JP2015505671A - Ｌ−アミノ酸及びリボフラビンを同時に生産する微生物及びそれを用いたｌ−アミノ酸及びリボフラビンの生産方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、高濃度のL-アミノ酸及びリボフラビンを同時に生産する方法及びL-アミノ酸及びリボフラビンを同時に生産する微生物に関し、具体的には、L-リシンまたはL-スレオニンの生産は能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、リボフラビン生合成遺伝子群を含むribオペロンにより発現する酵素群の活性を強化させることにより、改変されたL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを同時に生産する変異型微生物、前記微生物を用いたL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンの同時生産方法、前記変異型微生物培養液から製造したL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを含む製剤または顆粒製剤、飼料及び飼料添加剤を提供することに関する。
Description
本発明は、高濃度のL-アミノ酸及びリボフラビンを同時に生産する方法並びにL-アミノ酸及びリボフラビンを同時に生産する微生物に関する。
飼料に最も多く用いられる原料飼料であるトウモロコシ、キビ、麦、小麦といった穀類飼料は、一般に、アミノ酸要求量の30〜60％を供給する。従って、残りの要求量を満たし、必須アミノ酸間のバランスを維持するためには、アミノ酸の追加供給が必要である。また、あらゆる飼料には一定レベルのビタミンが含まれているが、如何なるビタミンであっても十分な量を供給しなければ欠乏症状は起こりうる。従って、ビタミンもアミノ酸と同様に、追加供給をしてこそ適正な含量を維持することができる。アミノ酸は、飼料成分のうち、供給源の価格が最も高い原料であり、前記アミノ酸の効率のよい供給が生産性全体を左右する要素の1つであると言える。特に、前記アミノ酸のうち、L-リシン及びL-スレオニンは、家畜の成長に対して第一制限必須アミノ酸となる場合が多い。前記L-リシン及びL-スレオニンは、微生物を用いた発酵法により生産されるが、前記発酵法で生産されたL-リシン及びL-スレオニンは、精製及び濃縮後に飼料に添加される。L-リシンの発酵に用いられる微生物は、コリネ型微生物(Corynebacterium sp.)またはエシェリキア属菌株(Escherichia. coli)が代表的であるが、前記微生物を遺伝子操作することにより、L-リシンを生産した例が多く報告されている(特許文献１、特許文献２、特許文献３)。
現在、遺伝工学的な方法で微生物を改良することによって、L-リシンまたはL-スレオニンの生産量を増やすための継続的な努力がなされているが、産業の発達に伴いさらに多くのL-リシンまたはL-スレオニンの供給が求められているため、より効果的かつ経済的にL-リシンまたはL-スレオニンが生産できる方法を開発するための努力が続けられている。
ビタミンは、非常に少ない量が要求されるが、家畜の正常な代謝機能、成長、繁殖機能及び健康維持のために供給されなければならない必須の有機化合物である。前記ビタミンのうち、リボフラビン(B2)は、多種の微生物やあらゆる植物において生合成される水溶性ビタミンであるが、ヒトを含む脊椎動物の体内では生合成されないという特性があり、外部からの供給が必要である。前記リボフラビンが欠乏すると、豚の場合、無発情と母豚の繁殖障害を誘発し(非特許文献１、非特許文献２)、ニワトリの場合、神経において、特に坐骨及び上腕神経に問題が生じ、胚子(embryo)の発育に悪影響を及ぼし、胚子が死亡することもある(非特許文献３)。したがって、前記リボフラビンは、家畜の成長のための飼料添加剤として用いられてきた。特に、濃縮状態のリボフラビンはそれ自体が飼料として用いられてきた。
現在、リボフラビンの生産量は、全世界的に年間6,000トンの規模であり、そのうち、75％程度が飼料添加剤として用いられ、残りは食品及び医薬用として用いられている。リボフラビンを生産する方法としては、化学的合成法と微生物を用いた発酵法が併用されている。化学的合成法は、おおむねD-リボースのような前駆物質を用いて多段階工程を経て高純度のリボフラビンを生産する方法である。前記化学的合成法は、その出発物質が高価であるため、生産コストが高いという欠点があり、微生物を用いた発酵法の開発がなされてきた。微生物を用いた発酵法は、自然からリボフラビンを生産する微生物を分離したり、リボフラビンが過生産されるように遺伝工学的方法または化学的・物理的方法で 微生物の変異を誘導し、適切な条件で培養した後、発酵液からリボフラビンを分離する方法である。最近では、価格(原価)競争力があり環境にやさしい発酵法が主として研究されており、前記発酵法で生産されたリボフラビンは精製及び濃縮後に飼料に添加される。
代表的なものとしては、酵母であるカンジダ・ファマタ(Candida famata)を用いたリボフラビンの生産方法が開示されており(特許文献４)、リボフラビンの産業的生産においては、子嚢菌類であるにエレモテシウム・アッシュビィ(Eremothecium ashbyii)とアッシュビヤ・ゴッシピィ(Ashbya gossypii;特許文献５)が最も多く用いられる菌株である。細菌としては、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)が報告されているが、前記細菌を遺伝子操作することにより、リボフラビンを生産した例が多数報告されており(特許文献６、特許文献７、特許文献８)、本発明者らも前記細菌を用いてリボフラビンを生産した(特許文献９)。また、リボフラビン生合成に関連する酵素遺伝子が過発現されるように操作して4.5 g/Lのリボフラビンを生産した例も報告されている(非特許文献４)。
動物飼料における各成分の要求量は、L-リシンは約1〜5 g/kg、L-スレオニンは約0.6〜3.3 g/kgであり、リボフラビンは約2〜4 mg/kgで、L-リシンの約0.1％のレベルで供給される(非特許文献５) 。しかし、前記L-リシン及びリボフラビンは、それぞれの発酵法で別途に生産され、飼料に添加される前に精製及び濃縮過程を経て、飼料配合工場にそれぞれ移送されるため、飼料の原価が高く策定されうる。仮に、L-リシン及びリボフラビンを同時に生産する微生物のリボフラビン濃度がL-リシン濃度の約0.1％のレベルに到達するならば、前記微生物の培養液を添加することで、飼料添加剤の基準要求量を満たすことができるであろう。しかし、未だこのような試みに関する報告はなされていない。
コリネバクテリウム属の微生物の場合、リボフラビンはペントースリン酸化経路(pentose-phosphate path way, PPP)の産物の1つであるリブロース-5-ホスフェート(ribulose-5-phosphate, Ru5P)とプリン経路(purime metabolism)の産物の1つであるグアノシントリホスフェート(Guanosine triphosphate, GTP)からの2つの経路を通じて生合成されるが、GTPシクロヒドロラーゼII(GTP cyclohydrolase II, RibA)遺伝子、ピリミジンデアミナーゼレダクターゼ(pyrimidine deaminase-reductase, RibG)遺伝子、リボフラビンシンターゼサブユニットアルファ(Riboflavin synthase subunit alpha, RibC)遺伝子及びリボフラビンシンターゼサブユニットベータ(riboflavin synthase subunit beta, RibH)遺伝子からなる遺伝子群(以下「リボフラビン生合成遺伝子群」)がこれに関与する。前記リボフラビン生合成遺伝子群は、ペントースリン酸化経路に関与するリブロース-5-ホスフェート-3-エピメラーゼ(ribulose-5-phosphate-3-epimerase, Rpe, NCgl1536)とともにオペロン(ribオペロン)をなしているが、前記Rpe及び前記RibAは、いずれもRu5Pを基質として用いる競合関係にある(図1)。即ち、RpeはRu5Pからキシロース-5-ホスフェート(D-Xylose-5-phosphate)を生合成することにより、ペントースリン酸化過程で生成された代謝産物を再度該当過程に流入させる中間反応を媒介し、RibAはリボフラビン生合成の中間段階の物質である3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン-4-ホスフェートを生合成する(非特許文献6)。
コリネバクテリウムにおいてペントースリン酸化経路は、リシン生合成に伴われる主な還元力(NADPH)の供給源であり、これを通じてなされるNADPHの再生とL-リシン生合成間の直接的な連関関係は、従来の文献により多数報告されている(非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９)。
前記ペントースリン酸化経路は、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)、6-ホスホグルコノラクトナーゼ(6-phosphogluconolactonase)、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(6-phosphogluconate dehydrogenase, 6PGD)、Rpe、リボース-5-ホスフェートイソメラーゼ(ribose-5-phosphate isomerase, RpiA)、トランスケトラーゼ(transketolase)及びトランスアルドラーゼ(transaldolase)が段階的な反応を触媒することによりなされ、この過程を通じて生成された最終の代謝産物は再度該当過程に流入する。
このようなペントースリン酸化経路を強化させるための研究結果として、特許文献１０と特許文献１１には、前記酵素中、NADPHを直接的に生産する酵素の陰性フィードバック抑制耐性を有する突然変異が開示されており、これらとともにトランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼを過発現させるコリネバクテリウムリシン生産菌株に関する発明が開示されている(特許文献１２、特許文献１３、 特許文献１４)。また、RpeまたはRpiAをそれぞれ過発現させたコリネバクテリウムでのL-リシン生産能の増加効果を開示した発明もある(特許文献１５、特許文献１６)。
これによりコリネバクテリウムにおいてL-リシン生産能が増加するほどペントースリン酸化経路に対する依存度が高くなることが分かるが、本発明の核心要素であるリボフラビン生合成経路はペントースリン酸化経路から派生するので、リボフラビン生合成のために当経路への炭素の流れを強化させる場合、ペントースリン酸化経路を経て該当過程に流入するべき炭素源の流出をもたらすようになり、結局、供給された単位炭素源当りのL-リシン生産収率が減少する。即ち、ペントースリン酸化経路上の十分な炭素の流れが必要なL-リシン生産菌株においてリボフラビン生合成経路はペントースリン酸化経路と競合関係にあると言え、さらに、当経路に流入する炭素の流れが増加する場合、L-リシン生産能の増加に否定的な影響を及ぼしうる。
したがって、L-リシン及びリボフラビンを同時に生産する微生物は、自然界に存在しうるが、L-リシン及びリボフラビンの生産収率は競合関係にあるため、L-リシンを大量に生産する産業用微生物において同時にリボフラビン生産量も産業化が可能なレベルまで増加させるための試みは、今のところ、報告されていない。
