SK16192001A3 - Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu tkt - Google Patents

Description

Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu tkt

Oblasť techniky

Predmetom vynálezu je spôsob fermentačnej prípravy L-lyzínu, L-treonínu a L-izoleucínu použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje aspoň gén tkt.

Doterajší stav techniky

L-Lyžín, L-treonín a L-izoleucín sa používajú vo výžive zvierat, v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle.

Je známe, že tieto aminokyseliny sa pripravujú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä Corynebacteriuir. glutamicum. Kvôli ich velkému významu sa stále pracuje na zlepšení týchto preparačných spôsobov. Zlepšenia spôsobov sa · môžu týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom, alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných produkčných vlastností samotného mi kroorgani zrnu.

Na zlepšenie produkčných vlastností týchto mikroorgani;:mov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutantov. Týmto spôsobom sa získavajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analóg treonínu kyselina a-amino-p-hydroxyvalérová (AHV), alebo sú auxotrofné vzhladom na regulačné významné metabolity a produkujú L-aminokyseliny, ako napríklad L-treonín.

F ΓΓ f • f r- r

OF r r r « » r r » · r r ^r

Už niekoľko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na kmeňové zlepšenie kmeňa Corynebacterium glutamicum produkujúceho L-aminokyseliny.

Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové základy zlepšených postupov fermentačnej prípravy L-lyzínu, L-treonínu a L-izoleucínu pomocou koryneformných baktérií.

L-Lyzín, L-treonín a L-izoleucín sa používajú v humánnej medicíne, vo farmaceutickom'priemysle, v potravinárskom priemysle a najmä vo výžive zvierat. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov prípravy týchto aminokyselín.

Keď sa v nasledovnom texte uvedú L-aminokyseliny, mien: sa tým L-lyzín, L-treonín a L-izoleucín.

• Podstata vynálezu

Vynález poskytuje spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje, najmä zvýšene exprimuje nukleotidová sekvencia kódujúca enzým transketolázu (EC 2.2.1.1) (gén tkt) .

Použité kmene prednostne už produkujú L-aminokyseliny pred zosilnením génu tkt.

Prednostné uskutočnenia sa nachádzajú v patentových nárokoch.

Pojem „zosilnenie opisuje v tejto súvislosti zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA, napríklad zvýšením počtu kópií génu alebo génov, použitím silného promótora alebo použitím génu, ktorý kóduje príslušný enzým s vysokou aktivitou a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.

Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať L-aminokyseliny z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Jedná sa o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.

Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad známe kmene divého typu

Corynebacterium glutamicum ATCC13032,

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,

Brevibacterium flavum ATCC14067,

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a z nich vytvorené mutanty produkujúce L-aminokyseliny, ako napríklad kmene produkujúce L-treonín

Corynebacterium glutamicum ATCC21649,

Brevibacterium flavum BB69,

Brevibacterium flavum DSM5399,

Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269,

Brevibacterium lactofermentum TBB-10 a napríklad kmene produkujúce L-izoleucín

Corynebacterium glutamicum ATCC 14309,

Corynebacterium glutamicum ATCC 14310, Corynebacterium glutami cum ATCC 14311, Corynebacterium glutamicum'ATCC 15168, Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 a napríklad kmene produkujúce L-lyzín

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709, Brevibacterium flavum FERM-P 1708, Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum DM58-1, Corynebacterium glutamicum D3M12866.

Zistilo sa, že koryneformné baktérie produkujú L-aminokyseliny zlepšeným spôsobom po zvýšenej expresii génu tkt, ktorý kóduje transketolázu (EC 2.2.1.1).

Nukleotidová sekvencia génu tkt je zverejnená pod prírastkovým číslom AB023377 v databáze European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heidelberg, Nemecko). Ikeda et a (Applied Microbiology and Biotechnology 51, 201-206 (1999) ďalej opisujú účinok zosilnenia génu tkt na tvorbu L-tryptofánu, L-tyrozínu a L-fenylalanínu. Gén tkt opísaný v texte uvedeného vyjadrenia sa môže použiť podlá vynálezu. Ďalej sa môžu použiť alely génu tkt, ktoré sú výsledkom degenerácie genetického kódu alebo sú spôsobené mutáciami neutrálnej funkcie so zmyslom.

Na dosiahnutie zosilnenia (t.j. zvýšenej expresie) sa napríklad zvýši počet kópií príslušných génov alebo sa mutuj promótorová a regulačná oblasť alebo miesto pre naviazanie ribozómov, ktoré sa nachádza v protismere štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom pôsobia expresívne kazety, ktoré sa vkladajú proti smeru štruktúrneho génu. Pomocou indukovatelných promótorov možno dodatočne zvýšiť expresiu v priebehu fermentačnej produkcie L-aminokyseliny. Opatreniami na predĺženie životnosti m-RNA sa expresia taktiež zlepšuje.

