SK17362000A3 - Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfk - Google Patents
Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfk Download PDFInfo
- Publication number
- SK17362000A3 SK17362000A3 SK1736-2000A SK17362000A SK17362000A3 SK 17362000 A3 SK17362000 A3 SK 17362000A3 SK 17362000 A SK17362000 A SK 17362000A SK 17362000 A3 SK17362000 A3 SK 17362000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- polynucleotide
- sequence
- gene
- lysine
- amino acid
- Prior art date
Links
- 101150020704 Pfk gene Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 16
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 37
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 24
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 13
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 52
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 13
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 11
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 claims description 5
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 2
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 claims description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150053253 pgi gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims description 2
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 7
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 25
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TTXMOJWKNRJWQJ-FXQIFTODSA-N Ala-Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N TTXMOJWKNRJWQJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N Ala-Glu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N Ala-Gly-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- JDIQCVUDDFENPU-ZKWXMUAHSA-N Ala-His-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CNC=N1 JDIQCVUDDFENPU-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SFPRJVVDZNLUTG-OWLDWWDNSA-N Ala-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SFPRJVVDZNLUTG-OWLDWWDNSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JSHVMZANPXCDTL-GMOBBJLQSA-N Arg-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JSHVMZANPXCDTL-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 2
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N Arg-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- XBQSLMACWDXWLJ-GHCJXIJMSA-N Asp-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O XBQSLMACWDXWLJ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- GCACQYDBDHRVGE-LKXGYXEUSA-N Asp-Thr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O GCACQYDBDHRVGE-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- GHAHOJDCBRXAKC-IHPCNDPISA-N Asp-Trp-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N GHAHOJDCBRXAKC-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QGZSAHIZRQHCEQ-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QGZSAHIZRQHCEQ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKVZTQVGUNLLQW-JBDRJPRFSA-N Ile-Ala-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N NKVZTQVGUNLLQW-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N Leu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N Leu-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- JFSGIJSCJFQGSZ-MXAVVETBSA-N Leu-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N JFSGIJSCJFQGSZ-MXAVVETBSA-N 0.000 description 2
- HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- DTUZCYRNEJDKSR-NHCYSSNCSA-N Lys-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN DTUZCYRNEJDKSR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- IUWMQCZOTYRXPL-ZPFDUUQYSA-N Lys-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IUWMQCZOTYRXPL-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- OVAOHZIOUBEQCJ-IHRRRGAJSA-N Lys-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OVAOHZIOUBEQCJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N Lys-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N Ser-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 2
- FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N Ser-Tyr-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N Thr-Asp-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 2
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100298079 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) pNG2 gene Proteins 0.000 description 1
- MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KTXKIYXZQFWJKB-VZFHVOOUSA-N Ala-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KTXKIYXZQFWJKB-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N Asp-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- NOCCABSVTRONIN-CIUDSAMLSA-N Cys-Ala-Leu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N NOCCABSVTRONIN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000644323 Escherichia coli C Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- AXNGDPAKKCEKGY-QPHKQPEJSA-N Ile-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N AXNGDPAKKCEKGY-QPHKQPEJSA-N 0.000 description 1
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N Leu-Ser-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- VEGLGAOVLFODGC-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VEGLGAOVLFODGC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- -1 Nitrogen-containing organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- BFYHIHGIHGROAT-HTUGSXCWSA-N Phe-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BFYHIHGIHGROAT-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- TXPUNZXZDVJUJQ-LPEHRKFASA-N Pro-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TXPUNZXZDVJUJQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N Thr-Leu-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N)O RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- NYQIZWROIMIQSL-VEVYYDQMSA-N Thr-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NYQIZWROIMIQSL-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N Thr-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 1
- KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N Thr-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N 0.000 description 1
- MXKUGFHWYYKVDV-SZMVWBNQSA-N Trp-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1c[nH]c2ccccc12)C(C)C)C(O)=O MXKUGFHWYYKVDV-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- IJGPOONOTBNTFS-GVXVVHGQSA-N Val-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IJGPOONOTBNTFS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 108010066119 arginyl-leucyl-aspartyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblasť techniky
Predmetom vynálezu sú nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfk a spôsob fermentačnej výroby aminokyselín, najmä L-lyzínu, použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje gén pfk.
Doterajší stav techniky
Aminokyseliny, najmä L-lyzín, sa používajú v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle, ale najmä vo výžive zvierat.
Je známe, že aminokyseliny sa vyrábajú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä Corynebacterium glutamicum. Kvôli veľkému významu sa stále pracuje na zlepšení spôsobov výroby. Zlepšenia spôsobov sa môžu dokonca týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom, alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných úžitkových vlastností samotného mikroorganizmu.
Na zlepšenie úžitkových vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutantov. Týmto spôsobom sa získajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analóg lyzínu S-(2• · ·· · ·· ·· ·· · · · · · ·
9 9 9 9 9 9 9
9999 9999 99 9
9 9 ·9 99
999 999 99 9 99 9
-aminoetyl)cysteín, alebo sú auxotrofné vzhladom na regulačné významné metabolity a produkujú L-aminokyseliny, napríklad L-lyzín.
Už niekolko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na kmeňové zlepšenie kmeňov Corynebacterium produkujúcich aminokyseliny tak, že jednotlivé gény pre biosyntézu aminokyselín sa amplifikujú a skúma sa účinok na produkciu aminokyseliny. Prehľadný článok k tomu sa nachádza medzi iným v Kinoshita („Glutamic Acid Bacteria, in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (vyd.), Benjamin Cummings, Londýn, Veľká Británia, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten a Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) a Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 2539 (1996)).
Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové opatrenia na zlepšenú fermentačnú výrobu aminokyselín, najmä L-lyzínu.
Aminokyseliny, najmä L-lyzín, sa používajú v humánnej medicíne, vo farmaceutickom priemysle a najmä vo výžive zvierat. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov výroby aminokyselín, najmä L-lyzínu.
Keď sa v nasledovnom texte uvedie L-lyzín alebo lyzín, mieni sa tým nielen zásada, ale aj soli, ako napríklad lyzín-monohydrochlorid alebo lyzín-sulfát.
·· · ·· • · · · · · • · · · · · • · · ···· é · · • ··· ·· ·
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je izolovaný polynukleotid z koryneformných baktérii, obsahujúci polynukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahŕňajúcej
a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID No. 2,
b) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No. 2,
c) polynukleotid, ktorý je komplementárny k polynukleotidom a) alebo b), a
d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov polynukleotidovej sekvencie a), b) alebo c).
