JP2001186895A - ｐｆｋ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 - Google Patents
ｐｆｋ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ｐｆｋ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチ
ド配列の提供。 【解決手段】 ａ）コリネバクテリウム・グルタミクム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）由来の特定ののアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％ま
で同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）前記アミノ酸配列と少なくとも７０％まで同一であ
るアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、 ｃ）ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌ
クレオチド、及びｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレ
オチド配列の少なくとも１５個の連続する塩基を有する
ポリヌクレオチド、の群から選択されたポリヌクレオチ
ド配列を有する、コリネフォルム細菌から単離したポリ
ヌクレオチド、ｐｆｋ−遺伝子の強化によるＬ−アミノ
酸の発酵による製法。
ド配列の提供。 【解決手段】 ａ）コリネバクテリウム・グルタミクム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）由来の特定ののアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％ま
で同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）前記アミノ酸配列と少なくとも７０％まで同一であ
るアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、 ｃ）ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌ
クレオチド、及びｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレ
オチド配列の少なくとも１５個の連続する塩基を有する
ポリヌクレオチド、の群から選択されたポリヌクレオチ
ド配列を有する、コリネフォルム細菌から単離したポリ
ヌクレオチド、ｐｆｋ−遺伝子の強化によるＬ−アミノ
酸の発酵による製法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の課題は、ｐｆｋ−遺
伝子をコードするヌクレオチド配列およびｐｆｋ−遺伝
子が強化されたコリネフォルム細菌を使用してアミノ
酸、特にＬ−リシンを発酵により製造するための方法で
ある。
伝子をコードするヌクレオチド配列およびｐｆｋ−遺伝
子が強化されたコリネフォルム細菌を使用してアミノ
酸、特にＬ−リシンを発酵により製造するための方法で
ある。
【０００２】アミノ酸、特にＬ−リシンはヒト医学およ
び医薬産業に、特に動物の飼料に使用される。
び医薬産業に、特に動物の飼料に使用される。
【０００３】アミノ酸がコリネフォルム細菌の菌株、特
にコリネバクテリウム・グルタミクムの発酵により製造
されることは公知である。この物質は非常に重要である
ので、この製法に関する改良は常に研究されている。こ
の方法の改良は、発酵技術における処置、例えば攪拌お
よび酸素の供給、または培地の組成、例えば発酵の間の
糖濃度、または例えばイオン交換クロマトグラフィーに
よる生産物の形への処理、または微生物の本来の性能特
性自体に関する。
にコリネバクテリウム・グルタミクムの発酵により製造
されることは公知である。この物質は非常に重要である
ので、この製法に関する改良は常に研究されている。こ
の方法の改良は、発酵技術における処置、例えば攪拌お
よび酸素の供給、または培地の組成、例えば発酵の間の
糖濃度、または例えばイオン交換クロマトグラフィーに
よる生産物の形への処理、または微生物の本来の性能特
性自体に関する。
【０００４】この微生物の性能特性を改良するために、
突然変異誘発、選択および突然変異体の選択の方法を使
用する。このようにして、代謝拮抗物質、例えばリシン
類似物質Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対し
て耐性であるかまたは制御に重要な物質代謝生成物に対
して栄養要求性であり、かつＬ−アミノ酸、例えばＬ−
リシンを生産する、菌株を得る。
突然変異誘発、選択および突然変異体の選択の方法を使
用する。このようにして、代謝拮抗物質、例えばリシン
類似物質Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対し
て耐性であるかまたは制御に重要な物質代謝生成物に対
して栄養要求性であり、かつＬ−アミノ酸、例えばＬ−
リシンを生産する、菌株を得る。
【０００５】ここ数年、コリネバクテリウムのアミノ酸
生産性菌株の菌株改良のために、組み換えＤＮＡ−技術
の方法も同様に使用され、その際個々のアミノ酸生合成
遺伝子を増幅し、かつアミノ酸生産への影響を調査す
る。このことに関する概要文献は、特にキノシタ（“Gl
utamic Acid Bacteria”,in: Biology of Industrial M
icroorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin
Cummings, London, UK,1985, 115-142）、Hilliger（B
ioTec 2, 40-44(1991)）、Eggeling（Amino Acids 6:26
1-272(1994)）、JettenおよびSinskey（Critical Revie
ws in Biotechnology 15, 73-103(1995)）およびSahm等
（Annuals of the New York Academy ofScience 782, 2
5-39(1996)）に見いだされる。
生産性菌株の菌株改良のために、組み換えＤＮＡ−技術
の方法も同様に使用され、その際個々のアミノ酸生合成
遺伝子を増幅し、かつアミノ酸生産への影響を調査す
る。このことに関する概要文献は、特にキノシタ（“Gl
utamic Acid Bacteria”,in: Biology of Industrial M
icroorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin
Cummings, London, UK,1985, 115-142）、Hilliger（B
ioTec 2, 40-44(1991)）、Eggeling（Amino Acids 6:26
1-272(1994)）、JettenおよびSinskey（Critical Revie
ws in Biotechnology 15, 73-103(1995)）およびSahm等
（Annuals of the New York Academy ofScience 782, 2
5-39(1996)）に見いだされる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、アミ
ノ酸、特にＬ−リシンの改良された発酵による製造のた
めの新規方法を提供することである。
ノ酸、特にＬ−リシンの改良された発酵による製造のた
めの新規方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】アミノ酸、特にＬ−リシ
ン、はヒト医学、医薬産業および特に動物飼料におい
て、その適用が見いだされる。従って、アミノ酸、特に
Ｌ−リシンを製造するための新規改良された方法を構築
することにも、一般的な興味が存在する。
ン、はヒト医学、医薬産業および特に動物飼料におい
て、その適用が見いだされる。従って、アミノ酸、特に
Ｌ−リシンを製造するための新規改良された方法を構築
することにも、一般的な興味が存在する。
【０００８】以下にＬ−リシンまたはリシンと記載した
場合には、この表現で塩基だけでなく塩、例えばリシン
−モノ塩酸塩またはリシン硫酸塩をも意味する。
場合には、この表現で塩基だけでなく塩、例えばリシン
−モノ塩酸塩またはリシン硫酸塩をも意味する。
【０００９】本発明の対象は、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％まで同
一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有するポリヌ
クレオチド、の群から選択されたポリヌクレオチド配列
を有する、コリネフォルム細菌から単離されたポリヌク
レオチドである。
コードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％まで同
一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有するポリヌ
クレオチド、の群から選択されたポリヌクレオチド配列
を有する、コリネフォルム細菌から単離されたポリヌク
レオチドである。
【００１０】同様に本発明の対象は請求項１のポリヌク
レオチド配列であり、この際このポリヌクレオチド配列
は有利に、（ｉ）配列番号１中に記載されたヌクレオチ
ド配列、または（ｉｉ）配列（ｉ）に遺伝学的コードの
縮重範囲内で相当する配列少なくとも１つ、または（ｉ
ｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列とハイ
ブリダイズする配列少なくとも１つ、および場合により
（ｉｖ）（ｉ）中での機能中立センス突然変異、を有す
る複製可能なＤＮＡである。
レオチド配列であり、この際このポリヌクレオチド配列
は有利に、（ｉ）配列番号１中に記載されたヌクレオチ
ド配列、または（ｉｉ）配列（ｉ）に遺伝学的コードの
縮重範囲内で相当する配列少なくとも１つ、または（ｉ
ｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列とハイ
ブリダイズする配列少なくとも１つ、および場合により
（ｉｖ）（ｉ）中での機能中立センス突然変異、を有す
る複製可能なＤＮＡである。
【００１１】更なる対象は、配列番号１中に記載されて
いるようなヌクレオチド配列を有する、請求項４記載の
ポリヌクレオチド、配列番号２中に記載されているよう
なアミノ酸配列を有する、ポリペプチドをコードする、
請求項６記載のポリヌクレオチド、請求項１のポリヌク
レオチドを含有するベクター、特にシャトルベクターま
たはプラスミドベクター、および前記ベクターを含有す
る宿主細胞として使用されるコリネフォルム細菌であ
る。
いるようなヌクレオチド配列を有する、請求項４記載の
ポリヌクレオチド、配列番号２中に記載されているよう
なアミノ酸配列を有する、ポリペプチドをコードする、
請求項６記載のポリヌクレオチド、請求項１のポリヌク
レオチドを含有するベクター、特にシャトルベクターま
たはプラスミドベクター、および前記ベクターを含有す
る宿主細胞として使用されるコリネフォルム細菌であ
る。
【００１２】本発明の対象は同様に、配列番号１に相当
するポリヌクレオチド配列を有する完全な遺伝子を含有
する、相応する遺伝子ライブラリーと、前記配列番号１
のポリヌクレオチドの配列またはそのフラグメントを含
有するプローブとのハイブリダイゼーションを用いてス
クリーニングし、かつ前記ＤＮＡ−配列を単離すること
により得られるポリヌクレオチド配列から主に構成され
るポリヌクレオチドである。
するポリヌクレオチド配列を有する完全な遺伝子を含有
する、相応する遺伝子ライブラリーと、前記配列番号１
のポリヌクレオチドの配列またはそのフラグメントを含
有するプローブとのハイブリダイゼーションを用いてス
クリーニングし、かつ前記ＤＮＡ−配列を単離すること
