KR20010062078A

KR20010062078A - ｇｌｋ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열

Info

Publication number: KR20010062078A
Application number: KR1020000072627A
Authority: KR
Inventors: 멕켈베티나; 페페를레발터
Original assignee: 추후; 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1999-12-02
Filing date: 2000-12-02
Publication date: 2001-07-07
Also published as: HUP0004783A2; MXPA00011815A; CA2325227A1; US6913910B2; ID28565A; DE19958159A1; ZA200007078B; RU2000129933A; JP2001204481A; HU0004783D0; PL344237A1; CN1305000A; AU7198800A; US20020040129A1; EP1106694A1; BR0005678A; US20030022320A1; SK17942000A3

Abstract

본 발명은,

a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드,

b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오티드 서열중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오티드; 및 글루코키나제 효소를 암호화하는 glk 유전자를 증폭시켜 L-아미노산을 발효적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

ｇｌｋ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열{Nucleotide sequences coding for the glk gene}

본 발명은 glk 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 glk 유전자가 증폭된 코리네형 박테리아를 사용하여 L-아미노산, 특히 L-리신을 발효적으로 생산하는 방법을 제공한다.

L-아미노산, 특히 L-리신은 사람의 의약 및 약제 산업, 특별히 동물의 사료에 사용된다.

L-아미노산은 코리네형 박테리아의 발효 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 의해 생산될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 이 아미노산의 지대한 중요성 때문에, 생산 공정을 개선하기 위한 노력이 계속되어왔다. 생산 공정의 개선은, 발효 기술법(예: 교반 및 산소 공급), 영양 배지의 조성(예: 발효중의 당의 농도), 제품 형으로의 후처리(예: 이온 교환 크로마토그래피), 또는 미생물 자체의 고유 생산성에 관한 것이다.

돌연변이유발법, 돌연변이체의 선택법 및 선별법을 사용하여 이들 미생물의 생산성을 개선시킬 수 있다. 이러한 방법하에서, 항대사물질(예: 리신 동족체 S-(2-아미노에틸)-시스테인)에 내성을 갖거나, 또는 조절상 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이며 L-아미노산(예: L-리신)을 생산하는 균주가 수득된다.

각각의 L-아미노산의 생합성 유전자를 증폭시키고 L-아미노산의 생산에 미치는 효과를 연구하여, L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개량하기 위하여, 수 년간 재조합 DNA 기술이 사용되어 왔다. 이러하 주제에 관한 참조 문헌으로는 특히 다음의 문헌을 검토할 수 있다: Kinoshita "Glutamic Acid Bacteria", in : Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Cumming, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6, 261-272 (1994)), Jetten and Sinskey (Critical Reviews in Biotecnology 15, 73-103 (1995) and Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).

본 발명자들이 이루고자 하는 목적은 L-아미노산, 특히 L-리신의 발효적 생산을 개선하기 위한 새로운 수단을 제공하는 것이다.

도 1은 플라스미드 pEC-K18mob2의 지도이다.

도 2는 플라스미드 pEC-K18mob2glkexp의 지도이다.

도면에서 사용된 두문자어 및 약어는 다음과 같이 정의된다:

per : pGA1의 복사체 수를 조절하는 유전자

oriV : pMB1의 ColE1-형 복제 기점

rep : 코리네박테리움 글루타미쿰 플라스미드 pGA1의 플라스미드-암호화된 복제 영역

RP4mob : RP4-이동 부위

Kan : 카나마이신 내성 유전자

glk : 코리네박테리움 글루타미쿰의 glk 유전자

EcoRI : 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

HindIII : 제한 효소 HindIII의 절단 부위

Ec1136II : 제한 효소 Ec1136II의 절단 부위

L-아미노산, 특히 L-리신은 사람의 의약 및 약제 산업, 특별히 동물의 사료 에 사용된다. 따라서, L-아미노산, 특히 L-리신을 생산하기 위한 새로운 개선된 방법을 제공하는 것이 일반적 중요하다.

이후 본원에서 L-리신 또는 리신이 언급되는 경우, 이는 염기 그자체만을 의미하는 것이 아니라, 예를 들면 리신 모노하이드로클로라이드 또는 리신 설페이트와 같은 염도 의미하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은,

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오티드 서열중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네형 박테리아로 부터 수득된 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 바람직하게는 코리네형 박테리아에서 복제가능한 재조합 DNA인 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 RNA인 폴리뉴클레오티드도 역시 제공한다.