Predmetom vynálezu je aj polynukleotid podlá nároku 1, pričom sa prednostne jedná o replikovatelnú DNA obsahujúcu:
(i) nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 1, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá sa hybridizuje so sekvenciou komplementárnou k sekvencii (i) alebo (ii), a poprípade
• · · • · 9 ·
9 9999 (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i) .
Ďalším predmetom je polynukleotid podlá nároku 4 obsahujúci nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 1, polynukleotid podía nároku 6, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No.
2, vektor obsahujúci polynukleotid podía nároku 1, najmä kyvadlový vektor alebo plazmidový vektor a koryneformné baktérie slúžiace ako hostitelské bunky, ktoré obsahujú tento vektor.
Predmetom vynálezu sú aj polynukleotidy, ktoré sa skladajú v podstate z polynukleotidovej sekvencie, ktoré možno získať skríningom prostredníctvom hybridizácie príslušnej génovej banky, ktorá obsahuje úplný gén s polynukleotidovou sekvenciou zodpovedajúcou SEQ ID No. 1, pomocou sondy, ktorá obsahuje sekvenciu uvedeného polynukleotidu podía SEQ ID No.
alebo jej fragment, a izoláciou uvedenej sekvencie DNA.
Polynukleotidové sekvencie podía vynálezu sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA, aby sa izolovali cDNA s celou dĺžkou, ktoré kódujú fosfofruktokinázu, a aby sa izolovali také cDNA alebo gény, ktoré vykazujú veľkú podobnosť sekvencie so sekvenciou génu pre fosfofruktokinázu.
·· · ·· • · · · · • · · · · · • β ······· ·
Polynukleotidové sekvencie podlá vynálezu sú ďalej vhodné ako priméry na produkciu DNA génov, ktoré kódujú fosfofruktokinázu, polymerázovou reťazovou reakciou (PCR).
Také oligonukleotidy slúžiace ako sondy alebo priméry obsahujú aspoň 30, prednostne aspoň 20, celkom obzvlášť prednostne aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov. Vhodné sú taktiež oligonukleotidy s dĺžkou aspoň 40 alebo 50 nukleotidov.
„Izolovaný znamená oddelený zo svojho prirodzeného prostredia.
„Polynukleotid sa vzťahuje všeobecne na polyribonukleotidy a polydeoxyribonukleotidy, pričom sa môže jednať o nemodifikované RNA alebo DNA alebo modifikované RNA alebo DNA.
Pod pojmom „polypeptidy sa rozumejú peptidy alebo proteíny, ktoré obsahujú dve alebo viac aminokyselín viazaných peptidovými väzbami.
Polypeptidy podľa vynálezu zahŕňajú polypeptid podľa SEQ ID No. 2, najmä polypeptidy s biologickou aktivitou fosfofruktokinázy a aj také, ktoré sú aspoň na 70 % identické s polypeptidom podľa SEQ ID No. 2, prednostne aspoň na 80 % a obzvlášť také, ktoré vykazujú identitu s polypeptidom podlá SEQ ID No. 2 aspoň na 90 % až 95 % a uvedenú aktivitu.
Vynález sa ďalej týka spôsobu fermentačnej výroby aminokyselín, najmä lyzínu, použitím koryneformných baktérií, ktoré najmä už produkujú aminokyseliny a v ktorých sa zošiltt 9 » · · • · · » · · · · · « ·· ňuj ú, najmä nadmerne exprimujú nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfk.
Pojem „zosilnenie opisuje v tejto súvislosti zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA, tým, že sa napríklad zvýši počet kópií génu, poprípade génov, použije sa silný promótor alebo sa použije gén, ktorý kóduje príslušný enzým s vysokou aktivitou a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.
Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať L-aminokyseliny, najmä lyzín, z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Môže sa jednať o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.
Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad známe kmene divého typu glutamicum ATCC13032, acetoglutamicum ATCC15806, acetoacidophilum ATCC13870, thermoaminogenes FERM BP-1539, melassecola ATCC17965, flavum ATCC14067, lactofermentum ATCC13869 a divaricatum ATCC14020
Corynebacterium Corynebacterium Corynebacteri um Co rynebacterium Corynebacterium Brevibacteri um Brevibacterium Brevibacterium a z nich vytvorené mutanty, poprípade kmene, produkujúce
Ί
Λ · · · · · · ·· ·· · · · · · · • · · · · · · · • · · · ···· · · · • · · · · · · ··· ··· ·· · ·· ·
L-lyzín, ako napríklad
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,
Brevibacterium flavum FERM-P 1708,
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Vynálezcom sa podarilo izolovať nový gén pfk z C. glutamicum, kódujúci enzým fosfofruktokinázu.
Na izoláciu génu pfk alebo aj iných génov z C. glutamicum sa najskôr založí génová banka tohto mikroorganizmu v E. coli. Založenie génových bánk je opísané vo všeobecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesť učebnicu od Winnackera: Gene und Klone, Eine Einfíihrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku od Sambrooka et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989). Velmi známou génovou bankou je génová banka kmeňa W3110 E. coli K-12, ktorú založili Kohara et al. (Celí 50, 495 - 508 (1987)) v λ-vektoroch. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032, ktorá bola založená pomocou kozmidového vektora SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) v kmeni NM554 E. coli K12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Bórmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) zasa opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032 s použitím kozmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Na vytvorenie génovej banky C. glutamicum v E. coli sa môžu použiť aj plazmidy, ako napríklad pBR322 • · ·· · ·· ·· ·· ··· ··· • · ···· · · • · · · · ···· · · · ··· ··· ·· · ·· ··· (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979) alebo pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268). Ako hostitelia sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne defektné. Príkladom toho je kmeň DH5amcr, ktorý opísal Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Dlhé fragmenty DNA klonované pomocou kozmidov sa potom zasa môžu subklonovať do bežných vektorov vhodných na sekvenovanie a potom sekvenovať, ako sa opisuje napríklad v Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74:5463-5467 (1977)).
Týmto spôsobom sa získala nová sekvencia DNA z C. glutamicum, kódujúca gén pfk, ktorá je ako SEQ ID No. 1 súčasťou predloženého vynálezu. Ďalej sa z tejto sekvencie DNA odvodila aminokyselinová sekvencia príslušného proteínu pomocou vyššie opísaných metód. V SEQ ID No. 2 je znázornená vyplývajúca aminokyselinová sekvencia génového produktu pfk.