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このような背景の下に、本発明者らはL-リシン及びリボフラビンを同時に生産する微生物を開発するために鋭意努力した結果、L-リシン生産能を有するコリネバクテリウムを対象にペントースリン酸化経路上の炭素の流れを増加させるために、人工突然変異を通じた高濃度グルコン酸適応性を付与し、L-リシン生産量が母菌株と類似のレベルに維持されながら、同時にリボフラビン生産量が母菌株に比べて増加した突然変異菌株を開発した。本発明者らは、L-リシン生産コリネバクテリウムにおいてリボフラビン生合成遺伝子群のプロモーターーを強力な発現誘導活性を有する異種プロモーターに置き換えた場合にも、L-リシン及びリボフラビンを同時に高濃度で生産することができ、また、L-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウムにおいても同一の効果が奏されることを確認することにより本発明を完成した。
本発明の１つの目的は、L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された前記微生物を培養してL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを発酵法で同時に生産する工程を含む、L-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンの同時生産方法を提供することである。
本発明の他の目的は、高濃度L-リシン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)に無作為の突然変異を誘導することにより、前記L-リシン生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された寄託番号KCCM11223Pの変異型コリネバクテリウム・グルタミクム微生物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、L-アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、リボフラビン生合成遺伝子群を含むribオペロンにより発現する酵素群の活性を強化させることにより、前記L-アミノ酸生産は高濃度に維持され、同時にリボフラビンの生産量が増加するように改変された、L-アミノ酸及びリボフラビンを同時に生産する変異型コリネバクテリウム属の微生物を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的は、前記微生物を培養し、顆粒化する工程を行って製造したL-アミノ酸及びリボフラビンを含む製剤または顆粒製剤を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的は、前記微生物を培養する工程を行って製造したL-アミノ酸及びリボフラビン含有製剤または前記顆粒製剤を含む飼料添加剤を提供することである。
本発明のL-アミノ酸及びリボフラビンの同時生産方法によれば、現在まで必須の動物飼料として用いられ、産業的に大量生産されているL-リシン、L-スレオニンなどのL-アミノ酸及びリボフラビンを高濃度に同時に生産できる微生物を開発して産業的な面で飼料の生産利便性及び製造原価の節減などの効果を期待することができ、効率のよいL-アミノ酸及びビタミン飼料添加剤の生産菌株として用いられるであろう。
以下、本発明の用語を説明する。
本発明において、用語「ribオペロン」とは、リボフラビン生合成遺伝子群であるピリミジンデアミナーゼレダクターゼ(RibG, NCgl1535)をコードするribG遺伝子、リボフラビンシンターゼサブユニットアルファ(Riboflavin synthase subunit alpha, RibC, NCgl1534)をコードするribC遺伝子、TPシクロヒドロラーゼII(GTP cyclohydrolase II, RibA)をコードするribA遺伝子、及びリボフラビンシンターゼサブユニットベータ(riboflavin synthase subunit beta, RibH, NCgl1532)をコードするribH遺伝子からなる遺伝子群(以下「リボフラビン生合成遺伝子群」)及びペントースリン酸化経路に関与するリブロース-5-ホスフェート-3-エピメラーゼ(ribulose-5-phosphate-3-epimerase, Rpe, NCgl1536)をコードするrpe遺伝子を含むオペロンを意味する(図2)。前記オペロンの各遺伝子に関する情報は、公開されたデータベース(NCBIのGenBank等)から得ることができる。
本発明における用語、「L-アミノ酸」は、L-リシン、L-スレオニン、L-バリン、L-イソロイシン、L-トリプトファン及びL-メチオニンからなる群から選択することができ、好ましくはL-リシンまたはL-スレオニンである。
前記目的を達成するための一実施態様として、本発明は、L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された前記微生物を培養してL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを発酵法により同時に生産する工程を含む、L-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンの同時生産方法を提供する。
本発明の具体的な実施例では、前記変形された微生物はL-リシンまたはL-スレオニンの生産量は母菌株と同様に維持しながら、リボフラビンの生産量が70〜80倍程度増加し、特に、リシンとリボフラビンの生産量の比率が約1:0.005またはL-スレオニンとリボフラビンの比率が約1:0.03をなすことを確認した(表1〜6)。したがって、本発明の微生物を用いて同時に生産されたL-アミノ酸とリボフラビンは飼料に添加するのに適当であることが確認された。
前記改変された微生物は、L-アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、リボフラビン生合成遺伝子群を含むribオペロンにより発現する酵素群の活性を強化することにより、前記L-アミノ酸生産は高濃度に維持され、同時にリボフラビンの生産量が増加するように改変された、L-アミノ酸及びリボフラビンを同時に生産する変異型コリネバクテリウム属の微生物であり、好ましくは、L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、リボフラビン生合成遺伝子群を含むribオペロンにより発現する酵素群の活性を強化することにより、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持され、同時にリボフラビンの生産量が増加するように改変された、L-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを同時に生産する変異型コリネバクテリウム属の微生物であってもよい。
本発明において、前記コリネバクテリウム属の微生物は、L-アミノ酸生産能を有する全てのコリネバクテリウム属の菌株を含むことができ、その例として、コリネバクテリウム・グルタミクム (ATCC13032)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)(FERM BP-1539)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)(ATCC14067)、またはブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium fermentum)(ATCC13869)などが用いられるが、これに限定されない。より好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムを用いることができ、前記コリネバクテリウム・グルタミクムの具体的な例としては、KFCC10881(特許文献１７)、KFCC11074(特許文献１８、特許文献特許１９)及びKCCM11222Pを用いることができるが、これら例に限定されるわけではない。本発明の具体的な実施例では、KFCC10881を母菌株として、L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持しながら、同時にリボフラビンの生産量が増加するように改変された変異型微生物を製造した。特に、L-スレオニンの生産は高濃度に維持しながら、同時にリボフラビンの生産量が増加するように改変された変異型微生物はKCCM11222Pを母菌株として製造した。
前記L-リシンの生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物は、L-リシンの生産効率を向上させた微生物であってもよい。L-リシンの生産効率を改善させるための方法として、L-リシン生合成経路上の遺伝子を増幅したり、遺伝子のプロモーターを改変して酵素の活性を増大させる方法を挙げることができる。L-リシン生合成に関与する酵素としては、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリネートレダクターゼ、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼなどを挙げることができる。コリネ型細菌由来のプロモーターと関連した先行特許としては、ジヒドロジピコリネートレダクターゼのプロモーターが改良された特許(特許文献２０)があり、アスパルトキナーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼのプロモーターが改良された特許(特許文献２１)が開示されている。また、特許文献２２には前記言及された生合成関与遺伝子をそれぞれ1コピー以上さらに導入し、前記遺伝子のプロモーターをそれぞれ外来の強力なプロモーターに置き換えて導入し、L-リシンの生産能を改善する方法が記載されている。