Ďalej sa enzýmová aktivita taktiež zvyšuje zabránením odbúravania enzýmového proteínu. Gény alebo génové konštrukty môžu buď existovať v plazmidoch s rozdielnym počtom kópií, alebo môžu byť v chromozóme integrované a amplifikované. Ďalej sa môže alternatívne dosiahnuť zvýšená expresia príslušných génov zmenou zloženia médií a zmenou postupu kultivácie.

Návody na to nájde odborník medzi iným v Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), v Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), v Eikmanns et al. (Gene 102^ 93-98 (1991)), v európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v US patente 4,601,893, v práci Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 8487 (1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), v LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), v patentovej prihláške WO 96/15246, v Malumbres et al. (Gene 134, 15 - 24 (1993)), v japonskom zverejnenom spise JP-A-10-229891, v práci Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie.

Transketoláza sa napríklad zvýšene exprimovala pomocou plazmidu. Na to sa použil kyvadlový vektor pEC-T18mob2 z E. coli - C. glutamicum znázornený na obrázku 1. Po vložení génu tkt do pEC-Tl8mob2 a následnej korekcii orientácie fragmentu DNA nesúceho gén tkt sa vytvoril plazmid pMS82B znázornený na obrázku 3.

» ·

Taktiež sa môžu použiť iné plazmidové vektory, ktoré sú schopné replikácie v C. glutamicum, ako je napríklad pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) alebo pZ8-l (EP-B- D

375 889).

Prídavné môže byť pre produkciu L-aminokyselín výhodné okrem génu tkt, ktorý kóduje transketolázu, zosilniť jeden alebo viac enzýmov príslušnej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky alebo prenosu aminokyselín.

Teda napríklad sa môže na produkciu L-treonínu súčasne zosilniť, najmä zvýšene exprimovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén hom kódujúci homoseríndehydrogenázu (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) alebo älela hom^dr kódujúca homoseríndehydrogenázu rezistentnú na spätnú väzbu (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991), • gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174:

6076-6086 (1992)), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Peters-Wendish et al., Microbiology 144: 915-927 (1998)), • gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), • gén zwf kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogenázu (JP-A09224661), • gén gnd kódujúci 6-fosfoglukonátdehydrogenázu (JP-A-9224662), • gén thrE kódujúci prenos treonínu (DE 199 41 478,5; DSM 12840), • gén zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115), • gén eno kódujúci enolázu (DE: 19947792.4).

Teda napríklad najmä na prípravu L-lyzínu sa môže súčasne zosilniť, prednostne zvýšene exprimovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu (EP-B 0 197 335), • gén lysC kódujúci aspartátkinázu rezistentnú na spätnú väzbu (Kalinowski et al., (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324), • gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns et al., (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Eikmanns et al., (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), • gén zwf kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogenázu (JP-A09224661), • súčasne gén gnd kódujúci 6-fosfoglukonátdehydrogenázu {JP-A-9-224662) , • súčasne gén lysE kódujúci prenos lyzínu (DE-A-195 48 222) , • súčasne gén zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115), • gén eno kódujúci enolázu (DE; 19947792.4).

Ďalej môže byť výhodné pre produkciu L-aminokyselín navyše k zosilneniu génu tkt súčasne zoslabiť jeden alebo viac génov zvolených zo súboru zahŕňajúceho:

• gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu (DE

199 50 409.1, DSM 13047), • gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu (US 09/396,478, DSM 12969), • gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu (DE 199 51 975.7, DSM 13114) , • gén zwa2 (DE 199 59 327.2; DSM 13113).

Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín okrem zvýšenej expresie transketolázy výhodné vylúčiť nežiaduce vedlajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms, in; Overproduction of Microbial Products, r r r ^ľ '

Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londýn,

Veľká Británia, 1982).

Mikroorganizmy vytvorené podľa vynálezu sa môžu na účely produkcie· L-aminokyselín kultivovať kontinuálnym spôsobom alebo spôsobmi diskontinuálnymi, či už vsádzkovou (batoh) kultiváciou alebo vsádzkovou kultiváciou s prítokom živín (ŕed batch) alebo vsádzkovou kultiváciou s opakovaným prídavkom živín (repeated fed· batch). Zhrnutie známych kultivačných metód je opísané v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. ’Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Biotechnológia 1. Úvod do biotechnológie, nakladateľstvo Gustáv Fischer, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periférne zariadenia, nakladateľstvo Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

Použité kultivačné médium musí patričným spôsobom vyhovovať nárokom príslušného mikroorganizmu. Opisy rôznych známych kultivačných médií pre mikroorganizmy sú uvedené V príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pre všeobecnú baktériológiu) vydaný Americkou bakteriologickou spoločnosťou (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, 1981. Ako zdroje uhlíka sa môžu použiť sacharidy, ako napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk; mastné kyseliny, ako napríklad kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy, ako napríklad glycerol a etanol, a organické kyseliny, ako napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu použiť buď jednotlivo, alebo v zmesi. Ako zdroje dusíka sa môžu použiť organické zlúčeniny obsahujúce dusík, ako napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múčka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a f · Γ dusičnan amónny. Tieto zdroje dusíka sa môžu použiť buď jednotlivo, alebo v zmesi. Ako zdroje fosforu možno použiť hydrogenfosforečnan alebo dihydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ktoré sú nutné na rast, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnatý. A napokon môže byť kultivačné médium okrem vyššie uvedených látok obohatené o esenciálne rastové látky, ako napríklad aminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu ešte pridať vhodné prekurzory. Uvedené východiskové látky sa môžu pridať do média jednorazovo na začiatku alebo vhodným spôsobom v priebehu kultivácie.

