MXPA00011416A

MXPA00011416A - Nuevas secuencias nucleotidas codificantes al gen pfk.

Info

Publication number: MXPA00011416A
Application number: MXPA00011416A
Authority: MX
Inventors: Mockel Bettina
Original assignee: Degussa
Priority date: 1999-11-23
Filing date: 2000-11-21
Publication date: 2002-05-23
Also published as: US20070054379A1; HU0004676D0; AU7166500A; PL344076A1; ID28421A; CA2323750A1; SK17362000A3; HUP0004676A2; JP2001186895A; ZA200006856B; EP1103613A1; KR20010051877A; US6806068B1; CN1297055A; BR0005543A; DE19956131A1

Abstract

La invencion se refiere a un polinucleotido aislado, que contiene una secuencia polinucleotida, seleccionada del grupo formado por a) polinucleotidos que cuando menos son 70% identicos a un polinucleotido que codifica a un polipeptido, que contiene la secuencia aminoacida de la SEQ. ID. NO. 2b), polinucleotido que codifica a un polipeptido, que contiene una secuencia aminoacida que cuando menos es 70% identica a la secuancia aminoacida de la SEQ. ID No. 2c) polinucleotidos que son complementarios a los polinucleotidos de a) o b), y d) polinucleotidos que contienen cuando menos 15 bases secuenciales de la secuencia polinucleotida de a), b) o c) ,procedimiento para la preparacion por fermentacion de L- aminoacidos reforzando el gen pfk y el uso como cebador o sonda de hibridizacion..

Description

NUEVAS SECUENCIAS NUCLEOTIDAS CODIFICANTES AL GEN pfk Descripción de la Invención El objeto de la invención son secuencias nucleótidas codificantes para el gen pfk y un procedimiento para la preparación por fermentación de aminoácidos, en especial L-lisina utilizando bacterias corineformes, en las cuales se refuerza el gen de pfk. Estado de la Técnica Los aminoácidos, en especial L-lisina se utilizan en la medicina humana y en la industria farmacéutica, pero en especial en la alimentación animal. Se conoce que esos aminoácidos se producen por fermentación de cepas de bacterias corineformes en especial con Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia de ese grupo de productos se trabaja continuamente a la mejora de esos procedimientos de preparación. Las mejoras del procedimiento pueden consistir en medidas técnicas de fermentación como por ejemplo agitación y alimentación de oxígeno, o la composición de los medios nutritivos como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o la post-elaboración a la forma de un producto, por medio por ejemplo de cromatografía de intercambio de iones o por medio de propiedades intrínsecas propias de los microorganismos. Para mejorar las propiedades de rendimiento de Ref: 125019 esos microorganismos se utilizan métodos como mutagenesis, selección y selección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra los antimetabolitos como por ejemplo el análogo de usina S- (2-aminoetil) -cistenina o auxótropas para los aminoácidos regulatoriamente importantes y que producen L-aminoácidos como por ejemplo L-lisina. Desde hace algunos años se han utilizado métodos de técnica de recombinación de ADN para el mejoramiento de cepas, de cepas que producen aminoácidos de Corynebacterium, en la cual genes de biosíntesis de aminoácidos individuales se amplifican y se estudia su efecto sobre la producción de los aminoácidos. Un artículo sobre esto se encuentra entre otros el de Kinoshita ("Glutamicum Acid Bacteria" en Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, Londres, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten y Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sahm et al., (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)). Tarea de la Invención Los inventores se propusieron la tarea de obtener nuevas medidas para mejorar la preparación por fermentación de aminoácidos, en especial L-lisina. Descripción de la Invención Los aminoácidos en especial L-lisina tienen aplicación en la medicina humana, en industria farmacéutica y en especial en la alimentación animal. Por lo tanto existe un interés general en un procedimiento nuevo y mejorado para la producción aminoácidos y en especial L-lisina. Cuando a continuación se mencionen L-lisina o usina, se implican no solo las bases sino también las sales como por ejemplo monoclorhidrato de Usina o sulfato de usina. El objeto de la invención es un polinucleótido aislado de bacterias corineformes, que contiene la secuencia nucleótida, seleccionada del grupo formado por: a) Polinucleótidos que cuando menos son 70% idénticos con un polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, b) Polinucleótidos que codifican a un polipéptido, que contiene una secuencia aminoácida que cuando menos es 70% idéntica a la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, c) Polinucleótidos que son complementarios a los polinucleótidos de a) o b) , y d) Polinucleótidos que contienen cuando menos 15 bases secuenciales de la secuencia polinucleótida de a) , b) o c) . El objeto de la invención es igualmente el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde preferentemente se trata de un ADN replicable, que contiene: (i) la secuencia nucleótida, mostrada en SEQ-ID no. 1, o (ii) cuando menos una secuencia que corresponda a las secuencias (i) dentro del rango de degeneración del código genético, o (iii) cuando menos una secuencia que se hibridice con las secuencias complementarias