KR20060080023A

KR20060080023A - 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 유전자의결실을 통한 알라닌 요구주의 제작 및 이를 이용한엘-라이신의 생산방법

Info

Publication number: KR20060080023A
Application number: KR1020050000472A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 임상조; 이희종; 김성준; 이성일
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2005-01-04
Filing date: 2005-01-04
Publication date: 2006-07-07
Also published as: KR100628394B1

Abstract

본 발명은 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotrasnferase) 유전자를 파괴시킴으로써 알라닌 요구주를 제작하고, 이를 직접 발효법으로 배양하여 발효액 중에 L-라이신을 축적시킨 후 그로부터 L-라이신을 회수함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법에 관한 것이다.

코리네박테리움, 알라닌, 아미노트랜스퍼레이즈, L-라이신, L-아미노산

Description

코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 유전자의 결실을 통한 알라닌 요구주의 제작 및 이를 이용한 엘-라이신의 생산방법{preparation of alanine auxotroph by deletion of alanine aminotransferase gene in Corynebacterium and production method of L-lysine using the same}

도 1은 본 발명에서 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase: aat) 유전자를 파괴하기 위한 용도로 제작한 서열번호 2의 aat 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터 pCR-Δaat이다.

본 발명은 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase: 이하 aat라 함) 유전자를 파괴시킴으로써 알라닌 요구주를 제작하고, 이를 직접 발효법으로 배양하여 발효액 중에 L-라이신을 축적시킨 후 그로부터 L-라이신을 회수함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 균주(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 약제산 업에 사용되고 있으며 코리네박테리움 균주의 발효에 의해 생성되고 있다. 이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다.

그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 각각의 L-아미노산 생합성-관련 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 많이 있어 왔다.『Kinoshita, "Glutamic Acid Bacteria" in : Biology of industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds), Benjamin Chummings, London, UK, 1985, 115-142; Hiliger, BioTec 2, 40-44(1991); Eggeling, Amino Acids 6, 261-272(1994); Jetten and Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995); 및 Sahm et al, Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)』. 또한, 특정유전자를 파괴시키거나 감쇠발현(Underexpression)시킴으로써 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있었다. 예를 들면, 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트의 대한민국 특허공개 제2001-51915호 및 제2001-62279호에는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 sucC 및 sucD 유전자 및 zwa2 유전자를 감쇠발현(underexpression)시켜 코리네형 박테리아로부터 L-아미노산의 생산성을 증대시키는 방법이 기술되어 있다.

또한 외부의 다른 박테리아 유래의 유전자를 도입하는 경우도 있다. 일본 특허공보 제(평)7-121228호에서는, 에스케리키아 콜리 유래의 시트르산 신타제를 암호화하는 유전자를 도입하는 방법이 기술되어 있다.

L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주의 경우, 각종 탄소원으로부터 해당과정(Glycolysis)을 거쳐 생성된 파이루베이트(pyruvate)가 여러 종류의 아미노산[발린(valine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 라이신(lysine), 알라닌(alanine) 등] 생성의 전구체가 된다. 이러한 이유로 특정 아미노산의 생산량을 증가시키고자 할 경우에는, 파이루베이트로부터 유래하는 기타 아미노산의 생산을 저해시켜 줌으로써 궁극적으로 원하는 아미노산만이 생산되도록 균주를 개량한다.

현재 코리네박테리움에서 파이루베이트로부터 발린, 이소루신, 루신, 라이신 등의 아미노산을 생성하는 대사경로는 모두 밝혀져 있으며, 이들을 이용한 각종 아미노산 생산균주 개량의 연구가 활발히 진행 중에 있다. 그러나 알라닌(alanine)의 경우에는 파이루베이트로부터 알라닌을 생성하는 경로의 효소가 아직까지 보고되고 있지 않다.

아미노산 생합성과 분해에 관여하는 효소의 일종인 아미노트랜스퍼레이즈(aminotransferase)는 아미노산과 옥소산(oxo acid) 사이에서 아미노 그룹(amino group)의 전달(transfer)을 매개하는 효소이다. 코리네박테리움에서 이러한 아미노트랜스퍼레이즈는 기질특이성이 다양하고 여러 기질에 대해 중복성을 나타내고 있어서 최근까지도 거의 특성이 보고되어 있지 않은 실정이다. 최근 보고된 논문(Journal of Biotechnology 104(2003) 229-240)에 의하면, 히든-마코브 모델(Hidden Markov model)에 기초한 분석에 의해 코리네박테리움의 아미노트랜스퍼레이즈 후보 유전자들을 탐색하여 분류하고 있으나, 각각의 아미노트랜스퍼레이즈들의 기능에 대하여서는 명확히 규정된 바가 없다. 특히 알라닌 생합성관련 아미노트 랜스퍼레이즈에 대해서는 현재까지 보고된 바가 없었으나, 2002년 일본 농예화학회에서 임상조 등이 코리네박테리움 락토퍼멘텀 13869 균주로부터 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(aat)를 클로닝하여 유전자 결손실험을 한 결과, 당 유전자가 코리네박테리움의 알라닌 생합성에 관여하는 유일한 아미노트랜스퍼레이즈임을 밝힌 바 있다(발표번호 3-5Bp14).