Na kontrolu pH v priebehu kultivácie sú vhodné zásadité zlúčeniny, ako napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, alebo kyslé zlúčeniny, ako napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Penenie kultivačnej zmesi možno kontrolovať prídavkom činidiel potláčajúcich tvorbu peny, ako sú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Stabilitu plazmidov možno udržiavať prostredníctvom vhodného selekčného činidla, napríklad antibiotika. Vhodné aeróbne podmienky možno udržiavať privádzaním kyslíka alebo zmesi plynov obsahujúcej kyslík, napríklad vzduchu, do kultivačného média. Vhodná teplota na pestovanie baktérií je zvyčajne od 20 °C do 45 °C a výhodne od 25 °C do 40 ’C. Čas kultivácie by mal byť taký, aby sa dosiahlo maximum tvorby aminokyselín. Toto maximum sa obvykle dosiahne v priebehu 10 až 160 hodín.

Analýza L-aminokyselín sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak, ako sa opisuje v práci Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190) alebo sa môže uskutočňovať HPLC s reverznou fázou, ako sa opisuje v práci Lindroth et al. (Analytical Chemistry, (1979) 51: 1167-1174).

Nasledujúce mikroorganizmy boli uložené v Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Nemecká zbierka mikroorganizmov a bunkových kultúr, Braunschweig, Nemecko) podlá Budapeštianskej zmluvy:

- Escherichia coli K-12 DH5a/pEC-T18mob.2 ako DSM 13244.

Prehlad obrázkov na výkresoch

Priložené sú nasledovné obrázky:

Obrázok 1: Mapa plazmidu pEC-T18mob2

Obrázok 2: Mapa plazmidu. pMS82

Obrázok 3: Mapa plazmidu pMS82B

Obrázok 4: Mapa plazmidu pCR2.lpoxBint

Stanovené počty párov báz sú približné hodnoty získané v súvislosti s reprodukovatelnosťou.

Použité skratky majú nasledovný význam:

Obrázok 1:

Tet: gén pre rezistenciu na tetracyklín

OriV: plazmidom kódovaný počiatok replikácie E.coli

RP4mob: oblasť mob na mobilizáciu plazmidu rep: plazmidom kódovaný počiatok replikácie z plazmidu pGAl z C. glutamicum per: gén na kontrolu počtu kópií z pGAl lacZ-alpha: génový fragment lacZa (N-koniec) génu pre β-galaktozidázu

Obrázok 2 a 3:

Tet: gén pre rezistenciu na tetracyklín rep: plazmidom kódovaný počiatok replikácie z plazmidu pGAl z C. glutamicum per :

lacZ:

tkt:

Obrázok 4:

ColEI:

lacZ :

fl ori: KmR:

ApR:

poxBint:

Okrem toho

Accl:

BamHI: EcoRI:

Hindlll: KpnI:

PstI:

Pvul:

Sali:

Sací:

Smal:

Sphl:

Xbal:

Xhol:

gén na kontrolu počtu kópií z pGAl klonovací relikt génového fragmentu lacZa z pEC T18mob2 gén pre tránsketolézu počiatok replikácie plazmidu ColEI klonovací relikt génového fragmentu lacZa počiatok replikácie fága fl rezistencia na kanamycín rezistencia na ampicilín vnútorný fragment génu poxB sa použili nasledovné skratky:

štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	Accl
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	BamHII
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	EcoRI
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	Hindlll
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	KpnI
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	PstI
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	Pvul
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	Sali
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	Sací
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	Smal
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	Sphl
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	Xbal
štiepne	miesto	pre	reštrikčný	enzým	Xhol

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledovné príklady bližšie vysvetľujú tento vynález. Použili sa metódy molekulovej biológie, napríklad izolácia plazmidovéj DNA, spracovanie reštrikčnými enzýmami, ligácie, štandardné transformácie Escherichia coli atď. (pokiaľ nie je stanovené inak), opísané v práci Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) , Cold Spring Harbor Laboratories, USA).

Príklad 1

Konštrukcia génovej banky kmeňa Corynebacterium glutamicum AS019

Génová banka kmeňa Corynebacterium glutamicum ASO19 (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)) sa skonštruovala použitím systému λ Zap Express™ (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583-7600), ako opisuje O'Donohue (O'Donohue, M. (1997), The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum, Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway). Kit λ Zap Express™ sa zakúpil od firmy Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 920037) a použil podľa návodu výrobcu. AS019-DNA sa rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3A a ligovala s vetvami λ Zap Express™ spracovanými a defosforylovanými BamHI.