前記L-スレオニンの生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物は、L-スレオニンの生産効率を向上させた微生物であってもよい。L-スレオニン生産能力を改善するために、栄養要求性突然変異株、類似体耐性株または代謝調節突然変異株を得るだけでなく、L-スレオニン生合成酵素の活性が増強された組換え菌株の製作といった、当業者が通常用いる方法を適宜用いることができる。例えば、突然変異株または組換え菌株を改変し、L-スレオニン生合成酵素がフィードバック抑制を受けないか、または組換え菌株がL-スレオニン生合成酵素遺伝子の発現を増強させるように改変されてもよい。これら方法によるL-スレオニン生産細菌の改良において、栄養要求性、類似体耐性及び代謝調節突然変異といった性質が単独または組み合わせて付与されてもよい。L-スレオニン生合成酵素の活性が増強されれば、1つ以上のこれら酵素の活性が増強されうる。例えば、L-スレオニン生合成酵素をコードする遺伝子の例は、アスパルトキナーゼIII遺伝子(lysC)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)、thrオペロンに含まれるアスパルトキナーゼI遺伝子(thrA)、ホモセリンキナーゼ遺伝子(thrB)及びスレオニンシンターゼ遺伝子(thrC)を挙げることができ、当該酵素をコードする遺伝子に突然変異を導入したり遺伝子を増幅させて酵素の細胞内活性を増加させることにより増強することができる。これらは、遺伝子組換え技術を用いて成しうる。また、スレオニン分解に関連したL-スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を欠如させることによりL-スレオニン生産を増加させることができる。また、L-スレオニン分解システム酵素以外に、L-スレオニンの生産に有害な影響を与える該当経路、TCAサイクルまたは呼吸連鎖過程に関与する酵素、遺伝子発現を調節する酵素または副産物の生合成システムの酵素を減少させたり欠如させることにより、L-スレオニン生産を増加させることができる。L-スレオニンの生産効率を改善させるための方法としては、例えば、L-スレオニンの生合成経路上の酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。L-スレオニン生合成に関与する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びスレオニンシンターゼ、スレオニン排出酵素などを挙げることができる。L-スレオニン生産能を付与または増強する他の方法の例は、ホモセリンデヒドロゲナーゼをスレオニンに対するフィードバック調節を解除するように変異を導入する方法などが知られている(特許文献２３)。本発明の具体的な実施例では、KFCC10881をL-スレオニン類似物質であるAHV(2-アミノ-3-ヒドロキシ-バレラート)に耐寒耐性を付与した突然変異を具現して寄託番号KCCM11222Pである変異型微生物KFCC10881-THRを用いた。
好ましくは、本発明の変異型コリネバクテリウム属の微生物は、高濃度のL-アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、ribオペロンにより発現する酵素の活性を強化することにより、前記L-アミノ酸の生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変されるとともに、L-アミノ酸及びリボフラビンを高濃度で生産する変異型コリネバクテリウム属の微生物であってもよく、またはribオペロン中、リボフラビン生合成遺伝子群により発現する酵素の活性を強化させた微生物であってもよい。
前記活性を強化する方法は、その例として、前記「オペロンまたは酵素群」(以下、酵素群と総称)をコードする遺伝子群の細胞内コピー数の増加、前記酵素群をコードする染色体上の遺伝子群の調節配列に変異を導入する方法、前記酵素群をコードする染色体上の遺伝子群の調節配列を、強力な活性を有する配列に置き換える方法、前記酵素群の活性が増加するように突然変異された遺伝子で染色体上の前記酵素をコードする遺伝子を代替する方法及び前記酵素群の活性が強化されるように前記酵素群をコードする染色体上の遺伝子群に変異を導入する方法からなる群から選択されるいずれか1つ以上の方法であってもよいが、これに限定されるものではなく、当業界に公知となった様々な方法によって行うことができる。好ましくは、ribオペロンにより発現する酵素群をコードする染色体上の遺伝子の調節配列を、強力な活性を有するプロモーターに置き換え、リボフラビン生合成遺伝子群の最も前方に位置したRibG(ピリミジンデアミナーゼレダクターゼ)をコードする遺伝子の染色体上の上流に強力なプロモーターを挿入する方法、もしくはribオペロンにより発現する酵素群またはリボフラビン生合成遺伝子群により発現する酵素群をコードする遺伝子群の細胞内コピー数を増加であってもよい。
前記細胞内コピー数の増加は、細胞の染色体内に前記酵素をコードする遺伝子が作動可能に連結され、安定的に前記酵素が発現される場合、または前記酵素をコードする遺伝子を含むベクターが細胞内に作動可能に形質転換されて、 安定的に前記酵素が発現される場合を含む。前記ベクターは、適合する宿主細胞内で目的遺伝子を発現させることができるように、適合する調節配列に作動可能に連結された遺伝子の塩基配列を含有するDNA産物を意味する。当業者であれば、染色体DNA内部のribオペロンにより発現する酵素をコードする遺伝子コピー数の増加による効果を通じて、ribオペロンにより発現する酵素が染色体の外部でベクターを介してコピー数が増加したり、染色体の内外部でribオペロンにより発現する酵素をコードする遺伝子の発現調節部位の改変あるいは遺伝子自体の変異による発現量の増加時にも同様の効果をもたらすことが予測されうる。ベクターを用いる場合、塩基配列を導入した組換えベクターでL-アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物を形質転換することにより、ribオペロンにより発現する酵素の活性が強化された微生物を製造することができる。本発明で使用可能なベクターは、特に限定されず、公知となった発現ベクターを用いることができる。好ましくはpACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118ベクターなどを用いることができる。本発明の具体的な実施例ではpECCG117を用いた。
また、原核生物における前記調節配列には、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意の作動遺伝子(operator)、適合するmRNAリボソーム結合部位をコードするRBS(リボゾーム結合部位)、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。
前記酵素をコードする遺伝子の上流に位置した本来のプロモーターの代わりに、固有のプロモーターから発生した塩基置換変異を有する改良型プロモーターまたは異種プロモーターが連結されうるが、前記異種プロモーターの例としては、pcj7プロモーター、lysCP1プロモーター、EF-Tuプロモーター、groELプロモーター、aceAプロモーター、aceBプロモーターなどがあり、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるpcj7プロモーターまたはlysCP1プロモーターを用いることが好ましく、最も好ましくはlysCP1プロモーターを用いることができる。
本発明の「lysCP1プロモーター」は、アスパラギン酸キナーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター部位の塩基配列置換を通じて改良したプロモーターであり、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子の発現量増大を通じて糖酵素の活性を野生型に比べて約5倍程度に向上させる強力なプロモーターを意味する(特許文献２０)。前記lysCP1プロモーターは、lysCP1プロモーター配列及びlysC-asd遺伝子の一部分を含む配列番号17の1〜353番目のヌクレオチド配列(配列番号6)からなりうる。具体的には、本発明のベクターは、前記配列番号5の塩基置換変異が含まれた改良型プロモーターまたは前記配列番号6の強力な発現誘導活性を有する lysC遺伝子の改良型プロモーターlysCP1を宿主細胞の染色体内に導入できるように製作された。目的とした遺伝子を過発現させるための方法として固有のプロモーター配列の一部塩基を他の塩基で置換することにより発現量が高くなるようにするプロモーター改良法及び発現量が多い他の遺伝子のプロモーターで置換する方法などがある(特許文献２０)。
本発明における用語「形質転換」とは、遺伝子を宿主細胞であるコリネバクテリウム属の菌株内に導入して前記宿主細胞内で発現されうるようにする全般的な行為を意味する。この時、プロモーターと遺伝子は、ポリヌクレオチドとしてDNA及びRNAを含む。前記遺伝子は、宿主細胞内に導入されて発現されうるものであれば、如何なる形態でも導入されうる。例えば、前記遺伝子は、独自に前記遺伝子の発現に必要な全ての要素(element)を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞内に導入されうる。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、転写終結信号、RBS及び翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自体複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記遺伝子は、それ自体またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞の発現に必要な配列と作動可能に連結されるものであってもよい。
本発明のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入する如何なる方法も含まれ、宿主細胞に応じて当分野で公知となったように、適合した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法(electroporation)、リン酸カルシウム(CaPO4)沈殿、塩化カルシウム(CaCl2)沈殿、マイクロインジェクション法(microinjection)、ポリエチレングリコール(PEG)法、DEAE-デキストラン法、カチオンリポソーム法、及び酢酸リチウム-DMSO法などがある。
前記宿主細胞としては、DNAの導入効率が高く、導入されたDNAの発現効率が高い宿主を用いるのがよいが、好ましくは、前述したように、コリネバクテリウム属の微生物を用いることができ、好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクム、具体的にコリネバクテリウム・グルタミクム KFCC10881を用いることができる。L-スレオニン生産能を有する微生物は、L-スレオニンを生産できる微生物は制限なしに用いることができるが、好ましくは、KFCC10881-THRを用いることができ、これは寄託番号KCCM11222Pであってもよい。
具体的には、ribオペロンにより発現する酵素群をコードする染色体上の上流プロモーターを配列番号5のプロモーターまたはribG遺伝子の上流プロモーターを配列番号6のプロモーターに置き換えることであってもよい。本発明の具体的な実施例では、KFCC10881菌株を配列番号5のプロモーターに置き換えた結果、L-リシンの平均濃度には変化がないが、リボフラビンの平均濃度が約61倍増加することを確認し(表2)、ribG遺伝子の上流プロモーターを配列番号6のプロモーターに置き換えた結果、リボフラビンが73倍増加し(表3)、ribオペロンコピー数の増加によりリボフラビンが66倍増加することを確認した(表4)。また、L-スレオニン生産菌株であるKFCC10881-THRを配列番号5及び6のプロモーターに置き換えた結果、L-スレオニンの平均濃度には変化がないが、それぞれリボフラビンの濃度が56倍及び66倍増加したことを確認した(表6)。
