JP2007167064A - Ｌ−リシン生産能の向上したコリネバクテリウム属微生物及びそれを利用したｌ−リシンの生産方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｌ−リシン生産能の向上したコリネバクテリウム属微生物及びそれを利用してＬ−リシンを生産する方法の提供。
【解決手段】特定の塩基配列を有する内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子内の突然変異によって不活性化されたことを特徴とするコリネバクテリウム属の微生物。該突然変異は一つ以上の塩基対の挿入、一つ以上の塩基対の結実を有する結実突然変異、及び前記遺伝子内にナンセンスコドンを導入させる塩基対の遷移または切り換え突然変異からなる群から選択される。
【選択図】図１

Description

本発明は、Ｌ−リシン生産能の向上したコリネバクテリウム属微生物及びそれを利用したＬ−リシンの生産方法に関する。

コリネバクテリウム属菌株、特に、コリネバクテリウム・グルタミカムは、Ｌ−アミノ酸の生産に多く利用されているグラム陽性の微生物である。Ｌ−アミノ酸、特に、Ｌ−リシンは、動物飼料、人間の医薬品及び薬剤産業に使用されており、コリネバクテリウム菌株の発酵により生成される。このように、コリネバクテリウム菌株を利用したＬ−アミノ酸の製造は重要であるため、その製造方法を改善するために多様な試みが行われている。

このような試みの中で、組み換えＤＮＡ技術を利用して特定の遺伝子を破壊または減衰発現させることによって、Ｌ−アミノ酸の生産コリネバクテリウム菌株を改良しようとする研究があった。例えば、特許文献１には、ａ）ホスホエノールピルビン酸 (ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ: ＰＥＰ）カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）をコードするＤＮＡにおいて、一つ以上の塩基対の挿入による挿入突然変異、一つ以上の塩基対の欠失を有する欠失突然変異、及びナンセンス突然変異の挿入を有する遷移または切り換え突然変異からなる群より選択される突然変異方法の何れか一つの方法によって、減衰されているか、減衰されていないコリネバクテリウムに比べて前記酵素の活性の低下したコリネバクテリウムを成長させる工程と、ｂ）培地または前記バクテリアの細胞中に所望のＬ−アミノ酸産物を濃縮する工程と、ｃ）前記Ｌ−アミノ酸を分離する工程とを含む、コリネバクテリウムのＬ−リシンを発酵によって製造する方法が開示されている。

また、それぞれのＬ−アミノ酸の生合成に関連した遺伝子を増幅させて、Ｌ−アミノ酸の生成に及ぼす効果を研究し、Ｌ−アミノ酸の生産コリネバクテリウム菌株を改良しようとする多様な研究が行われてきた（非特許文献１）。また、他のバクテリア由来の外来遺伝子を導入する場合もある。例えば、特許文献２には、微生物のクエン酸シンターゼの合成に関与する遺伝情報を有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組み換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を培養し、培養物中にＬ−グルタミン酸及びＬ−プロリン酸を製造する方法が開示されている。

しかし、依然としてＬ−リシンの生産能の向上した菌株が、当技術分野において必要とされている。

米国特許第６，８７２，５５３号明細書 特開平第７−１２１２２８号公報 Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ６，２６１〜２７２（１９９４）

本発明の目的は、Ｌ−リシンの生産能の向上したコリネバクテリウム属微生物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記微生物を利用してＬ−リシンを生産する方法を提供することである。

本発明は、内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子が不活性化されており、Ｌ−リシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明において、前記内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子は、コリネバクテリウム属微生物に内在的に存在する遺伝子であって、転写調節因子（ＥＣ：２.７.１.６３）として知られている。前記遺伝子は、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ １３０３２のゲノムの完全な配列分析からその活性が予測されたものである。望ましくは、前記遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するものである。

本発明において、内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子の不活性化された前記コリネバクテリウム属微生物には、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ １３０３２、コリネバクテリウムサーモアミノゲネスＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ １０８８１、及びコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ １１００１があるが、これらに限定されるものではない。