이에 따라 본 발명자들은 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈에 해당하는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 균주의 유전자는 NCBI 등록번호 AY238317로 등록된 유전자임을 확인하고, 본 유전자를 결손시켜 세포내 파이루베이트의 농도를 증가시킴으로써 L-라이신의 생산성을 증가시키려 하였다.

본 발명은 L-라이신 생합성의 주요 기질인 파이루베이트의 세포내 농도를 증가시켜 L-라이신 생산성을 향상시킬 목적으로, 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 유전자를 파괴하여 알라닌에 대한 요구성 및 그것이 L-라이신 생산에 미치는 영향을 확인하고, 이를 이용하여 L-라이신의 생산방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 코리네박테리움에서 알라닌 생합성에 관련된 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(aat) 유전자를 파괴할 경우 L-라이신 생산이 보다 더 증가됨을 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase: aat) 유전자를 파괴시킴으로써 알라닌 요구주를 제작하고, 이를 직접발효법으로 배양하여 발효액 중에 L-라이신을 축적시킨 후, 그로부터 L-라이신을 회수함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명을 자세히 설명하면 아래와 같다.

먼저, 본 발명은 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase: aat) 유전자를 파괴하기 위한 용도로 제작된 aat 유전자 단편이 포함된 재조합 벡터를 제공한다.

상기에서, 재조합 벡터는 서열번호 2의 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase: aat) 유전자 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기의 재조합벡터를 이용하여 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 유전자를 파괴시킨 형질전환 세포를 제공한다. 본 발명에서 사용 가능한 숙주세포로는 그람양성 박테리아에 속하는 미생물을 사용할 수 있으며, 특히 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.

더 나아가, 본 발명은 상기에서 제공된 형질전환 미생물을 L-라이신을 생성하기에 적절한 조건하에서 배양하고 L-라이신을 회수하여 L-라이신을 제조하는 방법을 제공한다.

한편, 본 발명에서 제공하는 상기의 유전자 aat 가 파괴된 코리네박테리움 라이신 생산균주, 코리네박테리움 글루타미쿰(CF3224-0412)는 2004년 12월 10일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 제KCCM-10636호를 부여받았다.

본원 명세서에 사용된 용어 '벡터'는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 실시할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호교환적으로 사용된다.

본 발명에서 사용되는 코리네박테리아 균주로는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 외에 다른 코리네박테리움 속 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적당한 균주로는 공지된 야생형 균주, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERMBP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) ATCC13869, 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001 등이 있다.

본 발명에 따라 사용되는 코리네박테리아 균주는 배치 공정(batch process) 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식 또는 회분식으로 배양할 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); 및 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다.

L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의해 분석할 수 있다(Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).

이하 본 발명의 구성을 실시예를 통해 더욱 구체적으로 설명하나, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래 aat 유전자의 클로닝 및 aat 유전자 파괴용 재조합벡터 제작

2002년 일본 농예화학회에서 발표된 코리네박테리움 락토퍼멘텀 13869 균주의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(aat)에 해당하는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 유전자(NCBI 등록번호 AY238317, 서열번호 1)를 클로닝하기 위하여, 등록된 염기서열에 근거하여 아래 표 1에서 기재된 한 쌍의 프라이머(서열번호 3, 서열번호 4)를 합성하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC 13032)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 연쇄중합법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=96℃,30초/Annealing=48℃,30초/Polymerization=72℃,1분 10초, 30회)에 의해 1,314 염기쌍의 aat 유전자를 증폭한 뒤 TOPO Cloning Kit(Invitrogen)을 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1(Invitrogen)에 클로닝하여 pCR-aat 플라스미드를 얻었다.