Kódujúce sekvencie DNA, ktoré vyplývajú z SEQ ID No. 1 v dôsledku degenerovatelnosti genetického kódu, sú taktiež súčasťou vynálezu. Rovnako sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa hybridizujú s SEQ ID No. 1 alebo časťami SEQ ID No. 1. V odbornom svete sú ďalej konzervatívne výmeny aminokyselín, ako napríklad výmena glycínu za alanín alebo kyseliny asparágovej za kyselinu glutámovú v proteínoch, známe ako „mutácie so zmyslom” (sense mutations), ktoré nevedú k žiadnej zásadnej zmene aktivity proteínu, t. zn. sú funkčne neutrálne. Ďalej je známe, že zmeny na N-konci a/alebo C-konci proteínu nemôžu jeho funkciu podstatne obmedzovať alebo ju môžu dokonca stabilizovať. Údaje k tomu nájde odborník medzi iným v Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), v O'Regan et al. (Gene • · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • · ···· ·· • · e· ·····«· · • · · · · · · ······ ·· · ·· ·
77:237-251 (1989)), v Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), v Hochuli et al. (Bio/Technology 6:13211325 (1988)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie. Aminokyselinové sekvencie, ktoré vyplývajú príslušným spôsobom z SEQ ID NO. 2, sú taktiež súčasťou vynálezu.
Súčasťou vynálezu sú rovnako aj sekvencie DNA, ktoré sa hybridizujú s SEQ ID NO. 1 alebo časťami SEQ ID NO. 1. Napokon sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa pripravujú polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) použitím primérov, ktoré vyplývajú z SEQ ID NO. 1. Také oligonukleotidy majú typickým spôsobom dĺžku aspoň 15 nukleotidov.
Návody na identifikáciu sekvencií DNA pomocou hybridizácie nájde odborník medzi iným v príručke „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a v Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Návody na amplifikáciu sekvencií DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) nájde odborník medzi iným v príručke Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, Veľká Británia, 1984) a v Newton a Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Nemecko, 1994).
Vynálezcovia zistili, že koryneformné baktérie po nadmernej expresii génu pfk produkujú zlepšeným spôsobom aminokyseliny, najmä L-lyzín.
Na dosiahnutie nadmernej expresie sa môže zvýšiť počet kópií príslušných génov alebo sa môže mutovať promótorová a regulačná oblasť alebo miesto pre naviazanie ribozómov, • t · · ·· · ·· ·· · · · · ·· • · ···· ··· • · · · · ···· · · · · • · · · · ··· ··· ··· ·· · ·· ··· ktoré sa nachádzajú proti smeru štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom pôsobia expresívne kazety, ktoré sa vkladajú proti smeru štruktúrneho génu. Pomocou indukovateľných promótorov možno dodatočne zvýšiť expresiu v priebehu fermentačnej produkcie L-lyzínu. Opatreniami na predĺženie trvanlivosti m-RNA sa expresia taktiež zlepšuje. Ďalej sa enzýmová aktivita taktiež zosilňuje zabránením odbúravania enzýmového proteínu. Gény alebo génové konštrukty môžu buď existovať v plazmidoch s rozdielnym počtom kópií, alebo môžu byť integrované a amplifikované v chromozóme. Ďalej sa môže alternatívne dosiahnuť nadmerná expresia príslušných génov zmenou zloženia médií a zmenou uskutočnenia kultivácie.
Návody na to nájde odborník medzi iným v Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), v Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), v Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), v európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v US patente 4,601,893, vo Schwarzer a Píihler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), v Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), v LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), v patentovej prihláške WO 96/15246, v Malumbres et al. (Gene 134, 15 - 24 (1993)), v japonskom zverejnenom spise JP-A-10-229891, v Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), v Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie .
Gén pfk podľa vynálezu sa napríklad nadmerne exprimoval pomocou plazmidov.
• · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • · · · · · B · • · · B ·BBBB · · ·
ΒΒΒ ··· BB · ·· ···
Ako plazmidy sú vhodné také, ktoré sa replikujú v koryneformných baktériách. Početné známe plazmidové vektory, ako napríklad pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989, 64: 549-554), pEKExl Eikmanns et al.
(Gene 102, 93-98 (1991) alebo pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) sa zakladajú na kryptických plazmidoch pHM1519, pBLl alebo pGAl. Rovnako sa môžu použiť iné plazmidové vektory, ako napríklad tie, ktoré sú založené na pCG4 (US-A 4,439,160) alebo pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) alebo pAGl (US-A 5,158,891).
Ďalej sú vhodné také plazmidové vektory, pomocou ktorých sa môže použiť spôsob génovej amplifikácie integráciou do chromozómu, ako opísal napríklad Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), na duplikáciu, poprípade amplifikáciu operónu hom-thrB. Pri tejto metóde sa úplný gén klonuje do plazmidového vektora, ktorý sa môže replikovať v hostiteľovi (typicky E. coli), avšak nie v C. glutamicum. Ako vektory prichádzajú do úvahy napríklad pSUP301 (Šimon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob alebo pKl9mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (firma Invitrogen, Groningen, Holandsko; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) alebo pEMl (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:45104516). Plazmidový vektor obsahujúci gén, ktorý sa má amplifikovať, sa potom prenesie konjugáciou alebo transformáciou do žiadaného kmeň C. glutamicum. Metóda konjugácie je opísaná napríklad v Schäfer et al., (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Metódy •
• · · • · · • · · · • · · ···· · · • · · · ·· · • · ·· · transformácie sa opisujú napríklad v Thierbach et al., (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican a Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) a Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Po homológnej rekombinácii pomocou „cross over udalosti obsahuje výsledný kmeň aspoň dve kópie uvedeného génu.
Prídavné môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné okrem génu pfk zosilniť alebo nadmerne exprimovať jeden alebo viac enzýmov danej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky, cyklu kyseliny citrónovej alebo exportu aminokyselín.
Takto sa napríklad môže na produkciu L-lyzínu súčasne nadmerne exprimovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu (EP-B 0 197 335), alebo • gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:
6076-6086), alebo • gén tpi kódujúci triózafosfátizomerázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), alebo • gén pgk kódujúci 3-fosfoglycerátkinázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), alebo • · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • a aaaa a · • · · a · ···· · · · a a a a a · a • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Eikmanns (1992),
Journal of bacteriology 174:6076-6086), alebo • gén lysE kódujúci export lyzínu (DE-A-195 48 222).
Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné vedia génu pfk súčasne zoslabiť • gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu (DE
199 50 409.1, DSM 13047) a/alebo • gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu (US 09/396,478, DSM 12969).
Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu, okrem nadmernej expresie génu pfk výhodné vylúčiť nežiaduce vedlajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londýn, Veľká Británia, 1982).
Mikroorganizmy vytvorené podlá vynálezu sa môžu na účely produkcie aminokyselín, najmä L-lyzínu, kultivovať kontinuálne alebo diskontinuálne spôsobom batoh (vsádzková kultivácia) alebo spôsobom fed batoh (prítokový systém) alebo spôsobom repeated fed batoh (opakovaný prítokový systém). Zhrnutie známych kultivačných metód je opísané v učebnici od Chmiela (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart,
1991) alebo v učebnici od Storhasa (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) .