a las secuencias (i) o (ii), y eventualmente (iv) mutaciones de sentido de función neutra en (i) . Otros objetos son un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, que contiene la secuencia nucleótida representada en SEQ ID no. 1, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, que codifica a un polipéptido que contiene la secuencia aminoácida como se representa en la SEQ. ID no. 2, un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en especial un vector péndulo o un vector de plásmido y bacterias corineformes que sirven como células anfitrionas, que contienen al vector. Objeto de la invención también lo son también polinucleótidos que en esencial consisten de una secuencia polinucleótida que pueden obtenerme por medio de selección por medio de hibridización de' un banco genético correspondiente, que contiene completamente al gen con la secuencia polinucleótida correspondiente a la SEQ ID no.l, o una sonda que contiene la secuencia del polinucleótido mencionado de acuerdo con SEQ ID No. 1 o un fragmento de esta y aislado de la secuencia de ADN mencionada. Las secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención son adecuadas como sondas de hibridización para ARN, cADN y ADN, para aislar cADN con longitud completa, que codifiquen a la quinasa de fosfofructosa y aislar aquellos cADN o genes, que presenten una alta similitud con la secuencia del gen de quinasa de fosfofructosa. Las secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención además son adecuadas como cebadores para la preparación de ADN de genes que codifican al la quinasa de fosfofructosa, con la ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Esos oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores contienen cuando menos 30, preferentemente cuando menos 20, más especialmente cuando menos 15 bases secuenciales. Adecuados son igualmente los oligonucleótidos con una longitud de cuando menos 40 o 50 pares de bases. "Aislado" significa que se retira de su ambiente natural . "Polinucleótido" se refiere en general a polirribonucleótidos y polidesoxirribunucleótidos, en donde 5 se puede tratar de ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados. Bajo "polipéptidos" se entiende péptidos o proteínas, que contienen dos o más aminoácidos unidos a través de enlaces de péptidos. 10 Los polipéptidos de acuerdo con la invención incluyen polipéptidos de acuerdo con la SEQ. ID no. 2, en especial aquellos con la actividad biológica de quinasa de fosfofructosa y también aquellos que sean cuando menos en un 70% idénticos con el polipéptido de acuerdo con la SEQ. ID 15 no. 2, preferentemente en un 80% y en especial posean cuando menos un 90 a 95% de identidad con el polipéptido de acuerdo con la SEQ ID No. 2, y que presenten la actividad mencionada. La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación por fermentación de aminoácidos, en 20 especial L-lisina utilizando bacterias corineformes que en especial ya produzcan los aminoácidos deseados y en os cuales se refuerzan, en especial se sobre-expresan, las secuencias nucleótidas que codifican al gen pfk. El concepto "refuerzo" describe a este respecto el 25 aumento de la actividad intracelular de una o varias enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el ADN correspondiente, para lo cual por ejemplo se aumenta el número de copias del gen o de los genes, se utiliza un fuerte promotor o un gen que codifica a la enzima correspondiente ^^^g^^^¿^ con alta actividad, y eventualmente se combinan esas medidas. Los microorganismos que son objeto de la presente invención pueden producir L-lisina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones, celulosa o de glicerina y etanol. Puede tratarse de un representante de las bacterias corineformes en especial del género Corynebacterium. En el género Corynebacterium debe mencionarse en especial el tipo Corynebacterium glutamicum, que se conoce en la técnica por su capacidad de producir L-aminoácidos . Cepas adecuadas del género Corynebacterium en especial del tipo Corynebacteri um glutamicum, son por ejemplo las cepas tipo nativo conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynejbacteriutp thermoaminogenes FERM BP-1539 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacteri um flavum ATCCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020 y los mutantes o cepas preparados de ellas que produzcan L-lisina, como por ejemplo Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463, Corynebacterium gl utamicum FERM-P 6464 y Corynebacterium glutamicum DSM5715. Los inventores pudieron aislar el nuevo gen de pfk codificante a la enzima quinasa de fosfofructosa, de C. glutamicum. Para aislar el gen pfk o también otros genes de C. glutamicum primero se introduce un banco genético de ese microorganismo en E. coli. La introducción de los bancos genéticos es en general conocido, y se describen en libros y manuales. Ejemplos de ellos son el texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el Manual de Sambrook et al.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual' (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un banco genético muy conocido es la cepa W3110 de E. coli K-12, que fue depositada por Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) en vectores D.