本発明において、前記不活性化は、周知の任意の不活性化方法によって行うことができる。本発明において、不活性化とは、前記ＮＣｇｌ１８３５遺伝子の発現が野生菌株に比べて低レベルに低下するか、または全く発現されない遺伝子、並びに産物を発現しても、その活性がないか、または低下している遺伝子が生成されることを意味する。

本発明の一具体例は、本発明の微生物において、前記不活性化は、前記ＮＣｇｌ１８３５遺伝子内に一つ以上の塩基対の挿入による挿入突然変異、前記遺伝子内の一つ以上の塩基対の欠失を有する欠失突然変異、及び前記遺伝子内のナンセンスコドンを導入させる塩基対の遷移または切り換え突然変異からなる群から選択される一つ以上の突然変異によって不活性化されたものであってもよい。

本発明の一具体例は、本発明の微生物において、前記不活性化は、前記ＮＣｇｌ１８３５遺伝子の一部分及び抗生剤マーカーを含むベクターでコリネバクテリウム属微生物を形質転換し、前記抗生剤の存在下で培養して選択されるものであってもよい。望ましくは、前記ベクターは、配列番号２のＮＣｇｌ１８３５遺伝子の断片を含むｐＣＲ−１８３５ベクターである。前記遺伝子の一部配列を含むベクターで前記微生物を形質転換し、選択マーカー下で培養する場合、前記遺伝子の一部配列と前記微生物内の内在的遺伝子と相同組み換えを引き起こす。前記相同組み換えによって前記微生物内の前記内在的遺伝子は組み換えられ、組み換えられた遺伝子のうち、前記マーカーを含む組み換え体のみが選択マーカーによって選択される。その結果、内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子は、不活性化されたコリネバクテリウム属微生物を得ることができる。しかし、本願の菌株を得る方法は、このような相同組み換え方法に限定されるものではなく、周知の任意の方法が使用されうる。

本発明の一具体例で、本発明の微生物は、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１（受託番号ＫＣＣＭ−１０７０８Ｐ）である。

本発明は、また、本発明の微生物を培養して、培養物または細胞中にＬ−リシンを生産する工程と、培養物からＬ−リシンを回収する工程とを含むＬ−リシンの生産方法を提供する。

本発明の方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養は、周知の任意の培養条件及び培養方法が使用できる。コリネバクテリウム属菌株培養のために使用できる培地として、例えば、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に開示された培地が使用できる。培地に使用可能な糖源としては、葡萄糖、サッカロース、乳糖、果糖、麦芽糖、澱粉、セルロースのような糖、炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油油、ココナッツ油のようなオイル、脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、及び酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別にあるいは混合物として使用されうる。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、発芽小麦及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び窒酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別または混合物として使用されうる。使用されうる燐源としては、燐酸二水素カリウムまたは燐酸水素二カリウムまたは相応するナトリウムを含有する塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有せねばならない。最後に、前記物質に加えてアミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用されうる。また、培養培地に適切な前駆体が使用されうる。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方式により回分式または連続式で添加されうる。

水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物または燐酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用して培養物のｐＨを調節できる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制できる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有の気体（例、空気）を注入する。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、望ましくは、２５℃〜４０℃である。培養時間は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が得られるまで続けられるが、望ましくは、１０時間〜１６０時間である。

本発明の方法において、培養は、配置工程、注入配置及び反復注入配置工程のような連続式または回分式で行われうる。このような培養方法は、当業者に周知であり、任意の方法が使用されうる。