また、具体的には、L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、ribオペロンの最も前方に位置したRpe(リブロース５−リン酸-３-エピメラーゼ)をコードする遺伝子の上流に強力なプロモーターを挿入したり、リボフラビン生合成遺伝子群の最も前方に位置したRibG(ピリミジンデアミナーゼレダクターゼ)をコードする遺伝子の上流に強力なプロモーターを挿入してribオペロンがコードする酵素群またはリボフラビン生合成酵素群の活性を強化させることにより(図2)、リボフラビンをL-リシンまたはL-スレオニンとともに高濃度で生産するように改変することができる。本発明の具体的な実施例では、寄託番号KCCM11223P菌株のribオペロンの最も上流に位置したrpeの-10番目〜-16番目の塩基配列の変異があることを確認した。これについて、前記寄託菌株のribオペロンのプロモーター予想区間(配列番号5)をクローニングした後、これをL-リシン生産能母菌株の染色体内に導入した結果、前記L-リシンの生産量は維持されながらリボフラビンの生産量がKCCM11223P菌株と類似のレベルに増加したことを確認した(表2)。これについて、前記ribオペロンの強化を通じてリボフラビン生産性が増加したものと予測し、前記ribオペロン内リボフラビン生合成遺伝子群の最も上流に位置したribGの上流に強力なプロモーターで導入した結果、母菌株よりリボフラビン生産量が約73倍増加したことを確認した(表3)。また、ribオペロンのコピー数が増加した場合にも、前記強力なプロモーターを用いた場合と類似のリボフラビン生産量の増加効果を確認した(表4)。また、L-スレオニン生産能母菌株にrpe上流のプロモーターを本発明の配列番号5のプロモーターに交替した結果及びribG上流に強力なプロモーターを導入した場合にも、L-スレオニンの生産量は類似に維持されながらリボフラビンの生産量が約60〜70倍増加したことを確認した(表6)。これから、本発明の変異型コリネバクテリウム属の微生物がL-アミノ酸の生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変されることにより、同時にL-アミノ酸とリボフラビンを高濃度で生産できることを確認した。
好ましくは、前記L-リシン及びリボフラビンを同時に生産する変異型コリネバクテリウム属微生物は、高濃度L-リシン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムに無作為突然変異を誘導することにより、前記L-リシン生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された寄託番号KCCM11223Pのコリネバクテリウム・グルタミクムであってもよい。または、前記L-リシン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、リボフラビン生合成遺伝子群を含むribオペロンにより発現する酵素群の活性を強化させることにより、前記L-リシン生産は高濃度に維持され、同時にリボフラビンの生産量が増加するように改変された、寄託番号KCCM11220P、KCCM11221PまたはKCCM11223Pのコリネバクテリウム・グルタミクムであってもよい。
本発明者らは、L-リシン生産菌株のペントースリン酸化経路上の炭素の流れを増加させるために、無作為人工突然変異を行う中で、濃厚な黄色の菌体色相を有するコロニーを発見し、前記突然変異の前記L-リシンの生産量は類似に維持されながらリボフラビンの生産性が約60倍増加したことを確認した(表1)。本発明者らは、前記突然変異株のこのような特徴がアミノ酸とリボフラビンが一定の比率で供給されなければならない飼料添加剤の生産の時に、有用であると判断した。これについて、本発明者らは、前記突然変異菌株をコリネバクテリウム・グルタミクム CA01-2183、KFCC10881-YCと命名し、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11223Pとして寄託した。前記突然変異菌株は、簡単に通称KFCC10881-YCとも称される。また、本発明者らは、母菌株であるKFCC10881のribオペロンプロモーターにPmrbプロモーターを導入した突然変異菌株をコリネバクテリウム・グルタミクム CA01-2162, KFCC10881::Pmrbと命名し、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11221Pとして寄託した。前記突然変異菌株は、簡単に通称KFCC10881::Pmrbとも称される。また、母菌株であるKFCC10881のribG遺伝子の開始コドンの上端にlysCP1を導入した菌株をコリネバクテリウム・グルタミクム CA01-2161、KFCC10881::lysCP1_ribGと命名した。前記突然変異菌株は、簡単に通称KFCC10881::lysCP1_ribGとも称され、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11220Pとして寄託した。
本発明の方法で同時に生産された培養液内L-アミノ酸及びリボフラビンの比率は1:0.0001〜0.1であり、前記L-アミノ酸がL-リシンである場合、より好ましくは1:0.001〜0.05であり、最も好ましくは1:0.003〜0.01である。また、前記L-アミノ酸がL-スレオニンである場合、L-スレオニン及びリボフラビンの比率は、より好ましくは1:0.001〜0.1であり、最も好ましくは1:0.005〜0.05である。
前記コリネバクテリウム属の微生物の培養は、適当な培地で当業界において公知の様々な培養方法で行うことができる(非特許文献１０、非特許文献１１)。前記培養方法の例としては、回分式、連続式及び流加式培養が含まれる。前記流加式培養には、注入配置及び反復注入配置培養が含まれるが、これに限定されるわけではない。
また、培養に用いられる培地は培養方式と菌株に応じて、当業界において知られた適当な培地が選択されうる(非特許文献１２)。本発明で用いられる培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素の成分を含む。コリネバクテリウム微生物の培養のための培地で炭素源としては、スクロース、グルコース、フルクトース、脂肪、脂肪酸、アルコール、有機酸などがいずれも使用可能である。使用可能な炭素源の具体的な例としては、糖蜜、グルコース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような炭水化物；大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸を含み、適正量の炭素源を様々に用いることができる。窒素供給源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、及び大豆粕加水分解物のような有機窒素源及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源がある。これら窒素源は、単独または組み合わせて用いることができる。前記培地には、リン酸供給源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するソジウム-含有塩を含むことができる。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などを含むことができる。これら培地または前駆体は培養物に回分式または連続式で添加することができる。
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養液に適切な方式で添加し、培養物のpHを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素-含有気体(例、空気)を注入する。培養物の温度は普通20℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃である。培養期間は、所望のL-アミノ酸の生成量がうられるまで続けることができ、好ましくは10〜160時間である。
また、本発明の方法は、さらに前記L-アミノ酸及びリボフラビンを含む培養発酵液を顆粒化する工程を含むことができる。前記発酵液は菌体スラッジを含むことができ、または、前記菌体スラッジが除去されたものであってもよい。菌体スラッジを除去するためには、前記L-リシンまたはL-スレオニン及びリボフラビンを含む培養発酵液から菌体スラッジを除去する工程をさらに含むことができる。
前記発酵液に菌体スラッジが含まれた場合、菌体スラッジを除去するためにフィルタ作業を行わず、別途の吸湿防止剤を添加しなくても吸湿性が低く流動性がよく、見かけ密度が高く、アミノ酸含量の調節が可能な顆粒製剤を生産することができる。前記顆粒化方法は、例えば、特許文献２４に記載された方法または特許文献２５に記載された方法などを適用することができる。具体的には、前記発酵液を濃縮する工程;前記濃縮液に賦形剤を添加して混合濃縮液を形成する工程;顆粒機に200〜500μmサイズの微粒子シードを投入する工程;及び熱風を加えながら顆粒機の下部から前記混合濃縮液を噴射して前記微粒子シードをコーティングしながら顆粒を形成する工程を通じて生産されうるが、これに限定されない。
または菌体スラッジが含まれていない場合、具体的には、発酵液を濾過して菌体スラッジを除去する工程;前記濾過液を濃縮する工程;前記濃縮液を乾燥して顆粒を形成する工程;及び賦形剤または吸湿防止剤等のコーティング剤で前記顆粒をコーティングする工程を通じて生産されうるが、これに限定されない。
前記菌体スラッジは、発酵液から分離する方法として、L-アミノ酸及びリボフラビンを遠心分離、濾過、イオン交換クロマトグラフィ及び結晶化などの方法で分離することにより除去されうる。具体的には、発酵液を低速遠心分離して菌体スラッジを除去し、さらに上澄液をイオン交換クロマトグラフィを通じて分離することができるが、これに限定されない。
他の一実施態様として、本発明は、高濃度L-リシン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムに無作為突然変異を誘導することにより、前記L-リシン生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された寄託番号KCCM11223Pの変異型コリネバクテリウム・グルタミクム微生物を提供する。
微生物に関しては、前述した通りである。
また、他の一実施態様として、本発明は、L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、リボフラビン生合成遺伝子群を含むribオペロンにより発現する酵素群の活性を強化させることにより、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持され、同時にリボフラビンの生産量が増加するように改変された、L-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを同時に生産する変異型コリネバクテリウム属の微生物でありうる。
微生物、酵素群の活性強化、変異型コリネバクテリウム属の微生物は、前述した通りである。
さらに他の一実施態様として、本発明は、a) L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された前記微生物を培養してL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを発酵法で同時に生産する工程;及びb) 前記工程a)のL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを含む発酵液を顆粒化する工程を行って製造された顆粒製剤を提供する。好ましくは、前記L-アミノ酸はL-リシンまたはL-スレオニンでありうる。変形された微生物は、前述した通りである。
前記顆粒製剤は、工程a)で生産されたL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを含む発酵培養液から菌体スラッジを除去する工程をさらに含めて製造された顆粒製剤でありうる。即ち、本発明の顆粒製剤は、前述した通り、菌体スラッジを含んでもよく、または含まなくてもよい。
