RU2247778C2 - Способ ферментативного получения l-аминокислоты с использованием коринеформных бактерий - Google Patents

Способ ферментативного получения l-аминокислоты с использованием коринеформных бактерий Download PDF

Info

Publication number
RU2247778C2
RU2247778C2 RU2000103965/13A RU2000103965A RU2247778C2 RU 2247778 C2 RU2247778 C2 RU 2247778C2 RU 2000103965/13 A RU2000103965/13 A RU 2000103965/13A RU 2000103965 A RU2000103965 A RU 2000103965A RU 2247778 C2 RU2247778 C2 RU 2247778C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
amino acids
bacteria
glutamate dehydrogenase
medium
corynebacteria
Prior art date
Application number
RU2000103965/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2000103965A (ru
Inventor
Ахим МАРКС (DE)
Ахим МАРКС
Беттина МЁККЕЛЬ (DE)
Беттина МЁККЕЛЬ
Вальтер ПФЕФФЕРЛЕ (DE)
Вальтер ПФЕФФЕРЛЕ
Германн ЗАМ (DE)
Германн ЗАМ
Алберт ДЕ-ГРАФ (NL)
Алберт ДЕ-ГРАФ
Лотар ЭГГЕЛИНГ (DE)
Лотар ЭГГЕЛИНГ
Original Assignee
Дегусса Аг
Форшунгсцентрум Йюлих Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19907347A external-priority patent/DE19907347A1/de
Application filed by Дегусса Аг, Форшунгсцентрум Йюлих Гмбх filed Critical Дегусса Аг
Publication of RU2000103965A publication Critical patent/RU2000103965A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2247778C2 publication Critical patent/RU2247778C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01002—Glutamate dehydrogenase (1.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. L-аминокислоты, такие как L-треонин, L-изолейцин, L-валин, L-триптофан и L-гомосерин получают путем ферментации с использованием коринебактерий, в которых сверхэкспрессируют нуклеотидную последовательность, кодирующую глютаматдегидрогеназу. Данное изобретение позволяет увеличить выход указанных аминокислот. 8 з.п. ф-лы, 6 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к способу ферментативного получения L-аминокислот с использованием коринебактерий, в которых усиливают ген глютаматдегидрогеназы.
Предпосылки создания изобретения
L-аминокислоты находят применение в кормах для животных, медицине и в фармацевтической промышленности.
L-аминокислоты получают ферментативным путем с использованием продуцирующих L-аминокислоты штаммов коринебактерий, прежде всего с использованием Corynebacterium glutamicum. Поскольку эта группа продуктов имеет большое значение, постоянно ведутся работы по совершенствованию способа их получения. Усовершенствования способа могут касаться технических сторон процесса ферментации, таких как, например, перемешивание и обеспечение кислородом, или состава питательных сред, например, концентрации сахара в процессе ферментации, или обработки продукта, например, с помощью ионообменной хроматографии, или присущей микроорганизму продуктивности.
Для улучшения продуктивности микроорганизмов применяют методы мутагенеза, селекции и отбора мутантов. Таким путем получают штаммы, которые обладают устойчивостью к антиметаболитам, таким как, например, аналог лизина 8-(2-аминоэтил)цистеин, или которые являются ауксотрофами в отношении обладающих регуляторной функцией аминокислот и продуцируют L-аминокислоты.
В течение ряда лет для улучшения продуцирующих L-аминокислоты штаммов Corynebacterium glutamicum также применяют методы рекомбинантной ДНК, с помощью которых амплифицируют отдельные гены биосинтеза и исследуют влияние на продуцирование L-аминокислот. Обзор работ в этой области можно найти среди прочего у Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria" в Biology of Industrial Microorganisms, под ред. Demain и Solomon, изд-во Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142), у Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), у Jetten и Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)), и у Sahm и др. (Annuals of the New York Academy of Sciences 782, 25-39 (1996)).
Фермент глютаматдегидрогеназа катализирует восстановительное аминирование α -кетоглутаровой кислоты с образованием глутаминовой кислоты. Во французской выложенной заявке на патент 2575492 описан фрагмент ДНК из штамма Corynebacterium melassecola 801, несущий ген глютаматдегидрогеназы. В заявке рассматривается возможность его применения с целью повысить продуцирование глутаминовой кислоты при ферментации с использованием Corynebacterium melassecola. Нуклеотидная последовательность гена глютаматдегидрогеназы штамма Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 описана у Bormann и др. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)). Нуклеотидная последовательность гена глютаматдегидрогеназы Peptostreptococcus asaccharolyticus описана у Snedecor и др. (Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)).