또한, 본 발명은,

(i) 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열,

(ii) 유전암호의 축퇴성(degeneration) 범위내에서 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드를 형성하는 하나 이상의 서열, 및 임의로,

(iv) 서열 (i)의 기능상 중성 센스 돌연변이체를 포함하는 바람직하게는 복제가능한 DNA인, 특허청구범위 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

추가로, 본 발명은 특허청구범위 제1항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 벡터, 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 박테리아를 제공한다.

또한, 본 발명은, 서열 1에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열를 갖는 완전한 유전자를 포함하는 상응하는 유전자 라이브러리를 서열 1의 상기 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 프로브와 하이브리드를 형성시키는 방법으로 스크리닝함으로써 수득될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 실질적으로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA, cDNA 및 DNA와의 하이브리드화 프로브로서 적합하므로, 글루코키나제를 암호화하는 전장 cDNA를 분리하고, 글루코키나제 유전자의 서열과 고도로 유사한 cDNA 또는 유전자를 분리할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 글루코키나제를 암호화하는 유전자의 DNA를 제조하기 위한 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 작용하는 이러한 올리고뉴클레오티드는 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속 염기를 포함한다. 40 또는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드도 또한 적합하다.

"분리된"이란 천연 환경으로 부터 분리되어짐을 의미한다.

"폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 폴리리보뉴클레오티드 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 의미하며, 이와 관련하여 이들 용어는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA를 의미할 수 있다.

"폴리펩티드"란 용어는 펩티드 결합을 통해 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 이해된다.

본 발명에 따른 폴리펩티드로는, 서열 2에 따른 폴리펩티드, 특히 글루코키나제의 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드, 및 서열 2의 폴리펩티드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90 내지 95% 동일하고, 위에서 언급한 활성을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.

또한, 본 발명은, 이미 L-아미노산을 생산하며 glk 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증폭, 특히 과발현되어진 코리네형 박테리아를 사용하여, L-아미노산, 특히 L-리신을 발효적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본원과 관련하여, "증폭"이란 용어는, 유전자(들)의 복사체 수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 고활성의 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용하거나, 임의로 이들 수단을 조합함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 미생물내에서 증가시키는 것을 의미한다.

본 발명의 대상인 미생물은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분 또는 셀룰로즈로 부터 또는 글리세롤 및 에탄올로 부터 아미노산, 특히 L-리신을 생산할 수 있다. 이러한 미생물은 코리네형 박테리아 유형, 특히 코리네박테리움 속의 미생물이다. 코리네박테리움 속중에서도, 특히 L-아미노산을 생산할 수 있는 이의 능력이 당업자에게 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 유형이 언급될 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 유형중에서 적합한 균주로는, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(acetoglutamicum) ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(acetoacidophilum) ATCC 13870, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539 , 코리네박테리움 멜라스세콜라(melassecola) ATCC 17965, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) ATCC 13869, 및 브레비박테리움 디바리카툼(divaricatum) ATCC 14020과 같은 공지된 야생형 균주; 및 이로 부터 수득된 L-아미노산-생산 돌연변이체 및/또는 균주, 예를 들면 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715가 있다.

본 발명에 이르러, 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터 글루코키나제 효소(EC 2.7.1.2)를 암호화하는 새로운 glk-유전자를 분리하는데 성공하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 glk 유전자 또는 기타 유전자를 분리하기 위하여, 일차적으로 이. 콜라이(E. coli)내에 당해 미생물의 유전자 라이브러리를 작제한다. 유전자 라이브러리의 작제법은 일반적으로 공지된 교과서 및 논문집에 기술되어 있다. 예로서, 교과서[참조: Winnacker: Gene und Klone, EineEinfuhrung in die Gentechnology (Gene and Clone, An Introduction to Gene Technology)(Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 논문집[Sambrook et al., : Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]를 언급할 수 있다. 매우 익히 공지된 유전자 라이브러리는 문헌[Kohara et al., Cell 50, 495-508(1987)]에 따라 λ 벡터내에 작제된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 라이브러리이다. 문헌[Bathe et al.(Molecular and General Genetics, 252, 255-265, 1996)]에는 코스미드 벡터 SuperCos I[참조: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Science USA, 84, 2160-2164]을 이용하여 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16, 1563-1575]내에 작제한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로 부터의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 또한, 문헌[Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326) (1992)]에는 코스미드 pHC79[참조: Hohn and Collins, Gene 11, 291-298(1980)]을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032부터 수득한 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 또한, 이. 콜라이내에 코리네박테리움 글루타미쿰로부터의 유전자 라이브러리를 제조하기 위하여, pBR322[참조: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818(1979)] 또는 pUC9[참조: Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268]와 같은 플라스미드를 사용할 수 있다. 제한-결함 및 재조합-결함인 이. 콜라이 균주가 숙주로서 특히 적합하다. 이러한 균주의 예로는 문헌[참조: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87(1990) 4645-4649)]에 기술된 균주 DH5αmcr가 있다. 이어서, 코스미드를 이용하여 클로닝된 장쇄 DNA 단편을 서열 분석이 가능한 적당한 벡터내에 서브클로닝한 다음, 최종적으로 서열 분석할 수 있다[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 5463-5467, (1977)].