Príklad 2

Izolácia a sekvenovanie génu tkt

1. Klonovanie

Kmeň Escherichia coli AI1118 nesúci mutácie v génoch tkcA a tktB, ako opisuje Iida et al., 1993 (Identification and * e p characterisation of the tktB gene encoding a second transketolase in Esch.erichia coli K-12, Journal of Bacteriology 175: 5375-83), sa transformoval s približne 500 ng plazmidovou knižnicou AS019 λ Zap Express™ opísanou vyššie. Selekcia transformantov sa uskutočnila na minimálnom médiu M9 (Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, USA) obsahujúcom kanamycín v koncentrácii 50 mg/1 a inkubácia sa uskutočňovala •48 hodín pri 37 °C. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu podlá Birnboima a Dolyho, 1979 (A rapid alkaľine extraction procedúre for screening.recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Research, 7: 1513-1523) a označila pTSM2.

3. Sekvenovanie

Kloň pTSM2 sa sekvenoval komerčne firmou MWG-Biotech Ltd., Waterside House, Peartree Bridge, Milton Keynes ΜΚβ 3BY, Veľká Británia. Plazmidová DNA s vysokou čistotou sa pripravila pre MWG-Biotech použitím kitu QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN GmbH, Max-Volmer-Strasse 4, 40724 Hilden, Nemecko) a potom lyofilizovala použitím lyofilizátora Lyovac GT 2 (Leybold Heraeus). Počiatočná analýza sekvencií sa uskutočnila použitím univerzálneho dopredného a reverzného priméru M13.

dopredný primér M13/pUC: 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3' reverzný primér M13/pUC: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3'

Potom sa zo získanej sekvencie, ktorá poskytla úplný gén tkt, ktorý sa má odvodiť, skonštruoval vnútorný primér. Sekvencia vnútorného priméru:

Vnútorný primér 1: 5' TGCAGCAACCAAGACTG 3'

Získaná sekvencia sa potom analyzovala použitím programu DNA Strider (Marek (1988), Nucleic Acids Research 16: 18291836), verzia 1.0 na počítači Apple Macintosh. Tento program umožňuje analýzu, ako je napríklad stanovenie použitím reštrikčného miesta, stanovenie analýzou otvoreného čítacieho rámca a použitím kodónu. Vyhladávanie medzi získanou sekvenciou DNA a sekvenciami v databázach EMBL a Genbank sa dosiahlo použitím programu BLAST (Altschul et al., 1997,

Nucleic Acids Research, 25:3389-3402). Sekvencie DNA a proteínu sa vyrovnali použitím programov Clustal V a Clustal W (Higgins and Sharp, 1988 Gene 73: 237-244).

Takto získaná sekvencia je znázornená v SEQ ID NO 1. Analýza získanej nukleotidovej sekvencie odhalila otvorený čítací rámec s 2094 pármi báz, ktorý sa označil ako gén tkt. Kóduje proteín so 697 aminokyselinami znázornený v SEQ ID NC

2.

Príklad 3

Expresia génu tkt

3.1 Príprava kyvadlového vektora pEC-T18mob2

Kyvadlový vektor pEC-T18mob2 z E. coli - C. glutamicum sa skonštruoval podľa doterajšieho stavu techniky.

Tento vektor obsahuje replikačnú oblasť rep plazmidu pGAl vrátane replikačného efektora per (US-A- 5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), gén tetA(Z) plazmidu pAGl sprostredkovávajúci rezistenciu na tetracyklín (US-A- 5,158,891; zápis do génovej banky v National Center for Biotechnology Information (NCBI,

Bethesda, MD, USA) s prírastkovým číslom AF121000), replikačnú oblasť oriV plazmidu pMBl (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quntitative Biology 43, 77-90 (1979)), génový fragment lacZa zahŕňajúci promótor lac a viacnásobné r r f c <' p ^r klonovacie miesto (multiple cloning site, mcs) (Norrander, J.

M. et al., Gene 26, 101-106 (1983) a oblasť mob plazmidu RP4 (Šimon et al., (1983), Bio/Technology 1: 784-791).

Skonštruovaný vektor sa transformoval do kmeňa E. coli DH5a (Hanahan, In: DNA cloning, A practical approach. zv. I., IRLPress, Oxford, Washington DC, USA)'. Bunky nesúce plazmid sa selektovali nanesením transformačnej zmesi na platne s agarom LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual,

2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím kitu QIAprep Spin Miniprep od firmy Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRi a Hindlll a potom elektroforézou v agarózovom géle (0,8%).

Plazmid sa nazval pEC-T18mob2 a je znázornený na obrázku 1. Je uložený vo forme kmeňa E. coli DH5a/pEC-T18mob2 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) ako DSM 13244.