Задача изобретения
Задачей изобретения является разработка новых подходов по усовершенствованию способа ферментативного получения других L-аминокислот.
Описание изобретения
L-аминокислоты находят применение в кормах для животных, медицине и в фармацевтической промышленности. Поэтому большой интерес представляет разработка нового улучшенного способа получения L-аминокислот.
Если в дальнейшем упоминаются L-аминокислоты, то при этом подразумеваются такие образующие протеин аминокислоты, как L-лизин, L-треонин, L-изолейцин, L-валин, L-пролин, L-триптофан и при определенных условиях их соли, а также L-гомосерин, прежде всего L-лизин, L-треонин и L-триптофан.
Объектом изобретения является способ ферментативного получения L-аминокислот с использованием коринебактерий, прежде всего тех, которые уже продуцируют соответствующие L-аминокислоты и в которых усиливают прежде всего сверхэкспрессируют, нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент глютаматдегидрогеназу.
Предпочтительные варианты осуществления приведены в формуле изобретения.
В контексте настоящего описания понятие "усиление" обозначает повышение в микроорганизме внутриклеточной активности одного или нескольких ферментов, кодируемых соответствующей ДНК, за счет, например, увеличения количества копий гена, соответственно генов, использования более сильного промотора или гена, кодирующего соответствующий фермент с высокой активностью, и при необходимости комбинации этих мер.
Микроорганизмы, являющиеся объектом настоящего изобретения, могут продуцировать L-аминокислоты из глюкозы, сахарозы, лактозы, фруктозы, мальтозы, мелассы, крахмала, целлюлозы или из глицерина и этанола. Они могут включать представителей коринебактерий, прежде всего из рода Corynebacterium. В роде Corynebacterium следует прежде всего отметить вид
Corynebacterium glutamicum, который, как известно специалистам, обладает способностью продуцировать L-аминокислоты.
Пригодными штаммами бактерий р. Corynebacterium, прежде всего вида Corynebacterium glutamicum, являются следующие известные штаммы дикого типа:
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
Brevibacterium flavum ATCC 14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 и
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
и полученные из них мутанты, соответственно штаммы, как, например, продуцирующие L-лизин штаммы:
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708 и
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,
или продуцирующие L-треонин штаммы:
Corynebacterium glutamicum FERM-P 5835
Brevibacterium flavum FERM-P 4164 и
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4180,
или продуцирующие L-изолейцин штаммы:
Corynebacterium glutamicum FERM-P 756
Brevibacterium flavum FERM-P 759 и
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4192,
или продуцирующие L-валин штаммы:
Brevibacterium flavum FERM-P 512 и
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1845,
и продуцирующие L-триптофан штаммы:
Corynebacterium glutamicum FERM-BP 478
Brevibacterium flavum FERM-BP 475 и
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 7127.
При создании изобретения было установлено, что в результате сверхэкспрессии L-глютаматдегидрогеназы повышается эффективность синтеза коринебактериями L-аминокислот, при этом под объем настоящего изобретения не подпадает L-глутаминовая кислота.
Согласно изобретению, может применяться ген глютаматдегидрогеназы из С.glutamicum, описанный Bormann и др. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)). Кроме того, пригодным является ген глютаматдегидрогеназы из других микроорганизмов, как, например, из Peptostreptococcus asaccharolyticus, описанный у Snedecor и др. (Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)). Кроме того, могут применяться аллели указанных генов, которые получают учитывая вырожденность генетического кода или с помощью функционально нейтральных смысловых мутаций.
Для достижения сверхэкспрессии может быть увеличено количество копий соответствующего гена или могут быть вызваны мутации в промоторной и регуляторной областях, расположенных против хода транскрипции относительно структурного гена. Таким же образом действуют кассеты экспрессии, встроенные против хода транскрипции относительно структурного гена. Кроме того, в процессе ферментативного продуцирования L-аминокислот экспрессию можно дополнительно повысить с помощью индуцибельных промоторов. Экспрессия также может быть усилена за счет увеличения продолжительности жизни мРНК. Кроме того, ферментативная активность также может быть усилена путем ингибирования разложения протеинов ферментов. При этом гены или генные конструкции либо могут находиться в различном количестве копий в плазмидах, либо их интегрируют в хромосомы и амплифицируют. В альтернативном варианте сверхэкспрессия рассматриваемых генов также может быть достигнута путем изменения состава среды и условий культивирования.