Bathe et al., (Molecular and General Genetics, 252; 255-265, 1996) describen un banco genético de C. glutamicum ATCC13032, que con la ayuda del vector de cosmido SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences US, 84:2160-2164) en la cepa NM554 de E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Bórmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) describe otra vez un banco genético de C. glutamicum ATCC13032 utilizando el cosmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-2989 (1980)).

Para la preparación de un banco genético de C. glutamicum en E. coli también pueden utilizarse los plásmidos como pBR322 (Bolívar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC9 (Viera et al., 1982, Gene, 19:259-268). Como anfitriones son adecuados en especial aquellas cepas de E.coli, que están defectuosas en restricción y recombinación. Un ejemplo de esto es la cepa DH5o_mcr, que fue descrita por Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences US, 87 (1990) 4645-4649) . Los fragmentos de ADN largos clonados con la ayuda de los cosmidos pueden ser subclonados y subsecuentemente secuenciados en vectores adecuados para la secuenciación, como lo describe por ejemplo Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America US, 74:5463-5467, 1977) . De esta manera se obtuvieron las nuevas secuencias de ADN de C. glutamicum que codifican al gen pfk, que como SEQ ID NO. 1 son parte de la presente invención. Además a partir de la presente secuencia de ADN puede seleccionarse la secuencia aminoácida de la proteína correspondiente por medio de los métodos antes descritos. En la SEQ ID NO. 2 se representa la secuencia aminoácida obtenida del producto genético de pfk. Las secuencias de ADN, que se obtienen de la SEQ ID NO. 1 por medio de la unidad de degeneración del código genético, también son parte de la invención. De la misma manera son parte de la invención, las secuencias de ADN, que se hibridizan con la SEQ ID NO. 1 o con partes de SEQ ID NO. 1. En la técnica se conocen además intercambios conservadores de aminoácidos como por ejemplo intercambio de glicina por alanina o de ácido asparagínico por ácido glutámico en proteínas como "mutaciones de sentido" (sense mutations), que no conducen a modificaciones fundamentales de la actividad del la proteína, esto es que son de función neutra. Además se sabe que las modificaciones en la terminal N y/o C de una proteína, no pueden influir de manera esencial o hasta estabilizarla. Los datos sobre esto las encuentra el técnico entre otros en Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), por O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), por Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), por Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988) ) y en textos conocidos de genética y biología molecular. Las secuencias aminoácidas, que se dan correspondientemente en SEQ ID no. 2 también son parte constitutiva de la invención. De igual manera son parte de la invención las secuencias de ADN que hibridizan con la SEQ ID no. l o partes de SEQ ID No. 1. Finalmente también son partes constitutivas de la invención las secuencias de ADN que se prepararon por F. medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores, que se obtienen de la SEQ ID. no. 1. Ese tipo de oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de cuando menos 15 pares de bases. Indicaciones respecto a la identificación de secuencias de ADN por medio de hibridización las encuentra el tencico entre otros en el Manual "The DIG System Users Guide for Filter Hibridization", de la firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993), y por Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-260). Indicaciones sobre la amplificación de secuencias de ADN con la ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se encuentran entre otros en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y por Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994) . Los inventores encontraron que las bacterias corineformes después de la sobre-expresión del gen pfk producen L-lisina de forma mejorada. Para obtener la sobre-expresión puede aumentarse el número de copias del gen correspondiente o puede mutarse la región promotora y reguladora o el punto de ligado de las ribosomas, que se encuentra corriente arriba del gen estructural. De igual manera sirven los cartuchos de expresión que se construyen corriente arriba del gen estructural. Por medio de promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción por fermentación de L-lisina. Por medio de medidas para alargar la vida del m-RNA se mejora igualmente la expresión. Además evitando la reducción de la proteína enzimática se refuerza la actividad enzimática. Los genes o las construcciones genéticas pueden encontrarse en los plásmidos con diferentes números de copias o estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente puede obtenerse una sobre-expresión de los genes en cuestión por medio de la modificación de la composición del medio y la realización del cultivo. Datos sobre esto los encuentra el técnico entre otros en los escritos de Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/technology 6, 428-430 (1988) ) de Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el escrito 'de patente europeo EP-B 0 472 869, en la patente de US 4,601,893, de Schwarzer y Pühler (Bio/technology 9, 84-87 (1991), de Reinscheid et al. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud de patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134,15-24 (1993)), el la publicación japonesa JP-A-10-229891, de Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 5 (1998)), de Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) y en los textos conocidos de Genética y Biología Molecular. Ejemplificativamente se sobre-expresó el gen pfk de acuerdo con la invención con la ayuda de plasmidos . 10 Como plasmidos son adecuados aquellos que se replican en bacterias corineformes. Muchos vectores de plasmidos conocidos como por ejemplo pZl (Menkel et al., Applied and Enviromental Microbiology, (1989) 64: 549-554), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 107:69-74 (1991)) o pHS2-l 15 (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) se basan en los plasmidos crípticos pHM1519, pBLl o pGAl . Otros vectores de plásmido como por ejemplo aquellos que se basan en pCG4 (US- A-4,489,160) o pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAGl (US-A 5,158,891), pueden 20 utilizarse de igualmente. Además son adecuados aquellos vectores de plásmido con cuya ayuda puede utilizarse el procedimiento de la amplificación genética por medio de integración en el cromosoma, descrito por ejemplo por Reinscheid et al. 25 (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para la duplicación o amplificación del operon hom-thrB. Con este método se clona el gen completo en un vector de plásmido, que puede replicarse en un anfitrión (típicamente E.coli), pero no en C. glutamicum. Como vectores entran en ¿al consideración por ejemplo pSUP301 (Simón et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Scháfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, Wl, US), pCR2.1-T0P0 (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; patente US 5,487,993, pCRÜ-Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) o pEMl (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516). El vector de plásmido que contiene al gen a amplificar, se conduce subsecuentemente por medio de conjugación o transformación en la cepa deseada de C. glutamicum, . Los métodos de conjugación se describen por ejemplo por Scháfer et al. (applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Los métodos para la transformación son descritos por ejemplo por Thierbach et al. (applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (/Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Después de la recombinación homologa por medio de un producto de "cross over", contiene la cepa resultante dos copias del gen en cuestión. Además puede ser ventajoso para la producción de aminoácidos en especial L-lisina el sobre-expresar además del gen pfk, una o varias enzimas de la vía de biosintesis, de la glicólisis, de la anapletórica, del ciclo del ácido cítrico o de la exportación de aminoácidos. Así puede ser ventajoso, por ejemplo para la preparación de L-lisina, el sobre-expresar simultáneamente: • el gen dapA que codifica a la sintasa de dihidropicolinato (EP-B 0 197 335) , o • el gen gap codificante a la dihidrogenasa de 3-fosfato de gliceraldehido (Eikmanns (1992) . Journal of Bacteriology 174:6076-6086) , o • el gen tpi codificante a la isomerasa de fosfato de tiosa (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076- 6086), o • el gen pgk codificante a la quinasa de 3-fosfoglicerato (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086), o • el gen pyc codificante a la carboxilasa de piruvato (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086), o • simultáneamente al gen lysE codificante al exportador de usina (DE-A-195 48 222) . Además puede ser ventajoso para la producción de aminoácidos, en especial L-lisina, el simultáneamente al refuerzo del gen pfk, adicionalmente debilitar • el gen pck codificante a la carboxiquinasa de fosfoenolpiruvato (DE 199 50 409.1, DSM 13047) y/o • el gen pgi codificante a isomerasa de glucosa-6-fosfato (US 09/396,478, DSM 12969). Además puede ser ventajoso para la producción de aminoácidos, en especial L-lisina, además de la sobre-expresión del gen pfk, el desactivar reacciones indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Amino Acid Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982) . Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse continua o discontinuamente en procedimientos por lotes o en procedimiento de alimentación (fed batch) o procedimiento de alimentación repetitivo (repeated fed batch) con el fin de producir aminoácidos, en especial L-lisina. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el texto de Chmiel (Bioprozestechnik 1.

Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). El medio de cultivo utilizado debe de una forma adecuada ser suficiente para los requisitos de las cepas microorganismos en cuestión. La descripción de medios de cultivo de diferentes microorganismos se encuentra en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., US, 1981) . Como fuente de carbono pueden utilizarse azucares y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones y celulosa, aceites y grasas como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como por ejemplo ácido palmitíco, ácido estearínico y ácido linoléico, alcoholes como por ejemplo glicerina y etanol y ácidos orgánicos como por ejemplo ácido acético. Esas substancias pueden utilizarse individualmente o en mezclas. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de soya y urea o compuesto inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o como mezclas. Como fuentes de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe además contener sales de metales como por ejemplo sulfato de magnesio o de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente pueden utilizarse promotores del crecimiento como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las substancias mencionadas. Al medio de cultivo pueden agregarse precursores adecuados. Los aditivos mencionados pueden agregarse al cultivo en forma de una carga única o en una forma adecuada agregarse durante el cultivo. Para controlar el pH del cultivo se utilizan compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico en forma adecuada. Para controlar la formación de espuma pueden utilizarse agentes anti-espumantes como por ejemplo poliglicoléster de ácido graso o aceites de silicona. Para mantener la estabilidad de los plásmidos pueden agregarse al medio substancias de efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas se introducen al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contengan oxígeno como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente a 2?Oc a 45C y preferentemente a 25Q a 4?Gb. El cultivo se continua hasta que se ha formado una cantidad máxima de L-aminoácido. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 a 160 horas . El análisis de L-lisina puede realizarse por medio de una cromatografía de intercambio de aniones con la subsecuente derivación de ninhidrina tal como lo describe Spack an et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190). El procedimiento de acuerdo con la invención sirve para la preparación por fermentación de aminoácidos, en especial de L-lisina. Ejemplos La presente invención se explicara más detalladamente con la ayuda de los ejemplos de realización. Ejemplo 1 Preparación de un banco genético de cosmido genómico a partir de Corynebacteri um glutamicum ATCC 13032. ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 fue aislado como lo describe Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179), y se disoció parcialmente con enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo Alemania, descripción del producto Sau3AI, código no. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desfofosforilaron con la ayuda de fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Bioche icals, Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP, código no. 1758250) . El ADN del vector de cosmido SuperCol (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences US 84:2160-2164), en referencia a la firma Stratagene (La Jolla, US, descripción del producto SuperCosl Cosmid Vektor Kit, código no. 251301) se disoció con la enzima de restricción Xbal (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto Xbal, código no. 27-0948-02) e igualmente se desfosforiló con fosfatasa alcalina. A continuación se disoció el ADN de cosmido con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto BamHI, código no. 27-0868-04) . El ADN de cosmido tratado de esa manera se mezcló con el ADN ATCC13032 tratado y el producto se trató con ligasa de ADN T4, (Amersham Pharmacia Biotech. Friburgo, Alemania, descripción del producto ligasa de ADN T4, producto no. 27-0870-04) . La mezcla de ligado se empacó en fagos con la ayuda de Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, US, denominación del producto Gigapack II XL Packing Extracts, código no. 200217) . Para la infección de la cepa de E. coli NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575) , las células se tomaron en 10 mM MgS04 y se mezclaron con una alícuota de suspensión de fagos. La infección y la titulación del banco de Cosmido fueron realizadas como lo describe Sambrook et al.; (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor) , en donde las células se trasplantan sobre agar LB (Lennox 1955, Virology, 1:190) con 100 Dg/ml de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37°C se seleccionaron las colonias individuales recombinantes . Ejemplo 2 Aislado y Secuenciación del gen pfk El ADN de cosmido de una colonia individual se aisló de acuerdo con las indicaciones del fabricante del Qiaprep Spin Miniprep Kit (producto no. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) y se disoció parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo Alemania, descripción del producto Sau3AI, código no. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desfofosforilaron con la ayuda de fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP, código no. 1758250) . Después de la separación electroforética de gel se realizó el aislado de los fragmentos de cosmido en el rango de 1500 a 2000 bp con el equipo QiaExII Gel Extraction Kit (producto no. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania) . El ADN del vector de secuenciación pZero-1 en relación al de la firma Invitrogen (Groningen, Holanda, denominación del producto Zero Background Cloning Kit, producto no. K2500-01) se disoció con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto BamHI, código no. 27-0868-04) . El ligado de los fragmentos de cosmido en el vector de secuenciación pZero-1 se realizó como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor) , en donde la mezcla de ADN se incuba durante la noche con ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania) . Esa mezcla de ligado se electroporó a continuación en la cepa de E. coli DH5oar?cr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) (Tauch et al. 1994, FEMS microbiology Letters, 123:343-7), y sobre agar LB (Lennox 1955, Virology, 1:190) con 50 Dg/ml de zeocina. La preparación de plásmido de 5 los clones recombinantes se realizó con el Birobot 9600 (producto no. 900200, Qiagen, Hilden, Alemania) . La secuenciación se realizó de acuerdo con el método de ruptura de la cadena didesoxi de Sanger et al, (1977, Proceedings of the National of Sciences of the United States of America US, 10 74:5463-5467) y modificaciones de acuerdo con Zímmerman et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se utilizó el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de PE Applied Biosystems (producto no. 403044, Weiterstadt, Alemania) . La separación electroforética y el análisis de la reacción de 15 secuenciación se realizó en un gel de "acrilamida/ bisacrilamida para Rotiphoresis NF" (29:1) (producto no. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el aparato de secuenciación "ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . 20 Los datos de la secuencia en bruto obtenidos fueron procesados subsecuentemente utilizando el paquete de programación Staden (1986, Nucleic Acids, Research, 14:217- 231) versión 97-0. Las secuencias individuales de los derivadas de pZerol se ensamblaron en un Contig dependiente. 25 El análisis de rango de codificación apoyado por computadora se realizó con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Otros análisis se realizaron con "BLAST search programs" (Altschiul et al., 1997, Nucleic Acids research, 25: 3389-3402), frente al banco de datos no ^^a^Sg^j^s&KáSg^ redundante del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, US) . La secuencia nucleótida obtenida se representa en SEQ ID no. 1. Los análisis de la secuencia nucleótida dio un marcador de lectura abierto con 990 pares de bases, que fue denominado como el gen pfk. El gen pfk codifica a una proteína de 330 aminoácidos. Ej emplo 3 Preparación del vector de expresión pZ-pfkex para reforzar el gen pfk en Corynebacterium glutamicum 3.1 Clonación del gen pfk De la cepa ATCC 13032 se aisló de acuerdo con el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140; 1817-1828 (1994)) ADN cromosómico. Debido a la secuencia conocida por el ejemplo 2 para C. glutamicum del gen pfk se seleccionaron los siguientes oligonucleótidos para la reacción de cadenas de polimerasa: pfk-ex: 5' GAT CTA GAA TTC AAC TTT CAG GTG GTA ACC C 3' pfk-glp2: 5' GAT CTA GTC GAC CGG AC AGC GAG GAA TTA T 3' Los cebadores representados fueron sintetizados por la firma ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Alemania) . El cebador pfk-ex contiene la secuencia del punto de corte de la endonucleasa de restricción EcoRI y el cebador pfk-glp2 el punto de corte de la endonucleasa Salí, que en la secuencia nucleótida representada arriba están subrayados. La reacción PCR se realizó de acuerdo con el protocolo estándar de Innis et al. (PCR protocols. A guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) con polimerasa Pwo de la firma Roche Diagostics GmbH (Mannheim, Alemania) . Con la ayuda de la reacción de cadenas de polimerasa permitieron los cebadores la amplificación de un fragmento de ADN de 1.05 kb de longitud, que portaba el gen pfk de Corynebacteri um glutamicum. El producto así amplificado se examinó electroforéticamente en un gel de agarosa al 0.8%. El fragmento PCR obtenido de esa manera se disoció completamente con las enzimas de restricción EcoRI y Salí. El fragmento de pfk de aproximadamente 1.05 kb se aisló del gel de agarosa con el equipo QiaEWxII Gel Extraction Kit (producto no. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania) . 3.2 Clonación del pfk en el vector pZ8-l Como vector base para la expresión tanto en C. glutamicum como también en E. coli se utilizó el vector péndulo de expresión de E.coli-C. glutamicum pZ8-l (EP 0 375 889) . El ADN de ese plásmido se disoció completamente con las enzimas de restricción EcoRI y Salí y a continuación se desfosforiló con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP, producto no. 1758250) . El fragmento pfk aislado del gel de agarosa en el ejemplo 3.1 fue mezclado con el vector pZ8-l previamente preparado y el producto se trato con ligasa de ADN T4 (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, descripción del producto ligasa de ADN T4, código no. 27- 0870-04) . El producto de ligado se transformó en la cepa de E. coli DH5oancr (Hanahan, en: DNA Cloning. A practical Approach, vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). La selección de células que portan el plásmido se realizó por medio de trasplantado del producto de transformación sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 50 mg/1 kanamicina. Después de la incubación durante la noche a 37lZfc se seleccionaron colonias individuales recombinantes. El ADN de plásmido se aisló de un transformante con el equipo Qiaprep Spin Miniprep Kit (producto no. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con los datos del fabricante y se verificó por medio de disociación de restricción. El plásmido obtenido fue llamado pZ-pfkex. Se encuentra representado en la figura 1. Ejemplo 4 Transformación de la cepa DSM5715 con el plásmido pZ-pfkex La cepa DSM5715 se transformó con el plásmido pXZ-pfkex utilizando el método de electroporación descrito por Liebl (FEMS Microbiology Letters 53:299-303 (1989)). La selección de los transformantes se realizó sobre agar LBHIS consistente de 18.5 g/1 de caldo de infusión de cerebro-corazón, 0.5 M ?orbitol, 5 g/1 Bacto-Trypton, 2.5 g/1 extracto Bacto-Yeast (bacto-levadura) , 5 g/1 NaCl y 18 g/1 Bacto-agar, que había sido suplementado con 25 mg/1 de kanamicina. La incubación se realizó durante dos días a 330;. El ADN de plásmido se aisló de un transformante de acuerdo con los métodos habituales (Peters-Wendish et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), se cortó con las endonucleasas de restricción EcoRI y Salí y el plásmido se verifico por medio de la subsecuente electroforesis de gel de agarosa. La cepa obtenida fue denominada DSM5715/pz-pfkex. Ejemplo 5 Preparación de usina La cepa de C. glutamicum DSM5715/pZ-pfkex obtenida en el ejemplo 4, se cultivo en un medio nutritivo adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de Usina en la nata del cultivo. Para esto, primero se incubó la cepa sobre una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/1) ) durante 24 horas a 33°C. A partir de ese cultivo en placas de agar se inoculó un pre-cultivo (10 ml de medio en un matraz Erlenmeyer de 100 ml) . Como medio para le pre-cultivo se utilizo el medio completo Cg III.

Medio Cg III NaCl 2.5 g/1 Bacto-peptona 10 g/1 Extracto Bacto-Levadura 10 g/1 Glucosa (en autoclave separado) 2% (p/v) El valor pH se ajustó a un pH de 7.4.

A este se le agregó kanamicina (25 mg/m) . El precultivo se incubó durante 16 horas a 33?; a 240 rpm en el agitador. De este precultivo se inoculó un cultivo principal, de tal forma que el OD inicial (660 nm) del cultivo principal fue de 0.05. Para le cultivo principal se utilizó el medio MM.

Medio MM CSL (Licor de remoj o de maíz ) 5 g/1 MOPS 20 g/1 Glucosa (er L autoclave ¡ separado) 50g/l Sales : MgS04*7H20 1 . 0g/l CaCl2*7H20 10 mg/1 FeS04*7H20 10mg/l MnS04*H20 5.0mg/l Biotina (filtrada estéril) 0.3 mg/1 Tiamina*HCl (filtrada estéril) 0.2 mg/1 L-Leucina (filtrada estéril) 0.1 g/1 CaC03 25 g/1 CSL, MOPS y la solución salina se ajustan a un pH de 7 con amoníaco acuoso y se someten autoclave. Finalmente se agregan las soluciones estériles de substrato y vitamina, así como el CaC03 sometido a autoclave. El cultivo se realiza en 10 ml de volumen en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con chicanas. Se agregó kanamicina (25 mg/1) . El cultivo se realizó a 33LH c y 80% de humedad de aire. Después de 72 horas se determinó la OD a una longitud de onda de medición de 660 nm con el Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La cantidad de Usina formada se determinó con un analizador de aminoácidos de la firma Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografía de intercambio de iones y la derivatización de columna posterior con detección de ninhidrina. En la tabla 1 se presentan los resultados de la prueba.