상기와 같은 방법으로써, 서열 1과 같이 본 발명에 해당하는, glk 유전자를 암호화하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 새로운 DNA 서열이 수득된다. 또한, 상응하는 단백질의 아미노산 서열도 상기한 방법에 의해 본 DNA 서열로부터 유도된다. 수득된 glk 유전자 산물의 아미노산 서열은 서열 2에 제시되어 있다.

유전암호의 축퇴성에 기인하여 서열 1로부터 수득되는 암호화 DNA 서열도 또한 본 발명에 해당한다. 게다가, 보존성 아미노산의 교체, 예를 들면 단백질에서 글리신의 알라닌로의 교체 또는 아스파르트산의 글루탐산으로의 교체는 단백질의 활성을 근본적으로 변화시키지 않는, 즉 작용상 중성인 센스 돌연변이로서 당업계에 공지되어 있다. 또한, 단백질의 N- 및/또는 C-말단에서의 변화가 실질적으로 이의 기능에 영향을 주지 않으며, 심지어 이를 안정화시킬 수 도 있다는 것이 공지되어 있다. 당업자는 이에 관한 정보를 특히 문헌[Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169:751 (1987); O'Regan et al., Gene 77:237-251 (1989); Sahin-Toth et al., Protein Science 3:240-247 (1994); Hochuli et al., Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)] 및 유전학 및 분자생물학에 관한 공지된 교과서에서 찾아 볼 수 있다. 서열 2로 부터 상응하는 방법으로 수득된 아미노산 서열 및 이들 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열도 역시 본 발명에 해당한다.

마찬가지로, 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드를 형성하는 DNA 서열은 본 발명에 해당한다. 최종적으로, 서열 1로부터 수득된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된 DNA 서열도 또한 본 발명에 해당한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 뉴클레오티드 길이가 15개 이상이다.

당업자는 하이브리드화에 의한 DNA 서열의 동정에 관한 정보를 문헌["The DIG System User's Guide for Filter Hybridization" from Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim, Germany, 1993); and Liebl et al.(International Journal of Systematic Bacteriology(1991) 41: 255-260)]에서 찾아볼 수 있다. 당업자는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 DNA 서열 증폭에 관한 상세한 내용을, 특히 문헌[Gait, Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984); and Newton & Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 찾아볼 수 있다.

본원의 발명자들은, glk-유전자의 과발현 후, 코리네형 박테리아가 L-아미노산, 특히 L-리신을 개선된 양상으로 생산한다는 것을 발견하였다.

과발현을 달성하기 위하여, 상응하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 또는 구조 유전자 상부에 위치하는 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상부에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방법으로 작용한다. 또한, L-아미노산의 발효적 생산 과정중에 유도성 프로모터를 사용하여 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 발현은 m-RNA의 수명을 연장시키기 위해 채택된 수단에 의해 유사하게 향상될 수 있다. 또한, 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 효소 활성이 마찬가지로 증가될 수 있다. 유전자(들) 작제물은 상이한 복사체 수의 플라스미드내에 존재하거나, 또는 염색체내에 통합되어 증폭될 수 있다. 달리, 관련 유전자의 과발현은 배지의 조성 및 배양 조건을 변화시킴으로써 성취될 수 있다.

