JP2001204481A - ｇｌｋ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 - Google Patents
ｇｌｋ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ｇｌｋ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチ
ド配列 【解決手段】 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくと
も７０％まで同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５個の連続する塩基を有するポリヌクレオチ
ド、の群から選択されたポリヌクレオチド配列を有す
る、コリネフォルム細菌から単離したポリヌクレオチ
ド、ｇｌｋ−遺伝子の強化によるＬ−アミノ酸の発酵に
よる製法。
ド配列 【解決手段】 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくと
も７０％まで同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５個の連続する塩基を有するポリヌクレオチ
ド、の群から選択されたポリヌクレオチド配列を有す
る、コリネフォルム細菌から単離したポリヌクレオチ
ド、ｇｌｋ−遺伝子の強化によるＬ−アミノ酸の発酵に
よる製法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の課題は、ｇｌｋ−遺
伝子をコードするヌクレオチド配列およびｇｌｋ−遺伝
子が強化されたコリネフォルム細菌を使用してＬ−アミ
ノ酸、特にＬ−リシンを発酵により製造するための方法
である。
伝子をコードするヌクレオチド配列およびｇｌｋ−遺伝
子が強化されたコリネフォルム細菌を使用してＬ−アミ
ノ酸、特にＬ−リシンを発酵により製造するための方法
である。
【０００２】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンはヒト医学
および医薬産業に、特に動物の飼料に使用される。
および医薬産業に、特に動物の飼料に使用される。
【０００３】Ｌ−アミノ酸がコリネフォルム細菌の菌
株、特にコリネバクテリウム・グルタミクムの発酵によ
り製造されることは公知である。この物質は非常に重要
であるので、この製法に関する改良は常に研究されてい
る。この方法の改良は、発酵技術における処置、例えば
攪拌および酸素の供給、または培地の組成、例えば発酵
の間の糖濃度、または例えばイオン交換クロマトグラフ
ィーによる生産物形への処理、または微生物の本来の性
能特性自体に関する。
株、特にコリネバクテリウム・グルタミクムの発酵によ
り製造されることは公知である。この物質は非常に重要
であるので、この製法に関する改良は常に研究されてい
る。この方法の改良は、発酵技術における処置、例えば
攪拌および酸素の供給、または培地の組成、例えば発酵
の間の糖濃度、または例えばイオン交換クロマトグラフ
ィーによる生産物形への処理、または微生物の本来の性
能特性自体に関する。
【０００４】この微生物の性能特性を改良するために、
突然変異誘発、選択および突然変異体の選択の方法を使
用する。このようにして、代謝拮抗物質、例えばリシン
類似物質であるＳ−（２−アミノエチル）−システイン
に対して耐性であるかまたは制御に重要な物質代謝生成
物に対して栄養要求性であり、かつＬ−アミノ酸、例え
ばＬ−リシンを生産する、菌株を得る。
突然変異誘発、選択および突然変異体の選択の方法を使
用する。このようにして、代謝拮抗物質、例えばリシン
類似物質であるＳ−（２−アミノエチル）−システイン
に対して耐性であるかまたは制御に重要な物質代謝生成
物に対して栄養要求性であり、かつＬ−アミノ酸、例え
ばＬ−リシンを生産する、菌株を得る。
【０００５】ここ数年、コリネバクテリウムのアミノ酸
生産性菌株の菌株改良のための組み換えＤＮＡ−技術の
方法も同様に使用され、その際個々のＬ−アミノ酸の生
合成遺伝子を増幅し、かつＬ−アミノ酸生産への影響を
調査する。このことに関する概要文献は、特にキノシタ
（“Glutamic Acid Bacteria”,in: Biology of Indust
rial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Be
njamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142）、Hill
iger（BioTec 2, 40-44(1991)）、Eggeling（Amino Aci
ds 6:261-272(1994)）、JettenおよびSinskey（Critica
l Reviews in Biotechnology 15, 73-103(1995)）およ
びSahm等（Annuals of the New York Academy of Scien
ce 782, 25-39(1996)）に見いだされる。
生産性菌株の菌株改良のための組み換えＤＮＡ−技術の
方法も同様に使用され、その際個々のＬ−アミノ酸の生
合成遺伝子を増幅し、かつＬ−アミノ酸生産への影響を
調査する。このことに関する概要文献は、特にキノシタ
（“Glutamic Acid Bacteria”,in: Biology of Indust
rial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Be
njamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142）、Hill
iger（BioTec 2, 40-44(1991)）、Eggeling（Amino Aci
ds 6:261-272(1994)）、JettenおよびSinskey（Critica
l Reviews in Biotechnology 15, 73-103(1995)）およ
びSahm等（Annuals of the New York Academy of Scien
ce 782, 25-39(1996)）に見いだされる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、Ｌ−
アミノ酸、特にＬ−リシンの改良された発酵による製造
のための新規方法を提供することである。
アミノ酸、特にＬ−リシンの改良された発酵による製造
のための新規方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−
リシン、はヒト医学、医薬産業および特に動物飼料にお
いて、その適用が見いだされる。従って、Ｌ−アミノ
酸、特にＬ−リシンを製造するための新規改良された方
法を構築することにも、一般的な興味が存在する。
リシン、はヒト医学、医薬産業および特に動物飼料にお
いて、その適用が見いだされる。従って、Ｌ−アミノ
酸、特にＬ−リシンを製造するための新規改良された方
法を構築することにも、一般的な興味が存在する。
【０００８】以下にＬ−リシンまたはリシンと記載した
場合には、この表現で塩基だけでなく塩、例えばリシン
−モノ塩酸塩またはリシン硫酸塩をも意味する。
場合には、この表現で塩基だけでなく塩、例えばリシン
−モノ塩酸塩またはリシン硫酸塩をも意味する。
【０００９】本発明の対象は、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％まで同
一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有するポリヌ
クレオチド、の群から選択されたポリヌクレオチド配列
を有する、コリネフォルム細菌から得られた単離したポ
リヌクレオチドである。
コードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％まで同
一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有するポリヌ
クレオチド、の群から選択されたポリヌクレオチド配列
を有する、コリネフォルム細菌から得られた単離したポ
リヌクレオチドである。
【００１０】本発明の対象は同様に、コリネフォルム細
菌中で複製可能な、有利には組み換え、ＤＮＡであるポ
リヌクレオチドである。
菌中で複製可能な、有利には組み換え、ＤＮＡであるポ
リヌクレオチドである。
【００１１】同様に本発明の対象はＲＮＡであるポリヌ
クレオチドである。
クレオチドである。
【００１２】同様に本発明の対象は請求項１のポリヌク
レオチド配列であり、この際このポリヌクレオチド配列
は有利に、（ｉ）配列番号１中に記載されたヌクレオチ
ド配列、または（ｉｉ）配列（ｉ）に遺伝学的コードの
縮重範囲内で相当する配列少なくとも１つ、または（ｉ
ｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列とハイ
ブリダイズする配列少なくとも１つ、および場合により
（ｉｖ）（ｉ）中での機能中立センス突然変異、を有す
る複製可能なＤＮＡである。
レオチド配列であり、この際このポリヌクレオチド配列
は有利に、（ｉ）配列番号１中に記載されたヌクレオチ
ド配列、または（ｉｉ）配列（ｉ）に遺伝学的コードの
縮重範囲内で相当する配列少なくとも１つ、または（ｉ
ｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列とハイ
ブリダイズする配列少なくとも１つ、および場合により
（ｉｖ）（ｉ）中での機能中立センス突然変異、を有す
る複製可能なＤＮＡである。
【００１３】更なる対象は、請求項１中に記載されてい
るようなポリペプチドを有するベクター、および前記ベ
クターを含有する宿主細胞として使用されるコリネフォ
ルム細菌である。
るようなポリペプチドを有するベクター、および前記ベ
クターを含有する宿主細胞として使用されるコリネフォ
ルム細菌である。
【００１４】本発明の対象は同様に、配列番号１に相当
するポリヌクレオチド配列を有する完全な遺伝子を含有
する、相応する遺伝子ライブラリーと、前記配列番号１
のポリヌクレオチドの配列またはそのフラグメントを含
有するプローブとのハイブリダイゼーションを用いてス
クリーニングし、かつ前記ＤＮＡ−配列を単離すること
により得られるポリヌクレオチド配列から主に構成され
るポリヌクレオチドである。
するポリヌクレオチド配列を有する完全な遺伝子を含有
する、相応する遺伝子ライブラリーと、前記配列番号１
のポリヌクレオチドの配列またはそのフラグメントを含
有するプローブとのハイブリダイゼーションを用いてス
クリーニングし、かつ前記ＤＮＡ−配列を単離すること
により得られるポリヌクレオチド配列から主に構成され
るポリヌクレオチドである。
【００１５】本発明によるポリヌクレオチド配列は、グ
ルコキナーゼをコードするｃＤＮＡを完全な長さで単離
するために、かつグルコキナーゼ−遺伝子の配列と高い
類似性の配列を有するｃＤＮＡまたは遺伝子を単離する
ために、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブ
リッド形成−プローブとして好適である。
ルコキナーゼをコードするｃＤＮＡを完全な長さで単離
するために、かつグルコキナーゼ−遺伝子の配列と高い
類似性の配列を有するｃＤＮＡまたは遺伝子を単離する
ために、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブ
リッド形成−プローブとして好適である。
【００１６】更に、本発明のポリヌクレオチド配列はグ
ルコキナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡのポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による製造のためのプライマーと
して好適である。
ルコキナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡのポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による製造のためのプライマーと
して好適である。
【００１７】プローブとしてまたはプライマーとして働
くオリゴヌクレオチドは少なくとも３０個の、有利には
少なくとも２０個の、特に有利には少なくとも１５個の
連続したヌクレオチドを含有する。同様に、少なくとも
４０または５０個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレ
オチドも好適である。
くオリゴヌクレオチドは少なくとも３０個の、有利には
少なくとも２０個の、特に有利には少なくとも１５個の
連続したヌクレオチドを含有する。同様に、少なくとも
４０または５０個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレ
オチドも好適である。
【００１８】“単離”とは、天然の環境から分離するこ
とを意味する。
とを意味する。
【００１９】“ポリヌクレオチド”とは、一般的にポリ
リボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチド
を意味し、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡをも意味することができる。
リボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチド
を意味し、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡをも意味することができる。
【００２０】“ポリペプチド”とは、ペプチド結合を介
して結合する２個以上のアミノ酸を有するペプチドまた
はタンパク質を意味する。
して結合する２個以上のアミノ酸を有するペプチドまた
はタンパク質を意味する。
【００２１】本発明によるポリペプチドは配列番号２の
ポリペプチドを包含し、特にグルコキナーゼの生物学的
活性を有するもの、および配列番号２のポリペプチドと
少なくとも７０％まで、有利には少なくとも８０％まで
同一のもの、特に配列番号２に記載のポリペプチドと少
なくとも９０％から９５％まで同一でありかつ前記の活
性を有するものである。
ポリペプチドを包含し、特にグルコキナーゼの生物学的
活性を有するもの、および配列番号２のポリペプチドと
少なくとも７０％まで、有利には少なくとも８０％まで
同一のもの、特に配列番号２に記載のポリペプチドと少
なくとも９０％から９５％まで同一でありかつ前記の活
性を有するものである。
【００２２】更に、本発明はコリネフォルム細菌を使用