Соответствующие рекомендации можно найти у Martin и др., (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), у Guerrero и др., (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya и Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), у Eikmanns и др., (Gene 102, 93-98 (1991)), в заявке ЕР-А 0472869, в патенте US 4601893, у Schwarzer и Punier (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), у Reinscheid и др., (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), у LaBarre и др., (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), в заявке WO 96/15246, у Jensen и Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), у Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) и в известных учебниках и справочниках по генетике и молекулярной биологии.
Примерами плазмид, с помощью которых можно сверхэкспрессировать глютаматдегидрогеназу, являются pEK1,9gdh-1 и pEKExpgdh, содержащиеся в штаммах ATCC13032/pEK1,9gdh-1 и DH5α /pEKExpgdh. Плазмида pEK1,9gdh-1 представляет собой бифункциональный вектор, содержащий зависящий от НАДФ ген глютаматдегидрогеназы из С. glutamicum. Плазмида pEKExpgdh представляет собой бифункциональный вектор, содержащий зависящий от НАД ген глютаматдегидрогеназы из Peptostreptococcus asaccharolyticus.
Для продуцирования соответствующей L-аминокислоты может оказаться целесообразным наряду с глютаматдегидрогеназой дополнительно сверхэкспрессировать один или несколько ферментов, участвующих в пути биосинтеза соответствующей аминокислоты. Так, например, можно
- для повышения продуктивности продуцирующих L-лизин коринебактерий дополнительно сверхэкспрессировать ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу (ЕР-В 0197335),
- для повышения продуктивности продуцирующих L-валин коринебактерий дополнительно сверхэкспрессировать ген, кодирующий (ацетооксикислота)-синтазу (ЕР-В 0356739),
- для повышения продуктивности продуцирующих L-триптофан коринебактерий дополнительно сверхэкспрессировать ген, кодирующий (антраниловая кислота)-фосфорибозилтрансферазу (ЕР-В 0124048),
- для повышения продуктивности продуцирующих L-гомосерин, либо L-треонин, либо L-изолейцин коринебактерий дополнительно сверхэкспрессировать ген, кодирующий гомосериндегидрогеназу (ЕР-В 0131171).
Кроме того, для продуцирования соответствующей L-аминокислоты может оказаться целесообразным наряду со сверхэкспрессией глютаматдегидрогеназы исключить нежелательные побочные реакции (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", Overproduction of Microbial Products, под ред. Krumphanzl, Sikyta, Vanek, изд-во Academic Press, London, UK, 1982).
Для продуцирования L-аминокислот созданные согласно изобретению микроорганизмы можно культивировать непрерывно или периодически с использованием периодического процесса (культивирование партий), либо периодического процесса с подпиткой, либо периодического процесса с повторяющейся подпиткой. Обзор известных способов культивирования представлен в учебнике Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (изд-во Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) или в учебнике Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (изд-во Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
Используемая культуральная среда должна быть адаптирована к требованиям конкретного штамма микроорганизма. Описания культуральных сред для различных микроорганизмов содержатся в справочнике "Manual of Methods for General Bacteriology" Американского общества бактериологии (Washington D.C., США, 1981). В качестве источника углерода могут быть использованы сахара и углеводы, например, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, например, такие как соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, например, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, например, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, например, такие как уксусная кислота. Эти вещества могут применяться по отдельности или в виде смеси. В качестве источника азота могут применяться органические азотсодержащие соединения, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкость, образующаяся после замачивания зерен кукурузы до разбухания, соевая мука и мочевина, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота могут применяться по отдельности или в виде смеси. В качестве источника фосфора могут применяться кислый фосфат калия или дикалийгидрофосфат либо соответствующие натриевые соли. Кроме того, культуральная среда должна содержать соли металлов, например, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. И, наконец, в дополнение к вышеназванным соединениям могут использоваться такие важные для роста вещества, как аминокислоты и витамины. Кроме того, в культуральную среду могут быть добавлены соответствующие предшественники. Вышеуказанные добавки могут быть введены в культуральную среду в виде одноразовой добавки или добавляться соответствующим образом в процессе культивирования.