당업자는 이의 상세한 내용을 특히 문헌[Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994); Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 명세서 EPS 0 472 869; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 국제특허출원 WO 96/15246; Malumbers et al., Gene 134, 15-24 (1993); 일본 공개 공보 명세서 JP-A-10-229891; Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); Makrides, Microbiological Review 60: 512-538 (1996)], 및 유전학 및 분자생물학에 관한 공지된 교과서에 찾아볼 수 있다.

예를 들면, 본 발명에 따르는 glk 유전자는 플라스미드에 의해 과발현된다.

적합한 플라스미드는 코리네형 박테리아에서 복제되는 것들이다. 다수의 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들어 pZ1[참조: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology(1989) 64, 549-554], pEKEx1[참조: Eikmanns et al., Gene 102, 93-98(1991)] 또는 pHS2-1[참조: Sonnen et al., Gene 107, 69-74(1991)]은 기본(cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기초로 한다. 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면 pCG4[참조: US-A-4,489,160], pNG2[참조: Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124(1990)] 또는 pAG1[참조: US-A-5,158,891]을 기초로 하는 플라스미드를 동일한 방법으로 사용할 수 있다.

hom-thrB-오페론의 복제 및/또는 증폭을 위해, 염색체내로 통합시켜 유전자를 증폭시키는 방법이 이용될 수 있는 플라스미드가 또한 적합하다[참조: Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]. 이러한 방법에서, 숙주(전형적으로 이. 콜라이)에서는 복제될 수 있으나, 코리네박테리움 글루타미쿰에서는 복제될 수 없는 플라스미드 벡터내에 완전한 유전자를 클로닝한다. 언급될 수 있는 적당한 벡터의 예로는, pSUP301[참조: Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는 pK19mob[참조: Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pGEM-T[공급원: Promege corporation, Madison, WI, USA] , pCR2.1-TOPO[참조: Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; 미국 특허 제5,487,993], pCR^RBlunt[참조: Firma Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)], 또는 pEM1[참조: Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516]이 있다. 이 후, 증폭시키고자 하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 접합 또는 형질전환법에 의해 목적하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로 전달한다.

접합법은, 예를 들면 문헌[Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기술되어 있다. 형질전환법은, 예를 들면 문헌[Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988), Dunican and Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989), and Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기술되어 있다. 교차결합에 의한 상동 재조합 후, 생성된 균주는 관련 유전자의 2이상의 복사체를 포함한다.

따라서, 본 발명은, 글루코키나제 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 수반하는 플라스미드 벡터에 의해 형질전환된 균주를 사용하여, L-아미노산, 특히 L-리신을 발효적으로 생산하는 방법을 또한 제공한다.

또한, L-아미노산, 특히 L-리신의 생산에 있어서, glk 유전자는 물론, 목적 L-아미노산의 생합성 경로의 또 다른 유전자를 증폭시켜, 관련 생합성 경로, 해당과정, 보전대사, 시트르산 사이클 또는 아미노산 수송의 효소중의 하나 이상을 과발현시키는 것이 유리할 수 있다.

따라서, L-리신의 생산을 위해, 예를 들면 하기 유전자를 동시에 과발현시킬 수 있다:

· 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자[EP-B 0 197 335],

·피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자[참조: Kalinowski et al., (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324]

· 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174, 6076-6086],

· 트리오즈포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174, 6076-6086],

· 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174, 6076-6086],

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174, 6076-6086],

· 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)], 또는

·리신 수송체를 암호화하는 lysE 유전자[참조: DE-A195 48 222].

또한, 아미노산, 특히 L-리신을 제조하기 위하여, glk 유전자를 증폭시키는 외에, 하기 유전자를 동시에 감쇠시키는 것이 유리할 수 있다:

·포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[DE 199 50 409.1, DSM13047], 및/또는

·글루코즈-6-포스페이트-이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[US 09/396,478, DSM12969].