してＬ−アミノ酸、特にＬ−リシンを発酵により製造す
る方法に関し、この細菌は特にすでにＬ−アミノ酸を生
産し、かつこの細菌中でｇｌｋ−遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列が強化され、特に過剰発現されるコリネ
フォルム細菌である。
してＬ−アミノ酸、特にＬ−リシンを発酵により製造す
る方法に関し、この細菌は特にすでにＬ−アミノ酸を生
産し、かつこの細菌中でｇｌｋ−遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列が強化され、特に過剰発現されるコリネ
フォルム細菌である。
【００２３】概念“強化”とはここでは、例えば１つま
たは複数の遺伝子のコピー数を上昇させるか、強力なプ
ロモーターを使用するか、または高い活性を有する相応
する酵素をコードする遺伝子を使用するか、または場合
によりこれらの処置を組み合わせることにより、微生物
中の相応するＤＮＡをコードする１種以上の酵素の細胞
内活性の上昇を記載している。
たは複数の遺伝子のコピー数を上昇させるか、強力なプ
ロモーターを使用するか、または高い活性を有する相応
する酵素をコードする遺伝子を使用するか、または場合
によりこれらの処置を組み合わせることにより、微生物
中の相応するＤＮＡをコードする１種以上の酵素の細胞
内活性の上昇を記載している。
【００２４】本発明の対象である微生物は、Ｌ−アミノ
酸、特にＬ−リシンをグルコース、サッカロース、ラク
トース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、
セルロースから又はグリセリンとエタノールとから製造
できる。この代表的なものはコリネフォルム細菌であ
り、特にコリネバクテリウム属のものである。コリネバ
クテリウム属においては特にコリネバクテリウム・グル
タミクム（Corynebacterium glutamicum）の種が挙げら
れ、これはこの専門分野においてＬ−アミノ酸を産生す
る能力が公知である。
酸、特にＬ−リシンをグルコース、サッカロース、ラク
トース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、
セルロースから又はグリセリンとエタノールとから製造
できる。この代表的なものはコリネフォルム細菌であ
り、特にコリネバクテリウム属のものである。コリネバ
クテリウム属においては特にコリネバクテリウム・グル
タミクム（Corynebacterium glutamicum）の種が挙げら
れ、これはこの専門分野においてＬ−アミノ酸を産生す
る能力が公知である。
【００２５】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミクム種の好適な菌株は例えば公知の野
生型株の、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣ
Ｃ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミク
ム（Corynebacterium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１
５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
（Corynebacterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３
８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Co
rynebacterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−
１５３９、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Coryne
bacterium melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５、ブレ
ビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavum）
ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ェルメンツム（Brevibacterium lactofermentum） Ａ
ＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム・ジバリカ
ツム（Brevibacterium divaricatum） ＡＴＣＣ１４０
２０、およびこれらから製造された、Ｌ−リシン生産性
突然変異体もしくは菌株、例えば、 コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４および コリネバクテリウム・グルタミクム ＤＳＭ５７１５ である。
リウム・グルタミクム種の好適な菌株は例えば公知の野
生型株の、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣ
Ｃ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミク
ム（Corynebacterium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１
５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
（Corynebacterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３
８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Co
rynebacterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−
１５３９、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Coryne
bacterium melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５、ブレ
ビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavum）
ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ェルメンツム（Brevibacterium lactofermentum） Ａ
ＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム・ジバリカ
ツム（Brevibacterium divaricatum） ＡＴＣＣ１４０
２０、およびこれらから製造された、Ｌ−リシン生産性
突然変異体もしくは菌株、例えば、 コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４および コリネバクテリウム・グルタミクム ＤＳＭ５７１５ である。
【００２６】本発明により、酵素グルコキナーゼ（ＥＣ
２.７.１.２）をコードする、新規ｇｌｋ−遺伝子を
コリネバクテリウム・グルタミクムから単離することが
達せられた。
２.７.１.２）をコードする、新規ｇｌｋ−遺伝子を
コリネバクテリウム・グルタミクムから単離することが
達せられた。
【００２７】コリネバクテリウム・グルタミクムのｇｌ
ｋ−遺伝子またはその他の遺伝子を単離するために、最
初にこの微生物の遺伝子ライブラリーをＥ.コリ中に導
入する。遺伝子ライブラリーの導入は一般に公知の教書
およびハンドブックに記載されている。例としてはウィ
ンナッカーの教書：Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einfuehrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie,
Weinheim, Deutschland, 1990)またはサンブルーク等の
ハンドブック：Sambrook et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989)を挙げることができる。十分に知られる
遺伝子ライブラリーはコハラ等により（Cell 50, 495-5
08 (1987)）λ−ベクター中に導入された、Ｅ.コリ Ｋ
−１２菌株Ｗ３１１０の遺伝子ライブラリーである。バ
セ等（Bathe et al.）はコスミドベクターＳｕｐｅｒＣ
ｏｓ Ｉ（Wahl et al., 1987, Proceedings of the Nat
ional Academy of Sciences USA, 84 : 2160-2164）を
用いてＥ.コリ Ｋ-１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et a
l., 1988, Nucleic Acids Resaearch 16 : 1563-1575）
中に導入されたコリネバクテリウム・グルタミクム Ａ
ＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載している
（Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 19
96）。ベールマン等（Boermann et al., Molecular Mic
robiology 6(3), 317-326(1992)）はコスミドｐＨＣ７
９（Hohn und Collins, Gene 11, 291-298(1980)）の使
用下にコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３
０３２の遺伝子ライブラリーを記載している。Ｅ.コリ
中にコリネバクテリウム・グルタミクムの遺伝子ライブ
ラリーを製造するためには、プラスミド、例えば、ｐＢ
Ｒ３２２（Bolivar, Life Scieces, 25, 807-818 (197
9)）またはｐＵＣ９（Vieira et al., 1982, Gene, 19
: 259-268）も使用することができる。宿主としては特
に、制限欠損および組み換え欠損を有する、Ｅ.コリ−
菌株が好適である。これに関する例は、Grant等により
記載された（Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649）菌株ＤＨ５αｍ
ｃｒである。コスミドを用いてクローニングした長いＤ
ＮＡ−フラグメントを、配列決定に好適な常用のベクタ
ー中で再びサブクローニングし、引き続き例えばSanger
等により記載されているように（Proceedings of the N
ational Academy of SciencesUSA, 74 (1977) 5463-546
7）配列決定する。
ｋ−遺伝子またはその他の遺伝子を単離するために、最
初にこの微生物の遺伝子ライブラリーをＥ.コリ中に導
入する。遺伝子ライブラリーの導入は一般に公知の教書
およびハンドブックに記載されている。例としてはウィ
ンナッカーの教書：Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einfuehrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie,
Weinheim, Deutschland, 1990)またはサンブルーク等の
ハンドブック：Sambrook et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989)を挙げることができる。十分に知られる
遺伝子ライブラリーはコハラ等により（Cell 50, 495-5
08 (1987)）λ−ベクター中に導入された、Ｅ.コリ Ｋ
−１２菌株Ｗ３１１０の遺伝子ライブラリーである。バ
セ等（Bathe et al.）はコスミドベクターＳｕｐｅｒＣ
ｏｓ Ｉ（Wahl et al., 1987, Proceedings of the Nat
ional Academy of Sciences USA, 84 : 2160-2164）を
用いてＥ.コリ Ｋ-１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et a
l., 1988, Nucleic Acids Resaearch 16 : 1563-1575）
中に導入されたコリネバクテリウム・グルタミクム Ａ
ＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載している
（Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 19
96）。ベールマン等（Boermann et al., Molecular Mic
robiology 6(3), 317-326(1992)）はコスミドｐＨＣ７
９（Hohn und Collins, Gene 11, 291-298(1980)）の使
用下にコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３
０３２の遺伝子ライブラリーを記載している。Ｅ.コリ
中にコリネバクテリウム・グルタミクムの遺伝子ライブ
ラリーを製造するためには、プラスミド、例えば、ｐＢ
Ｒ３２２（Bolivar, Life Scieces, 25, 807-818 (197
9)）またはｐＵＣ９（Vieira et al., 1982, Gene, 19
: 259-268）も使用することができる。宿主としては特
に、制限欠損および組み換え欠損を有する、Ｅ.コリ−
菌株が好適である。これに関する例は、Grant等により
記載された（Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649）菌株ＤＨ５αｍ
ｃｒである。コスミドを用いてクローニングした長いＤ
ＮＡ−フラグメントを、配列決定に好適な常用のベクタ
ー中で再びサブクローニングし、引き続き例えばSanger
等により記載されているように（Proceedings of the N
ational Academy of SciencesUSA, 74 (1977) 5463-546
7）配列決定する。
【００２８】このようにして、配列番号１として本発明
の構成分である、遺伝子ｇｌｋをコードするコリネフォ
ルム・グルタミクムの新規ＤＮＡ−配列が得られた。更
に、該ＤＮＡ配列から前記方法を用いて相応する蛋白質
のアミノ酸配列を誘導した。配列番号２には得られたｇ