Для контроля значения рН культуральной среды используют соответственно либо основания, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, либо кислоты, такие как фосфорная кислота или серная кислота. Для контроля пенообразования добавляют антивспениватели, например, такие как полигликолевые эфиры жирных кислот. Для поддержания стабильности плазмид могут быть добавлены соответствующие конкретной среде вещества, обладающие избирательным действием, например антибиотики. Для поддержания аэробных условий в культуру вводят кислород или содержащие кислород газовые смеси, например такие как воздух. Температура культуральной среды в норме находится в диапазоне от 20° С до 45° С и предпочтительно от 25° С до 40° С. Культивирование продолжают до тех пор, пока не образуется максимальное количество целевой L-аминокислоты. Как правило, на это требуется от 10 до 160 ч.
Анализ L-аминокислот можно проводить автоматически с помощью анионообменной хроматографии с последующей дериватизацией с использованием нингидрина по методу, описанному у Spackman и др. (Analytical Chemistry, 30, 1190 (1958)).
В соответствии с Будапештским договором в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zeilkulturen (DSMZ, Braunschweig, Германия)) депонированы следующие микроорганизмы:
- штамм Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pEK1,9gdh-1 под регистрационным номером DSM 12614;
- штамм Escherichia coli K-12 DH5α /pEKExpgdh под регистрационным номером DSM 12613.
Примеры
Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах.
Для этой цели с использованием перечисленных ниже продуцирующих аминокислоты штаммов проводили опыты, в которых были подтверждены преимущества способа по изобретению:
а) продуцирующий L-лизин штамм Corynebacterium glutamicum DSM5715 (ЕР-В 0435132),
б) продуцирующий L-треонин и L-изолейцин штамм Brevibacterium flavum DSM5399 (ЕР-В 0385940) и
в) продуцирующий L-валин, нуждающийся в изолейцине штамм АТСС13032Δ ilvА, депонированный в соответствии с Будапештским договором в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг (Германия) под регистрационным номером DSM12455.
Пример 1
Получение продуцирующих L-аминокислоты штаммов с усиленной глютаматдегидрогеназой
Плазмида pEK1,9gdh-1 соответствует плазмиде pEK1,9gdh, описанной Bormann и др. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)). Ее выделяли из штамма ATCC13032/pEK1,9gdh-1. Аналогичным образом известную плазмиду pEKExpgdh (Marx и др., Metabolic Engineering I, 35-48 (1999)), которая несет ген глютаматдегидрогеназы из Peptostreptococcus asaccharolyticus (Snedecor и др., Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)), выделяли из штамма Е.coli DH5a/pEKExpgdh.
Штаммы DSM5715, DSM5399 и ATCC13032Δ ilvA трансформировали плазмидой pEK1,9gdh-1 по методу, описанному у Liebl и др. (FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)). Отбор трансформантов осуществляли на агаре со средой, используемой для инфузии в мозг и сердце, фирмы Merck (Darmstadt, Германия), дополненной 50 мг/л канамицина. Таким путем получали штаммы DSM5715/pEK1,9gdh-1, DSM5399/pEK1,9gdh-1 и ATCC13032Δ ilvA/pEK1,9gdh-1. Аналогичным образом штамм DSM5715 трансформировали плазмидой pEKExpgdh и получали штамм DSM5715/pEKExpgdh.
Пример 2
Получение L-лизина
Штамм DSM5715/pEK1,9gdh-1 предварительно культивировали в комплексной среде 2TY, состоящей из 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl. Для этого в 60 мл среды 2TY, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 2 дефлекторами, с помощью петли для посева вносили штамм и культуру инкубировали в течение 12 ч при 150 об/мин и 30° С.
Предварительную культуру, предназначенную для инокуляции 60 мл среды, в которой получали продукт и которая содержалась в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 2 дефлекторами, центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин в мини-центрифуге типа Sepatech Minifuge RF (фирма Heraeus, Hanau, Германия). Надосадочную жидкость отбрасывали и дебрис ресуспендировали в 1 мл среды для получения продукта. Аликвотное количество этой суспензии клеток добавляли в среду, в которой получают продукт, так чтобы оптическая плотность ОП600 составляла приблизительно 2,0. В качестве среды, в которой получают продукт, применяли описанную у Keilhauer и др. (Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)) среду CGXII с рН 7,0 (таблица 1), дополненную 20 г/л глюкозы, 350 мг/л лейцина и 50 мг/л моносульфата канамицина. Культуры инкубировали в течение 72 ч при 30° С и 150 об/мин.