により得られるポリヌクレオチド配列から主に構成され
るポリヌクレオチドである。
【００１３】本発明によるポリヌクレオチド配列は、ホ
スホフルクトキナーゼ−をコードするｃＤＮＡを完全な
長さで単離するために、かつホスホフルクトキナーゼ−
遺伝子の配列と高い類似性の配列を有するｃＤＮＡまた
は遺伝子を単離するために、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤ
ＮＡのためのハイブリッド形成−プローブとして好適で
ある。
スホフルクトキナーゼ−をコードするｃＤＮＡを完全な
長さで単離するために、かつホスホフルクトキナーゼ−
遺伝子の配列と高い類似性の配列を有するｃＤＮＡまた
は遺伝子を単離するために、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤ
ＮＡのためのハイブリッド形成−プローブとして好適で
ある。
【００１４】更に、本発明のポリヌクレオチド配列はホ
スホフルクトキナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡのポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による製造のためのプラ
イマーとして好適である。
スホフルクトキナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡのポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による製造のためのプラ
イマーとして好適である。
【００１５】プローブとしてまたはプライマーとして働
くオリゴヌクレオチドは少なくとも３０個の、有利には
少なくとも２０個の、特に有利には少なくとも１５個の
連続したヌクレオチドを含有する。同様に、少なくとも
４０または５０個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレ
オチドも好適である。
くオリゴヌクレオチドは少なくとも３０個の、有利には
少なくとも２０個の、特に有利には少なくとも１５個の
連続したヌクレオチドを含有する。同様に、少なくとも
４０または５０個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレ
オチドも好適である。
【００１６】“単離”とは、天然の環境から分離するこ
とを意味する。
とを意味する。
【００１７】“ポリヌクレオチド”とは、一般的にポリ
リボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチド
を意味し、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡをも意味することができる。
リボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチド
を意味し、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡをも意味することができる。
【００１８】“ポリペプチド”とは、ペプチド結合を介
して結合する２個以上のアミノ酸を有するペプチドまた
はタンパク質を意味する。
して結合する２個以上のアミノ酸を有するペプチドまた
はタンパク質を意味する。
【００１９】本発明によるポリペプチドは配列番号２の
ポリペプチドを包含し、特にホスホフルクトキナーゼの
生物学的活性を有するもの、および配列番号２のポリペ
プチドと少なくとも７０％まで、有利には少なくとも８
０％まで同一のもの、特に配列番号２に記載のポリペプ
チドと少なくとも９０％から９５％まで同一でありかつ
前記の活性を有するものである。
ポリペプチドを包含し、特にホスホフルクトキナーゼの
生物学的活性を有するもの、および配列番号２のポリペ
プチドと少なくとも７０％まで、有利には少なくとも８
０％まで同一のもの、特に配列番号２に記載のポリペプ
チドと少なくとも９０％から９５％まで同一でありかつ
前記の活性を有するものである。
【００２０】更に、本発明はコリネフォルム細菌を使用
してアミノ酸、特にＬ−リシンを発酵により製造する方
法に関し、この細菌は特にすでにアミノ酸を生産し、か
つこの細菌中でｐｆｋ−遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列が強化され、特に過剰発現されるコリネフォルム
細菌である。
してアミノ酸、特にＬ−リシンを発酵により製造する方
法に関し、この細菌は特にすでにアミノ酸を生産し、か
つこの細菌中でｐｆｋ−遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列が強化され、特に過剰発現されるコリネフォルム
細菌である。
【００２１】概念“強化”とはここでは、例えば１つま
たは複数の遺伝子のコピー数を上昇させるか、強力なプ
ロモーターを使用するか、または高い活性を有する相応
する酵素をコードする遺伝子を使用するか、または場合
によりこれらの処置を組み合わせることにより、微生物
中の相応するＤＮＡをコードする１種以上の酵素の細胞
内活性の上昇を記載している。
たは複数の遺伝子のコピー数を上昇させるか、強力なプ
ロモーターを使用するか、または高い活性を有する相応
する酵素をコードする遺伝子を使用するか、または場合
によりこれらの処置を組み合わせることにより、微生物
中の相応するＤＮＡをコードする１種以上の酵素の細胞
内活性の上昇を記載している。
【００２２】本発明の対象である微生物は、Ｌ−アミノ
酸、特にＬ−リシンをグルコース、サッカロース、ラク
トース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、
セルロースから又はグリセリンとエタノールとから製造
できる。この代表的なものはコリネフォルム細菌であ
り、特にコリネバクテリウム属のものである。コリネバ
クテリウム属においては特にコリネバクテリウム・グル
タミクム（Corynebacterium glutamicum）の種が挙げら
れ、これはこの専門分野においてＬ−アミノ酸を産生す
る能力が公知である。
酸、特にＬ−リシンをグルコース、サッカロース、ラク
トース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、
セルロースから又はグリセリンとエタノールとから製造
できる。この代表的なものはコリネフォルム細菌であ
り、特にコリネバクテリウム属のものである。コリネバ
クテリウム属においては特にコリネバクテリウム・グル
タミクム（Corynebacterium glutamicum）の種が挙げら
れ、これはこの専門分野においてＬ−アミノ酸を産生す
る能力が公知である。
【００２３】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミクム種の好適な菌株は例えば公知の野
生型株の、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣ
Ｃ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミク
ム（Corynebacterium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１
５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
（Corynebacterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３
８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Co
rynebacterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−
１５３９、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Coryne
bacterium melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５、ブレ
ビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavum）
ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ェルメンツム（Brevibacterium lactofermentum） Ａ
ＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム・ジバリカ
ツム（Brevibacterium divaricatum） ＡＴＣＣ１４０
２０、およびこれらから製造された、Ｌ−リシン生産性
突然変異体もしくは菌株、例えば、 コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４およびコリネバクテリウム・グルタミクム ＤＳ
Ｍ５７１５である。
リウム・グルタミクム種の好適な菌株は例えば公知の野
生型株の、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣ
Ｃ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミク
ム（Corynebacterium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１
５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
（Corynebacterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３
８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Co
rynebacterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−
１５３９、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Coryne
bacterium melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５、ブレ
ビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavum）
ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ェルメンツム（Brevibacterium lactofermentum） Ａ
ＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム・ジバリカ
ツム（Brevibacterium divaricatum） ＡＴＣＣ１４０
２０、およびこれらから製造された、Ｌ−リシン生産性
突然変異体もしくは菌株、例えば、 コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４およびコリネバクテリウム・グルタミクム ＤＳ
Ｍ５７１５である。
【００２４】本発明により、酵素ホスホフルクトキナー
ゼをコードする、新規ｐｆｋ−遺伝子をコリネバクテリ
ウム・グルタミクムから単離することが達せられた。
ゼをコードする、新規ｐｆｋ−遺伝子をコリネバクテリ
ウム・グルタミクムから単離することが達せられた。
【００２５】コリネバクテリウム・グルタミクムのｐｆ
ｋ−遺伝子またはその他の遺伝子を単離するために、最
初にこの微生物の遺伝子ライブラリーをＥ.コリ中に導
入する。遺伝子ライブラリーの導入は一般に公知の教書
およびハンドブックに記載されている。例としてはウィ
ンナッカーの教書：Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einfuehrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie,