• · ·· · ·· · ·· ·· · · · · · ·· • · 9 9 9 9 9 9 9 • · · · · ···· · · · · • · · · · ···
999 999 99 9 99 999
Použité kultivačné médium musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom daných kmeňov. Opisy kultivačných médií rozličných mikroorganizmov sa nachádzajú v príručke „Manual of Methods for General Bacteriology od American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Ako zdroje uhlíka sa môžu používať cukry a sacharidy, ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový olej; mastné kyseliny, ako je kyselina palmitová, kyselina stearová, kyselina linolová; alkoholy, ako je napríklad glycerol a etanol; a organické kyseliny, ako je napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu používať ako jednotlivé zložky alebo ako zmes. Ako zdroje dusíka sa môžu používať organické zlúčeniny obsahujúce dusík, napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako je napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka sa môžu používať jednotlivo alebo ako zmes. Ako zdroje fosforu sa môžu používať kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železa, ktoré sú potrebné na rast. Napokon sa môžu prídavné k vyššie uvedeným látkam používať esenciálne rastové látky, ako sú aminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu okrem toho pridávať vhodné prekurzory. Uvedené vsádzkové suroviny sa môžu ku kultúre pridávať vo forme jednorazovej vsádzky alebo sa môžu vhodným spôsobom pridávať počas kultivácie.
| • · ·· | • | ·· · | |||
| ·· | • · | • | • · | • | |
| • | • · | • · | • · | ||
| • | • · · | ···· | • · · | ||
| • | • · | • | • · | ||
| ·· | ··· | ·· | • | ·· | • · |
Na kontrolu pH kultúry sa vhodne používajú zásadité zlúčeniny, ako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, poprípade amoniaková voda, alebo kyslé zlúčeniny, ako je kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Na kontrolu tvorby peny sa môžu používať odpeňovadlá, ako napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Na udržiavanie stability plazmidov sa môžu k médiu pridávať vhodné selektívne pôsobiace látky, napríklad antibiotiká. Aby sa udržiavali aeróbne podmienky, zavádza sa do kultúry kyslík alebo zmesi plynov obsahujúce kyslík, napríklad vzduch. Teplota kultúry je zvyčajne približne 20 °C až 45 °C a najmä približne 25 °C až 40 °C. Kultúra sa udržiava tak dlho, kým sa nevytvorí maximum lyzínu. Tento ciel sa zvyčajne dosiahne za 10 hodín až 160 hodín.
Analýza L-lyzínu sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak, ako sa opisuje v Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190) .
Spôsob podlá vynálezu slúži na fermentačnú výrobu aminokyselín, najmä L-lyzínu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Predložený vynález sa v nasledovnom texte bližšie vysvetľuje na základe príkladov uskutočnenia.
Príklad 1
Vytvorenie genomickej kozmidovej génovej banky z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ·· · ··· e ·· · ·· · • · · · · ·· • · · · · · · • · · ···· · · · · • · · · · · ·· · ·· ···
Chromozómová DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sa izolovala tak, ako sa opisuje v Tauch et al., (1995, Plasniid 33: 168-179), a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Sau3AI, Code no. 27-0913-02). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (shrimp) (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, Code no. 1758250). DNA kozmidového vektora SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), získaná od firmy Stratagene (La Jolla, USA, opis produktu SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301), sa štiepila reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Xbal, Code no. 27-0948-02) a taktiež defosforylovala alkalickou fosfatázou z garnátov. Následne sa kozmidová DNA štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, Code no. 27-086804). Týmto spôsobom spracovaná kozmidová DNA sa zmiešala so spracovanou DNA ATCC13032 a zmes sa spracovala T4-DNA-1Ígázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu T4-DNA-l.igáza, Code no. 27-0870-04) . Ligačná zmes sa potom pomocou Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, opis produktu Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) vbalila do fágov. Na infekciu kmeňa E. coli NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16:15631575) sa bunky extrahovali v lOmM MgSO4 a zmiešali s alikvotom suspenzie fágov. Infekcia a titrácia kozmidovej banky sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom sa bunky naniesli na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) so 100 gg/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé rekombinantné klony.
• · ·· · • 9 9 • · · · • · · ···· • · · ·· · • · ·· • · · • · · • · · ·· ···
Príklad 2
Izolácia a sekvenovanie génu pfk
Kozmidová DNA jednej jednotlivej kolónie sa izolovala pomocou Qiaprep Spin Miniprep Kit (produkt č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podlá návodov výrobcu a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Sau3AI, produkt č. 27-091302). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, produkt č. 1758250). Po separácii gélovou elektroforézou sa uskutočnila izolácia kozmidových plazmidov s rozsahom veľkostí 1 500 až 2 000 bp pomocou QiaExII gel Extraction Kit (produkt č. 20021,
Qiagen, Hilden, Nemecko). DNA sekvenčného vektora pZero-1, získaná od firmy Invitrogen (Groningen, Holandsko, opis produktu Zero Background Cloning Kit, produkt č. K2500-01), sa štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, produkt č. 27-086804). Ligácia kozmidových fragmentov do sekvenovacieho vektora pZero-1 sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual,
Cold Spring Har-bor), pričom zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) sa inkubovala cez noc. Táto ligačná zmes sa následne elektroporovala (Tauch et al. 1994, FEMS Micro-biol Letters, 123:343-7) do kmeňa E. coli DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) a naniesla na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s 50 μg/ml zeocínu. Plazmidová preparácia rekombinantných klonov sa uskutočňovala pomocou Biorobot 9600 (product č. 900200,
Qiagen, Hilden, Nemecko). Sekvenovanie sa uskutočňovalo • · · ··
··· · • · · · · • · · · · • ···· · · · • · ···· dideoxymetódou prerušenia reťazca od Sanger et al. (1997, Proceedings of the National of Sciences U.S.A.,74:5463-5467) s modifikáciami podľa Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Použil sa „RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od PE Applied Biosystems (produkt č. 403044, Weiterstadt, Nemecko). Separácia gélovou elektroforézou a analýza sekvenačnej reakcie sa uskutočňovala v géle „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid” (29:1) (produkt č. A124.1, Roth, Karslruhe, Nemecko) pomocou prístroja na sekvenovanie „ABI prism 377 od PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).
Získané nespracované údaje o sekvenciách sa následne spracovali procesorom použitím programového balíka Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) Version 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov pZerol sa zostavili do jedného súvislého celku. Počítačová analýza kódujúcich oblastí sa uskutočnila pomocou programu XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Ďalšie analýzy sa uskutočnili pomocou „BLAST search programs (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) proti neredundantnej databanke od „National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Získaná nukleotidové sekvencia je znázornená v SEQ ID No. 1. Analýza nukleotidovéj sekvencie poskytla otvorený čítací raster s 990 pármi báz, ktorý sa označil ako gén pfk. Gén pfk kóduje proteín s 330 aminokyselinami.