Ингредиент Концентрация на 1 л
(NH4)2SO4 20 г
мочевина 5 г
КН2РO4 1 г
К2НРO4 1 г
MgSO4· 7H2O 0,25 г
3-морфолинпропансульфоновая кислота 42 г
FeSO4· 7H2O 10 мг
MnSO4· H2O 10 мг
ZnSO4· 7H2O 1 мг
CuSO4 0,2 мг
Ингредиент Концентрация на 1 л
NiCl2· 6H2O 0,02 мг
CaCl2 10 мг
протокатеховая кислота 0,03 мг
биотин 200 мкг
После этого определяли оптическую плотность (ОП) (прибор типа Biochrom Novaspec 4049, фирма LKB Instrument GmbH, Grafelfing, Германия) при длине волны 600 нм и концентрацию образовавшегося L-лизина с помощью анализатора аминокислот фирмы Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Германия) с использованием ионообменной хроматографии и реакции на последующих колонках с обнаружением нингидрином. В таблице 2 представлены результаты опыта.
Штамм ОП L-лизин, г/л
DSM5715 16,5 4,5
DSM5715/pEK1,9gdh-1 19,4 6,2
Пример 3
Получение L-треонина и L-изолейцина
Штамм DSM5399/pEK1,9gdh-l предварительно культивировали в полной среде CgIII (Kase и Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9), 1611-1621 (1972)) с добавлением 50 мкг/мл канамицина. Для этого в 10 мл среды CgIII, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 100 мл с 4 дефлекторами, с помощью петли для посева вносили штамм и культуру инкубировали в течение 16 ч при 240 об/мин и 30° С.
Определяли ОП (при длине волны 660 нм) предварительной культуры, предназначенной для инокуляции 10 мл среды, в которой получали продукт и которая содержалась в колбе Эрленмейера объемом 100 мл с 4 дефлекторами. Основную культуру засевали до получения значения ОП, равного 0,1. В качестве среды, в которой получают продукт, применяли описанную у Keilhauer и др. (Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)) среду CgXII. Состав этой среды представлен в примере 2. Добавляли 4% глюкозы и 50 мг/л сульфата канамицина. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 33° С, 250 об/мин и 80%-ной влажности воздуха.
После этого аналогично методу, описанному в примере 2, определяли оптическую плотность при 660 нм и концентрацию образовавшихся L-треонина и L-изолейцина. В таблице 3 представлены результаты опыта.
Штамм ОП L-треонин L-изолейцин
DSM5399 10,5 1,77 1,05
DSM5399/pEK1,9gdh-1 11,0 2,26 1,44
Пример 4
Получение L-валина
Штамм ATCC13032Δ ilvA/pEK1,9gdh-1 предварительно культивировали в полной среде CgIII (Kase и Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9), 1611-1621 (1972)) с добавлением 50 мкг/мл канамицина. Для этого в 50 мл среды CgIII, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 4 дефлекторами, с помощью петли для посева вносили штамм и культуру инкубировали в течение 16 ч при 140 об/мин и 30° С.
Определяли ОП (при длине волны 660 нм) предварительной культуры, предназначенной для инокуляции 60 мл среды, в которой получали продукт и которая содержалась в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 4 дефлекторами. Основную культуру центрифугировали и отбрасывали надосадочную жидкость. Дебрис разбавляли в 5 мл среды, в которой получали продукт, и основную среду засевали до получения значения ОП, равного 0,3. В качестве среды для получения продукта применяли среду CgXII (Keilhauer и др.. Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)), как описано в примере 3 (с добавлением 4% глюкозы). Клетки инкубировали в течение 48 ч при 30° С и 150 об/мин.
После этого аналогично методу, описанному в примере 2, определяли оптическую плотность при 660 нм и концентрацию образовавшегося L-валина. В таблице 4 представлены результаты опыта.
Штамм ОП L-валин, г/л
ATCC13032Δ ilvA 18,5 0,29
ATCC13032Δ ilvA/pEK1,9gdh-1 17,6 0,45
Пример 5
Получение L-лизина, L-валина и L-аланина
Штамм DSM5715/pEKExpgdh предварительно культивировали в комплексной среде 2TY, состоящей из 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl. Для этого в 60 мг среды 2TY, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 2 дефлекторами, с помощью петли для посева вносили штамм и культуру инкубировали в течение 12 ч при 150 об/мин и 30° С.