好ましくは、前記顆粒製剤のL-リシンまたはL-スレオニン:リボフラビンの比率は1:0.0001〜0.01であってもよく、これは前述した通りである。
本発明の顆粒製剤は、既存の粉末形態におけるホコリ発生及び製品損失の欠点を克服するための顆粒化形態の製剤を意味する。
さらに他の一実施態様として、本発明は、a) L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された前記微生物を培養してL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを発酵法で同時に生産する工程;及びb) 前記工程a)のL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを含む発酵液から菌体スラッジを除去する工程を行って製造されたL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビン含有製剤を提供する。好ましくは、前記含有製剤のL-リシンまたはL-スレオニン:リボフラビンの比率は1:0.0001〜0.01であってもよく、これは前述した通りである。
さらに他の一実施態様として、本発明は、前記顆粒製剤、L-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビン含有製剤を含む飼料または飼料添加剤を提供する。
本発明の具体的な実施例において本発明の方法で生産された高濃度のL-リシンまたはL-スレオニン及びリボフラビンは、特にリシンとリボフラビンの比率が約1:0.005またはL-スレオニンとリボフラビンの比率が約1:0.03で構成された(表1〜6参照)。動物飼料においてL-リシンの要求量は約1〜5 g/kg、L-スレオニンは約0.6〜3.3 g/kgであり、リボフラビンは約2〜4 mg/kgでL-リシンの約0.1％のレベルで供給されるが(非特許文献５)、過量投与による毒性は報告されていない。これにより、本発明の方法で同時に生産されたL-アミノ酸とリボフラビンは飼料に添加されるのに適当であることが確認された。
好ましくは、前記L-アミノ酸はL-リシンまたはL-スレオニンであってもよい。
好ましくは、前記飼料または飼料添加剤のL-リシンまたはL-スレオニン:リボフラビンの比率は1:0.0001〜0.01であってもよく、これは前述した通りである。
本発明の飼料は、前記L-アミノ酸及びリボフラビンを飼料添加剤の形態で別途に製造して飼料に混合したり、飼料製造時に直接添加して製造することができる。本発明の飼料内のL-アミノ酸及びリボフラビンは液状または乾燥状態であってもよく、好ましくは、乾燥した粉末形態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥及び凍結乾燥が可能であるが、これに限定されるものではない。前記家畜用飼料は、本発明のL-アミノ酸及びリボフラビン以外に飼料の保存性を高める通常の添加剤をさらに含むことができる。
本発明の飼料添加剤には、非病原性の他の微生物がさらに添加されうる。添加され得る微生物としては、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素及び糖転換酵素を生産することができるバチルス・ズブチリスのような枯草菌、牛の胃腸のような嫌気的条件で生理的活性及び有機物分解能があるラクトバチルス菌株(Lactobacillus sp.)、家畜の体重を増加させ、牛乳の産乳量を増やし、飼料の消化吸収率を高める効果を示すアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)のような糸状菌(非特許文献１３)及びサッカロマイセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母(非特許文献１４)からなる群から選択されうる。
本発明におけるL-アミノ酸及びリボフラビンを含む飼料には、植物性としては、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質油、薬品製造時の副産物類、油脂類、澱粉類、粕類、穀物副産物類などがあり、動物性としては、タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、残飯などがあるが、これに限定されるものではない。
本発明におけるL-アミノ酸及びリボフラビンを含む飼料添加剤には、品質低下を防止するために添加する結着剤、乳化剤、保存剤などがあり、効用増大のために飼料に添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非蛋白態窒素化合物、珪酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、オリゴ糖などがあり、それ以外にも飼料混合剤などをさらに含むことができるが、これに限定されるものではない。
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるわけではない。
実施例1:人工突然変異法を用いたグルコン酸耐性株のスクリーニング
本実施例では、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてL-アミノ酸の生産時に必要なNADPH(コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)の主な供給経路であるペントースリン酸化経路上の炭素の流れを増加させるために高濃度グルコン酸に対する適応性を付与する実験を行った。
本実施例では、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてL-アミノ酸の生産時に必要なNADPH(コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)の主な供給経路であるペントースリン酸化経路上の炭素の流れを増加させるために高濃度グルコン酸に対する適応性を付与する実験を行った。
KFCC10881(特許文献１７)を母菌株としてN-メチル-N-ニトロ-N-ニトログアニジン(NTG)による人工突然変異を誘導した後、グルコン酸を20 g/ｌの濃度で含有した下記複合平板培地で培養しながらNTG非処理対照区に比べて急速にコロニーを形成する菌株を分離した。NTG非処理対照区の場合、培養60時間目で形成されたコロニーの平均直径が0.5 mm程度であるのに比べてNTG処理区では、培養約40時間で直径1 mm大に到達するコロニーが形成された。そのうち、特異的に対照区とは異なり、濃厚な黄色を帯びるコロニーを発見したが、新たな形質の突然変異が生成されたと予想し、この菌株をコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacteriumglutamicum)CA01-2183, KFCC10881-YCと命名して発色原因の究明を試みた。前記突然変異菌株は、簡単に通称KFCC10881-YCとも称され、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11223Pとして寄託した。
<複合平板培地(pH 7.0)>
グルコン酸20g、(NH4)2SO4 50g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 5g、K2HPO410g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミン塩酸塩100μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド2000μｇ、寒天20g(蒸溜水1リットル基準)
実施例2:KFCC10881-YCのリシン生産能分析及び発色原因の究明
前記実施例1で製造したKFCC10881-YC菌株の特性を調べるために下記のような方法で培養することによってリシン生産能を比較し、培養液成分を分析した。
グルコン酸20g、(NH4)2SO4 50g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 5g、K2HPO410g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミン塩酸塩100μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド2000μｇ、寒天20g(蒸溜水1リットル基準)
実施例2:KFCC10881-YCのリシン生産能分析及び発色原因の究明
前記実施例1で製造したKFCC10881-YC菌株の特性を調べるために下記のような方法で培養することによってリシン生産能を比較し、培養液成分を分析した。
種培地25 mlを含有する250 mlのコーナーバッフル付フラスコに各菌株を接種し、30℃で20時間、200 rpmで振盪培養した。その後、生産培地24 mlを含有する250 mlのコーナーバッフル付フラスコに1 mlの種培養液を接種して30℃で72時間、200 rpmで振盪培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
<種培地(pH 7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO48g、MgSO4 7H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミンHCl1000μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド2000μｇ (蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH 7.0)>
ブドウ糖100g、(NH4)2SO440g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KH2PO41g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミン塩酸塩1000μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド3000μｇ、CaCO3 30g(蒸溜水1リットル基準)。
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO48g、MgSO4 7H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミンHCl1000μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド2000μｇ (蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH 7.0)>
ブドウ糖100g、(NH4)2SO440g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KH2PO41g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミン塩酸塩1000μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド3000μｇ、CaCO3 30g(蒸溜水1リットル基準)。