Aat-F	5'- GTG ACT TCT AGA AAG CGC AAA ACC -3'
Aat-R	5'- CTA CTG CTT GTA AGT GGA CAG GAA -3'

그 다음 코리네박테리아 게놈상의 aat 유전자의 활성을 제거하기 위하여, 상기 유전자의 중간부분만을 증폭하여 양끝부위가 제거된 단편(Δaat)을 게놈상의 aat 유전자와 재조합시킴으로써 벡터 및 Δaat의 삽입에 의해 aat 유전자의 활성을 제거하고자 하였다. 우선 서열번호 1의 383..958bp의 염기서열만을 증폭하여 Δaat 단편(서열번호 2)을 제작하기 위해, 아래 표 2와 같은 한 쌍의 프라이머(서열번호 5, 서열번호 6)을 제작하였다. 상기에서 제작된 pCR-aat를 주형으로 하여 연쇄중합법(PCR법)(PCR 조건: Denaturing=96℃,30초/Annealing=48℃,30초/Polymerization=72℃,30초,30회)으로 Δaat 단편(서열번호 2)을 증폭한 후, TOPO Cloning Kit(Invitrogen)을 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1(Invitrogen)에 클로닝하여 pCR-Δaat 를 획득하였다(도 1).

Δaat-F	5'- TTG ATG ATG TGT TCT TAG GCA ACG -3'
Δaat-R	5'- GAA TAG CGT CGT GAG CTG GGA CAT -3'

실시예 2: L-라이신 생산 코리네박테리움에서의 aat 파괴 및 알라닌 요구성 확인

실시예 1에서 제작한 pCR-Δaat를 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10749에 전기펄스법으로 형질전환한 후 (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용), 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환균주를 획득하였다. 1차 재조합과정(cross-over)으로 게놈상으로 삽입된 pCR-Δaat에 의하여 aat 유전자가 파괴된 균주를 획득하였다(KFCC10749/Δaat).

유전자 aat가 실제로 알라닌에 대한 특이성을 갖는 아미노트랜스퍼레이즈인지 확인하고, 또한 파괴된 KFCC10749/Δaat의 알라닌 요구성을 파악하기 위하여, 알라닌이 함유되지 않은 최소배지[Biotechnology Letters vol.11(1) 11-16(1989)]에서 상기 세포의 성장을 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

KFCC10749/Δaat 균주의 알라닌 요구성

	KFCC10749	KFCC10749/Δaat
최소배지+알라닌(100mg/L)	+++++	+++++
최소배지	+++++	+

상기 표 3의 결과에 의해, 본 발명에서 이용한 유전자 aat가 실제로 알라닌 생합성에 관여하는 효소임을 확인할 수 있었다. 한편, 알라닌 요구성 균주로 확인된 상기 KFCC10749/Δaat는 코리네박테리움 글루타미쿰(CF3224-0412)로 명명한 후 2004년 12월 10일 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 제KCCM-10636호를 부여받았다.

실시예 3: aat 파괴 L-라이신 생산균주에서의 라이신 생산

실시예 2에서와 같이 알라닌 요구성을 갖는 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10749/Δaat 균주(KCCM-10636)를 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기의 종배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC10749와 본 발명 균주 KFCC10749/Δaat를 각각 접종하고 30℃에서 20시간 동안 진탕배양(200 rmp)하였다. 하기의 생산배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 각각 접종하고 30℃에서 120시간 동안 진탕배양(200 rpm)하였다. 배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10749와 KFCC10749/Δaat에 대한 배양물 중의 L-라이신 및 부산물로 생성되는 알라닌에 대한 결과는 아래 표 4와 같다.

균주	라이신	알라닌
KFCC10749	25.1g/L	479mg/L
KFCC10749/Δaat	31.0g/L	159mg/L

종배지 (pH 7.0)

: 원당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH₂PO₄ 4g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아마이드 2000㎍ (공정수 1리터 기준)

생산배지 (pH 7.0)

: 포도당 100g, (NH₄)·2SO₄ 40g, 콩 단백질(Soy Protein) 2.5g, 콘 스티프 솔리드(Corn Steep Solids) 5g, 요소 3g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아마이드 3000㎍, CaCO₃ 30g (공정수 1리터 기준)

상기의 표 4에서와 같이, 유전자 aat 파괴균주(KFCC10749/Δaat(KCCM-10636))의 경우 모균주 KFCC10749에 비해 라이신 생산이 현저히 증가되었으며, 알라닌의 생산은 약 67%가 감소되는 결과를 확인할 수 있었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼 레이즈 aat 유전자를 파괴시킴으로써 알라닌 요구주의 특성을 가짐과 동시에 L-라이신의 생산능력이 더욱 향상된 형질전환 미생물을 새로이 제공하고, 또한 상기 형질전환 미생물을 L-라이신을 생성하기에 적절한 조건하에서 배양한 후 L-라이신을 회수함으로써 종전보다 L-라이신을 훨씬 더 많이 생산할 수 있는 탁월한 L-라이신 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