3.2 Klonovanie génu tkt do kyvadlového vektora pEC-T18mob2 z E. coli - C. glutamicum

Na amplifikáciu fragmentov DNA obsahujúcich úplný gén tkt z C. glutamicum a priľahlých oblastí v protismere a v rovnakam smere sa použila PCR. PCR reakcie sa uskutočnili použitím oligonukleotidových primérov uvedených v' SEQ ID NO 1. Genómcvá DNA sa izolovala z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 podľa Heeryho a Dunicana (Applied and Environmental Microbiology 59: 791-799 (1993) a ako templát sa použilo približne 150 až 200 ng. Použité priméry:

.Dopredný primér tkt: 5'CTG ATC ATC GGA TCT AAC GAA 3'

Reverzný primér tkt: 5'ATT GCC CCG GGT TGA AGC TAA3 3'

Parametre. PCR boli nasledovné:

35	cyklov
95	°C- počas 6 minút
94	•’C. počas 1 minúty
55·'	°C- počas 1 minúty
72	°C počas 45 sekúnd

ImM MgCl₂

Získaný produkt PCR sa klonoval do komerčne dostupného vektora pGEM-T zakúpeného od firmy Promega Corp. .(pGEM-T Easy Vector System 1, katalógové číslo A1360, Promega-US, .·. Southampton) použitím kmeňa E. coli JM109 (Ýanisch-Perron· et al., Gene 33: 103-119 (1985)) ako hostiteiského mikroorganizmu. Úplný gén tkt sa potom izoloval z vektora pGEM T vo fragmente Sphl/Sall a klonoval do oblasti lacž Sphl/Sall kyvadlového vektora pEC-Ť18mob2 z E. coli -' C~.' .giuťämičum' (obrázok. 1) a označil ako pMS82 (obrázok 2). Analýza na základe reštrikčných enzýmov použitím Accl (Boehringer Mannheim GmbH, Nemecko) odhalila nesprávnu' orientáciu génu tkt v géne lacZa vektora pEC-T18mob2. Orientácia sa opravila•reštrikciou použitím enzýmu EcoRI (Boehringer Mannheim GmbH, Nemecko) a religáciou. Analýza reštrikčnými enzýmami použitím Accl (Boehringer Mannheim GmbH, Nemecko) odhalila správnu orientáciu génu tkt v géne lacZa (t.j. v smere promótora lac) vektora pEC-T18mob2 a tento plazmid sa označil ako pMS82B (obrázok 3).

Príklad 4

Účinok zvýšenej expresie génu tkt v rôznych producentoch lyzínu

Kmeň Corynebacterium glutamicum DSM5715 je opísaný v EPB-0435132 a kmeň DSM12866 je opísaný v DE-A-19931314.8. Obidva kmene sú uložené v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podlá

Budapeštianskej zmluvy.

4.1 Príprava kmeňov DSM5715/pMS82B a DSM12866/pMS82B

Kmene DSM5715 a DSM12866 sa transformovali s plazmidom pMS82B použitím elektroporačnej metódy opísanej v práci Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 53: 299-303 (1989)). Selekcia transformantov sa uskutočňovala na agare LBHIS zloženom z 18,5 g/l mozgovo-srdcového infúzneho bujónu, 0,5 M sorbitolu, 5 g/l Bacto-tryptónu, 2,5 g/l Bacto-yeast-extract, g/l NaCl a 18 g/l Bacto-agaru, ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu. Inkubácia sa uskutočňovala 2 dni pri 33 °C.

Plazmidové DNA sa izolovala vo všetkých prípadoch z transformantu obvyklou metódou (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), štiepila reštrikčnou endonukleázou Accl a plazmid sa analyzoval následnou elektroforézou v agarózovom géle. Získané kmene sa nazvali DSM5715/pMS82B a DSM12866/pMS82B.

4.2 Príprava L-lyzínu

Kmene Corynebacterium glutamicum DSM5715/pMS82B a DSM12866/pMS82B získané v príklade 4.1 sa kultivovali v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.

Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/1)). Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predkultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predkultúru bolo úplné médium CglII.

Médium Cg III

NaCI

Bacto-peptón

Bacto-yeast extract

Glukóza (oddelene autoklávovaná Hodnota pH sa nastavila na 7,4.

2,5 g/l g/l g/l % (hmotnosť/objem)

K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/l). Predkultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predkultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.

Médium MM:

CSL (kukuričná maceračná tekutina)	5 g/l
MOPS (kyselina morfolinopropán-	20 g/l
sulfónová)
Glukóza (oddelene autoklávovaná)	50 g/l
(NH4) 2SO4	25 g/l
kh2po4	0,1 g/l
MgSO4.7H2O	1,0 g/l
CaCl2.2H2O	10 mg/l
FeSO4.7H2O	10 mg/l
MnSO4.H2O	5,0 mg/l
Biotín (sterilné filtrovaný)	0,, 3 mg/ί
Tiamín.HCl (sterilné filtrovaný)	0,2 mg/l
Fumarát (sterilné filtrovaný)	' 5,81 g/l
L-Leucín (sterilné filtrovaný)	0,1 g/l
CaCO3	25 g/l

CSL, MOPS a roztok solí sa vodným roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali roztoky

Γ (* Γ r r sterilného substrátu a roztoky vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO₃.

Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal 'sa tetracyklín (5 mg/1). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.

Po 72 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizácicu na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.

Výsledok pokusu je uvedený v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Kmeň	Optická hustota	L-Lyzín.HCl
	(660 nm)	g/i
DSM5715	7,2	14,1
DSM5715/pMS82B	7,2	14,8
DSM12866	10,9	15, 3
DSM12866/pMS82B	11,2	16, 8

Príklad 5

Príprava genómovej kozmidovej knižnice Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

M

Chromozómová DNA baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sa najprv izolovala a čiastočne naštiepila (viď Tauch et al.(l995), Plasmid 33: strana 168 až 179) reštrikčným enzýmom Sau3AI '(Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0913-02). Izolované fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z morských garnátov (shrimp alkaline phosphatase, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové číslo 1758250). DNA kozmidového vektora SuperCosl (viď Wahl et al., (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: strana 2160 až 2164), získaného od firmy Stratagene (La Jolla, USA, SuperCosl Cosmid Vektor Kit, katalógové č. 251301), sa štiepila reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-094802) a taktiež defosforylovala alkalickou fosfatázou.

Následne sa kozmidová DNA štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0868-04). Týmto spôsobom získané fragmenty kozmidovej DNA sa zmiešali s fragmentárni genómovej DNA Corynobacetrium glutamicum ATCC13032 a potom spojili pomocou T4-DNA-ligázy (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0870-04).

Ligačná zmes sa potom pomocou baliaceho extraktu Gigapack II XL Packing (Stratagene, La Jolla, USA, Gigapack II XL· Packing Extract, katalógové č. 200217) zabalila do fágových častíc. Tieto fágové častice sa použili na infekciu kmeňa E. coli NM554 (Raleigh : et al.- 1988, Nucleic Acid Research 16: strana 1563 až 1575) . Bunky sa resuspendovali v lOrnM MgSO₄ a zmiešali s alikvótom suspenzie fágov. Infekcia a titrácia kozmidovej knižnice sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v knihe • ·

Sambrook a ďalší (1989, Molecular Cloning: A laboratory j

Manual, Cold Spring Harbor), pričom sa bunky naniesli na agar í

LB (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) so 100 pig/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé rekombinantné klony.

Príklad 6

Izolácia a sekvenovanie génu poxB ·

Kozmidová DNA individuálnej kolónie (príklad 5) sa izoloval pomocou kitu Qiaprep Spin Miniprep Kit (katalógové č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podlá návodov výrobcu a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0913-02). Získané fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové č. 1758250). Po separácii gélovou elektroforézou sa uskutočnila izolácia fragmentov kozmidu s rozsahom veľkostí 1 500 až 2 000 bp pomocou kitu QiaExII gel Extraction Kit (katalógové č. 20021, Qiagen, Hilden, Nemecko). Sekvenačný vektor pZero-1, získaný od firmy Invitrogen (Groningen, Holandsko, katalógové č. K2500-01), sa štiepil reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0868-04).

Ligácia kozmidových fragmentov do sekvenačného vektora pZero-1 sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v príručke Sambrook a ďalší (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , pričom zmes DNA s T4-li<jázou (Pharmacia Biotech., Freiburg, Nemecko) sa inkubovala cez noc. Ligačnou zmesou sa následne elektroporáciou (Tauch a ďalší· 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: strana 343 až 347) transformovali baktérie E. coli kmeňa DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: strana 4645 až 4649). Trans23 formované baktérie sa vysiali na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s prídavkom 50 pg/ml zeocínu.

Izolácia plazmidov z rekombinantných klonov sa uskutočňovala pomocou zariadenia Biorobot 9600 (katalógové č. 900200, Qiagen, Hilden, Nemecko). Sekvenovanie sa uskutočňovalo dideoxymetódou ukončenia reťazca (Sanger et al.., 1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: strana 5463 až 5467) s modifikáciami podľa Zimmermanna a ďalších (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Pritom sa použil sekvenačný kit „RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit· od firmy PE Applied Biosystems (katalógové č., 403044, Weiterstadt, Nemecko). Separácia gélovou elektroforézou a analýza sekvenačnej reakcie sa uskutočňovala v géle „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) (katalógové č. A124.1, Roth, Karslruhe, Nemecko) pomocou prístroja „ABI Prisni 377 od firmy PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).

Získané nespracované údaje o sekvenciách sa následne spracovali použitím programového balíka Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14: strana 217 aŽ 231), verzia 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov plazmidu pZerol sa zostavili do jedného súvislého kontigu. Počítačová analýza kódujúcich oblastí sa uskutočnila pomocou programu XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231). Ďalšie analýzy sa uskutočnili pomocou programu „BLAST (Altschul a ďalší, 1997, Nucleic Acids Research, 25: strana 3389 až 3402) proti neredundantnej databáze NCBI uloženej v'”Ňationaí Center for Biotechnology Information” (NCBI, Bethesda, MD, USA).