또한, L-아미노산, 특히 L-리신의 생산에 있어서, glk 유전자를 과발현시키는 것외에, 바람직하지 않은 2차 반응을 차단시키는 것이 유리할 수 있다[참조: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms": Overproductionof Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

본 발명에 따라 생산된 미생물을 배치 공정(배치 배양), 또는 공급 배치나 반복적 공급 배치 공정에서 연속적 또는 배치식으로 배양하여 L-아미노산, 특히 L-리신을 생산할 수 있다. 공지된 배양 방법은 교과서[Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에 요약되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적당히 관련 균주의 요구를 충족시켜야 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지에 관한 내용은 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" The American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 당류와 탄수화물(예: 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈), 유지(예: 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코낫유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올), 및 유기산(아세트산)이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 질소를 함유하는 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침적액, 대두분, 요소), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 포함된다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원으로는 인산, 이수소인산칼륨, 수소인산이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속 염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유해야 한다. 최종적으로, 필수 성장 물질, 예를 들면 아미노산 및 비타민이 위에서 언급된 물질에 추가하여 사용될 수 있다. 이와는 별도로, 적합한 전구체가 배양 배지에 가해질 수 있다. 상기 공급원 물질들은 상기 배지에 단일 배치 형태로 가해지거나, 또는 배양중에 적당히 계량되어 공급될 수 있다.

배지의 pH를 조절하기 위하여, 알칼리성 화합물, 예를 들면 수산화물, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수, 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적당히 가할 수 있다. 소포제, 예를 들면 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 발포 형성을 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들면 항생제를 배지에 가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물(예: 공기)를 배지에 도입한다. 배지의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 리신의 최대 수율이 수득될 때까지, 배양을 계속한다. 이러한 목표는 통상적으로 10 시간 내지 160 시간내에 달성될 수 있다.

따라서, 본 발명은,

a) 글루코키나제 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자가 증폭된, 특히 과발현된, L-아미노산 생산-코리네형 박테리아의 발효 단계,

b) 배지 또는 박테리아 세포내에서 L-아미노산의 농축 단계,

c) L-아미노산의 분리 단계를 수행하여, L-아미노산, 특히 L-리신을 발효적으로 생산하는 방법을 제공한다.

L-리신의 분석을, 음이온 교환 크로마토그래피 처리 후, 닌하이드린 유도화를 통해 수행한다[참조 문헌: Spackman et al., Analytical Chemistry 30, 1190 (1958)].

본 발명에 따른 방법을 사용하여, L-아미노산, 특히 L-리신을 발효적으로 생산할 수 있다.

실시예

본 발명은 후술되는 실시예를 통해 더욱 상세히 설명된다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 게놈성 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 염색체 DNA를 문헌[참조: Tauch et al., 1995, Plasmid 33, 168-179]에 기술된 바와 같이 분리하고, 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Code no. 27-0913-02)으로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 중하(中蝦) 알칼리 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Code no. 1758250)로 탈포스포릴화시킨다. 스트라타젠[La Jolla, USA, Product Description SuperCosI Cosmid Vector Kit, Code no. 251301]로부터 수득한 코스미드 벡터 SuperCos1[Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84, 2160-2164]의 DNA를 제한 효소 XbaI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-0948-02]로 절단하고, 역시 중하(中蝦) 알칼리 포스파타제로 탈포스포릴화시킨다. 이어서, 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code no. 27-0868-04]로 절단한다. 이러한 방법으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC13032 DNA와 혼합하고, 이 혼합물을 T4 DNA 리가제[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4 DNA ligase, Code no. 27-0870-04)로 처리한다. 이어서, 당해 결합 혼합물을 Gigapack II XL 패킹 추출물[Stratagene, La Jolla, USA, Product Description Gigapack II XL packing Extract, Code no. 200217]을 사용하여 파아지내에 충전시킨다. 이. 콜라이 균주 NM554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16, 1563-1575]를 감염시키기 위해, 당해 세포를 10mM MgSO₄에 담그고, 파아지 현탁액의 분액과 혼합한다. 세포를 100㎍/l의 앰피실린을 함유하는 LB 아가[Lennox, 1955, Virology, 1: 190]상에 플레이팅하여, 코스미드 뱅크의 감염 및 역가측정을 문헌[참조: Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행한다. 밤새 37℃에서 배양한 후, 각각의 재조합체 클론을 선별한다.