Для инокуляции 60 мл среды для получения продукта, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 2 дефлекторами, предварительную культуру центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин в мини-центрифуге типа Sepatech Minifuge RF (фирма Heraeus, Hanau, Германия). Надосадочную жидкость отбрасывали и дебрис ресуспендировали в 1 мл среды для получения продукта. Аликвотное количество этой суспензии клеток добавляли в среду для получения продукта, так чтобы оптическая плотность ОП600 составляла приблизительно 0,4. В качестве среды для получения продукта применяли описанную у Schrumpf и др. (Journal of Bacteriology 173, 4510-4516 (1991)) среду CGC (таблица 5), дополненную 25 г/л глюкозы, 350 мг/л лейцина и 42 мг/л 3-морфолинпропансульфоновой кислоты и 50 мг/л моносульфата канамицина с рН 7. Культуры инкубировали в течение 30 ч при 30° С и 150 об/мин.
Ингредиент Концентрация на 1 л
(NH4)2SO2, 5 г
мочевина 5 г
КН2РO4 0,5 г
К2НРO4 0,5 г
MgSO4· 7H2O 0,25 г
FeSO4· 7H2O 10 мг
MnSO4· H2O 10 мг
ZnSO4· 7H2O 1 мг
CuSO4 0,2 мг
NiCl2· H2O 0,02 мг
CaCl2· 2H2O 10 мг
биотин 200 мкг
После этого определяли оптическую плотность (ОП) (прибор типа Biochrom Novaspec 4049, фирма LKB Instrument GmbH, Grafelfing, Германия) при длине волны 600 нм и концентрацию образовавшихся L-аланина, L-лизина и L-валина с помощью анализатора аминокислот фирмы Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Германия) с использованием ионообменной хроматографии и реакции на последующих колонках с обнаружением нингидрином. В таблице 6 представлены результаты опыта.
Штамм ОП L-аланин, г/л L-лизин,г/л L-валин, г/л
DSM5715 29,4 следы 1,6 0,1
DSM5715/pEKExpgdh 19,4 0,6 2,1 0,6

Claims (9)

1. Способ получения L-аминокислот путем ферментации с использованием коринебактерий, отличающийся тем, что применяют бактерии, которые продуцируют одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, включающей L-треонин, L-изолейцин, L-валин, L-триптофан и L-гомосерин, и в которых усиливают, прежде всего сверхэкспрессируют, нуклеотидную последовательность, кодирующую глютаматдегидрогеназу.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что продуцируемая применяемыми бактериями глютаматдегидрогеназа зависит от НАДФ.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что продуцируемая применяемыми бактериями глютаматдегидрогеназа зависит от НАД.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что применяют бактерии, в которых дополнительно усиливают остальные гены путем биосинтеза требуемых L-аминокислот.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что применяют бактерии, в которых, по крайней мере, частично выключают пути биосинтеза, которые ингибируют образование требуемой (ых) L-аминокислоты (т).
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что применяют штамм, трансформированный векторной плазмидой, причем векторная плазмида несет нуклеотидную последовательность, кодирующую глютаматдегидрогеназу.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что применяют бактерии, трансформированные плазмидным вектором pEK1, 9gdh-1, депонированным в Corynebacterium glutamicum под регистрационным номером DSM 12614.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что применяют бактерии, трансформированные плазмидным вектором рЕКExpgdh, депонированным в E.coli под регистрационным номером DSM 12613.
9. Способ ферментативного получения L-аминокислот по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
а) ферментацию с использованием продуцирующих L-аминокислоту(ы) бактерий, в которых усиливают, по крайней мере, ген глютаматдегидрогеназы,
б) накопление требуемой (ых) L-аминокислоты (т) в среде или в клетках бактерий и
в) выделение L-аминокислоты (т).