Ｌ−アミノ酸は、陰イオン交換クロマトグラフィ及び後続でニンヒドリン誘導体化によって分離かつ分析されうる。

本発明の菌株及び方法を開発するために、本発明者らは、まず、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ １３０３２をＬ−リシンの存在下で培養し、それから発現される蛋白質のレベルを２次元電気泳動によって分析し、得られた結果を、Ｌ−リシンの不在下で培養された対照群の実験で得られた蛋白質のレベルと比較した。その結果、Ｌ−リシンの存在下で過発現される蛋白質、すなわちＬ−リシンによって発現が誘導されると推定される蛋白質を確認した。得られた蛋白質に関する情報に基づき、米国国立保健院ジーン・バンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から前記蛋白質についての遺伝子情報を確認し、これらがＮＣｇｌ１８３５及びＮＣｇｌ２０５３などであることを確認した。

また、前記遺伝子が実際にＬ−リシンの存在下で発現が誘導されるかを確認した。まず、前記遺伝子のプロモータ部分と予想される核酸領域を、ＰＣＲを通じて増幅し、増幅されたプロモータ核酸を、プロモータの除去されたｌａｃＺ遺伝子と融合させて、前記遺伝子のプロモータ−ｌａｃＺ遺伝子の融合遺伝子を製作し、得られた融合遺伝子をベクターに挿入し、前記ベクターで微生物を形質転換し、Ｌ−リシンの存在下で培養して、ｌａｃＺ蛋白質が発現されるかをβガラクトシダーゼ活性を測定して確認した。その結果、前記遺伝子は、実際にＬ−リシンにより発現が誘導されるということが確認された。

しかし、これらの遺伝子は、Ｌ−リシン生産菌株がＬ−リシンの生合成に何なる影響を及ぼすかについては全く知られていない。本発明者らは、前記遺伝子を確認したことに加えて、追加的にコリネバクテリウム属微生物中の内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子を不活性化させてＬ−リシンの生産量を測定し、実際にＬ−リシンの生産性が向上することを確認した。

本発明の微生物によれば、内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子が不活性化されており、Ｌ−リシン生産能力が向上した。

本発明の方法によれば、Ｌ−リシンを高生産性で生産できる。

以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

以下の実施例では、前記のようなＬ−リシンの存在下で発現が誘導されると知られたＮＣｇｌ１８３５遺伝子が、Ｌ−リシンの生産に及ぼす影響を確認するために、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１の内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子を不活性化させ、それを培養してＬ−リシンの生産量を測定した。

実施例１：コリネバクテリウム属微生物の内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子を不活性化させるためのベクターの製作
本実施例では、前記ＮＣｇｌ１８３５遺伝子の一部配列及び抗生剤マーカーを含むベクターを製作するために、配列番号３及び配列番号４のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ １３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約５００ｂｐ（配列番号２）（配列番号１の１２９ないし６２８番のヌクレオチド）のＮＣｇｌ１８３５遺伝子の断片を増幅した。ＰＣＲは、変性９６℃で３０秒、アニーリング５２℃で３０秒、重合７２℃で３０秒を３０回繰り返した。増幅されたＮＣｇｌ１８３５遺伝子の断片をＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を利用して、大腸菌プラスミドｐＣＲ２.１にクローニングしてｐＣＲ−１８３５プラスミドを得た。図１は、約５００ｂｐのＮＣｇｌ１８３５遺伝子の断片がクローニングされたｐＣＲ−１８３５ベクターを示す図面である。

実施例２：コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１の内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子が不活性されたＬ−リシンの生産菌株の製作
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５２：５４１−５４５に開示された形質転換法を利用して、実施例１で製作したｐＣＲ−１８３５プラスミドを、Ｌ−リシンの生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１を電気パルス法で形質転換した。形質転換株におけるＮＣｇｌ１８３５遺伝子の破壊を確認するために、培養２日目に得られた形質転換株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、形質転換株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、ｐＣＲ−１８３５プラスミドを含む約５０４０ｂｐ（配列番号１の１００ないし６７１番のヌクレオチド）のＮＣｇｌ１８３５遺伝子の断片を増幅した。その結果、相同組み換えによる交差によってｐＣＲ−１８３５プラスミドが、染色体ＤＮＡ上の内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子の中間部分に挿入されることによって、当遺伝子が破壊されたことが確認された菌株を獲得し、これをコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１と命名した。

コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１は、ブダペスト条約による国際寄託機関である韓国微生物保存センターに２００５年１１月１６日付で寄託された（受託番号ＫＣＣＭ−１０７０８Ｐ）。

実施例３：コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１を利用したＬ−リシンの生産
実施例２で得られたコリネバクテリアグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１菌株を培養してＬ−リシンを生産した。

まず、下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウムグルタミカム母菌株ＫＦＣＣ１０８８１とＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１とを接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで攪拌しつつ培養した。得られた種培養液１ｍＬを、下記の生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに接種し、３０℃で１２０時間２００ｒｐｍで攪拌しつつ培養した。培養終了後にＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ｗａｔｅｒｓ ２４５７）によりＬ−リシンの生産量を測定した。その結果、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１及びＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１菌株は、それぞれ培養物中のＬ−リシンの塩酸塩として表して、それぞれ４５ｇ／ｌ及び５０ｇ／ｌのＬ−リシンを生産した。

種培地（ｐＨ７.０）：
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１.５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ ０.５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）

生産培地（ｐＨ７.０）：
原糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ４０ｇ、台頭蛋白質２.５ｇ、コーンスティープ固体５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ、ＭｇＳＯ_４７ Ｈ_２Ｏ ０.５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）

実施例４：コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１菌株の培養物からＬ−リシンの回収
糖蜜及び原糖含有の培地中でコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１菌株を培養して得たＬ−リシン発酵液１Ｌに、塩酸を使用してｐＨを２.０に調節してＣａイオンをＣａＳＯ_４、ＣａＣｌ_２の形態に変形させた。次いで、前記培養物をアンモニウムイオンの形態に再生された陽イオン交換樹脂（Ｄｉａｉｏｎ ＳＫ−Ｌ１０）に上流方向に流して吸着させた。次いで、脱塩水で洗浄して樹脂層内に残存する菌体などを除去した後、２Ｎの水酸化アンモニウムで溶離して高濃度のＬ−リシンを回収した。回収された液体を濃縮した後、塩酸でｐＨ５.０に調節しつつ２０℃で冷却結晶化した。結晶化が完了したスラリーを遠心分離して、１次湿製品を得て、母液は、再度回分式で濃縮しつつ結晶化した後に２次湿製品を得た。１次湿製品及び２次湿製品を何れも合わせて乾燥した結果、含有量９８.５％のＬ−リシン乾制品４７.５ｇが得られた。

本発明は、コリネバクテリウム属微生物に関連した技術分野に好適に適用され得る。

約５００ｂｐのＮＣｇｌ１８３５遺伝子の断片がクローニングされたｐＣＲ−１８３５ベクターを示す図面である。

Claims (6)

1. 内在的ＮＣｇｌ１８３５遺伝子が不活性化されている、Ｌ−リシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
2. 前記不活性化は、前記ＮＣｇｌ１８３５遺伝子内に一つ以上の塩基対の挿入による挿入突然変異、前記遺伝子内の一つ以上の塩基対の結実を有する結実突然変異、及び前記遺伝子内にナンセンスコドンを導入させる塩基対の遷移または切り換え突然変異からなる群から選択される一つ以上の突然変異によって不活性化されたことを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
3. 前記不活性化は、前記ＮＣｇｌ１８３５遺伝子の一部分及び抗生剤マーカーを含むベクターでコリネバクテリウム属微生物を形質転換し、前記抗生剤の存在下で培養して選択されることを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
4. 前記ＮＣｇｌ１８３５遺伝子が、配列番号１のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
5. 前記微生物が、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪＰ５１０１（受託番号ＫＣＣＭ−１０７０８Ｐ）であることを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物を培養し、培養物または細胞中でＬ−リシンを生産する工程、及び
   培養物からＬ−リシンを回収する工程、
   を含むことを特徴とする、Ｌ−リシンを生産する方法。

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