Weinheim, Deutschland, 1990)またはサンブルーク等の
ハンドブック：Sambrook et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989)を挙げることができる。十分に知られる
遺伝子ライブラリーはコハラ等により（Cell 50, 495-5
08 (1987)）λ−ベクター中に導入された、Ｅ.コリ Ｋ
−１２菌株Ｗ３１１０の遺伝子ライブラリーである。バ
セ等（Bathe et al.）はコスミドベクターＳｕｐｅｒＣ
ｏｓ Ｉ（Wahl et al., 1987, Proceedings of the Nat
ional Academy of Sciences USA, 84 : 2160-2164）を
用いてＥ.コリ Ｋ-１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et a
l., 1988, Nucleic Acids Resaearch 16 : 1563-1575）
中に導入されたコリネバクテリウム・グルタミクム Ａ
ＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載している
（Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 19
96）。ベールマン等（Boermann et al., Molecular Mic
robiology 6(3), 317-326(1992)）はコスミドｐＨＣ７
９（Hohn und Collins, Gene 11, 291-298(1980)）の使
用下にコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３
０３２の遺伝子ライブラリーを記載している。Ｅ.コリ
中にコリネバクテリウム・グルタミクムの遺伝子ライブ
ラリーを製造するためには、プラスミド、例えば、ｐＢ
Ｒ３２２（Bolivar, Life Scieces, 25, 807-818 (197
9)）またはｐＵＣ９（Vieira et al., 1982, Gene, 19
: 259-268）も使用することができる。宿主としては特
に、制限欠損および組み換え欠損を有する、Ｅ.コリ−
菌株が好適である。これに関する例は、Grant等により
記載された（Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649）菌株ＤＨ５αｍ
ｃｒである。コスミドを用いてクローニングした長いＤ
ＮＡ−フラグメントを、配列決定に好適な常用のベクタ
ー中で再びサブクローニングし、引き続き例えばSanger
等により記載されているように（Proceedings of the N
ational Academy of SciencesUSA, 74 (1977) 5463-546
7）配列決定する。
ｋ−遺伝子またはその他の遺伝子を単離するために、最
初にこの微生物の遺伝子ライブラリーをＥ.コリ中に導
入する。遺伝子ライブラリーの導入は一般に公知の教書
およびハンドブックに記載されている。例としてはウィ
ンナッカーの教書：Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einfuehrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie,
Weinheim, Deutschland, 1990)またはサンブルーク等の
ハンドブック：Sambrook et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989)を挙げることができる。十分に知られる
遺伝子ライブラリーはコハラ等により（Cell 50, 495-5
08 (1987)）λ−ベクター中に導入された、Ｅ.コリ Ｋ
−１２菌株Ｗ３１１０の遺伝子ライブラリーである。バ
セ等（Bathe et al.）はコスミドベクターＳｕｐｅｒＣ
ｏｓ Ｉ（Wahl et al., 1987, Proceedings of the Nat
ional Academy of Sciences USA, 84 : 2160-2164）を
用いてＥ.コリ Ｋ-１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et a
l., 1988, Nucleic Acids Resaearch 16 : 1563-1575）
中に導入されたコリネバクテリウム・グルタミクム Ａ
ＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載している
（Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 19
96）。ベールマン等（Boermann et al., Molecular Mic
robiology 6(3), 317-326(1992)）はコスミドｐＨＣ７
９（Hohn und Collins, Gene 11, 291-298(1980)）の使
用下にコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３
０３２の遺伝子ライブラリーを記載している。Ｅ.コリ
中にコリネバクテリウム・グルタミクムの遺伝子ライブ
ラリーを製造するためには、プラスミド、例えば、ｐＢ
Ｒ３２２（Bolivar, Life Scieces, 25, 807-818 (197
9)）またはｐＵＣ９（Vieira et al., 1982, Gene, 19
: 259-268）も使用することができる。宿主としては特
に、制限欠損および組み換え欠損を有する、Ｅ.コリ−
菌株が好適である。これに関する例は、Grant等により
記載された（Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649）菌株ＤＨ５αｍ
ｃｒである。コスミドを用いてクローニングした長いＤ
ＮＡ−フラグメントを、配列決定に好適な常用のベクタ
ー中で再びサブクローニングし、引き続き例えばSanger
等により記載されているように（Proceedings of the N
ational Academy of SciencesUSA, 74 (1977) 5463-546
7）配列決定する。
【００２６】このようにして、配列番号１として本発明
の構成分である、遺伝子ｐｆｋをコードするコリネフォ
ルム・グルタミクムの新規ＤＮＡ−配列が得られた。更
に、該ＤＮＡ配列から前記方法を用いて相応する蛋白質
のアミノ酸配列を誘導した。配列番号２には得られたｐ
ｆｋ−遺伝子生成物のアミノ酸配列が示されている。
の構成分である、遺伝子ｐｆｋをコードするコリネフォ
ルム・グルタミクムの新規ＤＮＡ−配列が得られた。更
に、該ＤＮＡ配列から前記方法を用いて相応する蛋白質
のアミノ酸配列を誘導した。配列番号２には得られたｐ
ｆｋ−遺伝子生成物のアミノ酸配列が示されている。
【００２７】配列番号１から遺伝学的コードの縮重の範
囲で得られる、コードするＤＮＡ−配列は同様に本願発
明の構成分である。同様にして、配列番号１とまたは配
列番号１の一部とハイブリダイズするＤＮＡ配列は本発
明の構成分である。更に、専門分野においては保存的な
アミノ酸交換、例えば蛋白質中でのグリシンのアラニン
への置換またはアスパラギン酸のグルタミン酸への置換
は“センス突然変異”として公知であり、この突然変異
は蛋白質の活性の根本的な変化に導かない、すなわち機
能中立である。更に、蛋白質のＮ−および／またはＣ−
末端での変化はその機能に著しい影響を与えないかまた
はむしろ安定化するということは公知である。これに関
する記載は特にBen-Bassat等（Journal of Bacteriolog
y 169:751-757(1987)）、O'Regan等（Gene 77: 237-251
(1989)）、Sahin-Toth等（Protein Sciences 3: 240-24
7(1994)）、Hochuli等（Bio/Technology 6: 1321-1325
(1988)）において、および遺伝学および分子生物学の公
知教科書中に見いだすことができる。相応する方法で配
列番号２から得られるアミノ酸配列は、同様に本発明の
構成分である。
囲で得られる、コードするＤＮＡ−配列は同様に本願発
明の構成分である。同様にして、配列番号１とまたは配
列番号１の一部とハイブリダイズするＤＮＡ配列は本発
明の構成分である。更に、専門分野においては保存的な
アミノ酸交換、例えば蛋白質中でのグリシンのアラニン
への置換またはアスパラギン酸のグルタミン酸への置換
は“センス突然変異”として公知であり、この突然変異
は蛋白質の活性の根本的な変化に導かない、すなわち機
能中立である。更に、蛋白質のＮ−および／またはＣ−
末端での変化はその機能に著しい影響を与えないかまた
はむしろ安定化するということは公知である。これに関
する記載は特にBen-Bassat等（Journal of Bacteriolog
y 169:751-757(1987)）、O'Regan等（Gene 77: 237-251
(1989)）、Sahin-Toth等（Protein Sciences 3: 240-24
7(1994)）、Hochuli等（Bio/Technology 6: 1321-1325
(1988)）において、および遺伝学および分子生物学の公
知教科書中に見いだすことができる。相応する方法で配
列番号２から得られるアミノ酸配列は、同様に本発明の
構成分である。
【００２８】同様にして、配列番号１または配列番号１
の一部とハイブリダイズするＤＮＡ−配列は本発明の構
成分である。更に、配列番号１から明らかになる、プラ
イマーの使用下にポリメラーゼ−連鎖反応（ＰＣＲ）に
より製造される、ＤＮＡ−配列は本発明の構成分であ
る。この種のオリゴヌクレオチドは、典型的には少なく
とも塩基対１５個の長さを有する。
の一部とハイブリダイズするＤＮＡ−配列は本発明の構
成分である。更に、配列番号１から明らかになる、プラ
イマーの使用下にポリメラーゼ−連鎖反応（ＰＣＲ）に
より製造される、ＤＮＡ−配列は本発明の構成分であ
る。この種のオリゴヌクレオチドは、典型的には少なく
とも塩基対１５個の長さを有する。
【００２９】ハイブリダイゼーションを用いるＤＮＡ−
配列の同定のための指示は、特にベーリンガーマンハイ
ム社のハンドブック“The DIG System Users Guide for
Filter Hybridization”（Firma Boehringer Mannheim
GmbH; Mannheim, Deutschland, 1993）中におよびリー
ブル等において（Liebl et al.、：International Jour
nal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-26
0）、専門家は見いだすことができる。ポリメラーゼ−
連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ−配列の増幅に関す
る指示は、特にガイトのハンドブック（Gait: Oligonuk
leotide synthesis:a practical approach: IRL Press,
Oxford,UK, 1984）中におよびニュートンおよびグラハ
ムにおいて（Newton and Graham: PCR (Spektrum Akade
mischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994)）、
専門家は見いだすことができる。
配列の同定のための指示は、特にベーリンガーマンハイ
ム社のハンドブック“The DIG System Users Guide for
Filter Hybridization”（Firma Boehringer Mannheim
GmbH; Mannheim, Deutschland, 1993）中におよびリー
ブル等において（Liebl et al.、：International Jour