실시예 2

glk 유전자의 분리 및 서열분석

각 콜로니의 코스미드 DNA를 제조업자의 지침에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit[Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하고, 제한 효소 Sau3AI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Product No. 27-0913-02]로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 중하 알칼리 포스파타제[Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250]로 탈포스포릴화시킨다. 겔 전기영동으로 분리한 후, 크기가 1500 내지 2000bp 범위내인 코스미드 단편을 QiaExII Gel 추출 키트[Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany)로 분리한다. Invitrogen[Groningen, The Netherlands, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01]으로부터 구입한 서열분석 벡터 pZero-1의 DNA를 제한 효소 BamHI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Product No. 27-0868-04]으로 절단한다. 서열분석 벡터 pZero-1내로의 코스미드 단편의 결합을 문헌[참조: Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하는데, 이 경우 DNA 혼합물을 T4 리가제(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 항온처리한다. 이어서, 당해 결합 혼합물을 전기천공에 의해 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[참조: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 4645-4649]에 도입하고[Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol. Letters 123:343-7], 50㎍/l의 제오신을 함유하는 LB 아가[참조: Lennox, 1955, Virology,1: 190)상에 플레이팅한다. 재조합체 클론의 플라스미드 제조는 Biorobot 9600[Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany]를 사용하여 수행한다. 서열 분석은 문헌[참조: Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research 18: 1067]에 기술된 바와 같이 변형된 문헌[참조: Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences USA 74: 5463-5467]의 디데옥시 쇄 종결법에 따라 수행한다. PE Applied Biosystems(Weiterstadt, Germany)로부터의 RR dRhodamine 터미네이터 사이클 서열분석 키트[Product No. 403044]를 사용한다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열분석 반응의 분석을, PE Applied Biosystems(Weiterstadt, Germany)로부터의 "ABI Prism 377" 서열분석 장치를 사용하여 로티포레시스(rotiphoresis) NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드 겔(29:1)[Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany]에서 수행한다.

이어서, 수득된 미처리 서열 데이타를 스타덴(Staden) 프로그래밍 패키지[참조: 1986, Nucleic Acids Research 14, 217-231] 버젼 97-0을 사용하여 처리한다. pZero-1 유도체의 각각의 서열을 관련 Contig내로 조립한다. 컴퓨터를 이용한 암호 영역의 분석을 XNIP 프로그램[Staden, 1986, Nucleic Acids Research 14, 217-231]을 사용하여 수행한다. 추가 분석을, 기관["Natioanl Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA)]의 비-반복적 데이타 뱅크에 대해 "BLAST 서치 프로그램"[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25, 3389-3402]을 사용하여 수행한다.

수득된 핵산 서열은 서열 1에 제시되어 있다. 뉴클레오티드 서열의 분석을통해, glk 유전자로 명명된, 969개 염기쌍의 개방 판독 프레임이 밝혀졌다. glk 유전자는 3238개 아미노산의 단백질을 암호화한다.

실시예 3

코리네박테리움 글루타미쿰에서 glk 유전자를 증폭시키기 위한 왕복 벡터 pEC-K18mob2glkexp의 제조

3.1. glk 유전자의 클로닝

염색체 DNA를 문헌[참조: Eikmanns et al. (Microbiology 140, 1817-1828 (1994)]의 방법에 따라 균주 ATCC 13032로부터 분리한다. 실시예 2에서 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 공지된 glk 유전자의 서열을 기초로 하여, 하기 올리고뉴클레오티드를 폴리머라제 연쇄 반응을 위해 선택한다:

glk-ex1:

5' ACT GAC GTG AGC CAG AAC 3'

glk-ex2:

5' GAT CTA TCT AGA CAC CTA GTT GGC TTC CAC 3'

제시된 프라이머를, ARK 사이언티픽 게엠베하 바이오시스템스(ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstadt, Germany)로 합성하고, PCR 반응을 로체 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH, Manniheim, Germany)로부터 공급된 Pwo 폴리머라제를 사용하여 문헌[참조: Innis et al. PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법에 따라 수행한다. 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여, 프라이머로 부터 잠재적 프로모터 영역과 함께 gLK 유전자를 포함하는 약 1.45kb 크기의 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 증폭된 DNA 단편의 DNA 서열을 서열분석으로 확인한다.