<110> CJ Corp. <120> preparation of alanine auxotroph by deletion of alanine aminotransferase gene in Corynebacterium and production method of L-lysine using the same <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1314 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(1314) <223> These sequences encode alanine aminotransferase in Corynebacterium (aat). <400> 1 gtgactacag acaagcgcaa aacctctaag accaccgaca ccgccaacaa ggctgtgggc 60 gcggatcagg cagcgcgtcc cactcggcga acaactcgcc gcatcttcga tcagtcggag 120 aagatgaagg acgtgctgta cgagatccgt ggcccggtgg ccgcggaggc ggaacgcatg 180 gagcttgatg ggcataacat cttaaagctc aacacgggaa atccagccgt gttcggattc 240 gatgcccccg acgtgattat gcgtgacatg atcgccaacc ttccaacttc ccaagggtat 300 tccacctcca aaggcattat tccggcccgg cgagcagtgg tcacccgcta cgaagttgtg 360 cccggattcc cccacttcga tgttgatgat gtgttcttag gcaacggtgt ctcagaacta 420 atcaccatga ccacccaagc actcctcaac gacggcgatg aagttcttat ccccgcaccg 480 gactacccac tgtggactgc cgcaacctcc ctggctggtg gtaagcctgt gcactacctc 540 tgtgatgagg aagatgactg gaacccatcc atcgaagaca tcaagtccaa aatctcagag 600 aaaaccaaag ctattgtggt gatcaacccc aacaacccca cgggagctgt ctacccgcgc 660 cgggtgttgg aacaaatcgt cgagattgca cgcgagcatg acctgctgat tttggccgat 720 gaaatctacg accgcattct ctacgatgat gccgagcaca tcagcctggc aacccttgca 780 ccagatctcc tttgcatcac atacaacggt ctatccaagg cataccgcgt cgcaggatac 840 cgagctggct ggatggtatt gactggacca aagcaatacg cacgtggatt tattgagggc 900 ctcgaactcc tcgcaggcac tcgactctgc ccaaatgtcc cagctcagca cgctattcag 960 gtagctctcg gtggacgcca gtccatctac gacctcactg gcgaacacgg ccgactcctg 1020 gaacagcgca acatggcatg gacgaaactc aacgaaatcc caggtgtcag ctgtgtgaaa 1080 ccaatgggag ctctatacgc gttccccaag ctcgacccca acgtgtacga aatccacgac 1140 gacacccaac tcatgctgga tcttctccgt gccgagaaaa tcctcatggt tcagggcact 1200 ggcttcaact ggccacatca cgatcacttc cgagtggtca ccctgccatg ggcatcccag 1260 ttggaaaacg caattgagcg cctgggtaac ttcctgtcca cttacaagca gtag 1314 <210> 2 <211> 576 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 ttgatgatgt gttcttaggc aacggtgtct cagaactaat caccatgacc acccaagcac 60 tcctcaacga cggcgatgaa gttcttatcc ccgcaccgga ctacccactg tggactgccg 120 caacctccct ggctggtggt aagcctgtgc actacctctg tgatgaggaa gatgactgga 180 acccatccat cgaagacatc aagtccaaaa tctcagagaa aaccaaagct attgtggtga 240 tcaaccccaa caaccccacg ggagctgtct acccgcgccg ggtgttggaa caaatcgtcg 300 agattgcacg cgagcatgac ctgctgattt tggccgatga aatctacgac cgcattctct 360 acgatgatgc cgagcacatc agcctggcaa cccttgcacc agatctcctt tgcatcacat 420 acaacggtct atccaaggca taccgcgtcg caggataccg agctggctgg atggtattga 480 ctggaccaaa gcaatacgca cgtggattta ttgagggcct cgaactcctc gcaggcactc 540 gactctgccc aaatgtccca gctcagcacg ctattc 576 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 gtgacttcta gaaagcgcaa aacc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 ctactgcttg taagtggaca ggaa 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 ttgatgatgt gttcttaggc aacg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 gaatagcgtc gtgagctggg acat 24

Claims

코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase: aat) 유전자를 파괴하기 위한 용도로 제작된 aat 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 2의 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase: aat) 유전자 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase: aat) 유전자를 파괴하기 위한 용도로 제작된 aat 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
제3항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 유래의 미생물임을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제3항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(CF3224-0412) KCCM-10636 임을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 형질전환 미생물을 L-라이신을 생성하기에 직절한 조건 하에서 배양한 후 L-라이신을 회수함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법.