ｌｋ−遺伝子生成物のアミノ酸配列が示されている。
の構成分である、遺伝子ｇｌｋをコードするコリネフォ
ルム・グルタミクムの新規ＤＮＡ−配列が得られた。更
に、該ＤＮＡ配列から前記方法を用いて相応する蛋白質
のアミノ酸配列を誘導した。配列番号２には得られたｇ
ｌｋ−遺伝子生成物のアミノ酸配列が示されている。
【００２９】配列番号１から遺伝学的コードの縮重の範
囲で得られる、コードするＤＮＡ−配列は同様に本願発
明の構成分である。更に、専門分野においては保存的な
アミノ酸交換、例えば蛋白質中でのグリシンのアラニン
への置換またはアスパラギン酸のグルタミン酸への置換
は“センス突然変異”として公知であり、この突然変異
は蛋白質の活性の根本的な変化に導かない、すなわち機
能中立である。更に、蛋白質のＮ−および／またはＣ−
末端での変化はその機能に著しい影響を与えないかまた
はむしろ安定化するということは公知である。これに関
する記載は特にBen-Bassat等（Journal of Bacteriolog
y 169: 751-757(1987)）、O'Regan等（Gene 77: 237-2
51(1989)）、Sahin-Toth等（Protein Sciences 3: 240-
247(1994)）、Hochuli等（Bio/Technology 6: 1321-132
5(1988)）において、および遺伝学および分子生物学の
公知教科書中に見いだすことができる。相応する方法で
配列番号２から得られるアミノ酸配列およびこのアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ−配列は、同様に本発明の構
成分である。
囲で得られる、コードするＤＮＡ−配列は同様に本願発
明の構成分である。更に、専門分野においては保存的な
アミノ酸交換、例えば蛋白質中でのグリシンのアラニン
への置換またはアスパラギン酸のグルタミン酸への置換
は“センス突然変異”として公知であり、この突然変異
は蛋白質の活性の根本的な変化に導かない、すなわち機
能中立である。更に、蛋白質のＮ−および／またはＣ−
末端での変化はその機能に著しい影響を与えないかまた
はむしろ安定化するということは公知である。これに関
する記載は特にBen-Bassat等（Journal of Bacteriolog
y 169: 751-757(1987)）、O'Regan等（Gene 77: 237-2
51(1989)）、Sahin-Toth等（Protein Sciences 3: 240-
247(1994)）、Hochuli等（Bio/Technology 6: 1321-132
5(1988)）において、および遺伝学および分子生物学の
公知教科書中に見いだすことができる。相応する方法で
配列番号２から得られるアミノ酸配列およびこのアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ−配列は、同様に本発明の構
成分である。
【００３０】同様にして、配列番号１または配列番号１
の一部とハイブリダイズするＤＮＡ−配列は本発明の構
成分である。更に、配列番号１から明らかになる、プラ
イマーの使用下にポリメラーゼ−連鎖反応（ＰＣＲ）に
より製造される、ＤＮＡ−配列は本発明の構成分であ
る。この種のオリゴヌクレオチドは、典型的には少なく
ともヌクレオチド１５個の長さを有する。
の一部とハイブリダイズするＤＮＡ−配列は本発明の構
成分である。更に、配列番号１から明らかになる、プラ
イマーの使用下にポリメラーゼ−連鎖反応（ＰＣＲ）に
より製造される、ＤＮＡ−配列は本発明の構成分であ
る。この種のオリゴヌクレオチドは、典型的には少なく
ともヌクレオチド１５個の長さを有する。
【００３１】ハイブリダイゼーションを用いるＤＮＡ−
配列の同定のための指示は、特にベーリンガーマンハイ
ム社のハンドブック“The DIG System Users Guide for
Filter Hybridization”（Firma Boehringer Mannheim
GmbH; Mannheim, Deutschland, 1993）中におよびリー
ブル等において（Liebl et al.、：International Jour
nal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-26
0）、専門家は見いだすことができる。ポリメラーゼ−
連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ−配列の増幅に関す
る指示は、特にガイトのハンドブック（Gait: Oligonuk
leotide synthesis:a practical approach: IRL Press,
Oxford,UK, 1984）中におよびニュートンおよびグラハ
ムにおいて（Newton and Graham: PCR (Spektrum Akade
mischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994)）、
専門家は見いだすことができる。
配列の同定のための指示は、特にベーリンガーマンハイ
ム社のハンドブック“The DIG System Users Guide for
Filter Hybridization”（Firma Boehringer Mannheim
GmbH; Mannheim, Deutschland, 1993）中におよびリー
ブル等において（Liebl et al.、：International Jour
nal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-26
0）、専門家は見いだすことができる。ポリメラーゼ−
連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ−配列の増幅に関す
る指示は、特にガイトのハンドブック（Gait: Oligonuk
leotide synthesis:a practical approach: IRL Press,
Oxford,UK, 1984）中におよびニュートンおよびグラハ
ムにおいて（Newton and Graham: PCR (Spektrum Akade
mischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994)）、
専門家は見いだすことができる。
【００３２】ｇｌｋ−遺伝子の過剰発現によりコリネフ
ォルム細菌が改良された方法でＬ−アミノ酸、特にＬ−
リシンを生産することが見いだされた。
ォルム細菌が改良された方法でＬ−アミノ酸、特にＬ−
リシンを生産することが見いだされた。
【００３３】過剰発現を達成するために、相応する遺伝
子のコピー数を上昇させるか、または構造遺伝子の上流
に存在するプロモーター領域および制御領域またはリボ
ソーム結合位を突然変異させることができる。同様にし
て構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットが作用
する。誘導可能なプロモーターにより、付加的に発酵的
Ｌ−リシン−生産の過程において発現を上昇させること
も可能である。ｍ−ＲＮＡの寿命を長くする処置によっ
ても同様に発現は改善する。さらに、酵素タンパク質の
分解を阻止することにより同様に酵素活性は強化され
る。遺伝子または遺伝子構成体はプラスミド中に異なる
コピー数で存在するか、または染色体中に組み込まれ、
かつ増幅されていてよい。さらに、該当する遺伝子の過
剰発現は培地の組成および培養操作の変更により達成す
ることもできる。
子のコピー数を上昇させるか、または構造遺伝子の上流
に存在するプロモーター領域および制御領域またはリボ
ソーム結合位を突然変異させることができる。同様にし
て構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットが作用
する。誘導可能なプロモーターにより、付加的に発酵的
Ｌ−リシン−生産の過程において発現を上昇させること
も可能である。ｍ−ＲＮＡの寿命を長くする処置によっ
ても同様に発現は改善する。さらに、酵素タンパク質の
分解を阻止することにより同様に酵素活性は強化され
る。遺伝子または遺伝子構成体はプラスミド中に異なる
コピー数で存在するか、または染色体中に組み込まれ、
かつ増幅されていてよい。さらに、該当する遺伝子の過
剰発現は培地の組成および培養操作の変更により達成す
ることもできる。
【００３４】これに関する教示は、特にマルチン等（Ma
rtin et al.; Bio/Technology 5, 137-146 (1987)）に
より、グエレロ等（Guerrero et al.; Gene 138, 35-41
(1994)）により、ツチヤおよびモリナガ（Bio/Technol
ogy 6, 428-430 (1988)）により、エイクマンズ等（Eik
manns et al. Gene 102, 93-98(1991)）により、ヨーロ
パ特許明細書ＥＰＳ−０４７２８６９号中に、米国特許
第４６０１８９３号明細書中に、シュバルツアーおよび
ピューラー（Schwarzer and Puehler; Bio/Technology
9, 84-87 (1991)）により、ラインシャイド等（Reinsch
eid et al.; Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132(1994)）により、ラバレ等（Labarre et a
l.; Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(1993)）
により、特許出願ＷＯ９６／１５２４６中に、マルンブ
レス等（Malumbres et al.; Gene134, 15-24 (1993)）
により、特開平１０−２２９８９１号公報中に、ヤンセ
ンおよびハマー（Jansen and Hammer ;Biotechnology a
nd Bioengineering 58, 191-195 (1998)）により、マク
リデス（Makrides; Microbiological Reviews 60:512-5
38 (1996)）により、および遺伝子学および分子生物学
の公知教科書中に、記載されている。
rtin et al.; Bio/Technology 5, 137-146 (1987)）に
より、グエレロ等（Guerrero et al.; Gene 138, 35-41
(1994)）により、ツチヤおよびモリナガ（Bio/Technol
ogy 6, 428-430 (1988)）により、エイクマンズ等（Eik
manns et al. Gene 102, 93-98(1991)）により、ヨーロ
パ特許明細書ＥＰＳ−０４７２８６９号中に、米国特許
第４６０１８９３号明細書中に、シュバルツアーおよび
ピューラー（Schwarzer and Puehler; Bio/Technology
9, 84-87 (1991)）により、ラインシャイド等（Reinsch
eid et al.; Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132(1994)）により、ラバレ等（Labarre et a
l.; Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(1993)）
により、特許出願ＷＯ９６／１５２４６中に、マルンブ
レス等（Malumbres et al.; Gene134, 15-24 (1993)）
により、特開平１０−２２９８９１号公報中に、ヤンセ
ンおよびハマー（Jansen and Hammer ;Biotechnology a
nd Bioengineering 58, 191-195 (1998)）により、マク
リデス（Makrides; Microbiological Reviews 60:512-5
38 (1996)）により、および遺伝子学および分子生物学
の公知教科書中に、記載されている。
【００３５】例えば、本発明によるｇｌｋ−遺伝子をプ
ラスミドを用いて過剰発現した。
ラスミドを用いて過剰発現した。
【００３６】プラスミドとしてはコリネフォルム細菌中
で複製されるプラスミドが好適である。多くの公知のプ
ラスミドベクター、例えばｐＺ１（Menkel et al., App
liedand Environmental Microbiology (1989) 64: 549-
554）、ｐＥＫＥ×１（Eikmanns et al., Gene 102: 93
-98(1991)）またはｐＨＳ２-１（Sonnen et al., Gene
107: 69-74(1991)）は潜在プラスミドｐＨＭ１５１９、
ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。他のプラスミドベク
ター、例えばｐＣＧ４（US-A 4489160）またはｐＮＧ２
（Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters
66, 119-124(1990)）またはｐＡＧ１（US-A5158891）に
基づくものは、同様にして使用することができる。
で複製されるプラスミドが好適である。多くの公知のプ
ラスミドベクター、例えばｐＺ１（Menkel et al., App
liedand Environmental Microbiology (1989) 64: 549-
554）、ｐＥＫＥ×１（Eikmanns et al., Gene 102: 93
-98(1991)）またはｐＨＳ２-１（Sonnen et al., Gene
107: 69-74(1991)）は潜在プラスミドｐＨＭ１５１９、
ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。他のプラスミドベク
ター、例えばｐＣＧ４（US-A 4489160）またはｐＮＧ２
（Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters
66, 119-124(1990)）またはｐＡＧ１（US-A5158891）に
基づくものは、同様にして使用することができる。
【００３７】更に、プラスミドベクターを用いて染色体
中に組み込むことにより遺伝子を増幅する方法に適用す
ることのできるプラスミドベクターが好適であり、これ
は例えばReinscheid 等によりｈｏｍ-ｔｈｒＢ-Ｏｐｅ
ｒｏｎの重複または増幅のために記載されている（Appl
ied and Environmental Microbiology 60,126-132(199
4)）。この方法においては、宿主細胞（代表的にはＥ.