Príklad 3
Príprava expresívneho vektora pZ-pfkex na zosilnenie génu ,pfk v Corynebacterium glutamicum • · · · • · · ···· · · · • · · · ·
3.1 Klonovanie génu pfk
Z kmeňa ATCC 13032 sa metódou podlá Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) izolovala chromozómová DNA. Na základe sekvencie génu pfk známej z príkladu 2 pre C. glutamicum sa selektovali nasledovné oligonukleotidy pre polymerázovú reťazovú reakciu:
pfk-ex:
5' GAT CTA GAA TTC AAC TTT CAG GTG GTA ACC C 3' pfk-glp2:
5' GAT CTA GTC GAC CGG ACA AGC GAG GAA TTA T 3'
Znázornené priméry syntetizovala firma ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Nemecko). Primér ofk-ex obsahuje sekvenciu pre štiepne miesto pre reštrikčnú endonukleázu EcoRI a primér pfk-glp2 obsahuje štiepne miesto pre reštrikčnú endonukleázu Sali, ktoré sú vo vyššie znázornenom poradí nukleotidov vyznačené pomocou podčiarknutia. PCR reakcia sa uskutočnila podlá štandardnej metódy PCR od Innisa et al. (PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) s polymerázou Pwo od firmy Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Nemecko). Pomocou tejto polymerázovej reakcie umožnili priméry amplifikáciu fragmentu DNA s veľkosťou približne 1,5 kb, ktorý nesie gén pfk z Corynebactéri um glutamicum. Takto amplifikovaný produkt sa skúmal elektroforézou v 0,8% agorózovom géle.
Takto získaný fragment PCR sa úplne rozštiepil reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sali. Fragment pfk s veľkosťou približne 1,5 kb sa izoloval z agarózového gélu pomocou • · »· · ·· • · ·· ··· ··· • · · · · · · · • · · · · ···· · · ·
QiaExII Gel Extraktion Kit (produkt č. 20021, Qiagen,
Hilden, Nemecko).
3.2. Klonovanie pfk do vektora pZ8-l
Ako základný vektor na expresiu v C. glutamicum aj v E. coli sa použil kyvadlový-expresívny vektor pZ8-l z E. coli - C. glutamicum (EP 0 375 889). DNA tohto plazmidu sa úplne rozštiepila reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sali a potom defosforylovala alkalickou fosfatázou z garnátov (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, produkt č. 1758250). Fragment pfk izolovaný z agarózového gélu v príklade 3.1 sa zmiešal s takto pripraveným vektorom pZ8-l a zmes sa spracovala s T4-DNA-ligázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu T4-DNA-ligáza, kód č. 27-0370-04).
Ligačná zmes sa transformovala do kmeňa E. coli DH5amcr (Hanahan, in: DNA Cloning. A Practical Approach. zv. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). Selekcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočnila nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s 50 mg/l kanamycínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé rekombinantné klony. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím QIAprep Spin Miniprep Kit (produkt č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podlá údajov výrobcu a skúmala reštrikčným štiepením. Získaný plazmid sa nazval pZ-pfkex. Je znázornený na obrázku 1.
Príklad 4
Transformácia kmeňa DSM5715 s plazmidom pZ-pfkex • · ·· · ·· ·· ·· ··· ··· • · ···· ·· • · ·· ······· · • * · · · · · ··· ··· ·· · ·· ·
Kmeň DSM5715 sa transformoval s plazmidom pZ-pfkex použitím eletroporačnej metódy opísanej v Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)). Selekcia transformantov sa uskutočnila na agare LBHIS zloženom z 18,5 g/1 mozgovo-srdcového infúzneho bujónu, 0,5 M sorbitolu, g/1 Bacto-tryptónu, 2,5 g/1 Bacto-yeast extract, 5 g/1 j
NaCI a 18 g/1 Bacto-agaru, ktorý bol doplnený 25 mg/1 kanamycínu. Inkubácia sa uskutočňovala 2 dni pri 33 °C.
Plazmidová DNA sa izolovala z transformantov obvyklými metódami (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), štiepila reštrikčnými endonukleázami EcoRI a Sali a plazmid sa potom analyzoval elektroforézou v agarózovom géle. Získaný kmeň sa nazval DSM5715/pZ-pfkex.
Príklad 5
Príprava lyzínu
Kmeň C. glutamicum DSM5715/pZ-pfkex získaný v príklade 4 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.
t Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 • °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/1)). Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predkultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Ako médium pre predkultúru sa použilo kompletné médium Cg III.
• · · • ···· • · · · · · · ··· ··· ·· · ·· ·
Médium Cg III
NaCl 2,5 g/1
Bacto-peptón 10 g/1
Bacto-yeast extract 10 g/1
Glukóza (oddelene autoklávovaná) 2 % (hmotnosť/objem)
Hodnota pH sa nastavila na 7,4.
K tomu sa pridal kanamycín (25 mg/1). Predkultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala predkultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,05. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.
Médium MM:
| CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/1 |
| MOPS (kyselina morfolinopropán- | 20 g/1 |
| sulfónová) | |
| Glukóza (oddelene autoklávovaná) | 50 g/1 |
| (NH4)2SO4 | 25 g/1 |
| kh2po4 | 0,1 g/1 |
| MgSO4.7H2O | 1,0 g/1 |
| CaCl2.2H2O | 10 mg/1 |
| FeSO4.7H2O | 10 mg/1 |
| MnSO4.H2O | 5,0 mg/1 |
| Biotín (sterilizovaný filtráciou) | 0,3 mg/1 |
| Tiamín.HCl (sterilizovaný filtráciou) | 0,2 mg/1 |
| L-Leucín (sterilizovaný filtráciou) | 0,1 g/1 |
| CaCO3 | 25 g/1 |
·· · ·· • · · · · · • · · · · · • · ···· · · · • · · · ·
CSL, MOPS a roztok solí sa roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridal sterilný roztok substrátu a roztok vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO3.
Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa kanamycín (25 mg/l). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.
Po 72 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.
Výsledok pokusu je uvedený v tabulke 1.