培養を終了した後にも、KFCC10881-YCの菌体色相は濃厚な黄色を維持しており、培養上澄液も対照区であるKFCC10881の培養液とは異なり、濃厚な黄色を帯びていることを確認した。これにより、本発明者は、このような発色の原因物質が培養液中に含まれていると判断し、これを究明するために微生物の発色に影響を及ぼすカルチノイド類及びリボフラビンの濃度を分析した。その結果、培養液中のリボフラビンの濃度が対照区と明確な差を示し、カルチノイド類では特に差を発見できなかった。HPLCを用いて分析されたL-リシン及びリボフラビンの濃度を下記表1に示した。
その結果、表1の結果で示されたように、L-リシン生産菌株KFCC10881に比べ、KFCC10881-YCの場合には、L-リシンの平均濃度は同等であるが、リボフラビンの濃度が実に57倍も増加したことを確認した。これからコロニーの色相が母菌株と区分される明確な特徴として濃厚な黄色い色を帯びるようになったことは、リボフラビンの濃度増加によることが分かった。
実施例3:高濃度リボフラビン生産株のribオペロン上流プロモーターの変異確認及び前記変異型プロモーター(Pmrb)の染色体導入用ベクターの製作
前記実施例1で製造したKFCC10881-YCの色相変化及びリボフラビン生産能の増加を誘発した根本的な遺伝子レベルでの塩基配列突然変異を探索するためにコリネバクテリウム・グルタミクム中のKFCC10881-YCのリボフラビン生合成に関連した染色体部位の塩基配列を決定し、アメリカ国立衛生研究所の遺伝子銀行(NIH genBank)を根拠として確認した。
前記実施例1で製造したKFCC10881-YCの色相変化及びリボフラビン生産能の増加を誘発した根本的な遺伝子レベルでの塩基配列突然変異を探索するためにコリネバクテリウム・グルタミクム中のKFCC10881-YCのリボフラビン生合成に関連した染色体部位の塩基配列を決定し、アメリカ国立衛生研究所の遺伝子銀行(NIH genBank)を根拠として確認した。
その結果、ribオペロン最上流に位置したrpe遺伝子の開始コドンの前から10番目と16番目の塩基配列がそれぞれGからAに、GからTに置換されたことを確認し、ribオペロンプロモーター予想区間に前記2つの塩基置換変異を有するプロモーターをPmrbと命名した(配列番号5)。
塩基配列が置換されたPmrbプロモーターの発現誘導活性及び酵素活性の増加によるリボフラビン濃度増加効果を確認するために、これを染色体上に導入できるベクターを製作した。
報告された塩基配列に基づいて5'末端にEcoRＩ制限酵素部位を挿入したプライマーと3'末端にSalＩ制限酵素部位を挿入したプライマー(配列番号7及び8)を合成し、KFCC10881-YCの染色体を鋳型にしたPCRを通じてribオペロンプロモーター予想区間350 bpを含む約650 bpのPm-rpe遺伝子断片を増幅した。PCR条件は94℃で5分間変性した後、94℃で30秒間変性、56℃で30秒間アニーリング、72℃で40秒間重合を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。これに用いたプライマーは下記に示した。
配列番号7:5'-tttgaattcgtgtgcgtgcaggtttctc-3'
配列番号8:5'-tttgtcgacattccgctaaaacacgt-3'
PCRで増幅された遺伝子断片を制限酵素EcoRＩとSalＩで処理してそれぞれのDNA切片を得た後、これを制限酵素EcoRＩ及びSalＩ末端を有する染色体導入用pDZベクター(特許文献２６)に連結した後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25 mg/ｌ)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、公知のプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドをpDZ-Pmrbと命名した(図3)。
配列番号8:5'-tttgtcgacattccgctaaaacacgt-3'
PCRで増幅された遺伝子断片を制限酵素EcoRＩとSalＩで処理してそれぞれのDNA切片を得た後、これを制限酵素EcoRＩ及びSalＩ末端を有する染色体導入用pDZベクター(特許文献２６)に連結した後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25 mg/ｌ)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、公知のプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドをpDZ-Pmrbと命名した(図3)。
実施例4:高濃度リシン生産株の染色体内ribオペロン上流にPmrb導入菌株の製作、並びにリシン及びリボフラビン生産能の比較
前記実施例3で製造したベクターpDZ-Pmrbを相同染色体組換えによりL-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクム KFCC10881に形質転換させた。その後、染色体上のribオペロンプロモーター変異が導入された菌株をコロニー色相変化により選択的に分離して実施例2と同様の方法で培養し、これから回収されたL-リシン及びリボフラビンの濃度を分析した(表2)。前記ribオペロンプロモーター変異が導入された菌株をコリネバクテリウム・グルタミクム CA01-2162, KFCC10881::Pmrbと命名した。前記突然変異菌株は、簡単に通称KFCC10881::Pmrbとも称され、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11221Pとして寄託した。
前記実施例3で製造したベクターpDZ-Pmrbを相同染色体組換えによりL-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクム KFCC10881に形質転換させた。その後、染色体上のribオペロンプロモーター変異が導入された菌株をコロニー色相変化により選択的に分離して実施例2と同様の方法で培養し、これから回収されたL-リシン及びリボフラビンの濃度を分析した(表2)。前記ribオペロンプロモーター変異が導入された菌株をコリネバクテリウム・グルタミクム CA01-2162, KFCC10881::Pmrbと命名した。前記突然変異菌株は、簡単に通称KFCC10881::Pmrbとも称され、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11221Pとして寄託した。
その結果、表2の結果で確認されたように、野生型rpe遺伝子固有プロモーターを有する対照区KFCC10881(実験群3)に比べ、2つの塩基置換変異を有するプロモーターPmrbが導入されたKFCC10881::Pmrbの場合(実験群4)、L-リシンの平均濃度には変化がなかったが、リボフラビンの平均濃度は実に約61倍が増加したことを確認した。
実施例5:ribオペロン内のribG上流に強力なプロモーター(LysCP1)導入用ベクター製作
rpe遺伝子を除いたリボフラビン生合成遺伝子群のみを過発現させるために、コリネバクテリウム由来の強力なプロモーターをrib生合成遺伝子群の最前方に位置したribG遺伝子(配列番号4)の開始コドン上端に連結することによりリボフラビン生合成遺伝子群の発現量の増加を誘導するための組換えベクターを製作した。
rpe遺伝子を除いたリボフラビン生合成遺伝子群のみを過発現させるために、コリネバクテリウム由来の強力なプロモーターをrib生合成遺伝子群の最前方に位置したribG遺伝子(配列番号4)の開始コドン上端に連結することによりリボフラビン生合成遺伝子群の発現量の増加を誘導するための組換えベクターを製作した。
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のribG遺伝子断片を確保するために、コリネバクテリウム・グルタミクム KFCC10881の染色体DNAを鋳型とし、5'末端にEcoRＩ制限酵素部位と3'末端にXbaＩ制限酵素部位を有するように考案したプライマー(配列番号9及び10)を合成した。合成したプライマーでPCRを通じてribG遺伝子の開始コドンの上流300 bpを含んでいるDNA断片を得た。また、5'末端にXbaＩとNdeＩ制限酵素部位と3'末端にSalＩ制限酵素部位を有するように考案したプライマー(配列番号11及び12)を合成し、PCRを通じてribG遺伝子の開始コドンを含んでいる300 bp DNA断片を確保した。PCR条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒間変性、56℃で30秒間アニーリング、72℃で30秒間重合を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。前記2つのPCR増幅産物をそれぞれEcoRＩとXbaＩ、XbaＩとSalＩで処理した後、pDZベクターを制限酵素SalＩとEcoRＩで処理して得たDNA切片と連結してpDZ-ribGベクターを製作した。本PCRに用いたプライマー配列を下記に示した。
配列番号9:5'-tttgaattcgtgtgcgtgcaggtttctcc-3'
配列番号10:5'-tttctagattactgcgcgagtgctc-3'
配列番号11:5'-ttttctagataacatatggatgttgcgcacgcg-3'
配列番号12:5'-tttgtcgacattggcgtaaaacacgt-3'
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のlysCP1プロモーター(配列番号6)を増幅でき、5'末端にXbaＩ制限酵素部位を挿入したプライマーと3'末端にNdeＩ制限酵素部位を有するように考案したプライマー(配列番号13及び14)を合成し、コリネバクテリウム・グルタミクム菌株の染色体DNAを鋳型にしたPCRを通じて約400 bpのプロモーター部位を増幅した。PCR条件は94℃で5分間変性した後、94℃で30秒間変性、58℃で30秒間アニーリング、72℃で30秒間重合を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。前記PCR増幅産物をXbaＩとNdeＩで処理した後、pDZ-ribGベクターを制限酵素XbaＩとNdeＩで処理して得たDNA切片と連結してpDZ-lysCP1_ribGベクターを製作した(図4)。本PCRに用いたプライマー配列を下記に示した。
配列番号10:5'-tttctagattactgcgcgagtgctc-3'
配列番号11:5'-ttttctagataacatatggatgttgcgcacgcg-3'
配列番号12:5'-tttgtcgacattggcgtaaaacacgt-3'
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のlysCP1プロモーター(配列番号6)を増幅でき、5'末端にXbaＩ制限酵素部位を挿入したプライマーと3'末端にNdeＩ制限酵素部位を有するように考案したプライマー(配列番号13及び14)を合成し、コリネバクテリウム・グルタミクム菌株の染色体DNAを鋳型にしたPCRを通じて約400 bpのプロモーター部位を増幅した。PCR条件は94℃で5分間変性した後、94℃で30秒間変性、58℃で30秒間アニーリング、72℃で30秒間重合を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。前記PCR増幅産物をXbaＩとNdeＩで処理した後、pDZ-ribGベクターを制限酵素XbaＩとNdeＩで処理して得たDNA切片と連結してpDZ-lysCP1_ribGベクターを製作した(図4)。本PCRに用いたプライマー配列を下記に示した。