コリ）中では複製不可能であるが、コリネバクテリウム
・グルタミクム中では複製可能なプラスミドベクター中
で完全な遺伝子をクローニングする。ベクターとして
は、例えばｐＳＵＰ３０１（Simon et al., Bio/Techno
logy 1, 784-791(1983)）、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ
１９ｍｏｂ（Schaefer et al., Gene 145, 69-73(199
4)）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corporation, Madison,
WI, USA）、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（Shuman(1994). Jo
urnal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-特
許 5487993）、ｐＣＲ（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ（Firma Invitr
ogen, Groningen, Niederlande;Bernard et al., Journ
al of Molecular Biology, 234: 534-541(1993)）また
はｐＥＭ１（Schrumpf et al., 1991, Journal of Bact
eriology 173: 4510-4516）を挙げることができる。増
幅すべき遺伝子を含有するプラスミドベクターは引き続
き接合または形質転換によりコリネバクテリウム・グル
タミクムの所望の菌株中に導入される。接合の方法は例
えばSchaefer等（Applied and Environmental Microbio
logy 60, 756-759(1994)）により記載されている。形質
転換のための方法は例えば、Thierbach等（Applied Mic
robiology and Biotechnology 29, 356-362(1988)）、D
unican und Shivnan（Bio/Technology 7, 1067-1070(19
89)）およびTauch等（FEMS Microbiological Letters 1
23, 343-347(1994)）により記載されている。“クロス
オーバー”−処置による相同的組み換えにより、生じた
菌株は該当する遺伝子の少なくとも２個のコピーを有す
る。
中に組み込むことにより遺伝子を増幅する方法に適用す
ることのできるプラスミドベクターが好適であり、これ
は例えばReinscheid 等によりｈｏｍ-ｔｈｒＢ-Ｏｐｅ
ｒｏｎの重複または増幅のために記載されている（Appl
ied and Environmental Microbiology 60,126-132(199
4)）。この方法においては、宿主細胞（代表的にはＥ.
コリ）中では複製不可能であるが、コリネバクテリウム
・グルタミクム中では複製可能なプラスミドベクター中
で完全な遺伝子をクローニングする。ベクターとして
は、例えばｐＳＵＰ３０１（Simon et al., Bio/Techno
logy 1, 784-791(1983)）、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ
１９ｍｏｂ（Schaefer et al., Gene 145, 69-73(199
4)）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corporation, Madison,
WI, USA）、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（Shuman(1994). Jo
urnal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-特
許 5487993）、ｐＣＲ（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ（Firma Invitr
ogen, Groningen, Niederlande;Bernard et al., Journ
al of Molecular Biology, 234: 534-541(1993)）また
はｐＥＭ１（Schrumpf et al., 1991, Journal of Bact
eriology 173: 4510-4516）を挙げることができる。増
幅すべき遺伝子を含有するプラスミドベクターは引き続
き接合または形質転換によりコリネバクテリウム・グル
タミクムの所望の菌株中に導入される。接合の方法は例
えばSchaefer等（Applied and Environmental Microbio
logy 60, 756-759(1994)）により記載されている。形質
転換のための方法は例えば、Thierbach等（Applied Mic
robiology and Biotechnology 29, 356-362(1988)）、D
unican und Shivnan（Bio/Technology 7, 1067-1070(19
89)）およびTauch等（FEMS Microbiological Letters 1
23, 343-347(1994)）により記載されている。“クロス
オーバー”−処置による相同的組み換えにより、生じた
菌株は該当する遺伝子の少なくとも２個のコピーを有す
る。
【００３８】本発明の更なる対象は、Ｌ−アミノ酸、特
にＬ−リシンの発酵による製法であり、この際、酵素グ
ルコキナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を
有するプラスミドベクターで形質転換した菌株を使用す
る。
にＬ−リシンの発酵による製法であり、この際、酵素グ
ルコキナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を
有するプラスミドベクターで形質転換した菌株を使用す
る。
【００３９】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシン、の生産の
ためにｇｌｋ−遺伝子の他に、所望のＬ−アミノ酸の生
合成経路の遺伝子を強化することも有利であり、こうし
てそれぞれの合成経路、解糖、補充反応、クエン酸サイ
クルまたはアミノ酸搬送の酵素を１種以上過剰発現する
ことが有利である。
ためにｇｌｋ−遺伝子の他に、所望のＬ−アミノ酸の生
合成経路の遺伝子を強化することも有利であり、こうし
てそれぞれの合成経路、解糖、補充反応、クエン酸サイ
クルまたはアミノ酸搬送の酵素を１種以上過剰発現する
ことが有利である。
【００４０】こうして、例えばＬ−リシンの製造のため
には、 ・同時に、ジヒドロジピコリン酸−シンターゼをコード
するｄａｐＡ−遺伝子（ＥＰ−Ｂ−０１９７３３５）、
または ・同時に、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ
をコードするｌｙｓＣ−遺伝子（Kalinowski et al.,
(1990), Molecular and General Genetics 224: 317-32
4）、または ・同時に、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナ
ーゼをコードするｇａｐ−遺伝子（Eikmanns (1992), J
ournal of Bacteriology 174: 6076-6086）、または ・同時に、トリオース燐酸イソメラーゼをコードするｔ
ｐｉ−遺伝子（Eikmanns(1992), Journal of Bacteriol
ogy 174: 6076-6086）、または ・同時に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードす
るｐｇｋ−遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bact
eriology 174: 6076-6086）、または ・同時に、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐ
ｙｃ−遺伝子（Eikmanns(1992), Journal of Bacteriol
ogy 174: 6076-6086）、または ・同時に、マレイン酸−キノン−オキシドレダクターゼ
をコードするｍｑｏ−遺伝子（Molenaar et al., Europ
ean Journal of Biochemistry 254, 395-403(1998)）、
または ・同時に、リシン−搬送をコードするｌｙｓＥ−遺伝子
（ＤＥ−Ａ−１９５４８２２２）が過剰発現される。
には、 ・同時に、ジヒドロジピコリン酸−シンターゼをコード
するｄａｐＡ−遺伝子（ＥＰ−Ｂ−０１９７３３５）、
または ・同時に、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ
をコードするｌｙｓＣ−遺伝子（Kalinowski et al.,
(1990), Molecular and General Genetics 224: 317-32
4）、または ・同時に、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナ
ーゼをコードするｇａｐ−遺伝子（Eikmanns (1992), J
ournal of Bacteriology 174: 6076-6086）、または ・同時に、トリオース燐酸イソメラーゼをコードするｔ
ｐｉ−遺伝子（Eikmanns(1992), Journal of Bacteriol
ogy 174: 6076-6086）、または ・同時に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードす
るｐｇｋ−遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bact
eriology 174: 6076-6086）、または ・同時に、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐ
ｙｃ−遺伝子（Eikmanns(1992), Journal of Bacteriol
ogy 174: 6076-6086）、または ・同時に、マレイン酸−キノン−オキシドレダクターゼ
をコードするｍｑｏ−遺伝子（Molenaar et al., Europ
ean Journal of Biochemistry 254, 395-403(1998)）、
または ・同時に、リシン−搬送をコードするｌｙｓＥ−遺伝子
（ＤＥ−Ａ−１９５４８２２２）が過剰発現される。
【００４１】更に、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンの生
産のために、ｇｌｋ−遺伝子の他に同時に ・ホスホエノールピルビン酸−カルボキシキナーゼをコ
ードするｐｃｋ−遺伝子（ＤＥ１９９５０４０９.１、
ＤＳＭ１３０４７）および／または ・グルコース−６−燐酸イソメラーゼをコードするｐｇ
ｉ−遺伝子（ＵＳ０９／３９６４７８、ＤＳＭ１２９６
９）を弱めることも有利である。
産のために、ｇｌｋ−遺伝子の他に同時に ・ホスホエノールピルビン酸−カルボキシキナーゼをコ
ードするｐｃｋ−遺伝子（ＤＥ１９９５０４０９.１、
ＤＳＭ１３０４７）および／または ・グルコース−６−燐酸イソメラーゼをコードするｐｇ
ｉ−遺伝子（ＵＳ０９／３９６４７８、ＤＳＭ１２９６
９）を弱めることも有利である。
【００４２】更に、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンの生
産のためには、ｇｌｋ−遺伝子の過剰発現とともに、不
所望な副反応を排除することも有利であろう（ナカヤ
マ：“Breeding of Amino Acid Producing Micro-organ
isms”, in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta,Vanek (eds.), Academic Press, L
ondon, UK, 1982）。
産のためには、ｇｌｋ−遺伝子の過剰発現とともに、不
所望な副反応を排除することも有利であろう（ナカヤ
マ：“Breeding of Amino Acid Producing Micro-organ
isms”, in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta,Vanek (eds.), Academic Press, L
ondon, UK, 1982）。
【００４３】本発明により製造した微生物は、Ｌ−アミ
ノ酸、特にＬ−リシンの生産のために、バッチでの連続
的または非連続的方法で（バッチ法培養）または供給バ
ッチ法（供給法）または反復供給バッチ法（反復供給
法）で培養することができる。公知培養法に関する概要
は、クミールの教科書（Chmiel: Bioprozesstechnik 1.
Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fi
scher Verlag, Stuttgart, 1991)）またはストルハスの
教科書（Storhas: Bioreaktoren und periphereEinrich
tungen (Vieweg Verlag, Braunsheweig/Wiesbaden, 199
4)）に記載されている。
ノ酸、特にＬ−リシンの生産のために、バッチでの連続
的または非連続的方法で（バッチ法培養）または供給バ
ッチ法（供給法）または反復供給バッチ法（反復供給
法）で培養することができる。公知培養法に関する概要
は、クミールの教科書（Chmiel: Bioprozesstechnik 1.
Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fi
scher Verlag, Stuttgart, 1991)）またはストルハスの
教科書（Storhas: Bioreaktoren und periphereEinrich
tungen (Vieweg Verlag, Braunsheweig/Wiesbaden, 199
4)）に記載されている。
【００４４】使用されるべき培地は、それぞれの菌株の
要求を好適な方法で満たさなければならない。種々の微
生物の培地に関しては参考書“Manual of Methods for
General Bacteriology”（American Society for Bacte
riology (Washington D.C. ,USA, 1981)）に記載されて
いる。炭素源としては糖および炭水化物、例えばグルコ
ース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マル
トース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油脂、例え
ば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびやし油、および
脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノ
ール酸、アルコール、例えばグリセリンおよびエタノー
ルおよび有機酸、例えば酢酸を使用することができる。
これらの物質は個々にまたは混合物として使用すること
ができる。窒素源としては有機窒素含有化合物、例えば
ペプトン、酵母エキス、肉汁エキス、麦芽エキス、トウ
モロコシ膨潤水、大豆粉および尿素または無機化合物、
例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム
を使用することができる。この窒素源を個別にまたは混
合物として使用することができる。燐源としては、リン
酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸一水素二カリウ
ムまたはこれに相当するナトリウム含有塩を使用するこ
とができる。さらに、培地は成長に必要な金属の塩、例
えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有しなければな
らない。最後に、必須の生長物質、例えばアミノ酸およ
びビタミンを前記物質に加えて使用することができる。
さらに、これに加えて好適な前駆物質を培地に添加する
ことができる。前記添加物質は一回の配合物の形で添加
することも、または好適な方法で培養の間供給すること
もできる。
要求を好適な方法で満たさなければならない。種々の微
生物の培地に関しては参考書“Manual of Methods for
General Bacteriology”（American Society for Bacte
riology (Washington D.C. ,USA, 1981)）に記載されて
いる。炭素源としては糖および炭水化物、例えばグルコ
ース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マル
トース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油脂、例え
ば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびやし油、および
脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノ
ール酸、アルコール、例えばグリセリンおよびエタノー
ルおよび有機酸、例えば酢酸を使用することができる。
これらの物質は個々にまたは混合物として使用すること
ができる。窒素源としては有機窒素含有化合物、例えば
ペプトン、酵母エキス、肉汁エキス、麦芽エキス、トウ
モロコシ膨潤水、大豆粉および尿素または無機化合物、
例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム
を使用することができる。この窒素源を個別にまたは混
合物として使用することができる。燐源としては、リン
酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸一水素二カリウ
ムまたはこれに相当するナトリウム含有塩を使用するこ
とができる。さらに、培地は成長に必要な金属の塩、例
えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有しなければな
らない。最後に、必須の生長物質、例えばアミノ酸およ
びビタミンを前記物質に加えて使用することができる。
さらに、これに加えて好適な前駆物質を培地に添加する
ことができる。前記添加物質は一回の配合物の形で添加
することも、または好適な方法で培養の間供給すること
もできる。
【００４５】培地のｐＨ−制御のために、塩基性化合
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアもしくはアンモニア水または酸性化合物、例えばリ
ン酸または硫酸を好適な方法で使用する。泡形成の制御
のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステ
ルを使用することもできる。プラスミドの安定化の維持
のためにも、培地に好適な選択的に作用する物質、例え
ば抗生物質を添加することができる。好気的条件を維持
するためには、酸素または酸素含有混合物、例えば空気
を培地中に導入する。培地の温度は通常２０〜４５℃で
あり、有利に２５〜４０℃である。培養は、リシンの最
大量が形成されるまで続ける。この目的は通常１０〜１
６０時間で達成される。
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアもしくはアンモニア水または酸性化合物、例えばリ
ン酸または硫酸を好適な方法で使用する。泡形成の制御
のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステ
ルを使用することもできる。プラスミドの安定化の維持
のためにも、培地に好適な選択的に作用する物質、例え
ば抗生物質を添加することができる。好気的条件を維持
するためには、酸素または酸素含有混合物、例えば空気
を培地中に導入する。培地の温度は通常２０〜４５℃で
あり、有利に２５〜４０℃である。培養は、リシンの最
大量が形成されるまで続ける。この目的は通常１０〜１
６０時間で達成される。
【００４６】更に、本発明の対象はＬ−アミノ酸、特に
Ｌ−リシンの発酵による製法であり、この製法において
は、次の工程： ａ）少なくとも酵素グルコキナーゼをコードする遺伝子
が強化され、特に過剰発現される、Ｌ−アミノ酸を生産
するコリネフォルム細菌の発酵、 ｂ）培地中または細菌の細胞中でのＬ−アミノ酸の富
化、および ｃ）Ｌ−アミノ酸の単離、を実施する。
Ｌ−リシンの発酵による製法であり、この製法において
は、次の工程： ａ）少なくとも酵素グルコキナーゼをコードする遺伝子
が強化され、特に過剰発現される、Ｌ−アミノ酸を生産
するコリネフォルム細菌の発酵、 ｂ）培地中または細菌の細胞中でのＬ−アミノ酸の富
化、および ｃ）Ｌ−アミノ酸の単離、を実施する。
【００４７】Ｌ−リシンの分析は、アニオン交換クロマ
トグラフィー、および引き続きニンヒドリンでの誘導体
化により行われ、この方法はスパックマン等により（Sp
ackman et al. : Analytical Chemistry, 30, (1958),
1190）記載されているように実施することができる。
トグラフィー、および引き続きニンヒドリンでの誘導体
化により行われ、この方法はスパックマン等により（Sp
ackman et al. : Analytical Chemistry, 30, (1958),
1190）記載されているように実施することができる。
【００４８】本発明による方法はＬ−アミノ酸、特にＬ
−リシンの発酵による製造に使用される。
−リシンの発酵による製造に使用される。
【００４９】
【実施例】本発明を以下に、実施例につき詳細に説明す
る。
る。
【００５０】実施例１ コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からのゲノムコスミド−遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡをTauch等（1995, Plasmid 33: 168
-179）に記載されているように単離し、制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02）
を用いて部分的に切断した。ＤＮＡ−フラグメントを小
エビアルカリ性ホスファターゼ（Roche Molecular Bioc
hemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibu
ng SAP, Code no. 1758250）を用いて脱ホスホリル化し
た。Stratagene社（La Jolla,USA, Produktbeschreibun
gSuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301）か
らのコスミドベクターSuperCos1のＤＮＡ（Wahl et al.
(1987) Proceedings of the National Academy ofScie
nces USA 84: 2160-2164）を制限酵素ＸｂａＩ（Amersh
am Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschr
eibung XbaI, Code no. 27-0948-02）で切断し、同様に
して小エビアルカリ性ホスファターゼを用いて脱ホスホ
リル化した。引き続き、コスミド−ＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschlan
d, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-0
4）で切断した。このようにして処理したコスミド−Ｄ
ＮＡを処理したＡＴＣＣ１３０３２−ＤＮＡと混合し、
この配合物をＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（Amersham Pharm
acia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T
4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04）で処理した。引き
続き、連結反応混合物をGigapack II XLパッキング抽出
物（Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung
Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217）
を用いてファージ中にパッキングした。Ｅ.コリ菌株Ｎ
Ｍ５５４（Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Resea
rch 16: 1563-1575）の感染のために、この細胞を１０
ｍＭＭｇＳＯ４中に取り込み、このファージ懸濁液の分
割量と混合した。コスミドライブラリーの感染およびそ
の評価はSambrook等（1989, Mokecular Cloning: A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor）により記載され
ているように実施された、この際、細胞をアンピシリン
１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天培地（Lennox,
1955, Virology, 1:190）上に塗布した。３７℃で一夜
インキュベーションした後、組み換えした単独のクロー
ンを選択した。
からのゲノムコスミド−遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡをTauch等（1995, Plasmid 33: 168
-179）に記載されているように単離し、制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02）
を用いて部分的に切断した。ＤＮＡ−フラグメントを小
エビアルカリ性ホスファターゼ（Roche Molecular Bioc
hemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibu
ng SAP, Code no. 1758250）を用いて脱ホスホリル化し
た。Stratagene社（La Jolla,USA, Produktbeschreibun
gSuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301）か
らのコスミドベクターSuperCos1のＤＮＡ（Wahl et al.
(1987) Proceedings of the National Academy ofScie
nces USA 84: 2160-2164）を制限酵素ＸｂａＩ（Amersh
am Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschr
eibung XbaI, Code no. 27-0948-02）で切断し、同様に
して小エビアルカリ性ホスファターゼを用いて脱ホスホ
リル化した。引き続き、コスミド−ＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschlan
d, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-0
4）で切断した。このようにして処理したコスミド−Ｄ
ＮＡを処理したＡＴＣＣ１３０３２−ＤＮＡと混合し、
この配合物をＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（Amersham Pharm
acia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T
4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04）で処理した。引き
続き、連結反応混合物をGigapack II XLパッキング抽出
物（Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung
Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217）
を用いてファージ中にパッキングした。Ｅ.コリ菌株Ｎ
Ｍ５５４（Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Resea
rch 16: 1563-1575）の感染のために、この細胞を１０
ｍＭＭｇＳＯ４中に取り込み、このファージ懸濁液の分
割量と混合した。コスミドライブラリーの感染およびそ
の評価はSambrook等（1989, Mokecular Cloning: A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor）により記載され
ているように実施された、この際、細胞をアンピシリン
１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天培地（Lennox,
1955, Virology, 1:190）上に塗布した。３７℃で一夜
インキュベーションした後、組み換えした単独のクロー
ンを選択した。
【００５１】実施例２ ｇｌｋ−遺伝子の単離および配列決定 単独のコロニーのコスミド−ＤＮＡをQiaprep Spin Min
iprep キット（Product No., 27106, Qiagen, Hilden,
Germany）を用いて、製造業者による記載に従って単離
し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Frei
burg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Pro
duct No. 27-0913-02）で部分的に切断した。このＤＮ
Ａフラグメントを小エビアルカリ性ホスファターゼ（Ro
che Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250）を
用いて脱ホスホリル化した。ゲル電気泳動による分離の
後、コスミドフラグメントを１５００〜２０００ｂｐの
大きさの範囲でQiaExII ゲル抽出キット（Product No.