3.2. 이. 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 왕복 벡터 pEC-K18mob의 제조

이. 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 왕복 벡터를 종래의 기술에 따라 작제한다. 당해 벡터는, 복제 효과인자 per를 포함하는 플라스미드 pGA1의 복제 영역 rep[참조: US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532(1997)]; 카나마이신 내성을 부여하는 트랜스포손 Tn5의 aph(3')-IIa-유전자[참조: Beck et al., Gene 19, 327-336 (1982)]; 플라스미드 pMB1의 복제 영역 oriV[참조: Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantiative Biology 43, 77-90 (1979)]; lac 프로모터와 다중 클로닝 부위(mcs)를 포함하는 lacZα 유전자 단편[참조: Norrander, J.M. et al., Gene 26, 101-106 (1983)]; 및 플라스미드 RP4의 mob 영역[참조: Simon et al., Bio/Technology 1:784-791]을 포함한다. 이와같이 작제된 벡터로 이. 콜라이 균주 DH5α[Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]를 형질전환시킨다. 이 형질전환 혼합물을, 25mg/l의 카나마이신이 보충된 LB아가[Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]상에 플레이팅하여, 플라스미드-수반 세포를 선별한다. 플라스미드 DNA를, QIAprep Spin Miniprep Kit[Qiagen사(社)]를사용하여 형질전환체로 부터 분리하여, 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 제한분석한 후, 아가로즈 겔 전기영동(0.8%)으로 확인한다. 이러한 플라스미드는 pEC-K18mob2로 명명되며, 도 1에 도시되어 있다.

하기 미생물은 부다페스트 조약에 따라 독일 브라운쉬바이크에 소재하는 국제기탁기관[German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)]에 기탁되었다:

ㆍ 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM 5715/pEC-K18mob2(수탁번호: DSM 13245).

3.3. 이. 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 왕복 벡터 pEC-K18mob2에서 glk의 클로닝

실시예 3.2에 기술된 이. 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 왕복 벡터 pEC-K18mob2를 사용한다. 이 플라스미드의 DNA를 제한 효소 Ecl136II으로 완전히 절단하고, 중하 알칼리 포스파타제(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250)로 탈포스포릴화시킨다.

실시예 3.1에 기술된 바와 같이 수득된 glk 단편을 제조된 벡터 pEC-K18mob2와 혼합하고, 이 혼합물을 T4 DNA 리가제[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4 DNA ligase, Code No. 27-0870-04)로 처리한다. 당해 결합 혼합물로 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Science U.S.A., 87:4645-4649]를 형질전환시킨다. 이 형질전환 혼합물을, 25mg/l의 카나마이신이 보충된 LB 아가[Lennox, 1955, Virology 1, 190]상에 플레이팅하여, 플라스미드-수반 세포를 선별한다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 각각의 재조합체 클론을 선별한다. 플라스미드 DNA를, 제조업자의 지침에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고, 제한 효소 EcoRI 및 XbaI으로 절단하고, 이어서 아가로즈 겔 전기영동으로 당해 플라스미드를 확인한다. 수득된 플라스미드는 pEC-K18mob2glkexp로 명명되며, 이는 도 2에 도시되어 있다.

실시예 4

플라스미드 pEC-K18mob2glkexp를 사용한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 RES167의 형질전환

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 RES167[참조: Schafer, A. et al., Journal Bacteriological 176: 7309-731 (1994)]를 문헌[참조: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 53, 299-303(1989)]에 기술된 전기천공 방법을 사용하여 플라스미드 pEC-K18mob2glkexp로 형질전환시킨다. 당해 형질전환체를, 25mg/l의 카나마이신이 보충된, 18.5g/l의 뇌-심장 주입(BHI) 브로쓰, 0.5M 소르비톨, 5g/l의 박토 트립톤, 2.5g/l의 박토 효모 추출물, 5g/l의 NaCl 및 18g/l의 박토 아가로 이루어진 LBHIS 아가상에서 선별한다. 배양을 2일 동안 33℃에서 수행한다.

플라스미드 DNA를 통상의 방법[참조: Peters-Wendisch et al., Microbiology 1998, 144: 915-927(1998)]으로 형질전환체로부터 분리하고, 제한 엔도뉴클레아제EcoRI 및 XbaI으로 절단한 다음, 이어서 당해 플라스미드를 겔 전기영동으로 확인한다. 수득된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 RES167/pEC-K18mob2glkexp로 명명한다.

실시예 5

리신의 제조

실시예 4에서 수득한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 RES167/pEC-K18mob2glkexp를 리신 제조에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상층액중의 리신 함량을 측정한다.

이를 위하여, 당해 균주를 일차적으로 적절한 항생제(카나마이신(25mg/l)를 함유하는 뇌-심장 아가)와 함께 아가 플레이트상에서 24시간 동안 33℃에서 배양한다. 이러한 아가 플레이트 배지를 사용하여 예비배양물(100ml의 에를렌마이에르 플라스크중의 10ml 배지)을 접종한다. 완전한 배지 CgIII을 예비배양물의 배지로서 사용한다.