nal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-26
0）、専門家は見いだすことができる。ポリメラーゼ−
連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ−配列の増幅に関す
る指示は、特にガイトのハンドブック（Gait: Oligonuk
leotide synthesis:a practical approach: IRL Press,
Oxford,UK, 1984）中におよびニュートンおよびグラハ
ムにおいて（Newton and Graham: PCR (Spektrum Akade
mischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994)）、
専門家は見いだすことができる。
【００３０】ｐｆｋ−遺伝子の過剰発現によりコリネフ
ォルム細菌が改良された方法でアミノ酸、特にＬ−リシ
ンを生産することが見いだされた。
ォルム細菌が改良された方法でアミノ酸、特にＬ−リシ
ンを生産することが見いだされた。
【００３１】この過剰発現を達成するために、相応する
遺伝子のコピー数を上昇させるか、または構造遺伝子の
上流に存在するプロモーター領域および制御領域または
リボソーム結合位を突然変異させることができる。同様
にして構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットが
作用する。誘導可能なプロモーターにより、付加的に発
酵的Ｌ−リシン−生産の過程において発現を上昇させる
ことも可能である。ｍ−ＲＮＡの寿命を長くする処置に
よっても同様に発現は改善する。さらに、酵素タンパク
質の分解を阻止することにより同様に酵素活性は強化さ
れる。遺伝子または遺伝子構成体はプラスミド中に異な
るコピー数で存在するか、または染色体中に組み込ま
れ、かつ増幅されていてよい。さらに、該当する遺伝子
の過剰発現は培地の組成および培養操作の変更により達
成することもできる。
遺伝子のコピー数を上昇させるか、または構造遺伝子の
上流に存在するプロモーター領域および制御領域または
リボソーム結合位を突然変異させることができる。同様
にして構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットが
作用する。誘導可能なプロモーターにより、付加的に発
酵的Ｌ−リシン−生産の過程において発現を上昇させる
ことも可能である。ｍ−ＲＮＡの寿命を長くする処置に
よっても同様に発現は改善する。さらに、酵素タンパク
質の分解を阻止することにより同様に酵素活性は強化さ
れる。遺伝子または遺伝子構成体はプラスミド中に異な
るコピー数で存在するか、または染色体中に組み込ま
れ、かつ増幅されていてよい。さらに、該当する遺伝子
の過剰発現は培地の組成および培養操作の変更により達
成することもできる。
【００３２】これに関する教示は、特にマルチン等（Ma
rtin et al.; Bio/Technology 5, 137-146 (1987)）に
より、グエレロ等（Guerrero et al.; Gene 138, 35-41
(1994)）により、ツチヤおよびモリナガ（Bio/Technol
ogy 6, 428-430 (1988)）により、エイクマンズ等（Eik
manns et al. Gene 102, 93-98(1991)）により、ヨーロ
パ特許明細書ＥＰＳ−０４７２８６９号中に、米国特許
第４６０１８９３号明細書中に、シュバルツアーおよび
ピューラー（Schwarzer and Puehler; Bio/Technology
9, 84-87 (1991)）により、ラインシャイド等（Reinsch
eid et al.; Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132(1994)）により、ラバレ等（Labarre et a
l.; Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(1993)）
により、特許出願ＷＯ９６／１５２４６中に、マルンブ
レス等（Malumbres et al.; Gene134, 15-24 (1993)）
により、特開平１０−２２９８９１号公報中に、ヤンセ
ンおよびハマー（Jansen and Hammer ;Biotechnology a
nd Bioengineering 58, 191-195 (1998)）により、マク
リデス（Makrides; Microbiological Reviews 60:512-5
38 (1996)）により、および遺伝子学および分子生物学
の公知教科書中に、記載されている。
rtin et al.; Bio/Technology 5, 137-146 (1987)）に
より、グエレロ等（Guerrero et al.; Gene 138, 35-41
(1994)）により、ツチヤおよびモリナガ（Bio/Technol
ogy 6, 428-430 (1988)）により、エイクマンズ等（Eik
manns et al. Gene 102, 93-98(1991)）により、ヨーロ
パ特許明細書ＥＰＳ−０４７２８６９号中に、米国特許
第４６０１８９３号明細書中に、シュバルツアーおよび
ピューラー（Schwarzer and Puehler; Bio/Technology
9, 84-87 (1991)）により、ラインシャイド等（Reinsch
eid et al.; Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132(1994)）により、ラバレ等（Labarre et a
l.; Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(1993)）
により、特許出願ＷＯ９６／１５２４６中に、マルンブ
レス等（Malumbres et al.; Gene134, 15-24 (1993)）
により、特開平１０−２２９８９１号公報中に、ヤンセ
ンおよびハマー（Jansen and Hammer ;Biotechnology a
nd Bioengineering 58, 191-195 (1998)）により、マク
リデス（Makrides; Microbiological Reviews 60:512-5
38 (1996)）により、および遺伝子学および分子生物学
の公知教科書中に、記載されている。
【００３３】例えば、本発明によるｐｆｋ−遺伝子をプ
ラスミドを用いて過剰発現した。
ラスミドを用いて過剰発現した。
【００３４】プラスミドとしてはコリネフォルム細菌中
で複製されるプラスミドが好適である。多くの公知のプ
ラスミドベクター、例えばｐＺ１（Menkel et al., App
liedand Environmental Microbiology (1989) 64: 549-
554）、ｐＥＫＥ×１（Eikmanns et al., Gene 102: 93
-98(1991)）またはｐＨＳ２-１（Sonnen et al., Gene
107: 69-74(1991)）は潜在性プラスミドｐＨＭ１５１
９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。他のプラスミド
ベクター、例えばｐＣＧ４（US-A 4489160）またはｐＮ
Ｇ２（Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Lett
ers 66, 119-124(1990)）またはｐＡＧ１（US-A515889
1）に基づくものは、同様にして使用することができ
る。
で複製されるプラスミドが好適である。多くの公知のプ
ラスミドベクター、例えばｐＺ１（Menkel et al., App
liedand Environmental Microbiology (1989) 64: 549-
554）、ｐＥＫＥ×１（Eikmanns et al., Gene 102: 93
-98(1991)）またはｐＨＳ２-１（Sonnen et al., Gene
107: 69-74(1991)）は潜在性プラスミドｐＨＭ１５１
９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。他のプラスミド
ベクター、例えばｐＣＧ４（US-A 4489160）またはｐＮ
Ｇ２（Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Lett
ers 66, 119-124(1990)）またはｐＡＧ１（US-A515889
1）に基づくものは、同様にして使用することができ
る。
【００３５】更に、プラスミドベクターを用いて染色体
中に組み込むことにより遺伝子を増幅する方法に適用す
ることのできるプラスミドベクターが好適であり、これ
は例えばReinscheid 等によりｈｏｍ-ｔｈｒＢ-Ｏｐｅ
ｒｏｎの重複または増幅のために記載されている（Appl
ied and Environmental Microbiology 60,126-132(199
4)）。この方法においては、宿主細胞（代表的にはＥ.
コリ）中では複製不可能であるが、コリネバクテリウム
・グルタミクム中では複製可能なプラスミドベクター中
で完全な遺伝子をクローニングする。ベクターとして
は、例えばｐＳＵＰ３０１（Simon et al., Bio/Techno
logy 1, 784-791(1983)）、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ
１９ｍｏｂ（Schaefer et al., Gene 145, 69-73(199
4)）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corporation, Madison,
WI, USA）、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（Shuman(1994). Jo
urnal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A
5487993）、ｐＣＲ（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ（Firma Invitroge
n, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534-541(1993)）または
ｐＥＭ１（Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacter
iology 173: 4510-4516）を挙げることができる。増幅
すべき遺伝子を含有するプラスミドベクターは引き続き
接合または形質転換によりコリネバクテリウム・グルタ
ミクムの所望の菌株中に導入される。接合の方法は例え
ばSchaefer等（Applied and EnvironmentalMicrobiolog
y 60, 756-759(1994)）により記載されている。形質転
換のための方法は例えば、Thierbach等（Applied Micro
biology and Biotechnology 29, 356-362(1988)）、Dun
ican und Shivnan（Bio/Technology 7, 1067-1070(198
9)）およびTauch等（FEMS Microbiological Letters 12
3, 343-347(1994)）により記載されている。“クロスオ
ーバー”−処置による相同的組み換えにより、生じた菌
株は該当する遺伝子の少なくとも２個のコピーを有す
る。
中に組み込むことにより遺伝子を増幅する方法に適用す
ることのできるプラスミドベクターが好適であり、これ
は例えばReinscheid 等によりｈｏｍ-ｔｈｒＢ-Ｏｐｅ
ｒｏｎの重複または増幅のために記載されている（Appl
ied and Environmental Microbiology 60,126-132(199
4)）。この方法においては、宿主細胞（代表的にはＥ.
