 후, 프라이머 3과 프라이머 6를 첨가한 후 다시 25회 PCR법으로 증폭하였다. 이 때 사용한 PCR 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동 후 원하는 크기의 밴드 (약 1600 염기쌍) 를 용리하여 얻었다.

Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 L-트립토판 생산 대장균 CJ285 (대한민국 특허 공고 10-2005-0059685)를 컴피턴트 상태로 제조 후, PCR법으로 얻어진 1600 염기쌍 크기의 유전자 단편으로 형질 전환시켰다. 클로람페니콜 (15mg/L) 이 든 고체 배지 에 도말하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 얻어진 콜로니는 다시 PCR법을 통한 결과물 (1600 염기쌍) 로 entC가 결손 되었다는 것을 확인하였다. 이 때 사용한 프라이머는 프라이머 3과 프라이머 6이며, 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 2분을 30회 반복 수행하였다. 이후 얻어진 재조합 균주를 대장균 CA04-0014로 명명하였으며, 그를 2006년 12월 8일자로 일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호에 수탁번호 KCCM 10813P로 기탁하였다.

실시예 2 : EntC 가 불활성화된 재조합 미생물의 L-트립토판 생산능 비교

본 실시 예에서는 실시예 1에서 제작된 재조합 균주 CA04-0014(KCCM 10813P)의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/l, 박토 효모엑기스 5g/l, 염화나트륨 10g/l) 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 성장한 균주를 표 4에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200rpm에서 48시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 트립토판 농도와 CJ285에서 얻어진 트립토판 농도를 비교하였다. 얻어진 L-트립토판 농도는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

조성	농도(g/L)
글루코오스 (glucose)	60
효모 추출물 (Yeast extract)	2.5
암모늄 설페이트 ((NH₄)₂SO₄)	10
마그네슘 설페이트 (MgSO₄ _·H₂0)	1
구연산 나트륨 (Sodium citrate)	5
소디움 클로라이드 (NaCl)	1
타이로신 (L-tyrosine)	0.1
페닐알라닌 (L-phenylalanine)	0.15
칼슘 카르보네이트 (CaCO₃)	40
포타슘 디히드로겐포스페이트 (K₂HPO₄)	1

그 결과, 수득된 L-트립토판의 농도는 하기의 표 5와 같이 형질전환체 CA04-0014(KCCM 10813P)의 L-트립토판 농도가 대장균 CJ285에서보다 10.1% 증가되었음을 확인하였다.

균주	L-트립토판(g/L)
CJ285	7.9
CJ	8.7

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명에 따라 L-트립토판 생산 미생물의 entC 유전자를 불활성화시킴으로써 L-트립토판 생산능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 구체적으로는 L-트립토판 생산능을 가진 대장균 CJ285에서 entC 유전자가 불활성화된 재조합 대장균 CA04-0014(KCCM 10813P)을 제조하고, 이의 배양을 통하여 L-트립토판을 고농도로 생산하여 그 생산성을 증가시킬 수 있다.

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서열번호 7의 염기서열을 가지는 entC 유전자가 불활성화된 대장균 CA04-0014(KCCM 10813P).
제4항의 대장균을 사용하는 것을 특징으로 하는 L-트립토판 제조방법.