20021, Qiagen, Hilden, Germany）を用いて行った。In
vitrogen社からの配列決定用ベクターpZero-1のＤＮＡ
（Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero
Background Cloning Kit, Product No. K2500-01）を
制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product N
o. 27-0868-04）を用いて切断した。配列決定用ベクタ
ーpZero-1中へのコスミドフラグメントの連結反応を、S
ambrook等（1989, Molecular Cloning: A Laboratory M
anual, Cold Spring Harbor）に記載されたように実施
し、この際、Ｔ４−リガーゼ（Pharmacia Biotech, Fre
iburg, Deutschland）と共にＤＮＡ−混合物を一夜イン
キュベーションした。引き続き、この連結反応混合物を
Ｅ.コリ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 1990, Proceeding
s of the National Academy of Sciences USA, 87: 464
5-4649））中に、エレクトロポレーションし（Tauch et
al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7）、
かつゼオシン（Zeocin）５０μｇ／ｍｌを有するＬＢ−
寒天培地（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上に塗布
した。組み換えクローンのプラスミド調製はBiorobot 9
600（Product No., 900200, Qiagen, Hilden, German
y）を用いて行った。配列決定はザンガー等によるジデ
オキシチェーンターミネーション法（Sanger et al. 19
77, Proceedings of the National Academy of Science
s U.S.A., 74: 5463-5467）によりZimmermann等による
改変法（1990, Nucleic Acids Research, 18:1067）を
用いて行った。PE Applied Biosystemsの“RR dRhodami
nTerminator Cycle Sequencing Kit”（Product No. 40
3044, Weiterstadt, Deutschland）を使用した。ゲル電
気泳動による分離および配列決定反応の分析は“ABI Pr
ism 377”配列決定装置（PE Applied Biosystems社、We
iterstadt, Deutschland）を用いて、“Rotiphorese NF
Acrylamid/Bisacrylamid”ゲル（２９：１）（Product
No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Gemany）中で行った。
iprep キット（Product No., 27106, Qiagen, Hilden,
Germany）を用いて、製造業者による記載に従って単離
し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Frei
burg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Pro
duct No. 27-0913-02）で部分的に切断した。このＤＮ
Ａフラグメントを小エビアルカリ性ホスファターゼ（Ro
che Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250）を
用いて脱ホスホリル化した。ゲル電気泳動による分離の
後、コスミドフラグメントを１５００〜２０００ｂｐの
大きさの範囲でQiaExII ゲル抽出キット（Product No.
20021, Qiagen, Hilden, Germany）を用いて行った。In
vitrogen社からの配列決定用ベクターpZero-1のＤＮＡ
（Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero
Background Cloning Kit, Product No. K2500-01）を
制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product N
o. 27-0868-04）を用いて切断した。配列決定用ベクタ
ーpZero-1中へのコスミドフラグメントの連結反応を、S
ambrook等（1989, Molecular Cloning: A Laboratory M
anual, Cold Spring Harbor）に記載されたように実施
し、この際、Ｔ４−リガーゼ（Pharmacia Biotech, Fre
iburg, Deutschland）と共にＤＮＡ−混合物を一夜イン
キュベーションした。引き続き、この連結反応混合物を
Ｅ.コリ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 1990, Proceeding
s of the National Academy of Sciences USA, 87: 464
5-4649））中に、エレクトロポレーションし（Tauch et
al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7）、
かつゼオシン（Zeocin）５０μｇ／ｍｌを有するＬＢ−
寒天培地（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上に塗布
した。組み換えクローンのプラスミド調製はBiorobot 9
600（Product No., 900200, Qiagen, Hilden, German
y）を用いて行った。配列決定はザンガー等によるジデ
オキシチェーンターミネーション法（Sanger et al. 19
77, Proceedings of the National Academy of Science
s U.S.A., 74: 5463-5467）によりZimmermann等による
改変法（1990, Nucleic Acids Research, 18:1067）を
用いて行った。PE Applied Biosystemsの“RR dRhodami
nTerminator Cycle Sequencing Kit”（Product No. 40
3044, Weiterstadt, Deutschland）を使用した。ゲル電
気泳動による分離および配列決定反応の分析は“ABI Pr
ism 377”配列決定装置（PE Applied Biosystems社、We
iterstadt, Deutschland）を用いて、“Rotiphorese NF
Acrylamid/Bisacrylamid”ゲル（２９：１）（Product
No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Gemany）中で行った。
【００５２】得られた粗配列データを引き続きStaden-
プログラムパッケージ（1986, Nucleic Acids Reaseac
h, 14: 217-231）バージョン９７-０を適用して、処理
を進めた。ｐＺｅｒｏｌ−誘導体の個々の配列を関連す
るコンティグに統合してまとめた。コンピューターによ
り支持されたコード領域分析はXNIPプログラム（Stade
n, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231）を用
いて、完成された。その先の分析を“BLAST サーチプロ
グラム”（Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res
earch, 25: 3389-3402）を用いて“National Center fo
r BiotechnologyInformation”（NCBI, Bethesda, MD,
USA）の非重複のデータバンクに対して実施した。
プログラムパッケージ（1986, Nucleic Acids Reaseac
h, 14: 217-231）バージョン９７-０を適用して、処理
を進めた。ｐＺｅｒｏｌ−誘導体の個々の配列を関連す
るコンティグに統合してまとめた。コンピューターによ
り支持されたコード領域分析はXNIPプログラム（Stade
n, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231）を用
いて、完成された。その先の分析を“BLAST サーチプロ
グラム”（Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res
earch, 25: 3389-3402）を用いて“National Center fo
r BiotechnologyInformation”（NCBI, Bethesda, MD,
USA）の非重複のデータバンクに対して実施した。
【００５３】得られたヌクレオチド配列を配列番号１中
に示した。ヌクレオチド配列の分析は９６９塩基対のオ
ープンリーディングフレームを示し、これをｇｌｋ−遺
伝子と命名した。このｇｌｋ−遺伝子はアミノ酸３２３
個からなる蛋白質をコードする。
に示した。ヌクレオチド配列の分析は９６９塩基対のオ
ープンリーディングフレームを示し、これをｇｌｋ−遺
伝子と命名した。このｇｌｋ−遺伝子はアミノ酸３２３
個からなる蛋白質をコードする。
【００５４】実施例３ コリネバクテリウム・グルタミクム中のｇｌｋ−遺伝子
を強化するためのシャトルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏ
ｂ２ｇｌｋｅｘｐの製造 ３.１ ｇｌｋ−遺伝子のクローニング 菌株ＡＴＣＣ１３０３２からEikmann等の方法（Microbi
ology 140: 1817-1828(1994)）により染色体ＤＮＡを単
離した。実施例２からコリネバクテリウム・グルタミク
ムに関して知られたｇｌｋ−遺伝子の配列に基づきポリ
メラーゼ連鎖反応のために次のオリゴヌクレオチドを選
択した：
を強化するためのシャトルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏ
ｂ２ｇｌｋｅｘｐの製造 ３.１ ｇｌｋ−遺伝子のクローニング 菌株ＡＴＣＣ１３０３２からEikmann等の方法（Microbi
ology 140: 1817-1828(1994)）により染色体ＤＮＡを単
離した。実施例２からコリネバクテリウム・グルタミク
ムに関して知られたｇｌｋ−遺伝子の配列に基づきポリ
メラーゼ連鎖反応のために次のオリゴヌクレオチドを選
択した：
【００５５】
【外１】
【００５６】この示したプライマーをＡＲＫ Scientifi
c GmbH Biosystems（Darmstadt, Germany）により合成
し、ＰＣＲ−反応をInnis等の標準ＰＣＲ法（PCR proto
cols.A guide to methods and applications, 1990, Ac
ademic Press）によりRocheDiagnostics GmbH社（Mannh
eim, Deutschland）のＰｗｏ−ポリメラーゼを用いて実
施した。このプライマーはポリメラーゼ連鎖反応を用い
て、潜在性プロモーター領域を有するｇｌｋ−遺伝子を
有する約１.４５ｋｂの大きさのＤＮＡ−フラグメント
の増幅を可能にした。増幅されたＤＮＡフラグメントの
ＤＮＡ配列を配列決定により試験した。
c GmbH Biosystems（Darmstadt, Germany）により合成
し、ＰＣＲ−反応をInnis等の標準ＰＣＲ法（PCR proto
cols.A guide to methods and applications, 1990, Ac
ademic Press）によりRocheDiagnostics GmbH社（Mannh
eim, Deutschland）のＰｗｏ−ポリメラーゼを用いて実
施した。このプライマーはポリメラーゼ連鎖反応を用い
て、潜在性プロモーター領域を有するｇｌｋ−遺伝子を
有する約１.４５ｋｂの大きさのＤＮＡ−フラグメント
の増幅を可能にした。増幅されたＤＮＡフラグメントの
ＤＮＡ配列を配列決定により試験した。
【００５７】３.２. Ｅ.コリ−コリネバクテリウム・
グルタミクムシャトルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２
の製造 公知技術により、Ｅ.コリ−コリネバクテリウム・グル
タミクムシャトルベクターを構成した。このベクターは
複製エフェクターｐｅｒを含むプラスミドｐＧＡ１の複
製領域ｒｅｐ（US-A-5175108; Nesvera et al., Jourun
al of Bacteriology 179k 1525-1532(1997)）、カナマ
イシン耐性を仲介するトランスポゾンＴｎ５のａｐｈ
（３′）−ＩＩａ−遺伝子（Beck et al., Gene 19, 32
7-336(1982)）、プラスミドｐＭＢ１の複製領域ｏｒｉ
Ｖ（Sutcliffe, Cold Spring HarborSymposium on Quan
titative Biology 43, 77-90(1979)）、ｌａｑプロモー
ターおよびマルチプルクローニングサイト（multiple c
loning site, ｍcｓ）を含むｌａｃＺα遺伝子フラグメ
ント（Norrender, J.M. et al., Gene 26, 101-106(198
3)）およびプラスミドＲＰ４のｍｏｂ−領域（Simon et
al., Bio/Technology1: 784-791(1983)）を包含する。
構成したベクターをＥ.コリ菌株ＤＨ５α（Hanahan, I
n: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I,IRL-P
ress, Oxford,Washington DC, USA）中に形質転換し
た。プラスミドを有する細胞の選択はカナマイシン２５
ｍｇ／ｌを補填したＬＢ寒天培地（Sambrook et al., M
olecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harb
or, N.Y.）上に形質転換体配合物を塗布することにより
行った。プラスミド−ＤＮＡを形質転換体からQiagen社
のQIAprep Spin Miniprep キットを用いて単離し、制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限し、