コリ）中では複製不可能であるが、コリネバクテリウム
・グルタミクム中では複製可能なプラスミドベクター中
で完全な遺伝子をクローニングする。ベクターとして
は、例えばｐＳＵＰ３０１（Simon et al., Bio/Techno
logy 1, 784-791(1983)）、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ
１９ｍｏｂ（Schaefer et al., Gene 145, 69-73(199
4)）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corporation, Madison,
WI, USA）、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（Shuman(1994). Jo
urnal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A
5487993）、ｐＣＲ（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ（Firma Invitroge
n, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534-541(1993)）または
ｐＥＭ１（Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacter
iology 173: 4510-4516）を挙げることができる。増幅
すべき遺伝子を含有するプラスミドベクターは引き続き
接合または形質転換によりコリネバクテリウム・グルタ
ミクムの所望の菌株中に導入される。接合の方法は例え
ばSchaefer等（Applied and EnvironmentalMicrobiolog
y 60, 756-759(1994)）により記載されている。形質転
換のための方法は例えば、Thierbach等（Applied Micro
biology and Biotechnology 29, 356-362(1988)）、Dun
ican und Shivnan（Bio/Technology 7, 1067-1070(198
9)）およびTauch等（FEMS Microbiological Letters 12
3, 343-347(1994)）により記載されている。“クロスオ
ーバー”−処置による相同的組み換えにより、生じた菌
株は該当する遺伝子の少なくとも２個のコピーを有す
る。
【００３６】アミノ酸、特にＬ−リシン、の生産のため
にｐｆｋ−遺伝子の他に、その都度の生合成経路、解
糖、補充反応、クエン酸サイクルまたはアミノ酸搬送の
酵素を１種以上強化するかまたは過剰発現することが有
利である。
にｐｆｋ−遺伝子の他に、その都度の生合成経路、解
糖、補充反応、クエン酸サイクルまたはアミノ酸搬送の
酵素を１種以上強化するかまたは過剰発現することが有
利である。
【００３７】こうして、例えばＬ−リシンの製造のため
には同時に次の群 ・ジヒドロジピコリン酸−シンターゼをコードするｄａ
ｐＡ−遺伝子（ＥＰ−Ｂ−０１９７３３５）、または ・グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼをコ
ードするｇａｐ−遺伝子（Eikmanns (1992), Journal o
f Bacteriology 174: 6076-6086）、または ・トリオース燐酸イソメラーゼをコードするｔｐｉ−遺
伝子（Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174:
6076-6086）、または ・ホスホグリセリン酸キナーゼをコードするｐｇｋ−遺
伝子（Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174:
6076-6086）、または ・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ−遺
伝子（Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174:
6076-6086）、または ・リシン−搬送をコードするｌｙｓＥ−遺伝子（ＤＥ−
Ａ−１９５４８２２２）から選択された１つ以上の遺伝
子が同時に過剰発現される。
には同時に次の群 ・ジヒドロジピコリン酸−シンターゼをコードするｄａ
ｐＡ−遺伝子（ＥＰ−Ｂ−０１９７３３５）、または ・グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼをコ
ードするｇａｐ−遺伝子（Eikmanns (1992), Journal o
f Bacteriology 174: 6076-6086）、または ・トリオース燐酸イソメラーゼをコードするｔｐｉ−遺
伝子（Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174:
6076-6086）、または ・ホスホグリセリン酸キナーゼをコードするｐｇｋ−遺
伝子（Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174:
6076-6086）、または ・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ−遺
伝子（Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174:
6076-6086）、または ・リシン−搬送をコードするｌｙｓＥ−遺伝子（ＤＥ−
Ａ−１９５４８２２２）から選択された１つ以上の遺伝
子が同時に過剰発現される。
【００３８】更に、アミノ酸、特にＬ−リシンの生産の
ために、ｐｆｋ−遺伝子の他に同時に ・ホスホエノールピルビン酸−カルボキシキナーゼをコ
ードするｐｃｋ−遺伝子（ＤＥ１９９５０４０９.１、
ＤＳＭ１３０４７）および／または ・グルコース−６−燐酸イソメラーゼをコードするｐｇ
ｉ−遺伝子（ＵＳ０９／３９６４７８、ＤＳＭ１２９６
９）を弱めることも有利である。
ために、ｐｆｋ−遺伝子の他に同時に ・ホスホエノールピルビン酸−カルボキシキナーゼをコ
ードするｐｃｋ−遺伝子（ＤＥ１９９５０４０９.１、
ＤＳＭ１３０４７）および／または ・グルコース−６−燐酸イソメラーゼをコードするｐｇ
ｉ−遺伝子（ＵＳ０９／３９６４７８、ＤＳＭ１２９６
９）を弱めることも有利である。
【００３９】更に、アミノ酸、特にＬ−リシンの生産の
ためには、ｐｆｋ−遺伝子の過剰発現とともに、不所望
な副反応を排除することも有利であろう（ナカヤマ：
“Breeding of Amino Acid Producing Micro-organism
s”, in: Overproduction of Microbial Products, Kru
mphanzl, Sikyta,Vanek (eds.), Academic Press, Lond
on, UK, 1982）。
ためには、ｐｆｋ−遺伝子の過剰発現とともに、不所望
な副反応を排除することも有利であろう（ナカヤマ：
“Breeding of Amino Acid Producing Micro-organism
s”, in: Overproduction of Microbial Products, Kru
mphanzl, Sikyta,Vanek (eds.), Academic Press, Lond
on, UK, 1982）。
【００４０】本発明により製造した微生物は、アミノ
酸、特にＬ−リシンの生産のために、バッチでの連続的
または非連続的方法で（バッチ法培養）または供給バッ
チ法（供給法）または反復供給バッチ法（反復供給法）
で培養することができる。公知培養法に関する概要は、
クミールの教科書（Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Ein
fuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fisch
er Verlag, Stuttgart,1991)）またはストルハスの教科
書（Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtun
gen (Vieweg Verlag, Braunsheweig/Wiesbaden, 199
4)）に記載されている。
酸、特にＬ−リシンの生産のために、バッチでの連続的
または非連続的方法で（バッチ法培養）または供給バッ
チ法（供給法）または反復供給バッチ法（反復供給法）
で培養することができる。公知培養法に関する概要は、
クミールの教科書（Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Ein
fuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fisch
er Verlag, Stuttgart,1991)）またはストルハスの教科
書（Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtun
gen (Vieweg Verlag, Braunsheweig/Wiesbaden, 199
4)）に記載されている。
【００４１】使用されるべき培地は、それぞれの菌株の
要求を好適な方法で満たさなければならない。種々の微
生物の培地に関しては参考書“Manual of Methods for
General Bacteriology”（American Society for Bacte
riology (Washington D.C. ,USA, 1981)）に記載されて
いる。炭素源としては糖および炭水化物、例えばグルコ
ース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マル
トース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油脂、例え
ば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびやし油、および
脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノ
ール酸、アルコール、例えばグリセリンおよびエタノー
ルおよび有機酸、例えば酢酸を使用することができる。
これらの物質は個々にまたは混合物として使用すること
ができる。窒素源としては有機窒素含有化合物、例えば
ペプトン、酵母エキス、肉汁エキス、麦芽エキス、トウ
モロコシ膨潤水、大豆粉および尿素または有機化合物、
例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム
を使用することができる。この窒素源を個別にまたは混
合物として使用することができる。燐源としては、リン
酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸一水素二カリウ
ムまたはこれに相当するナトリウム含有塩を使用するこ
とができる。さらに、培地は成長に必要な金属の塩、例
えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有しなければな
らない。最後に、必須の生長物質、例えばアミノ酸およ
びビタミンを前記物質に加えて使用することができる。
さらに、これに加えて好適な前駆物質を培地に添加する
ことができる。前記添加物質は一回の配合物の形で添加
することも、または好適な方法で培養の間供給すること
もできる。
要求を好適な方法で満たさなければならない。種々の微
生物の培地に関しては参考書“Manual of Methods for
General Bacteriology”（American Society for Bacte
riology (Washington D.C. ,USA, 1981)）に記載されて
いる。炭素源としては糖および炭水化物、例えばグルコ
ース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マル
トース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油脂、例え
ば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびやし油、および
脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノ
ール酸、アルコール、例えばグリセリンおよびエタノー
ルおよび有機酸、例えば酢酸を使用することができる。
これらの物質は個々にまたは混合物として使用すること
ができる。窒素源としては有機窒素含有化合物、例えば
ペプトン、酵母エキス、肉汁エキス、麦芽エキス、トウ
モロコシ膨潤水、大豆粉および尿素または有機化合物、
例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム
を使用することができる。この窒素源を個別にまたは混
合物として使用することができる。燐源としては、リン
酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸一水素二カリウ
ムまたはこれに相当するナトリウム含有塩を使用するこ
とができる。さらに、培地は成長に必要な金属の塩、例
えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有しなければな
らない。最後に、必須の生長物質、例えばアミノ酸およ
びビタミンを前記物質に加えて使用することができる。
さらに、これに加えて好適な前駆物質を培地に添加する
ことができる。前記添加物質は一回の配合物の形で添加
することも、または好適な方法で培養の間供給すること
もできる。
【００４２】培地のｐＨ−制御のために、塩基性化合
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアもしくはアンモニア水または酸性化合物、例えばリ
ン酸または硫酸を好適な方法で使用する。泡形成の制御
のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステ
ルを使用することもできる。プラスミドの安定化の維持
のためにも、培地に好適な選択的に作用する物質、例え
ば抗生物質を添加することができる。好気的条件を維持
するためには、酸素または酸素含有混合物、例えば空気
を培地中に導入する。培地の温度は通常２０〜４５℃で
あり、有利に２５〜４０℃である。培養は、リシンの最
大量が形成されるまで続ける。この目的は通常１０〜１
６０時間で達成される。
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアもしくはアンモニア水または酸性化合物、例えばリ
ン酸または硫酸を好適な方法で使用する。泡形成の制御
のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステ
ルを使用することもできる。プラスミドの安定化の維持
のためにも、培地に好適な選択的に作用する物質、例え
ば抗生物質を添加することができる。好気的条件を維持
するためには、酸素または酸素含有混合物、例えば空気
を培地中に導入する。培地の温度は通常２０〜４５℃で
あり、有利に２５〜４０℃である。培養は、リシンの最
大量が形成されるまで続ける。この目的は通常１０〜１
６０時間で達成される。
【００４３】Ｌ−アミノ酸の分析は、アニオン交換クロ
マトグラフィー、および引き続きニンヒドリンでの誘導
体化により行われ、この方法はスパックマン等により
（Spackman et al. : Analytical Chemistry, 30, (195
8), 1190）記載されているように実施することができ
る。
マトグラフィー、および引き続きニンヒドリンでの誘導
体化により行われ、この方法はスパックマン等により
（Spackman et al. : Analytical Chemistry, 30, (195
8), 1190）記載されているように実施することができ
る。
【００４４】本発明による方法はアミノ酸、特にＬ−リ
シンの発酵による製造に使用される。
シンの発酵による製造に使用される。
【００４５】
【実施例】本発明を以下に、実施例につき詳細に説明す
る。
る。
【００４６】実施例１ コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からのゲノムコスミド−遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡをTauch等（1995, Plasmid 33: 168
-179）に記載されているように単離し、制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02）
を用いて部分的に切断した。ＤＮＡ−フラグメントを小
エビアルカリ性ホスファターゼ（Roche Molecular Bioc
hemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibu
ng SAP, Code no. 1758250）を用いて脱ホスホリル化し
た。Stratagene社（La Jolla,USA, Produktbeschreibun
gSuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301）か
らのコスミドベクターSuperCos1のＤＮＡ（Wahl et al.