RU2000103965/13A 1999-02-20 2000-02-18 Способ ферментативного получения l-аминокислоты с использованием коринеформных бактерий RU2247778C2 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19907347A DE19907347A1 (de) 1999-02-20 1999-02-20 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE19907347.3 1999-02-20
US09/324,940 1999-06-03
US09/324,940 US6355454B1 (en) 1999-02-20 1999-06-03 Process for the fermentative production of L-amino acids using coryneform bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2000103965A RU2000103965A (ru) 2002-04-27
RU2247778C2 true RU2247778C2 (ru) 2005-03-10

Family

ID=26051968

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2000103965/13A RU2247778C2 (ru) 1999-02-20 2000-02-18 Способ ферментативного получения l-аминокислоты с использованием коринеформных бактерий

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP1029919B1 (ru)
JP (1) JP2000236893A (ru)
CN (1) CN1222622C (ru)
AT (1) ATE263246T1 (ru)
AU (1) AU770187B2 (ru)
BR (1) BRPI0000897B1 (ru)
CA (1) CA2299105A1 (ru)
ES (1) ES2218009T3 (ru)
HU (1) HUP0000747A2 (ru)
ID (1) ID24801A (ru)
RU (1) RU2247778C2 (ru)
SK (1) SK1942000A3 (ru)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651461C2 (ru) * 2013-10-11 2018-04-19 СиДжей ЧЕИЛДЗЕДАНГ КОРП. Способ получения l-аминокислот
RU2675506C2 (ru) * 2013-06-03 2018-12-20 Эвоник Дегусса Гмбх Способ получения l-лейцина, l-валина, l-изолейцина, альфа-кетоизовалерата, альфа-кето-бета-метилвалерата или альфа-кетоизокапроата с использованием рекомбинантных коринебактерий, содержащих оперон ilvbn, который можно индуцировать пропионатом
RU2697005C2 (ru) * 2013-10-11 2019-08-08 СиДжей ЧЕИЛДЗЕДАНГ КОРП. Способ получения l-аминокислот
RU2732338C1 (ru) * 2018-09-28 2020-09-15 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Микроорганизм для получения L-аминокислоты с повышенной активностью α-глюкозидазы и способ получения L-аминокислоты с его использованием
RU2793440C1 (ru) * 2021-01-28 2023-04-03 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Новый вариант белка и способ получения L-валина с его применением

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3965821B2 (ja) * 1999-03-09 2007-08-29 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
AU2001282132A1 (en) * 2000-09-12 2002-03-26 Degussa A.G. Isolation and sequencing of the pknb gene of c. glutamicum
US6939692B2 (en) 2000-09-12 2005-09-06 Degussa Ag Nucleotide sequences coding for the pknB gene
DE10045496A1 (de) * 2000-09-14 2002-03-28 Degussa Neue für das ptsi-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE102004037572A1 (de) * 2004-08-03 2006-02-23 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
JP2010017081A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
DE102006050489A1 (de) 2006-10-26 2008-04-30 Evonik Degussa Gmbh Allele des prpD1-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102006054202A1 (de) * 2006-11-17 2008-05-21 Evonik Degussa Gmbh Allele des oxyR-Gens aus coryneformen Bakterien
CN101565723B (zh) * 2009-05-25 2011-06-01 河南孟成生物药业股份有限公司 一种l-色氨酸的发酵生产工艺
CN102653736A (zh) * 2012-04-12 2012-09-05 大连大学 微生物发酵生产谷氨酸脱氢酶的方法
CN103184247A (zh) * 2013-04-08 2013-07-03 绍兴市安杰生物科技有限公司 一种l-赖氨酸联产l-乳酸的方法
CN105505894A (zh) * 2014-09-24 2016-04-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶突变体及其应用
CN105506014B (zh) * 2015-12-23 2019-02-12 湖南宝利士生物技术有限公司 高光学纯l-高丝氨酸及其衍生物的生物合成方法
CN109337854B (zh) * 2018-11-19 2020-11-03 南京工业大学 一株敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN111197014B (zh) * 2020-04-01 2022-11-08 宜昌三峡普诺丁生物制药有限公司 谷氨酸棒状杆菌诱变菌株及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2575492B1 (fr) * 1984-12-27 1988-09-16 Asahi Chemical Ind Fragment d'adn contenant un gene codant pour la glutamate deshydrogenase, adn recombinant le contenant, et microorganisme contenant l'adn recombinant
GB2223754B (en) * 1988-09-12 1992-07-22 Degussa Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase
DE3943117A1 (de) * 1989-12-27 1991-07-04 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna
FI980551A (fi) * 1998-03-11 1999-09-12 Valtion Teknillinen Transformoidut mikro-organismit, joilla on parannettuja ominaisuuksia