Tabulka 1
| Kmeň | Optická hustota (660 nm) | Lyzín-HCl g/1 |
| DSM5715 | 7,9 | 13,0 |
| DSM5715/pZ-pfkex | 9,9 | 13,4 |
·· • · • · · • · • · · • · · • ·· · • · • · · · • ·
Prehľad obrázkov na výkresoch
Priložený je nasledovný obrázok:
Obrázok 1: Plazmid pZ-pfkex
Použité skratky a názvy na obrázku majú nasledovný
| význam: | ||
| Kan: | gén pre rezistenciu na kanamycín | |
| Ptac: | promótor tac | |
| pfk: | gén pfk z C. glutamicum | |
| rrnB-TlT2: | terminátor T1T2 génu rrnB z | E. coli |
| rep: | plazmidom kódovaný počiatok C. glutamicum (pHM1519) | replikácie pre |
EcoRI: štiepne miesto pre reštrikčný enzým EcoRI
Sali: štiepne miesto pre reštrikčný enzým Sali t
• · • · ···· • · · · · · · ··· ··· ·· · ··
SEKVENČNÝ PROTOKOL <110> Degussa-Huls AG <120> Nové nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfk ' <130> 990179 BT <140>
<141>
<160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1120 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> CDS <222> (68)..(1057) <400> 1 ttgttaccga tgaccacacg ctagattttc cagttttgcc cgaccacaac tttcaggtgg 60
| taacccc atg atc | atc aca íle Thr | ttc acc Phe Thr 5 | cca aac ccg Pro Asn Pro | agt att gat | tcc Ser | acg Thr | 109 | |||||||||
| Met 1 | íle | Ser 10 | íle | Asp | ||||||||||||
| ctg | tcg | ctc | ggc | gaa | gag | ctc | tcc | cgt | gga | tcc | gtc | caa | ega | ctt | gat | 157 |
| Leu | Ser | Leu | Gly | Glu | Glu | Leu | Ser | Arg | Gly | Ser | Val | Gin | Arg | Leu | Asp | |
| 15 | 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| tcc | gtc | acc | get | gtc | gca | ggt | ggt | aaa | ggc | atc | aat | gtc | gcc | cac | get | 205 |
| Ser | Val | Thr | Ala | Val | Ala | Gly | Gly | Lys | Gly | íle | Asn | Val | Ala | His | Ala | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| gtc | ttg | ctt | gcg | ggc | ttt | gaa | acc | ttg | get | gtg | ttc | cca | gcc | ggc | aag | 253 |
| Val | Leu | Leu | Ala | Gly | Phe | Glu | Thr | Leu | Ala | Val | Phe | Pro | Ala | Gly | Lys | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| ctc | gac | ccc | ttc | gtc | cca | ctg | gtc | ege | gac | atc | ggc | ttg | ccc | gtg | gaa | 301 |
| Leu | Asp | Pro | Phe | Val | Pro | Leu | Val | Arg | Asp | íle | Gly | Leu | Pro | Val | Glu | |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
| act | gtt | gtg | atc | aac | aag | aac | gtc | ege | acc | aac | acc | aca | gtc | acc | gaa | 349 |
| Thr | Val | Val | íle | Asn | Lys | Asn | Val | Arg | Thr | Asn | Thr | Thr | Val | Thr | Glu | |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
| ccg | gac | ggc | acc | acc | acc | aag | ctc | aac | ggc | ccc | ggc | gcg | ccg | ctc | age | 397 |
| Pro | Asp | Gly | Thr | Thr | Thr | Lys | Leu | Asn | Gly | Pro | Gly | Ala | Pro | Leu | Ser | |
| 95 | 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| gag | cag | aag | ctc | cgt | age | ttg | gaa | aag | gtg | ctt | atc | gac | gcg | ctc | ege | 445 |
| Glu | Gin | Lys | Leu | Arg | Ser | Leu | Glu | Lys | Val | Leu | íle | Asp | Ala | Leu | Arg | |
| 115 | 120 | 125 |
• A A A A
A A A A A A • · · A A · • A AAAA A A A • · · A ·
AA A AA A
| ccc gaa Pro Glu | gtc acc Val Thr 130 | tgg gtt gtc ctg gcg ggc tcg ctg cca | cca ggg gca | 493 | ||||||||||||
| Trp | Val Val | Leu | Ala 135 | Gly | Ser | Leu | Pro | Pro 140 | Gly | Ala | ||||||
| cca | gtt | gac | tgg | tac | gcg | cgt | ctc | acc | gcg | ttg | atc | cat | tca | gca | ege | 541 |
| Pro | Val | Asp | Trp | Tyr | Ala | Arg | Leu | Thr | Ala | Leu | íle | His | Ser | Ala | Arg | |
| 145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
| cct | gac | gtt | ege | gtg | get | gtc | gat | acc | tca | gac | aag | cca | ctg | atg | gcg | 589 |
| Pro | Asp | Val | Arg | Val | Ala | Val | Asp | Thr | Ser | Asp | Lys | Pro | Leu | Met | Ala | |
| 160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
| ttg | ggc | gag | age | ttg | gat | aca | cct | ggc | get | get | ccg | aac | ctg | att | aag | 637 |
| Leu | Gly | Glu | Ser | Leu | Asp | Thr | Pro | Gly | Ala | Ala | Pro | Asn | Leu | íle | Lys | |
| 175 | 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| cca | aat | ggt | ctg | gaa | ctg | ggc | cag | ctg | get | aac | act | gat | ggt | gaa | gag | 685 |
| Pro | Asn | Gly | Leu | Glu | Leu | Gly | Gin | Leu | Ala | Asn | Thr | Asp | Gly | Glu | Glu | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| ctg | gag | gcg | cgt | get | gcg | caa | ggc | gat | tac | gac | gcc | atc | atc | gca | get | 733 |
| Leu | Glu | Ala | Arg | Ala | Ala | Gin | Gly | Asp | Tyr | Asp | Ala | íle | Íle | Ala | Ala | |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| gcg | gac | gta | ctg | gtt | aac | cgt | ggc | atc | gaa | cag | gtg | ctt | gtc | acc | ttg | 781 |
| Ala | Asp | Val | Leu | Val | Asn | Arg | Gly | íle | Glu | Gin | Val | Leu | Val | Thr | Leu | |
| 225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
| ggt | gcc | gca | gga | gcg | gtg | ttg | gtc | aac | gca | gaa | ggt | gcg | tgg | act | get | 829 |
| Gly | Ala | Ala | Gly | Ala | Val | Leu | Val | Asn | Ala | Glu | Gly | Ala | Trp | Thr | Ala | |
| 240 | 245 | 250 | ||||||||||||||
| act | tet | cca | aag | att | gat | gtt | gta | tcc | acc | gtt | gga | get | gga | gac | tgt | 877 |
| Thr | Ser | Pro | Lys | íle | Asp | Val | Val | Ser | Thr | Val | Gly | Ala | Gly | Asp | Cys | |
| 255 | 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| get | ctt | gca | ggt | ttt | gtt | atg | gca | cgt | tcc | cag | aag | aaa | aca | ctg | gag | 925 |
| Ala | Leu | Ala | Gly | Phe | Val | Met | Ala | Arg | Ser | Gin | Lys | Lys | Thr | Leu | Glu | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| gaa | tet | ctg | ctg | aat | gcc | gtg | tet | tac | ggc | tcg | act | gcg | gcg | tet | ctt | 973 |