引き続きアガロースゲル−電気泳動（０.８％）で検査
した。このプラスミドをｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２と命名
し、図１中に示した。
グルタミクムシャトルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２
の製造 公知技術により、Ｅ.コリ−コリネバクテリウム・グル
タミクムシャトルベクターを構成した。このベクターは
複製エフェクターｐｅｒを含むプラスミドｐＧＡ１の複
製領域ｒｅｐ（US-A-5175108; Nesvera et al., Jourun
al of Bacteriology 179k 1525-1532(1997)）、カナマ
イシン耐性を仲介するトランスポゾンＴｎ５のａｐｈ
（３′）−ＩＩａ−遺伝子（Beck et al., Gene 19, 32
7-336(1982)）、プラスミドｐＭＢ１の複製領域ｏｒｉ
Ｖ（Sutcliffe, Cold Spring HarborSymposium on Quan
titative Biology 43, 77-90(1979)）、ｌａｑプロモー
ターおよびマルチプルクローニングサイト（multiple c
loning site, ｍcｓ）を含むｌａｃＺα遺伝子フラグメ
ント（Norrender, J.M. et al., Gene 26, 101-106(198
3)）およびプラスミドＲＰ４のｍｏｂ−領域（Simon et
al., Bio/Technology1: 784-791(1983)）を包含する。
構成したベクターをＥ.コリ菌株ＤＨ５α（Hanahan, I
n: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I,IRL-P
ress, Oxford,Washington DC, USA）中に形質転換し
た。プラスミドを有する細胞の選択はカナマイシン２５
ｍｇ／ｌを補填したＬＢ寒天培地（Sambrook et al., M
olecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harb
or, N.Y.）上に形質転換体配合物を塗布することにより
行った。プラスミド−ＤＮＡを形質転換体からQiagen社
のQIAprep Spin Miniprep キットを用いて単離し、制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限し、
引き続きアガロースゲル−電気泳動（０.８％）で検査
した。このプラスミドをｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２と命名
し、図１中に示した。
【００５８】次の微生物をＤＳＭＺ（Deutsche Sammlun
g fuer Mikrooruganismen und Zellkulturen; Braunsch
weig, Deutschland）にブタペスト条約により寄託し
た：・コリネバクテリウム・グルタミクム株ＤＳＭ５７
１５／ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２をＤＳＭ１３２４５とし
て。
g fuer Mikrooruganismen und Zellkulturen; Braunsch
weig, Deutschland）にブタペスト条約により寄託し
た：・コリネバクテリウム・グルタミクム株ＤＳＭ５７
１５／ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２をＤＳＭ１３２４５とし
て。
【００５９】３.３. Ｅ.コリ−Ｃ.グルタミクムシャト
ルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２中へのｇｌｋのクロ
ーニング ベクターとしては実施例３.２中に記載したＥ.コリ−コ
リネバクテリウム・グルタミクムシャトルベクターｐＥ
Ｃ−Ｋ１８ｍｏｂ２を使用した。このプラスミドのＤＮ
Ａを制限酵素Ｅｃｌ１３６ＩＩで完全に切断し、引き続
き小エビアルカリ性ホスファターゼ（Roche Diagnostic
s GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250）を用いて脱ホスホリル化
した。
ルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２中へのｇｌｋのクロ
ーニング ベクターとしては実施例３.２中に記載したＥ.コリ−コ
リネバクテリウム・グルタミクムシャトルベクターｐＥ
Ｃ−Ｋ１８ｍｏｂ２を使用した。このプラスミドのＤＮ
Ａを制限酵素Ｅｃｌ１３６ＩＩで完全に切断し、引き続
き小エビアルカリ性ホスファターゼ（Roche Diagnostic
s GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250）を用いて脱ホスホリル化
した。
【００６０】実施例３.１中に記載したようにして得ら
れたｇｌｋ−フラグメントを前記のように準備したベク
ターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２と混合し、この配合物をＴ
４−ＤＮＡ−リガーゼ（Amersham Pharmacia, Freibur
g, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase,
Code no. 27-0870-04）で処理した。このリガーゼ配合
物をＥ.コリ株ＤＨ５αｍｃｒ（Grant, 1990, Prpceedi
ngs of the NationalAcademy of Sciences USA, 87: 46
45-4649）中に形質転換した。プラスミドを有する細胞
の選択をカナマイシン２５ｍｇ／ｌを有するＬＢ−寒天
培地（Lennox,1955, Virology, 1:190）上にこの形質転
換体配合物を塗布することにより実施した。３７℃で一
夜インキュベートした後、組み換えした単独クローンを
選択した。形質転換体からプラスミドＤＮＡをQiaprep
Spin Miniprep キット（Product No., 27106, Qiagen,
Hilden, Germany）を用いて製造者の指示書に従って、
単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて切
断し、引き続きこのプラスミドをアガロースゲル−電気
泳動により検査した。得られたプラスミドをｐＥＣ−１
８ｍｏｂ２ｇｌｋｅｘｐと命名した。これを図２中に示
した。
れたｇｌｋ−フラグメントを前記のように準備したベク
ターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２と混合し、この配合物をＴ
４−ＤＮＡ−リガーゼ（Amersham Pharmacia, Freibur
g, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase,
Code no. 27-0870-04）で処理した。このリガーゼ配合
物をＥ.コリ株ＤＨ５αｍｃｒ（Grant, 1990, Prpceedi
ngs of the NationalAcademy of Sciences USA, 87: 46
45-4649）中に形質転換した。プラスミドを有する細胞
の選択をカナマイシン２５ｍｇ／ｌを有するＬＢ−寒天
培地（Lennox,1955, Virology, 1:190）上にこの形質転
換体配合物を塗布することにより実施した。３７℃で一
夜インキュベートした後、組み換えした単独クローンを
選択した。形質転換体からプラスミドＤＮＡをQiaprep
Spin Miniprep キット（Product No., 27106, Qiagen,
Hilden, Germany）を用いて製造者の指示書に従って、
単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて切
断し、引き続きこのプラスミドをアガロースゲル−電気
泳動により検査した。得られたプラスミドをｐＥＣ−１
８ｍｏｂ２ｇｌｋｅｘｐと命名した。これを図２中に示
した。
【００６１】実施例４ プラスミドｐＥＣ−１８ｍｏｂ２ｇｌｋｅｘｐを用いる
菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＲＥＳ１６７の
形質転換 プラスミドｐＥＣ−１８ｍｏｂ２ｇｌｋｅｘｐを用いて
菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＲＥＳ１６７
（Schaefer, A. et al., Journal Bacteriological 17
6: 7309-731(1994)）をLiebl等（FEMS Microbiology Le
tters, 53: 299-303(1989)）により記載されたエレクト
ロポレーション法を適用して形質転換した。形質転換体
の選択は、カナマイシン２５ｍｇ／ｌが補填された、脳
−心臓浸出液１８.５ｇ／ｌ、ソルビトール０.５Ｍ、バ
クト−トリプトン５ｇ／ｌ、バクト−イースト−抽出液
２.５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌおよびバクト−寒天１
８ｇ／ｌからなるＬＢＨＩＳ寒天培地上で行われた。イ
ンキュベーションを３３℃で２日間行った。
菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＲＥＳ１６７の
形質転換 プラスミドｐＥＣ−１８ｍｏｂ２ｇｌｋｅｘｐを用いて
菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＲＥＳ１６７
（Schaefer, A. et al., Journal Bacteriological 17
6: 7309-731(1994)）をLiebl等（FEMS Microbiology Le
tters, 53: 299-303(1989)）により記載されたエレクト
ロポレーション法を適用して形質転換した。形質転換体
の選択は、カナマイシン２５ｍｇ／ｌが補填された、脳
−心臓浸出液１８.５ｇ／ｌ、ソルビトール０.５Ｍ、バ
クト−トリプトン５ｇ／ｌ、バクト−イースト−抽出液
２.５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌおよびバクト−寒天１
８ｇ／ｌからなるＬＢＨＩＳ寒天培地上で行われた。イ
ンキュベーションを３３℃で２日間行った。
【００６２】プラスミドＤＮＡを形質転換体から常法で
単離し（Peters-Wendisch et al.,1998, Microbiology,
144, 915-927）、制限インドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
およびＸｂａＩで切断し、このプラスミドを次いでアガ
ロースゲル−電気泳動で試験した。得られた菌株をコリ
ネバクテリウム・グルタミクムＲＥＳ１６７／ｐＥＣ−
１８ｍｏｂ２ｇｌｋｅｘｐと命名した。
単離し（Peters-Wendisch et al.,1998, Microbiology,
144, 915-927）、制限インドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
およびＸｂａＩで切断し、このプラスミドを次いでアガ
ロースゲル−電気泳動で試験した。得られた菌株をコリ
ネバクテリウム・グルタミクムＲＥＳ１６７／ｐＥＣ−
１８ｍｏｂ２ｇｌｋｅｘｐと命名した。
【００６３】実施例５ リシンの製造 実施例４により得られたコリネバクテリウム・グルタミ
クム菌株ＲＥＳ１６７／ｐＥＣ−１８ｍｏｂ２ｇｌｋｅ
ｘｐをリシンの生産に好適な培地中で培養し、培地上澄
み中のリシン含量を測定した。
クム菌株ＲＥＳ１６７／ｐＥＣ−１８ｍｏｂ２ｇｌｋｅ
ｘｐをリシンの生産に好適な培地中で培養し、培地上澄
み中のリシン含量を測定した。
【００６４】このためには、この菌株を最初に相応する
抗生物質を有する寒天プレート（カナマイシン（２５ｍ
ｇ／ｌ）を含有する脳−心臓−寒天）上で、３３℃で２
４時間インキュベートした。この寒天プレート培地から
出発し、予培地を接種した（１００ｍｌの三角フラスコ
中に１０ｍｌの培地）。予培養のための培地としては完
全培地ＣｇＩＩＩを使用した。
抗生物質を有する寒天プレート（カナマイシン（２５ｍ
ｇ／ｌ）を含有する脳−心臓−寒天）上で、３３℃で２
４時間インキュベートした。この寒天プレート培地から
出発し、予培地を接種した（１００ｍｌの三角フラスコ
中に１０ｍｌの培地）。予培養のための培地としては完
全培地ＣｇＩＩＩを使用した。
【００６５】 培地Ｃｇ ＩＩＩ ＮａＣｌ ２.５ｇ／ｌ、 バクト−ペプトン １０ｇ／ｌ、 バクトイースト−抽出物 １０ｇ／ｌ、 グルコース（分離してオートクレーブ処理）２％（ｗ／ｖ） ｐＨ−値をｐＨ７.４に調節した。
【００６６】これにカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添
加した。この予培地を振盪器上で３３℃、２４０ｒｐｍ
で１６時間インキュベートした。この予培地から主培養
に接種し、こうして主培養の開始−ＯＤ（６６０ｎｍ）
が０.０５を有した。主培養のためには培地ＭＭを使用
した。
加した。この予培地を振盪器上で３３℃、２４０ｒｐｍ
で１６時間インキュベートした。この予培地から主培養
に接種し、こうして主培養の開始−ＯＤ（６６０ｎｍ）
が０.０５を有した。主培養のためには培地ＭＭを使用
した。
【００６７】 培地 ＭＭ ＣＳＬ（コーンスチープリカー） ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ（モルホリンプロパンスルホン酸） ２０ｇ／ｌ グルコース（分離してオートクレーブ処理） ５０ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０.１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １.０ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ５.０ｍｇ／ｌ ビオチン（滅菌濾過） ０.３ｍｇ／ｌ チアミン・ＨＣｌ（滅菌濾過） ０.２ｍｇ／ｌ ＣａＣＯ３ ２５ｇ／ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液をアンモニア水でｐＨ７
に調節し、かつオートクレーブ処理した。引き続き、滅
菌した基質溶液およびビタミン溶液を添加し、並びに乾
燥オートクレーブ処理したＣａＣＯ３を添加した。
に調節し、かつオートクレーブ処理した。引き続き、滅
菌した基質溶液およびビタミン溶液を添加し、並びに乾