配列番号13:5'-ttttctagatagggagccatcttttgggg-3'
配列番号14:5'-tttcatatgctttgtgcacctttcg-3'
実施例6:ribG上流に強力なプロモーター(LysCP1)が導入された菌株のリシン及びリボフラビン生産能の比較
前記実施例5で製造したベクターpDZ-lysCP1_ribGを電気パルス法を用いてL-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクム KFCC10881に形質転換させ、染色体上のribG遺伝子固有プロモーターがlysCP1で置換された菌株を選択的に分離することにより、L-リシン及びリボフラビンを同時に生産するKFCC10881::lysCP1_ribGを得た。この菌株を実施例2と同様の方法で培養し、培養液中のL-リシン及びリボフラビンの濃度を分析した(表3)。前記KFCC10881::lysCP1_ribG菌株をコリネバクテリウム・グルタミクム CA01-2161、KFCC10881::lysCP1_ribGと命名した。前記突然変異菌株は簡単に通称KFCC10881::lysCP1_ribGとも称され、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11220Pとして寄託した。
配列番号14:5'-tttcatatgctttgtgcacctttcg-3'
実施例6:ribG上流に強力なプロモーター(LysCP1)が導入された菌株のリシン及びリボフラビン生産能の比較
前記実施例5で製造したベクターpDZ-lysCP1_ribGを電気パルス法を用いてL-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクム KFCC10881に形質転換させ、染色体上のribG遺伝子固有プロモーターがlysCP1で置換された菌株を選択的に分離することにより、L-リシン及びリボフラビンを同時に生産するKFCC10881::lysCP1_ribGを得た。この菌株を実施例2と同様の方法で培養し、培養液中のL-リシン及びリボフラビンの濃度を分析した(表3)。前記KFCC10881::lysCP1_ribG菌株をコリネバクテリウム・グルタミクム CA01-2161、KFCC10881::lysCP1_ribGと命名した。前記突然変異菌株は簡単に通称KFCC10881::lysCP1_ribGとも称され、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11220Pとして寄託した。
その結果、表3の結果で示されたように、野生型プロモーターを有する対照区KFCC10881(実験群5)に比べてlysCP1プロモーターを用いてRibGを過発現させる場合(実験群6)、L-リシンの平均濃度には変化がなかったが、リボフラビンの濃度が73倍も増加したことを確認した。
従って、リボフラビン生合成オペロンを異種プロモーターを用いて過発現させる場合、リシン生産には全く影響を与えないながら、リボフラビン生産量を大幅に増加させることができ、プロモーターの発現誘導活性が強いほどリボフラビン生合成遺伝子群の過発現によるリボフラビン生産能が増加することが分かった。
実施例7:ribオペロンのコピー数が増加した菌株のリシン及びリボフラビン生産能の比較
KFCC10881菌株にribオペロンを含んでいるプラスミドを導入してリボフラビン生合成遺伝子のコピー数を増加させてリボフラビン生産能を確認することにした。
KFCC10881菌株にribオペロンを含んでいるプラスミドを導入してリボフラビン生合成遺伝子のコピー数を増加させてリボフラビン生産能を確認することにした。
報告された塩基配列に基づいて5'末端にXbaＩ制限酵素部位を挿入したプライマーと3'末端に同一の制限酵素部位を挿入したプライマー(配列番号15及び16)を合成し、KFCC10881の染色体を鋳型にしたPCRを通じてプロモーター部位を含めた約4500 bpのribオペロンを増幅した。PCR条件は94℃で5分間変性した後、94℃で30秒間変性、56℃で30秒間アニーリング、72℃4分重合を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。本PCRに用いたプライマー配列を下記に示した。
配列番号15:5'-TTTGGTACCGATTGAAAAGTCCGTGCGTG-3'
配列番号16:5'-TTTGGTACCCGCGATCTTTTTCAGAAACT-3'
PCRで増幅された遺伝子断片を制限酵素XbaＩで処理してDNA切片を得た後、これを制限酵素XbaＩ末端を有するpECCG117ベクターに連結した後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/ｌ)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、通常、知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドをpECCG117-ribと命名した。
配列番号16:5'-TTTGGTACCCGCGATCTTTTTCAGAAACT-3'
PCRで増幅された遺伝子断片を制限酵素XbaＩで処理してDNA切片を得た後、これを制限酵素XbaＩ末端を有するpECCG117ベクターに連結した後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/ｌ)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、通常、知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドをpECCG117-ribと命名した。
前記製造したベクターpECCG117-ribを電気パルス法を用いてKFCC10881菌株に導入した後、実施例2と同様の方法で培養し、培養液中のL-リシン及びリボフラビンの濃度を分析した(表4)。
その結果、表4の結果で示されたように、ribオペロンを含んでいない対照区KFCC10881::pECCG117(実験群7)に比べてプラスミド導入を通じてribオペロンのコピー数を増加させる場合(実験群8)、L-リシンの平均濃度には変化がなかったが、リボフラビンの濃度が66倍も増加したことを確認した。
したがって、リボフラビン生合成オペロンをプラスミドを用いてコピー数を増加させることにより、リボフラビン生合成遺伝子を過発現させる場合、リシン生産には全く影響を与えないながら、リボフラビン生産量を大幅に増加させることができた。
実施例8:人工突然変異法を用いたAHV耐性L-スレオニン生産菌株の製作
本実施例では、コリネバクテリウム・グルタミクムのL-スレオニン生産能を増加させるためにL-スレオニン類似物質であるAHV(2-アミノ-3-ヒドロキシ-バレラート)に対する耐性を付与する実験を行った。KFCC10881を母菌株としてN-メチル-N-ニトロ-N-ニトログアニジン(NTG)による人工突然変異を誘導した後、AHVを1〜10g/ｌの濃度で含有した下記最小培地で培養しながら培地内のAHV濃度によるコロニー形成の有無をNTG非処理対照区と比較した。NTG非処理対照区の場合、培養72時間目を基準に1〜3g/ｌのAHVに対する耐性を示したが、NTG処理区では、同一時間培養した時、AHV 6g/ｌの濃度までにおいてコロニーが形成された。これらのL-スレオニン生産能増加の有無を確認するために、下記のような方法で培養し、培養液中のL-スレオニンの生産量を分析した。
本実施例では、コリネバクテリウム・グルタミクムのL-スレオニン生産能を増加させるためにL-スレオニン類似物質であるAHV(2-アミノ-3-ヒドロキシ-バレラート)に対する耐性を付与する実験を行った。KFCC10881を母菌株としてN-メチル-N-ニトロ-N-ニトログアニジン(NTG)による人工突然変異を誘導した後、AHVを1〜10g/ｌの濃度で含有した下記最小培地で培養しながら培地内のAHV濃度によるコロニー形成の有無をNTG非処理対照区と比較した。NTG非処理対照区の場合、培養72時間目を基準に1〜3g/ｌのAHVに対する耐性を示したが、NTG処理区では、同一時間培養した時、AHV 6g/ｌの濃度までにおいてコロニーが形成された。これらのL-スレオニン生産能増加の有無を確認するために、下記のような方法で培養し、培養液中のL-スレオニンの生産量を分析した。
種培地25 mlを含有する250 mlのコーナーバッフル付フラスコに各菌株を接種し、30℃で20時間、200 rpmで振盪培養した。その後、生産培地24 mlを含有する250 mlのコーナーバッフル付フラスコに1 mlの種培養液を接種して30℃で48時間、200 rpmで振盪培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
<最小培地(pH 7.2)>
ブドウ糖5g、KH2PO4 1g、(NH4)2SO4 5g、MgSO4 7H2O 0.4g、NaCl 0.5gビオチン200μｇ、チアミンHCl 100μｇ、カルシウム-パントテン酸100μｇ、ニコチンアミド0.03g、L-スレオニン0.01g、尿素2g、Na2B4O710H2O 0.09 mg、(NH4)6Mo7O274H2O 0.04 mg、ZnSO47H2O 0.01 mg、CuSO45H2O、MnCl24H2O 0.01 mg、FeCl36H2O 1 mg、CaCl2 0.01 mg(蒸溜水1リットル基準)
<種培地(pH 7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO47H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミンHCl 1000μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド2000μｇ(蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH 7.0)>
ブドウ糖100g、(NH4)2SO420g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO47H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミン塩酸塩1000μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド3000μｇ、CaCO330g(蒸溜水1リットル基準)
培養を終了した後、HPLCを用いて培養液中のL-スレオニンの濃度を分析し、最も高いL-スレオニン生産能を示した変異株をコリネバクテリウム・グルタミクム CA01-2182、KFCC10881-THRと命名した。前記突然変異菌株は、簡単に通称KFCC10881-THRとも称され、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11222Pとして寄託した。KFCC10881-THRのL-スレオニン生産能は下記の通りだ(表5)。
ブドウ糖5g、KH2PO4 1g、(NH4)2SO4 5g、MgSO4 7H2O 0.4g、NaCl 0.5gビオチン200μｇ、チアミンHCl 100μｇ、カルシウム-パントテン酸100μｇ、ニコチンアミド0.03g、L-スレオニン0.01g、尿素2g、Na2B4O710H2O 0.09 mg、(NH4)6Mo7O274H2O 0.04 mg、ZnSO47H2O 0.01 mg、CuSO45H2O、MnCl24H2O 0.01 mg、FeCl36H2O 1 mg、CaCl2 0.01 mg(蒸溜水1リットル基準)