Výsledná nukleotidová sekvencia je znázornená v

SEQ ID No. 3. . ‘ Analýza tejto nukleotidovej sekvencie odhalila otvorený čítací rámec s 1737 pármi báz, ktorý sa označil ako gén poxB. Gén poxB kóduje polypeptid s 579 aminokyselinami (SEQ ID NO. 4).

r p

Príklad 7

Príprava integračného vektora na integračnú mutagenézu génu poxB

Z kmeňa ATCC 13032 sa metódou podlá Eikmannsa et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) izolovala chromózomová DNA. Na základe sekvencie génu poxB známej z príkladu 8 pre C. glutamicum sa selektovali nasledovné oligonukleotidy pre polymerázovú reťazovú reakciu:

poxBintl:

5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3' poxBint2:

5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'

Znázornené priméry syntetizovala firma MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko) a PCR reakcia sa uskutočnila podľa štandardnej metódy PCR od Innisa et al. (PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) s polymerázou Pwo od firmy Boehringer. Pomocou tejto polymerázovej reťazovej reakcie sa izoloval fragment DNA s veľkosťou približne 0,9 kb, ktorý nesie interný fragment génu poxB a je znázornený v SEQ ID No. 5.

Amplifikovaný fragment DNA sa ligoval pomocou klonovacieho kitu TOPO TA od firmy Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA,

USA; katalógové číslo K4500-01) do vektora pCR2.1-TOPO (Mead et al., (1991), Bio/Technology 9:657-663). Kmeň E. coli DH5ct sa potom elektroporoval s ligačnou zmesou (Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. zv. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Selekcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočnila nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nxi Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), ktorý bol doplnený 25 mg/1 kanamycínu. Plazmidová r rr r fl t

DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím kitu QIAprep Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI a následnou elektroforézou v agarózovom géle (0,8%). Plazmid sa nazval pCR2.lpoxBint (obrázok 4).

Plazmid pCR2.lpoxBint sa uložil vo forme kmeňa Escherichia coli DH5a/pCR2.lpoxBint ako DSM 13114 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ,

Braunschweig, Nemecko) podlá Budapeštianskej zmluvy.

Príklad 8

Integračná mutagenéza génu poxB v kmeni DSM 5715 .produkujúcom lyzín

Vektor pCR2.lpoxBint uvedený v príklade 7 sa elektroporoval v C. glutamicum DSM 5715 podľa elektroporačnej metódy Taucha et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343347 (1994)). Pri kmeni DSM 5715 sa jedná o producenta L-lyzínu rezistentného na AEC. Vektor pCR2.lpoxBint sa nemôže samostatne replikovať v DSM5715 a zachováva sa v bunke len vtedy, ak sa integroval do chromozómu DSM 5715. Selekcia klonov pomocou pCR2.lpoxBint integrovaného do chromozómu sa uskutočnila nanesením elektroporačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 15 mg/l kanamycínu. Na dôkaz integrácie sa fragment poxBint označil pomocou hybridizačného kitu Dig.od firmy Boehringer metódou „The DIG Systems Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993). Chromozómová DNA potenciálneho integrantu sa izolovala metódou od Eikmanns et al.

(Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) a štiepila reštrikčným enzýmom Sali, Sací a Hindlll. Vznikajúce fragmenty sa separovali pomocou elektroforézy v agarózovom géle

Γ r f a hybridizovali pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy

Boehringer pri 68 ’C. Plazmid pCR2.lpoxBint uvedený v príklade sa vnútri chromozómového génu poxB vložil do chromozómu

DSM5715. Kmeň sa označil DSM5715::pCR2.lpoxBint.

Príklad 9

Účinok zvýšenej expresie génu tkt so súčasnou elimináciou génu poxB na prípravu lyzínu

9.1 Príprava kmeňa DSM5715::pCR2.lpoxBint/pMS82B

Kmeň DSM5715::pCR2.lpoxBint/pMS82B sa transformoval plazmidom pMS82B použitím elektroporačnej metódy opísanej v práci Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 53: 299-303 (1989)). Selekcia transformantov sa uskutočňovala na agare LBHIS zloženom z 18,5 g/l mozgovo-srdcového infúzneho bujónu, 0,5 M sorbitolu, 5 g/l Bacto-tryptónu, 2,5 g/l Bacto-yeastextraktu, 5 g/l NaCl a 18 g/l Bacto-agaru, ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu a 25 mg/1 kanamycínu. Inkubácia sa uskutočňovala 2 dni pri 33 ’C.

Plazmidová DNA sa izolovala vo všetkých prípadoch z transformantu obvyklou metódou (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), štiepila reštrikčnou endonukleázou Accl a plazmid sa analyzoval následnou elektroforézou v agarózovom géle. Získaný kmeň sa nazval

DSM5715::pCR2.1poxBint/pMS82B.