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BORMANN et al. Molecular analysis of the Corynebacterium glutamicum gdh gene encoding glutamate dehydrogenase, Molecular microbiology vol.6, №3, 1992, р.317-326. NAKAYAMA "Breeding of Amino Acid Prodycing Microorganisms", Overproduction of Microbial Products, под ред. Krumphanzl, Academic Press, 1982. MARX et al. Response of the central metabolism in Corynebacterium glutamicum to the use of an NADH-dependent glutamate dehydrogenase, Metab Eng. 1999 Jan; 1(1): 35-48. *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2675506C2 (ru) * 2013-06-03 2018-12-20 Эвоник Дегусса Гмбх Способ получения l-лейцина, l-валина, l-изолейцина, альфа-кетоизовалерата, альфа-кето-бета-метилвалерата или альфа-кетоизокапроата с использованием рекомбинантных коринебактерий, содержащих оперон ilvbn, который можно индуцировать пропионатом
RU2651461C2 (ru) * 2013-10-11 2018-04-19 СиДжей ЧЕИЛДЗЕДАНГ КОРП. Способ получения l-аминокислот
RU2697005C2 (ru) * 2013-10-11 2019-08-08 СиДжей ЧЕИЛДЗЕДАНГ КОРП. Способ получения l-аминокислот
RU2732338C1 (ru) * 2018-09-28 2020-09-15 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Микроорганизм для получения L-аминокислоты с повышенной активностью α-глюкозидазы и способ получения L-аминокислоты с его использованием
RU2793468C1 (ru) * 2021-01-26 2023-04-04 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Новый вариант тетрагидродипиколинат-n-сукцинилтрансферазы и способ получения l-валина с его применением
RU2793440C1 (ru) * 2021-01-28 2023-04-03 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Новый вариант белка и способ получения L-валина с его применением
RU2795162C1 (ru) * 2021-04-07 2023-04-28 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Новый вариант регулятора транскрипции WHCA семейства WHIB и способ получения L-валина с его применением

Also Published As

Publication number Publication date
AU770187B2 (en) 2004-02-12
ES2218009T3 (es) 2004-11-16
ID24801A (id) 2000-08-24
CN1266905A (zh) 2000-09-20
HUP0000747A2 (en) 2002-09-28
HU0000747D0 (en) 2000-04-28
JP2000236893A (ja) 2000-09-05
ATE263246T1 (de) 2004-04-15
BR0000897A (pt) 2001-05-02
SK1942000A3 (en) 2000-09-12
BRPI0000897B1 (pt) 2016-11-22
CN1222622C (zh) 2005-10-12
EP1029919A3 (de) 2001-11-07
CA2299105A1 (en) 2000-08-20
EP1029919B1 (de) 2004-03-31
EP1029919A2 (de) 2000-08-23
AU1760000A (en) 2000-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2247778C2 (ru) Способ ферментативного получения l-аминокислоты с использованием коринеформных бактерий
RU2264461C2 (ru) Способ получения l-лизина
US6355454B1 (en) Process for the fermentative production of L-amino acids using coryneform bacteria
SK10202000A3 (sk) Koryneformn baktrie produkujce l-lyzn a spsob vroby lyznu
US20060014259A9 (en) Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
US7144724B2 (en) Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryneform bacteria
US7759056B2 (en) Nucleotide sequence encoding the dapC gene and process for the production of L-lysine
AU2236900A (en) Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryeform
US6379934B1 (en) Process for the fermentative preparation of L-amino acids using coryneform bacteria
SK16542001A3 (sk) Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu gnd
US20020028490A1 (en) Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryneform bacteria
US20030087400A1 (en) Process for the fermentative production of L-lysine using coryneform bacteria
SK16192001A3 (sk) Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu tkt
EP1709166A1 (en) Process for the preparation of l-amino acids with amplification of the zwf gene
KR100645769B1 (ko) 에이에스피 에이 유전자가 파괴된 코리네박테리움을 이용한엘-라이신의 제조방법
US20020127662A1 (en) Process for the fermentative preparation of L-glutamic acid using coryneform bacteria
MXPA00001638A (en) Process for the fermentative production of l-amino acids using coryneform bacteria
MXPA00002332A (es) Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos utilizando bacterias coreniformes
MXPA00004870A (en) Process for the fermentative preparation of l-amino acids using coryneform bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20041220