<種培地(pH 7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO47H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミンHCl 1000μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド2000μｇ(蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH 7.0)>
ブドウ糖100g、(NH4)2SO420g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO47H2O 0.5g、ビオチン100μｇ、チアミン塩酸塩1000μｇ、カルシウム-パントテン酸2000μｇ、ニコチンアミド3000μｇ、CaCO330g(蒸溜水1リットル基準)
培養を終了した後、HPLCを用いて培養液中のL-スレオニンの濃度を分析し、最も高いL-スレオニン生産能を示した変異株をコリネバクテリウム・グルタミクム CA01-2182、KFCC10881-THRと命名した。前記突然変異菌株は、簡単に通称KFCC10881-THRとも称され、これを2011年11月11日に韓国微生物保存センター(大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞ユリムビル)に寄託番号KCCM11222Pとして寄託した。KFCC10881-THRのL-スレオニン生産能は下記の通りだ(表5)。
前記表5において実験群9の対照区であるKFCC10881のL-スレオニン平均濃度を示し、実験群10はKFCC10881-THRのL-スレオニン平均濃度を示す。
その結果、表5の結果で示されるように、KFCC10881に比べてKFCC10881-THRの場合、L-スレオニンの生産能が約5.6g/ｌ程度増加したことを確認した。
実施例9:染色体内ribオペロン上流またはribG上流に強力なプロモーター導入菌株の製作、並びにスレオニン及びリボフラビン生産能の比較
前記実施例3で製造したベクターpDZ-Pmrbと実施例5で製造したpDZ-lysCP1_ribGを電気パルス法を用いて前記実施例8で製造したL-スレオニン生産菌株であるKFCC10881-THRにそれぞれ形質転換させ、染色体上のrpe遺伝子固有プロモーターがPmrbで置換された菌株またはribG遺伝子固有プロモーターがlysCP1で置換された菌株を選択的に分離して実施例7と同様の方法で培養し、これから回収されたL-スレオニン及びリボフラビンの濃度を分析した(表6)。
前記実施例3で製造したベクターpDZ-Pmrbと実施例5で製造したpDZ-lysCP1_ribGを電気パルス法を用いて前記実施例8で製造したL-スレオニン生産菌株であるKFCC10881-THRにそれぞれ形質転換させ、染色体上のrpe遺伝子固有プロモーターがPmrbで置換された菌株またはribG遺伝子固有プロモーターがlysCP1で置換された菌株を選択的に分離して実施例7と同様の方法で培養し、これから回収されたL-スレオニン及びリボフラビンの濃度を分析した(表6)。
その結果、表6の結果で確認されたように、野生型rpe及びribG遺伝子固有プロモーターを有する対照区KFCC10881-THR(実験群11)に比べ、2つの塩基置換変異を有するプロモーターPmrbが導入されたKFCC10881::Pmrb(実験群12)とlysCP1プロモーターを用いてRibGを過発現させたKFCC10881-THR::lysCP1_ribGの場合(実験群13)、L-スレオニンの平均濃度には変化がなかったが、リボフラビンの平均濃度は、それぞれ約56倍及び66倍が増加したことを確認した。
前記結果は、リボフラビン生合成オペロンを過発現させる場合、L-スレオニン生産には全く影響を与えず、かつリボフラビン生産量を大幅に増加させてL-スレオニン及びリボフラビンを同時に生産できることが分かった。従って、L-スレオニン生産菌株リボフラビン生合成オペロンプロモーターの発現誘導活性が強いほどリボフラビン生合成遺伝子群の過発現によりリボフラビンの生産能が増加することが分かった。
Claims (21)
- L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された前記微生物を培養してL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを発酵法で同時に生産する工程を含む、L-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンの同時生産方法。
- 前記コリネバクテリウム属の微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacteriumglutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)及びブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium fermentum)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記コリネバクテリウム属の微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項２に記載の方法。
- 前記L-リシンまたはL-スレオニン:リボフラビンの比率が、1:0.0001〜0.1である、請求項１に記載の方法。
- 前記L-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを含む培養発酵液を顆粒化する工程を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記L-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを含む培養発酵液から菌体スラッジを除去する工程を含む、請求項１に記載の方法。
- 高濃度L-リシン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムに無作為突然変異を誘導することにより、前記L-リシン生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された寄託番号KCCM11223Pの変異型コリネバクテリウム・グルタミクム微生物。
- L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、リボフラビン生合成遺伝子群を含むribオペロンにより発現する酵素群の活性を強化させることにより、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持され、同時にリボフラビンの生産量が増加するように改変された、L-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを同時に生産する変異型コリネバクテリウム属の微生物。
- 前記コリネバクテリウム属の微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム及びブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムからなる群から選択される、請求項８に記載の微生物。
- リボフラビン生合成遺伝子群により発現する酵素群の活性を強化させる、請求項８に記載の微生物。
- 前記酵素群の活性強化が、前記酵素群をコードする遺伝子の細胞内コピー数の増加、前記酵素群をコードする染色体上の遺伝子の調節配列に変異を導入する方法、前記酵素群をコードする染色体上の遺伝子の調節配列を、強力な活性を有する配列に置き換える方法、前記酵素群の活性が増加するように突然変異された遺伝子で染色体上の前記酵素群をコードする遺伝子を代替する方法、及び前記酵素群の活性が強化されるように前記酵素群をコードする染色体上の遺伝子に変異を導入させる方法からなる群から選択されるいずれか1つ以上の方法である、請求項１０に記載の微生物。
- 前記酵素群をコードする染色体上の遺伝子の調節配列を、強力な活性を有するプロモーターに置き換える方法である、請求項１１に記載の微生物。
- 前記プロモーターが、配列番号５または配列番号６で記載されたプロモーターである、請求項１２に記載の微生物。
- L-リシン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、リボフラビン生合成遺伝子群を含むribオペロンにより発現する酵素群の活性を強化させることにより、前記L-リシン生産は高濃度に維持され、同時にリボフラビンの生産量が増加するように改変された、L-リシン及びリボフラビンを同時に生産する寄託番号KCCM11220P、KCCM11221PまたはKCCM11223Pである請求項８に記載の微生物。
- 前記L-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物が、寄託番号KCCM11222Pである、請求項８に記載の微生物。
- a) L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は、高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された前記微生物を培養してL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを発酵法で同時に生産する工程;及びb) 前記工程a)のL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを含む発酵液を顆粒化する工程を行って製造された顆粒製剤。
- 前記L-リシンまたはL-スレオニン:リボフラビンの比率が、1:0.0001〜0.01である、請求項１６に記載の顆粒製剤。
- 前記工程a)で生産されたL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを含む発酵培養液から菌体スラッジを除去する工程を含む、請求項１６または１７に記載の顆粒製剤。
- a)L-リシンまたはL-スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物において、前記L-リシンまたはL-スレオニンの生産は高濃度に維持され、リボフラビンの生産量が増加するように改変された前記微生物を培養してL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを発酵法で同時に生産する工程;及びb) 工程a)のL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビンを含む発酵液から菌体スラッジを除去する工程を行って製造されたL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビン含有製剤。
- 前記L-リシンまたはL-スレオニン:リボフラビンの比率が1:0.0001〜0.01である、請求項１９に記載のL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビン含有製剤。
- 請求項１６または１８に記載の顆粒製剤または請求項１９に記載のL-リシンまたはL-スレオニン、及びリボフラビン含有製剤を含む飼料添加剤。
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