| Glu | Ser | Leu | Leu | Asn | Ala | Val | Ser | Tyr | Gly | Ser | Thr | Ala | Ala | Ser | Leu | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| cct | ggc | act | acc | att | cct | cgt | cct | gac | caa | ctc | gcc | aca | get | ggt | gca | 1021 |
| Pro | Gly | Thr | Thr | íle | Pro | Arg | Pro | Asp | Gin | Leu | Ala | Thr | Ala | Gly | Ala | |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
| acg | gtc | acc | caa | gtc | aaa | gga | ttg | aaa | gaa | tca | gca | tgaatagcgt | 1067 | |||
| Thr | Val | Thr | Gin | Val | Lys | Gly | Leu | Lys | Glu | Ser | Ala |
320 325 330 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum aaataattcc tcgcttgtcc ggctggatgt cgatttcggc gactccacca cgg 1120 • · • · ···· • · · ·· · · • · · • · · · • · · · • ··· ·· · ·· ·· ·
| <400> 2 | Thr | Leu 15 | Ser | |||||||||||||
| Met 1 | íle | íle Thr | Phe 5 | Thr | Pro Asn | Pro | Ser 10 | íle Asp | Ser | |||||||
| Leu | Gly | Glu | Glu | Leu | Ser | Arg | Gly | Ser | Val | Gin | Arg | Leu | Asp | Ser | Val | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| Thr | Ala | Val | Ala | Gly | Gly | Lys | Gly | íle | Asn | Val | Ala | His | Ala | Val | Leu | |
| J | 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Leu | Ala | Gly | Phe | Glu | Thr | Leu | Ala | Val | Phe | Pro | Ala | Gly | Lys | Leu | Asp | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| Pro | Phe | Val | Pro | Leu | Val | Arg | Asp | íle | Gly | Leu | Pro | Val | Glu | Thr | Val | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| Val | íle | Asn | Lys | Asn | Val | Arg | Thr | Asn | Thr | Thr | Val | Thr | Glu | Pro | Asp | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| Gly | Thr | Thr | Thr | Lys | Leu | Asn | Gly | Pro | Gly | Ala | Pro | Leu | Ser | Glu | Gin | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| Lys | Leu | Arg | Ser | Leu | Glu | Lys | Val | Leu | íle | Asp | Ala | Leu | Arg | Pro | Glu | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| Val | Thr | Trp | Val | Val | Leu | Ala | Gly | Ser | Leu | Pro | Pro | Gly | Ala | Pro | Val | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| Asp | Trp | Tyr | Ala | Arg | Leu | Thr | Ala | Leu | íle | His | Ser | Ala | Arg | Pro | Asp | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| Val | Arg | Val | Ala | Val | Asp | Thr | Ser | Asp | Lys | Pro | Leu | Met | Ala | Leu | Gly | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| Glu | Ser | Leu | Asp | Thr | Pro | Gly | Ala | Ala | Pro | Asn | Leu | íle | Lys | Pro | Asn | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| « | Gly | Leu | Glu | Leu | Gly | Gin | Leu | Ala | Asn | Thr | Asp | Gly | Glu | Glu | Leu | Glu |
| 1 | 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| - | Ala | Arg | Ala | Ala | Gin | Gly | Asp | Tyr | Asp | Ala | íle | íle | Ala | Ala | Ala | Asp |
| • | 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Val | Leu | Val | Asn | Arg | Gly | íle | Glu | Gin | Val | Leu | Val | Thr | Leu | Gly | Ala | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| Ala | Gly | Ala | Val | Leu | Val | Asn | Ala | Glu | Gly | Ala | Trp | Thr | Ala | Thr | Ser | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| Pro | Lys | íle | Asp | Val | Val | Ser | Thr | Val | Gly | Ala | Gly | Asp | Cys | Ala | Leu | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| Ala | Gly | Phe | Val | Met | Ala | Arg | Ser | Gin | Lys | Lys | Thr | Leu | Glu | Glu | Ser | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| Leu | Leu | Asn | Ala | Val | Ser | Tyr | Gly | Ser | Thr | Ala | Ala | Ser | Leu | Pro | Gly | |
| 290 | 295 | 300 |
• · ···
Thr Thr Ile Pro Arg Pro Asp Gin Leu Ala Thr Ala Gly Ala Thr Val
305 310 315 320 • · ·· · ·· ·· ·· · · · · · • · · · · · ·· • · · · · ···· · · · • · · · · · · ······ ·· · ··
Thr Gin Val Lys Gly Leu Lys Glu Ser Ala 325 330 .1 f
• · ·· · ·· · ·· ·· · · · · · ·· • · ···· ··· • · · · · ···· · · · · • · ··· ··· ··· ··· ·· · ·· ···
Claims (16)
1. Izolovaný polynukleotid z koryneformných baktérií, obsahujúci polynukleotidovú sekvenciu, vybranú zo skupiny zahŕňajúcej
a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID No. 2,
b) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No. 2,
c) polynukleotid, ktorý je komplementárny k polynukleotidom
a) alebo b), a
d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcich báz polynukleotidovej sekvencie a), b) alebo c).
2. Polynukleotid podlá nároku 1, pričom polynukleotidom je prednostne rekombinantná DNA, replikovateľná v koryneformných baktériách.
3. Polynukleotid podlá nároku 1, pričom polynukleotidom je RNA.
4. Polynukleotid podlá nároku 2, obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny znázornenú v SEQ ID No. 1.
5. Replikovateľná DNA podľa nároku 2 obsahujúca:
(i) nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 1, • · • · ·· · ·· ·· · · · • · · · e · • · · · · ···· • · · · · ··· ··· ·· · ·· alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá sa hybridizuje so sekvenciou komplementárnou k sekvencii (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).
6. Polynukleotidová sekvencia podľa nároku 2, ktorá kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 2.
7. Spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňujú nasledovné kroky:
a) fermentácia koryneformných baktérií produkujúcich
L-aminokyselinu, v ktorých sa zosilňuje, najmä nadmerne exprimuje aspoň gén pfk alebo nukleotidové sekvencie, ktoré ho kódujú,
b) koncentrovanie L-aminokyseliny v médiu alebo v bunkách baktérií a
c) izolácia L-aminokyseliny.
8. Spôsob podlá nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu žiadanej L-aminokyseliny.
• · ·· · ·· ·· · · ··· ··· • · · · · · · e • · · · · ···· · · ·
9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa aspoň čiastočne eliminujú metabolické dráhy, ktoré znižujú tvorbu L-lyzínu.
10. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sa používa kmeň transformovaný plazmidovým vektorom a tento plazmidový vektor nesie nukleotidovú sekvenciu kódujúcu gén pfk.
11. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 7 až 10, vyznačujúci sa tým, že sa používajú koryneformné baktérie, ktoré produkujú L-lyzín.
12. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že na výrobu lyzínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zosilňuje, najmä nadmerne exprimuje alebo ampliíikuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej
12.1 gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu,
12.2 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu,
12.3 gén tpi kódujúci triózafosfátizomerázu,
12.4 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,
12.5 gén pgk kódujúci 3-fosfoglycerátkinázu,
12.6 gén lysE kódujúci export lyzínu.
·· · ·· • · · · · • · · · · • ···· · · · • · · · · • ·· · ·· · • ·
13. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že na výrobu L-lyzínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej J . 13.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu,
13.2 gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu
14. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa používajú mikroorganizmy rodu Corynebacterium glutamicum.
15. Použitie polynukleotidových sekvencií podľa nároku 1 ako primérov na prípravu DNA génov, ktoré kódujú fosfofruktokinázu, polymerázovou reťazovou reakciou.
16. Použitie polynukleotidových sekvencií podľa nároku 1 ako hybridizačných sond.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19956131A DE19956131A1 (de) | 1999-11-23 | 1999-11-23 | Neue für das pfk-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK17362000A3 true SK17362000A3 (sk) | 2001-10-08 |
Family
ID=7929914
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1736-2000A SK17362000A3 (sk) | 1999-11-23 | 2000-11-16 | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfk |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6806068B1 (sk) |
| EP (1) | EP1103613A1 (sk) |
| JP (1) | JP2001186895A (sk) |
| KR (1) | KR20010051877A (sk) |
| CN (1) | CN1297055A (sk) |
| AU (1) | AU7166500A (sk) |
| BR (1) | BR0005543A (sk) |
| CA (1) | CA2323750A1 (sk) |
| DE (1) | DE19956131A1 (sk) |
| HU (1) | HUP0004676A2 (sk) |
| ID (1) | ID28421A (sk) |
| MX (1) | MXPA00011416A (sk) |
| PL (1) | PL344076A1 (sk) |
| SK (1) | SK17362000A3 (sk) |
| ZA (1) | ZA200006856B (sk) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10112992A1 (de) | 2001-03-17 | 2002-09-26 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| WO2003008613A2 (en) * | 2001-07-18 | 2003-01-30 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced soda gene |
| US20060166236A1 (en) * | 2004-12-15 | 2006-07-27 | Chong-Sheng Yuan | Allosteric enzyme coupled immunoassay (AECIA) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4517512A (en) | 1982-05-24 | 1985-05-14 | Micro Component Technology, Inc. | Integrated circuit test apparatus test head |
| JPH07121227B2 (ja) | 1986-10-17 | 1995-12-25 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
| DE69942821D1 (de) | 1998-12-18 | 2010-11-18 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure |
| EP1263963A2 (en) | 1999-06-25 | 2002-12-11 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
-
1999
- 1999-11-23 DE DE19956131A patent/DE19956131A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-11-16 SK SK1736-2000A patent/SK17362000A3/sk unknown
- 2000-11-17 AU AU71665/00A patent/AU7166500A/en not_active Abandoned
- 2000-11-20 US US09/715,040 patent/US6806068B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-20 CA CA002323750A patent/CA2323750A1/en not_active Abandoned
- 2000-11-21 JP JP2000354308A patent/JP2001186895A/ja active Pending
- 2000-11-21 MX MXPA00011416A patent/MXPA00011416A/es unknown
- 2000-11-22 EP EP00125528A patent/EP1103613A1/de not_active Withdrawn
- 2000-11-22 HU HU0004676A patent/HUP0004676A2/hu unknown
- 2000-11-22 KR KR1020000069629A patent/KR20010051877A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-11-22 ZA ZA200006856A patent/ZA200006856B/xx unknown
- 2000-11-22 ID IDP20001005A patent/ID28421A/id unknown
- 2000-11-23 BR BR0005543-3A patent/BR0005543A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-11-23 CN CN00132502A patent/CN1297055A/zh active Pending
- 2000-11-23 PL PL00344076A patent/PL344076A1/xx unknown
-
2004
- 2004-08-26 US US10/926,293 patent/US20070054379A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20070054379A1 (en) | 2007-03-08 |
| AU7166500A (en) | 2001-05-24 |
| KR20010051877A (ko) | 2001-06-25 |
| DE19956131A1 (de) | 2001-05-31 |
| US6806068B1 (en) | 2004-10-19 |
| MXPA00011416A (es) | 2002-05-23 |
| HU0004676D0 (sk) | 2001-02-28 |
| BR0005543A (pt) | 2001-08-07 |
| CA2323750A1 (en) | 2001-05-23 |
| JP2001186895A (ja) | 2001-07-10 |
| EP1103613A1 (de) | 2001-05-30 |
| ID28421A (id) | 2001-05-24 |
| PL344076A1 (en) | 2001-06-04 |
| ZA200006856B (en) | 2001-07-12 |
| HUP0004676A2 (en) | 2002-10-28 |
| CN1297055A (zh) | 2001-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK18342000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa1 a spôsoby fermentačnej výroby l-aminokyselín | |
| SK14582000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén eno | |
| US20050100927A1 (en) | Nucleotide sequence encoding the dapC gene and process for the production of L-lysine | |
| US6759218B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the glbO gene | |
| KR100762112B1 (ko) | ｐｔｓＨ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 | |
| WO2002024915A1 (en) | Dcta (c4-dicarboxylate transporter) from corynebacterium glutamicum | |
| US6818432B2 (en) | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene | |
| US6913910B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the glk-gene | |
| US20020094554A1 (en) | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene | |
| US6806068B1 (en) | Nucleotide sequences which encode the pfk gene | |
| US6830921B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the ACP gene | |
| SK17372000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfka | |
| US20020042107A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the fadD15 gene | |
| US6987015B1 (en) | Nucleotide sequences encoding the pfkA gene | |
| US6638753B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the cma gene | |
| KR20020097245A (ko) | ｃｄｓＡ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 | |
| US20020155555A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the pgsA2 gene | |
| US20040092710A1 (en) | Nucleotide sequences coding for the cdsA gene | |
| US20020034794A1 (en) | Nucleotide sequences which encode the gpsA gene | |
| US20050266534A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the cstA gene | |
| KR20020097250A (ko) | ｃｍａ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 | |
| KR20020097244A (ko) | ｐｇｓＡ2 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 |