燥オートクレーブ処理したＣａＣＯ３を添加した。
【００６８】培養をじゃま板を備える１００ｍｌ三角フ
ラスコ中に容量１０ｍｌで実施した。カナマイシン（２
５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃で湿度８０％で
行った。
ラスコ中に容量１０ｍｌで実施した。カナマイシン（２
５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃で湿度８０％で
行った。
【００６９】７２時間後、Biomek 1000（Beckmann Inst
ruments GmbH, Muenchen）を用いて、測定波長６６０ｎ
ｍでＯＤを調べた。生じたリシン量はアミノ酸分析装置
（Firma Eppendorf-BioTronik製: Hamburg, Deutschlan
d）を用いて、イオン交換クロマトグラフィーおよびニ
ンヒドリン検出での後カラム誘導体化により決定した。
ruments GmbH, Muenchen）を用いて、測定波長６６０ｎ
ｍでＯＤを調べた。生じたリシン量はアミノ酸分析装置
（Firma Eppendorf-BioTronik製: Hamburg, Deutschlan
d）を用いて、イオン交換クロマトグラフィーおよびニ
ンヒドリン検出での後カラム誘導体化により決定した。
【００７０】表１は実験の結果を示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】
【配列表】
【００７３】
【外２】
【００７４】
【外３】
【００７５】
【外４】
【００７６】
【外５】
【図１】プラスミドｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２を示す図で
ある。
ある。
【図２】プラスミドｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｇｌｋｅｘ
ｐを示す図である。
ｐを示す図である。
図中で示した短縮形は以下の意味を有する： ｐｅｒ ｐＧＡ１からのコピー数を制御するための遺伝
子 ｏｒｉＶ ｐＭＢ１からのＣｏｌＥ１類似オリジン ｒｅｐ Ｃ.グルタミクムプラスミドｐＧＡ１からのプ
ラスミドをコードする複製オリジン ＲＰ４ｍｏｂ ＲＰ４−可動性部位 Ｋａｎ カナマイシンに対する耐性遺伝子 ｇｌｋ コリネバクテリウム・グルタミクムからのｇｌ
ｋ−遺伝子 ｐｆｋ Ｃ.グルタミクムのｐｆｋ−遺伝子 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断位 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断位 Ｅｃｌ１３６ＩＩ 制限酵素Ｅｃｌ１３６ＩＩの切断位
子 ｏｒｉＶ ｐＭＢ１からのＣｏｌＥ１類似オリジン ｒｅｐ Ｃ.グルタミクムプラスミドｐＧＡ１からのプ
ラスミドをコードする複製オリジン ＲＰ４ｍｏｂ ＲＰ４−可動性部位 Ｋａｎ カナマイシンに対する耐性遺伝子 ｇｌｋ コリネバクテリウム・グルタミクムからのｇｌ
ｋ−遺伝子 ｐｆｋ Ｃ.グルタミクムのｐｆｋ−遺伝子 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断位 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断位 Ｅｃｌ１３６ＩＩ 制限酵素Ｅｃｌ１３６ＩＩの切断位
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月２７日（２０００．１２．
２７）
２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７６】
【外５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/14 １０１ Ｃ１２Ｎ 9/88 9/88 9/90 9/90 Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/02 (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/04 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/12 (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/14 (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/88 (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/90 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (22)
- 【請求項１】 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくと
も７０％まで同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有するポリヌ
クレオチド、の群から選択されたポリヌクレオチド配列
を有する、コリネフォルム細菌から得られた単離したポ
リヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがコリネフォルム細菌
中で複製可能な、有利に組み換えＤＮＡである、請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 （ｉ）配列番号１中に記載されたヌクレ
オチド配列、または（ｉｉ）配列（ｉ）に遺伝学的コー
ドの縮重範囲内で相当する配列少なくとも１つ、または
（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列と
ハイブリダイズする配列少なくとも１つ、および場合に
より（ｉｖ）（ｉ）中での機能中立センス突然変異、を
有する、請求項２記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号２に記載されているアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする、請求項２記載の
ポリヌクレオチド配列。 - 【請求項６】 請求項１記載のポリヌクレオチド配列を
有するベクター。 - 【請求項７】 請求項６記載のベクターを有するコリネ
フォルム細菌。 - 【請求項８】 Ｌ−アミノ酸の発酵による製法におい
て、次の工程： ａ）少なくとも酵素グルコキナーゼをコードする遺伝子
が強化され、特に過剰発現される、Ｌ−アミノ酸を生産
するコリネフォルム細菌の発酵、 ｂ）培地中または細菌の細胞中でのＬ−アミノ酸の富
化、および ｃ）Ｌ−アミノ酸の単離、を実施することを特徴とす
る、Ｌ−アミノ酸の発酵による製法。 - 【請求項９】 所望のＬ−アミノ酸の生合成経路のその
他の遺伝子がその中で付加的に強化された細菌を使用す
る請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 Ｌ−アミノ酸の形成を減少させる物質
代謝経路が少なくとも部分的に遮断されている細菌を使
用する請求項８記載の方法。 - 【請求項１１】 プラスミドベクターで形質転換した菌
株を使用し、該プラスミドベクターが酵素グルコキナー
ゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を有する請求
項８記載の方法。 - 【請求項１２】 Ｌ−リシンを製造するコリネフォルム
細菌を使用する請求項８から１１までのいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項１３】 ジヒドロジピコリン酸−シンターゼを
コードするｄａｐＡ−遺伝子が同時に過剰発現される、
請求項９記載の方法。 - 【請求項１４】 フィードバック耐性アスパラギン酸キ
ナーゼをコードするｌｙｓＣ−遺伝子が同時に過剰発現
される、請求項９記載の方法。 - 【請求項１５】 グリセルアルデヒド３−燐酸デヒドロ
ゲナーゼをコードするｇａｐ−遺伝子が同時に過剰発現
される、請求項９記載の方法。 - 【請求項１６】 トリオース燐酸イソメラーゼをコード
するｔｐｉ−遺伝子が同時に過剰発現される、請求項９
記載の方法。 - 【請求項１７】 ３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコ
ードするｐｇｋ−遺伝子が同時に過剰発現される、請求
項９記載の方法。 - 【請求項１８】 ピルビン酸カルボキシラーゼをコード
するｐｙｃ−遺伝子が同時に過剰発現される、請求項９
記載の方法。 - 【請求項１９】 マレイン酸−キノンオキシドレダクタ
ーゼをコードするｍｑｏ−遺伝子が同時に過剰発現され
る、請求項９記載の方法。 - 【請求項２０】 リシン搬送をコードするｌｙｓＥ−遺
伝子が同時に過剰発現される、請求項９記載の方法。 - 【請求項２１】 グルコース−６−燐酸イソメラーゼを
コードするｐｇｉ−遺伝子が同時に弱められる、請求項
１０記載の方法。 - 【請求項２２】 ホスホエノールピルビン酸−カルボキ
シキナーゼをコードするｐｃｋ−遺伝子が同時に弱めら
れる、請求項１０記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE19958159.2 | 1999-12-02 | ||
| DE19958159A DE19958159A1 (de) | 1999-12-02 | 1999-12-02 | Neue für das glk-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001204481A true JP2001204481A (ja) | 2001-07-31 |
Family
ID=7931209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000363632A Pending JP2001204481A (ja) | 1999-12-02 | 2000-11-29 | ｇｌｋ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 |
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|---|---|
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| KR (1) | KR20010062078A (ja) |
| CN (1) | CN1305000A (ja) |
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| CA (1) | CA2325227A1 (ja) |
| DE (1) | DE19958159A1 (ja) |
| HU (1) | HUP0004783A2 (ja) |
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| MX (1) | MXPA00011815A (ja) |
| PL (1) | PL344237A1 (ja) |
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| SK (1) | SK17942000A3 (ja) |
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Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| PT1448186E (pt) * | 2001-11-19 | 2009-03-24 | Medigene Ag | Medicamento para o tratamento de doenças virais da pele e doenças tumorais |
| DE10162730A1 (de) | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Degussa | Allele des glk-Gens aus coryneformen Bakterien |
| US7915018B2 (en) * | 2004-10-22 | 2011-03-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPH07509694A (ja) * | 1992-05-14 | 1995-10-26 | ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン | 突然変異したステロイドホルモン受容体，その使用方法および遺伝子治療のための分子スイッチ |
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| DE19644567A1 (de) * | 1996-10-26 | 1998-04-30 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / II |
| DE19818541C2 (de) * | 1998-04-24 | 2003-04-10 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / III |
| DE19924365A1 (de) * | 1999-05-27 | 2000-11-30 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren und für das accDA Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| KR20070087090A (ko) * | 1999-06-25 | 2007-08-27 | 바스프 악티엔게젤샤프트 | 탄소 대사 및 에너지 생산과 관련된 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 |
| JP4623825B2 (ja) | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
-
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-
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- 2000-11-24 EP EP00125716A patent/EP1106694A1/de not_active Withdrawn
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