(1987) Proceedings of the National Academy ofScie
nces USA 84: 2160-2164）を制限酵素ＸｂａＩ（Amersh
am Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschr
eibung XbaI, Code no. 27-0948-02）で切断し、同様に
して小エビアルカリ性ホスファターゼを用いて脱ホスホ
リル化した。引き続き、コスミド−ＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschlan
d, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-0
4）で切断した。このようにして処理したコスミド−Ｄ
ＮＡを処理したＡＴＣＣ１３０３２−ＤＮＡと混合し、
この配合物をＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（Amersham Pharm
acia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T
4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04）で処理した。引き
続き、連結反応混合物をGigapack II XLパッキング抽出
物（Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung
Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217）
を用いてファージ中にパッキングした。Ｅ.コリ菌株Ｎ
Ｍ５５４（Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Resea
rch 16: 1563-1575）の感染のために、この細胞を１０
ｍＭＭｇＳＯ４中に取り込み、このファージ懸濁液の分
割量と混合した。コスミドライブラリーの感染およびそ
の評価はSambrook等（1989, Mokecular Cloning: A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor）により記載され
ているように実施された、この際、細胞をアンピシリン
１００μｇ／ｌを含有するＬＢ−寒天培地（Lennox, 19
55, Virology, 1:190）上に塗布した。３７℃で一夜イ
ンキュベーションした後、組み換えした単独のクローン
を選択した。
からのゲノムコスミド−遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡをTauch等（1995, Plasmid 33: 168
-179）に記載されているように単離し、制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02）
を用いて部分的に切断した。ＤＮＡ−フラグメントを小
エビアルカリ性ホスファターゼ（Roche Molecular Bioc
hemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibu
ng SAP, Code no. 1758250）を用いて脱ホスホリル化し
た。Stratagene社（La Jolla,USA, Produktbeschreibun
gSuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301）か
らのコスミドベクターSuperCos1のＤＮＡ（Wahl et al.
(1987) Proceedings of the National Academy ofScie
nces USA 84: 2160-2164）を制限酵素ＸｂａＩ（Amersh
am Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschr
eibung XbaI, Code no. 27-0948-02）で切断し、同様に
して小エビアルカリ性ホスファターゼを用いて脱ホスホ
リル化した。引き続き、コスミド−ＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschlan
d, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-0
4）で切断した。このようにして処理したコスミド−Ｄ
ＮＡを処理したＡＴＣＣ１３０３２−ＤＮＡと混合し、
この配合物をＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（Amersham Pharm
acia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T
4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04）で処理した。引き
続き、連結反応混合物をGigapack II XLパッキング抽出
物（Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung
Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217）
を用いてファージ中にパッキングした。Ｅ.コリ菌株Ｎ
Ｍ５５４（Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Resea
rch 16: 1563-1575）の感染のために、この細胞を１０
ｍＭＭｇＳＯ４中に取り込み、このファージ懸濁液の分
割量と混合した。コスミドライブラリーの感染およびそ
の評価はSambrook等（1989, Mokecular Cloning: A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor）により記載され
ているように実施された、この際、細胞をアンピシリン
１００μｇ／ｌを含有するＬＢ−寒天培地（Lennox, 19
55, Virology, 1:190）上に塗布した。３７℃で一夜イ
ンキュベーションした後、組み換えした単独のクローン
を選択した。
【００４７】実施例２ ｐｆｋ−遺伝子の単離および配列決定 単独のコロニーのコスミド−ＤＮＡをQiaprep Spin Min
iprep キット（Product No., 27106, Qiagen, Hilden,
Germany）を用いて、製造業者による記載に従って単離
し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Frei
burg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Pro
duct No. 27-0913-02）で部分的に切断した。このＤＮ
Ａフラグメントを小エビアルカリ性ホスファターゼ（Ro
che Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250）を
用いて脱ホスホリル化した。ゲル電気泳動による分離の
後、コスミドフラグメントを１５００〜２０００ｂｐの
大きさの範囲でQiaExII ゲル抽出キット（Product No.
20021, Qiagen, Hilden, Germany）を用いて行った。In
vitrogen社からの配列決定用ベクターpZero-1（Groning
en, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Backgrou
nd Cloning Kit, Product No. K2500-01）を制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschlan
d, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-
04）を用いて切断した。配列決定用ベクターpZero-1中
へのコスミドフラグメントの連結反応を、Sambrook等
（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor）に記載されたように実施し、この
際、Ｔ４−リガーゼ（Pharmacia Biotech, Freiburg, D
eutschland）と共にＤＮＡ−混合物を一夜インキュベー
ションした。引き続き、この連結反応混合物をＥ.コリ
菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 1990, Proceedings of th
e National Academy of Sciences USA, 87 4645-464
9））中に、エレクトロポレーションし（Tauch et al.
1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7）、かつゼ
オシン（Zeocin）５０μｇ／ｍｌを有するＬＢ−寒天培
地（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上に塗布した。
組み換えクローンのプラスミド調製はBiorobot 9600（P
roduct No., 900200, Qiagen, Hilden, Germany）を用
いて行った。配列決定はザンガー等によるジデオキシチ
ェーンターミネーション法（Sanger et al. 1977, Proc
eedings of the National Academy of Sciences U.S.
A., 74:5463-5467）によりZimmermann等による改変法
（1990, Nucleic Acids Research,18:1067）を用いて行
った。PE Applied Biosystemsの“RR dRhodamin Termin
ator Cycle Sequencing Kit”（Product No. 403044, W
eiterstadt, Deutschland）を使用した。ゲル電気泳動
による分離および配列決定反応の分析は“ABI Prism 37
7”配列決定装置（PE Applied Biosystems社、Weiterst
adt, Deutschland）を用いて、“Rotiphorese NF Acryl
amid/Bisacrylamid”ゲル（２９：１）（Product No. A
124.1, Roth, Karlsruhe, Gemany）中で行った。
iprep キット（Product No., 27106, Qiagen, Hilden,
Germany）を用いて、製造業者による記載に従って単離
し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Frei
burg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Pro
duct No. 27-0913-02）で部分的に切断した。このＤＮ
Ａフラグメントを小エビアルカリ性ホスファターゼ（Ro
che Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250）を
用いて脱ホスホリル化した。ゲル電気泳動による分離の
後、コスミドフラグメントを１５００〜２０００ｂｐの
大きさの範囲でQiaExII ゲル抽出キット（Product No.
20021, Qiagen, Hilden, Germany）を用いて行った。In
vitrogen社からの配列決定用ベクターpZero-1（Groning
en, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Backgrou
nd Cloning Kit, Product No. K2500-01）を制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschlan
d, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-
04）を用いて切断した。配列決定用ベクターpZero-1中
へのコスミドフラグメントの連結反応を、Sambrook等
（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor）に記載されたように実施し、この
際、Ｔ４−リガーゼ（Pharmacia Biotech, Freiburg, D
eutschland）と共にＤＮＡ−混合物を一夜インキュベー
ションした。引き続き、この連結反応混合物をＥ.コリ
菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 1990, Proceedings of th
e National Academy of Sciences USA, 87 4645-464
9））中に、エレクトロポレーションし（Tauch et al.
1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7）、かつゼ
オシン（Zeocin）５０μｇ／ｍｌを有するＬＢ−寒天培
地（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上に塗布した。
組み換えクローンのプラスミド調製はBiorobot 9600（P
roduct No., 900200, Qiagen, Hilden, Germany）を用
いて行った。配列決定はザンガー等によるジデオキシチ
ェーンターミネーション法（Sanger et al. 1977, Proc
eedings of the National Academy of Sciences U.S.