배지 CgIII

NaCl 2.5g/l

박토-펩톤 10g/l

박토-효모 추출물 10g/l

글루코즈(별도로 오토클레이빙) 2%(w/v)

pH를 7.4로 조절한다.

이 배지에 카나마이신(25mg/l)를 가한다. 예비배양물을 진탕기에서 16시간 동안 33℃에서 240rpm으로 진탕시키면서 항온처리한다. 주 배양물의 초기 흡광도(660nm)가 0.05가 되도록, 상기 예비배양물로 부터 주 배양물을 접종시킨다. 주 배양을 위해 배지 MM을 사용한다.

배지 MM

CSL(옥수수 침적액) 5g/l

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/l

글루코즈(별도로 오토클레이빙) 50g/l

(NH₄)₂SO₄25g/l

KH₂PO₄0.1g/l

MgSO₄·7H₂O 1.0g/l

CaCl₂·2H₂O 10mg/l

FeSO₄·7H₂O 10mg/l

MnSO₄·H₂O 5.0mg/l

비오틴(멸균 여과) 0.3mg/l

티아민-HCl(멸균 여과) 0.2mg/l

CaCO₃25g/l

CSL, MOPS 및 염 용액을 수성 암모니아를 사용하여 pH 7로 조절하고, 오토클레이빙한다. 이어서, 멸균 기질과 비타민 용액 및 무수-오토클레이빙 CaCO₃를 가한다.

배양을, 배플이 있는 100ml의 에를렌마이에르 플라스크내에서 10ml의 용적으로 수행한다. 카나마이신(25mg/l)을 가한다. 배양을 33℃ 및 80% 대기 습도하에 수행한다.

72시간 후, OD를 Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)를 사용하여 660nm의 파장에서 측정한다. 생성된 리신의 양을, 독일 함부르크에 소재하는 에펜도르프-바이오트로닉(Eppendorf-BioTronik)사의 아미노산 분석기를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 이용한 포스트-컬럼 유도화로 측정한다.

시험 결과는 표 1에 제시되어 있다.

균주	OD(660)	리신·HCl(mg/l)
코리네박테리움 글루타미쿰 RES167	13.8	287
코리네박테리움 글루타미쿰 RES167/pEC-18mob2glkexp	15	345

본 발명에 따르면, 발효에 의해 아미노산, 특히 L-리신을 개선된 방법으로 생산할 수 있다.

Claims

a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드,

b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오티드 서열중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 서열을 포함하는, 코리네형 박테리아로 부터 수득된 분리된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 코리네형 박테리아에서 복제가능한 바람직한 재조합 DNA인 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서,

(i) 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열,

(ii) 유전암호의 축퇴성 범위내에서 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드를 형성하는 하나 이상의 서열, 및 임의로,

(iv) 서열 (i)중의 기능상 중성 센스 돌연변이체를 포함하는, 복제가능한 DNA인 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
제1항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
제6항에 따른 벡터를 포함하는 코리네형 박테리아.
a) 글루코키나제 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자가 증폭된, 특히 과발현된, L-아미노산 생산-코리네형 박테리아의 발효 단계,

b) 배지 또는 박테리아 세포중 L-아미노산의 농축 단계,

c) L-아미노산의 분리 단계를 수행하여, L-아미노산을 발효적으로 생산하는 방법.
제8항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 또 다른 유전자가 추가로 증폭된 박테리아를 사용하는 방법.
제8항에 있어서, L-아미노산의 생성을 감소시키는 대사 경로가 부분적으로나 전체적으로 차단된 박테리아를 사용하는 방법.
제8항에 있어서, 글루코키나제 효소를 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 수반하는 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주를 사용하는 방법.
제8항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, L-리신을 생산하는 코리네형 박테리아를 사용하는 방법.
제9항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
제9항에 있어서, 피드백-내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
제9항에 있어서, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
제9항에 있어서, 트리오즈포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
제9항에 있어서, 3-포스페이트 글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
제9항에 있어서, 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
제9항에 있어서, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
제9항에 있어서, 리신 수송체를 암호화하는 lysE 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
제10항에 있어서, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자가 동시에 감쇠되는 방법.
제10항에 있어서, 포스포엔올피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자가 동시에 감쇠되는 방법.