9.2 Príprava L-lyzínu

Kmeň C. glutamicum DSM5715::pCR2.lpoxBint/pMS82B získaný v príklade 9.1 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.

Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri -33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/1) a kanamycínom (25 mg/1)).

Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predkultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke).

Médiom použitým pre predkultúru bolo úplné médium CglII.

Médium Cg III

NaCI

Bacto-peptón

Bacto-yeast extract

Glukóza (oddelene autoklávovaná) Hodnota pH sa nastavila na 7,4.

2,5 g/1 g/1 g/1 % (hmotnosť/objem)

K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/1) a kanámycín (25 mg/1)). Predkultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predkultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.

Médium MM:

CSL (kukuričná maceračná tekutina)	5 .g/1
MOPS (kyselina morfolinopropán-	20 g/1
sulfónová)
Glukóza (oddelene autoklávovaná)	50 g/1
(NH4)2SO4	25 g/1
kh2po4	0,1 g/1
MgSO4.7H2O	1,0 g/1
CaCl2.2H2O	10 mg/1
FeSO4.7H2O	10 mg/1
MnSO4.H2O	5,0 mg/1
Biotín (sterilné filtrovaný)	0,3 mg/1
Tiamín.HCl (sterilné filtrovaný)	0,2 mg/1

Fumarát (sterilné filtrovaný) L-Leucín (sterilné filtrovaný) CaCO₃

5,81 g/1 0,1 g/1 25 g/1

CSL, MOPS a roztok solí sa vodným roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali roztoky sterilného substrátu a roztoky vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO₃.

Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa tetracyklín (5 mg/1) a kanamycin (25 mg/1). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.

Po 72 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.

Výsledok pokusu je uvedený v tabuľke 2.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob prípravy L-aminokyselín fermentáciou koryneformných baktérií, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa uskutočnenie nasledovných stupňov:

   a) fermentácia baktérií produkujúcich žiadanú

   L-aminokyselinu, v ktorých sa zosilňuje aspoň gén tkt,

   b) koncentrovanie L-aminokyseliny v médiu alebo v bunkách baktérií a

   c) izolácia produkovanej L-aminokyseliny.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú, najmä zvýšene exprimujú, ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu· žiadanej L-aminokyseliny.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, ktoré produkujú L-treonín, L-lyzín alebo L-izoleucín.
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, ktoré produkujú L-lyzín.
5. 5. Spôsob fermentačnej prípravy L-lyzínu podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že v koryneformných mikroorganizmoch, ktoré najmä už produkujú L-lyzín, sa súčasne zosilňuje alebo zvýšene exprimuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej

   5.1 gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu,

   5.2 gén lysC kódujúci aspartátkinázu rezistentnú na spätnú väzbu, r r r Γ f r

   5.3 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,

   5.4 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu,

   5.5 gén zwf kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogenázu,

   5.6 gén gnd kódujúci 6-fosfoglukonátdehydrogenázu,

   5.7 gén lysE kódujúci prenos lyzínu,

   5.8 gén mqo kódujúci malát-chinónoxidoreduktázu, '5.9 gén zwal,

   5.10 gén eno kódujúci enolázu.
6. 6. Spôsob fermentačnej prípravy L-treonínu podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že v koryneformných mikroorganizmoch, ktoré najmä už produkujú L-treonín, sa súčasne zosilňuje, najmä zvýšene exprimuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej

   6.1 gén hom kódujúci homoseríndehydrogenázu alebo alelu hom^dr kódujúcu homoseríndehydrogenázu rezistentnú na spätn väzbu,

   6.2 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,

   6.3 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu,

   6.4 gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu,

   6.5 gén zwf kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogenázu,

   6.6 gén gnd kódujúci 6-fosfoglukonátdehydrogenázu,

   6.7 gén thrE kódujúci prenos treonínu,

   6.8 gén zwal,

   6.9 gén eno kódujúci enolázu.
7. 7. Spôsob podlá nároku 2,vyznačujúci sa tým, že na prípravu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu alebo L-treonínu,sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej

   7.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu,

   7.2 gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu, • 7.3 gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu,

   7.4 gén zwa2.
8. 8. Spôsob podlá nárokov 2 až 6, vyznačujúci sa t ý m , že na dosiahnutie zosilnenia sa pomocou transformácie mikroorganizmov plazmidovým vektorom nesúcim tieto gény alebo nukleotidové sekvencie zvýši počet kópií génov alebo nukleotidových sekvencií.
9. 9. Plazmidový vektor pEC-T18mob2 uložený pod označením DSM 13244 v K-12 DH5a, znázornený na obrázku 1.
10. 10. Plazmidový vektor pEC-T18mob2 pódia nároku 9, vyznačujúci sa tým, že.prídavné nesie gén tkt.
11. 11. Korynefromný mikroorganizmus, najmä rodu

    Corynebacteríum, transformovaný pomocou vloženia plazmidového vektora podľa nároku 10, ktorý prídavné obsahuje gén ,tkt.