A., 74:5463-5467）によりZimmermann等による改変法
（1990, Nucleic Acids Research,18:1067）を用いて行
った。PE Applied Biosystemsの“RR dRhodamin Termin
ator Cycle Sequencing Kit”（Product No. 403044, W
eiterstadt, Deutschland）を使用した。ゲル電気泳動
による分離および配列決定反応の分析は“ABI Prism 37
7”配列決定装置（PE Applied Biosystems社、Weiterst
adt, Deutschland）を用いて、“Rotiphorese NF Acryl
amid/Bisacrylamid”ゲル（２９：１）（Product No. A
124.1, Roth, Karlsruhe, Gemany）中で行った。
【００４８】得られた粗配列データを引き続きStaden-
プログラムパッケージ（1986, Nucleic Acids Reaseac
h, 14: 217-231）バージョン９７-０を適用して、処理
を進めた。ｐＺｅｒｏｌ−誘導体の個々の配列を関連す
るコンティグに統合してまとめた。コンピューターによ
り支持されたコード領域分析はXNIPプログラム（Stade
n, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231）を用
いて、完成された。その先の分析を“BLAST サーチプロ
グラム”（Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res
earch, 25: 3389-3402）を用いて“National Center fo
r BiotechnologyInformation”（NCBI, Bethesda, MD,
USA）の非重複のデータバンクに対して実施した。
プログラムパッケージ（1986, Nucleic Acids Reaseac
h, 14: 217-231）バージョン９７-０を適用して、処理
を進めた。ｐＺｅｒｏｌ−誘導体の個々の配列を関連す
るコンティグに統合してまとめた。コンピューターによ
り支持されたコード領域分析はXNIPプログラム（Stade
n, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231）を用
いて、完成された。その先の分析を“BLAST サーチプロ
グラム”（Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res
earch, 25: 3389-3402）を用いて“National Center fo
r BiotechnologyInformation”（NCBI, Bethesda, MD,
USA）の非重複のデータバンクに対して実施した。
【００４９】得られたヌクレオチド配列を配列番号１中
に示した。ヌクレオチド配列の分析は９９０塩基対のオ
ープンリードフレームを示し、これをｐｆｋ−遺伝子と
命名した。このｐｆｋ−遺伝子はアミノ酸３３０個から
なる蛋白質をコードする。
に示した。ヌクレオチド配列の分析は９９０塩基対のオ
ープンリードフレームを示し、これをｐｆｋ−遺伝子と
命名した。このｐｆｋ−遺伝子はアミノ酸３３０個から
なる蛋白質をコードする。
【００５０】実施例３ コリネバクテリウム・グルタミクム中のｐｆｋ−遺伝子
を強化するための発現ベクターｐＺ−ｐｆｋｅｘの製造 ３.１ ｐｆｋ−遺伝子のクローニング 菌株ＡＴＣＣ１３０３２からEikmann等の方法（Microbi
ology 140: 1817-1828(1994)）により染色体ＤＮＡを単
離した。実施例２からコリネバクテリウム・グルタミク
ムに関して知られたｐｆｋ−遺伝子の配列に基づきポリ
メラーゼ連鎖反応のために次のオリゴヌクレオチドを選
択した：
を強化するための発現ベクターｐＺ−ｐｆｋｅｘの製造 ３.１ ｐｆｋ−遺伝子のクローニング 菌株ＡＴＣＣ１３０３２からEikmann等の方法（Microbi
ology 140: 1817-1828(1994)）により染色体ＤＮＡを単
離した。実施例２からコリネバクテリウム・グルタミク
ムに関して知られたｐｆｋ−遺伝子の配列に基づきポリ
メラーゼ連鎖反応のために次のオリゴヌクレオチドを選
択した：
【００５１】
【外１】
【００５２】この示したプライマーをＡＲＫ Scientifi
c GmbH Biosystems（Darmstadt, Germany）により合成
した。このプライマーｐｆｋ−ｅｘは制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲＩの切断位のための配列を有し、プライ
マーｐｆｋ−ｇｌｐ２は制限エンドヌクレアーゼＳａｌ
Ｉの切断位のための配列を有し、これらの切断位は前記
のヌクレオチド配列に下線で示した。ＰＣＲ−反応をIn
nis等の標準ＰＣＲ法（PCR protocols. A Guide to Met
hods von Applications, 1990, Academic Press）によ
りRoche Diagnostics GmbH社（Mannheim, Deutschlan
d）のＰｗｏ−ポリメラーゼを用いて実施した。このプ
ライマーはポリメラーゼ連鎖反応を用いて、コリネバク
テリウム・グルタミクムからのｐｆｋ−遺伝子を有する
約１.０５ｋｂの大きさのＤＮＡ−フラグメントの増幅
を可能にした。このようにして増幅された生成物を０.
８％のアガロースゲル中で試験した。
c GmbH Biosystems（Darmstadt, Germany）により合成
した。このプライマーｐｆｋ−ｅｘは制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲＩの切断位のための配列を有し、プライ
マーｐｆｋ−ｇｌｐ２は制限エンドヌクレアーゼＳａｌ
Ｉの切断位のための配列を有し、これらの切断位は前記
のヌクレオチド配列に下線で示した。ＰＣＲ−反応をIn
nis等の標準ＰＣＲ法（PCR protocols. A Guide to Met
hods von Applications, 1990, Academic Press）によ
りRoche Diagnostics GmbH社（Mannheim, Deutschlan
d）のＰｗｏ−ポリメラーゼを用いて実施した。このプ
ライマーはポリメラーゼ連鎖反応を用いて、コリネバク
テリウム・グルタミクムからのｐｆｋ−遺伝子を有する
約１.０５ｋｂの大きさのＤＮＡ−フラグメントの増幅
を可能にした。このようにして増幅された生成物を０.
８％のアガロースゲル中で試験した。
【００５３】このようにして得られたＰＣＲフラグメン
トは制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いて完全に
切断される。約１.０５ｋｂの大きさのｐｆｋ−フラグ
メントをQiaExII ゲル抽出キット（Product No., 2002
1, Qiagen, Hilden, Germany）を用いて単離した。
トは制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いて完全に
切断される。約１.０５ｋｂの大きさのｐｆｋ−フラグ
メントをQiaExII ゲル抽出キット（Product No., 2002
1, Qiagen, Hilden, Germany）を用いて単離した。
【００５４】３.２. ベクターｐＺ８−１中でのｐｆｋ
のクローニング コリネバクテリウム・グルタミクム中でもＥ.コリ中で
も発現するためのベースベクターとしてＥ.コリ−コリ
ネバクテリウム・グルタミクム−シャトル−発現ベクタ
ーｐＺ８−１（ＥＰ ０３７５８８９）を使用した。こ
のプラスミドのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａ
ｌＩで完全に切断し、引き続き小エビアルカリ性ホスフ
ァターゼ（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutsc
hland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 175825
0）を用いて脱ホスホリル化した。実施例３.１中でアガ
ロースゲルから単離したｐｆｋ−フラグメントを前記の
ように準備したベクターｐＺ８−１と混合し、この配合
物をＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（Amersham Pharmacia, Fr
eiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Li
gase, Code no. 27-0870-04）で処理した。
のクローニング コリネバクテリウム・グルタミクム中でもＥ.コリ中で
も発現するためのベースベクターとしてＥ.コリ−コリ
ネバクテリウム・グルタミクム−シャトル−発現ベクタ
ーｐＺ８−１（ＥＰ ０３７５８８９）を使用した。こ
のプラスミドのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａ
ｌＩで完全に切断し、引き続き小エビアルカリ性ホスフ
ァターゼ（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutsc
hland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 175825
0）を用いて脱ホスホリル化した。実施例３.１中でアガ
ロースゲルから単離したｐｆｋ−フラグメントを前記の
ように準備したベクターｐＺ８−１と混合し、この配合
物をＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（Amersham Pharmacia, Fr
eiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Li
gase, Code no. 27-0870-04）で処理した。
【００５５】このリガーゼ配合物をＥ.コリ株ＤＨ５α
ｍｃｒ（Hanahan, In: DNA Cloning.A Practical Appro
ach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, US
A）中に形質転換した。プラスミドを有する細胞の選択
をカナマイシン５０ｍｇ／ｌを有するＬＢ−寒天培地
（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上にこの形質転換
体配合物を塗布することにより実施した。３７℃で一夜
インキュベートした後、組み換えした単独クローンを選
択した。形質転換体からプラスミドＤＮＡをQuiaprep S
pin Miniprep キット（Product No., 27106, Qiagen, H
ilden, Germany）を用いて製造者の指示書に従って、単
離し、制限切断により試験した。得られたプラスミドを
ｐＺ−ｐｆｋｅｘと命名した。これを図１中に示した。
ｍｃｒ（Hanahan, In: DNA Cloning.A Practical Appro
ach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, US
A）中に形質転換した。プラスミドを有する細胞の選択
をカナマイシン５０ｍｇ／ｌを有するＬＢ−寒天培地
（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上にこの形質転換
体配合物を塗布することにより実施した。３７℃で一夜
インキュベートした後、組み換えした単独クローンを選
択した。形質転換体からプラスミドＤＮＡをQuiaprep S
pin Miniprep キット（Product No., 27106, Qiagen, H
ilden, Germany）を用いて製造者の指示書に従って、単
離し、制限切断により試験した。得られたプラスミドを
ｐＺ−ｐｆｋｅｘと命名した。これを図１中に示した。
【００５６】実施例４ プラスミドｐＺ−ｐｆｋｅｘを用いる菌株ＤＳＭ５７１
５の形質転換 菌株ＤＳＭ５７１５をLiebl等（FEMS Microbiology Let
ters, 53: 299-303(1989)）により記載されたエレクト
ロポレーション法を適用し、プラスミドｐＺ−ｐｆｋｅ
ｘで形質転換した。形質転換体の選択は、カナマイシン
２５ｍｇ／ｌが補填された、脳−心臓浸出液１８.５ｇ
／ｌ、ソルビトール０.５Ｍ、バクト−トリプトン５ｇ
／ｌ、バクト−イースト−抽出液２.５ｇ／ｌ、ＮａＣ
ｌ５ｇ／ｌおよびバクト−寒天１８ｇ／ｌからなるＬＢ
ＨＩＳ寒天培地上で行われた。インキュベーションを３
３℃で２日間行った。
５の形質転換 菌株ＤＳＭ５７１５をLiebl等（FEMS Microbiology Let
ters, 53: 299-303(1989)）により記載されたエレクト
ロポレーション法を適用し、プラスミドｐＺ−ｐｆｋｅ
ｘで形質転換した。形質転換体の選択は、カナマイシン
２５ｍｇ／ｌが補填された、脳−心臓浸出液１８.５ｇ
／ｌ、ソルビトール０.５Ｍ、バクト−トリプトン５ｇ
／ｌ、バクト−イースト−抽出液２.５ｇ／ｌ、ＮａＣ
ｌ５ｇ／ｌおよびバクト−寒天１８ｇ／ｌからなるＬＢ
ＨＩＳ寒天培地上で行われた。インキュベーションを３
３℃で２日間行った。
【００５７】プラスミドＤＮＡを形質転換体から常法で
単離し（Peters-Wendisch et al.,1998, Microbiology,
144, 915-927）、制限インドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩで切断し、このプラスミドを次いでアガ
ロースゲル−電気泳動で試験した。得られた菌株をＤＳ
Ｍ５７１５／ｐＺ−ｐｆｋｅｘと命名した。
単離し（Peters-Wendisch et al.,1998, Microbiology,
144, 915-927）、制限インドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩで切断し、このプラスミドを次いでアガ
ロースゲル−電気泳動で試験した。得られた菌株をＤＳ
Ｍ５７１５／ｐＺ−ｐｆｋｅｘと命名した。
【００５８】実施例５ リシンの製造 実施例４により得られたコリネバクテリウム・グルタミ
クム菌株５７１５／ｐＺ−ｐｆｋｅｘをリシンの生産に
好適な培地中で培養し、培地上澄み中のリシン含量を測
定した。
クム菌株５７１５／ｐＺ−ｐｆｋｅｘをリシンの生産に
好適な培地中で培養し、培地上澄み中のリシン含量を測
定した。
【００５９】このためには、この菌株を最初に相応する
抗生物質を有する寒天プレート（テトラサイクリン（５
ｍｇ／ｌ）を含有する脳−心臓−寒天）上で、３３℃で
２４時間インキュベートした。この寒天プレート培地か
ら出発し、予培地を接種した（１００ｍｌの三角フラス
コ中に１０ｍｌの培地）。予培養のための培地としては
完全培地ＣｇＩＩＩを使用した。
抗生物質を有する寒天プレート（テトラサイクリン（５
ｍｇ／ｌ）を含有する脳−心臓−寒天）上で、３３℃で
２４時間インキュベートした。この寒天プレート培地か
ら出発し、予培地を接種した（１００ｍｌの三角フラス
コ中に１０ｍｌの培地）。予培養のための培地としては
完全培地ＣｇＩＩＩを使用した。
【００６０】 培地Ｃｇ ＩＩＩ ＮａＣｌ ２.５ｇ、 バクト−ペプトン １０ｇ／ｌ、 バクトイースト−抽出物 １０ｇ／ｌ、 グルコース（分離してオートクレーブ処理）２％（ｗ／ｖ） ｐＨ−値をｐＨ７.４に調節した。
【００６１】これにカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添
加した。この予培地を振盪器上で３３℃、２４０ｒｐｍ
で１６時間インキュベートした。この予培地から主培養
に接種し、こうして主培養の開始−ＯＤ（６６０ｎｍ）
が０.０５を有した。主培養のためには培地ＭＭを使用
した。
加した。この予培地を振盪器上で３３℃、２４０ｒｐｍ
で１６時間インキュベートした。この予培地から主培養
に接種し、こうして主培養の開始−ＯＤ（６６０ｎｍ）
が０.０５を有した。主培養のためには培地ＭＭを使用
した。
【００６２】 培地 ＭＭ ＣＳＬ（コーンスチープリカー） ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ（モルホリンプロパンスルホン酸） ２０ｇ／ｌ グルコース（分離してオートクレーブ処理） ５０ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０.１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １.０ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ５.０ｍｇ／ｌ ビオチン（滅菌濾過） ０.３ｍｇ／ｌ チアミン・ＨＣｌ（滅菌濾過） ０.２ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシン（滅菌濾過） ０.１ｇ／ｌ ＣａＣＯ３ ２５ｇ／ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液をアンモニア水でｐＨ７
に調節し、かつオートクレーブ処理した。引き続き、滅
菌した基質溶液およびビタミン溶液を添加し、並びに乾
燥オートクレーブ処理したＣａＣＯ３を添加した。
に調節し、かつオートクレーブ処理した。引き続き、滅
菌した基質溶液およびビタミン溶液を添加し、並びに乾
燥オートクレーブ処理したＣａＣＯ３を添加した。
【００６３】培養をじゃま板を備える１００ｍｌ三角フ
ラスコ中に容量１０ｍｌで実施した。カナマイシン（２
５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃で湿度８０％で
行った。
ラスコ中に容量１０ｍｌで実施した。カナマイシン（２
５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃で湿度８０％で
行った。
【００６４】７２時間後、Biomek 1000（Beckmann Inst
ruments GmbH, Muenchen）を用いて、測定波長６６０ｎ
ｍでＯＤを調べた。生じたリシン量はアミノ酸分析装置
（Firma Eppendorf-BioTronik製: Hamburg, Deutschlan
d）を用いて、イオン交換クロマトグラフィーおよびニ
ンヒドリン検出での後カラム誘導体化により決定した。
ruments GmbH, Muenchen）を用いて、測定波長６６０ｎ
ｍでＯＤを調べた。生じたリシン量はアミノ酸分析装置
（Firma Eppendorf-BioTronik製: Hamburg, Deutschlan
d）を用いて、イオン交換クロマトグラフィーおよびニ
ンヒドリン検出での後カラム誘導体化により決定した。
【００６５】表１は実験の結果を示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【配列表】
【００６８】
【外２】
【００６９】
【外３】
【００７０】
【外４】
【図１】プラスミドｐＺ-ｐｆｋｅｘを示す図である。
図中で示した短縮形は以下の意味を有する： Ｋａｎ： カナマイシンに対する耐性遺伝子 Ｐｔａｃ： ｔａｃ−プロモータ ｐｆｋ： Ｃ.グルタミクムのｐｆｋ−遺伝子 ｒｒｎＢ−Ｔ１Ｔ２： Ｅ.コリのｒｒｎＢ−遺伝子の
ターミネーターＴ１Ｔ２ ｒｅｐ： Ｃ.グルタミクムに関するプラスミド
（ｐＨＭ１５１９）をコードする複製オリジン ＥｃｏＲＩ： 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断位 ＳａｌＩ： 制限酵素ＳａｌＩの切断位
ターミネーターＴ１Ｔ２ ｒｅｐ： Ｃ.グルタミクムに関するプラスミド
（ｐＨＭ１５１９）をコードする複製オリジン ＥｃｏＲＩ： 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断位 ＳａｌＩ： 制限酵素ＳａｌＩの切断位
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (16)
- 【請求項１】 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくと
も７０％まで同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５個の連続する塩基を有するポリヌクレオチ
ド、の群から選択されたポリヌクレオチド配列を有す
る、コリネフォルム細菌から得られた単離したポリヌク
レオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがコリネフォルム細菌
中で複製可能な、有利に組み換えＤＮＡである、請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に記載された核酸配列を有す
る、請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 （ｉ）配列番号１中に記載されたヌクレ
オチド配列、または（ｉｉ）配列（ｉ）に遺伝学的コー
ドの縮重範囲内で相当する配列少なくとも１つ、または
（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列と
ハイブリダイズする配列少なくとも１つ、および場合に
より（ｉｖ）（ｉ）中での機能中立センス突然変異、を
有する、請求項２記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列番号２に記載されているアミノ酸配
列を有する、ポリペプチドをコードする、請求項２記載
のポリヌクレオチド配列。 - 【請求項７】 Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンの発酵に
よる製法において、次の工程： ａ）少なくともｐｆｋ−遺伝子またはこれをコードする
ヌクレオチド配列が強化され、特に過剰発現される、Ｌ
−アミノ酸を生産するコリネフォルム細菌の発酵、 ｂ）細菌の培地中または細胞中でのＬ−アミノ酸の富
化、および ｃ）Ｌ−アミノ酸の単離、を実施することを特徴とす
る、Ｌ−アミノ酸の発酵による製法。 - 【請求項８】 所望のＬ−アミノ酸の生合成経路のその
他の遺伝子がその中で付加的に強化された細菌を使用す
る請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 Ｌ−リシンの形成を減少させる物質代謝
経路が少なくとも部分的に遮断されている細菌を使用す
る請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】 プラスミドベクターで形質転換した菌
株を使用し、プラスミドベクターがｐｆｋ−遺伝子をコ
ードするヌクレオチド配列を有する請求項７記載の方
法。 - 【請求項１１】 Ｌ−リシンを製造するコリネフォルム
細菌を使用する請求項７から１０までのいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項１２】 リシンの製造のために、 １２.１ ジヒドロジピコリン酸−シンターゼをコード
するｄａｐＡ−遺伝子、 １２.２ ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐ
ｙｃ−遺伝子、 １２.３ トリオース燐酸イソメラーゼをコードするｔ
ｐｉ−遺伝子、 １２.４ グリセルアルデヒド３−燐酸デヒドロゲナー
ゼをコードするｇａｐ−遺伝子、 １２.５ ３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードす
るｐｇｋ−遺伝子、 １２.６ リシン−搬送をコードするｌｙｓＥ−遺伝子 からなる群から選択された１つ以上の遺伝子が同時に強
化され、特に過剰発現または増幅される細菌を発酵させ
る、請求項６記載の方法。 - 【請求項１３】 Ｌ−リシンの製造のために、１３.１
ホスホエノールピルビン酸−カルボキシキナーゼをコ
ードするｐｃｋ−遺伝子、 １３.２ グルコース−６−燐酸イソメラーゼをコード
するｐｇｉ−遺伝子 からなる群から選択された１つ以上の遺伝子が同時に弱
められた細菌を発酵させる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１４】 コリネバクテリウム・グルタミクム属
の微生物を使用する請求項７から１３までのいずれか１
項記載の製法。 - 【請求項１５】 ポリメラーゼ連鎖反応により、ホスホ
フルクトキナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡの製造の
ためのプライマーとしての請求項１記載のポリヌクレオ
チド配列の使用。 - 【請求項１６】 ハイブリダイゼーションのためのプロ
ーブとしての、請求項１記載のポリヌクレオチド配列の
使用。
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