Tabla Se anexan las siguientes figuras: Ilustración 1: plásmido pZ-pfkex Las abreviaturas y denominaciones usadas tienen los siguientes significados: Kan: Gen de resistencia a la kanamicina Ptac: Promotor tac pfk: gen pfk de C. glutamicum rrnB-TlT2: ter inador T1T2 el gen rrnB de E. coli rep: origen de replicación codificado por plásmido para C. glutamicum (de pHM1519) EcoRI : punto de corte de la enzima de restricción EcoRI Salí : punto de corte de la enzima de restricción Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 1 PROTOCOLO DE SECUENCIA <110> Degussa-Húls AG <120> NUEVAS SECUENCIAS NUCLEOTIDAS CODIFICANTES AL GEN pfk <130> 990179 BT <140> <141> <160> 2 <170> Patent In Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1120 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (68).. (1057) <400> 1 ttgttaccga tgaccacacg ctagattttc cagttttgec cgaccacaac tttcaggtgg SO taacccc atg ate ate acá ttc acc cea aac ccg agt att gat ccc acg 109 Met lie He Thr Phe Thr Pro Asn Pro Ser He ASD Ser Thr 1 5 10 erg teg etc ggc gaa gag etc tec cgt gga tec gtc caá cga ctt gat 157 leu Ser Leu Gly Glu Glu Leu Ser Arg Giy Ser Val Gln Arg Leu Asp 15 20 ¿ JU tec gtc acc gct gtc gca ggt ggt aaa ggc ate aat gtc gcc cae gct 205 Ser Val Thr Ala Val Ala Gly Gly Lys Gly He Asn Val Ala His Ala 35 40 45 gtc ttg ctt gcg ggc ttt gaa acc ttg gct gtg ttc cea gcc ggc aag 253 Val Leu Leu Ala Gly Phe Glu Thr Leu Ala Val Phe Pro Ala Gly Lys 50 55 60 etc gac ccc ttc gtc cea ctg gtc cgc gac ate ggc ttg ccc gtg gaa 301 Leu Asp Pro Phe Val Pro Leu Val Arg Asp lie Gly Leu Pro Val Glu 65 70 75 act gtt gtg ate aac aag aac gtc cgc acc aac acc acá gtc ac ¿&& 349 Thr Val Val lie Asn Lys Asn Val Arg Thr Asn Thr Thr Val Thr Giu 30 85 90 ccg qac ggc acc acc acc aag etc aac ggc ccc ggc gcg ccg etc age 397 Pro Asp Gly Thr Thr Thr Lys Leu Asn Giy Pro Gly Ala Pro Leu Ser ys iUU lüo 110 gag cag aag etc cgt age ttg gaa aag gtg ctt ate gac gcg etc cgc 445 Glu Gln Lys Leu Arg Ser Leu Glu Lys Val Leu He Asp Ala Leu Arg 115 120 125 c— gaa gtc acc tgg gct gtc ccg gcg sgc tcg ctg cea cea ggg oca 45? F_v Glu Val Thr Trp Val Val Leu Ala Cly Ser Leu Pro Pro Cly la 130 135 140 c zs gtt gac tgy la<_ y?-y '-y1- t-1-'- al- 9 ,3 tt(3 atc at tca •3ca C9C 541 Pro Vai Asp Trp Tyr Ala Arg Leu Thr Ala Leu He His Ser Ala Arg 145 " 150 155 cct gac gtt cgc gtg gct gtc gat acc tca gac aag cea ctg atg gcg 535 Pro ASD Val Arg Val Ala Val Asp Thr Ser Asp Lys Pro Leu Met Ala 160 165 170 ttg sse aaa asc ttq qat acá cct ggc gct gct ccg aac ctg att aag 63" Leu Gly Glu Ser Leu Asp Thr Pro Gly Ala Ala Pro Asn Leu He Lys 175 180 185 190 cea aat ggt ctg gaa ctg ?gc cag ctg gct aac act gat ggt gaa gag 685 Pro Asn Gly Leu Glu Leu Gly Gln Leu Ala Asn Thr Asp Gly Glu Glu 195 2nn ?n<^ ctg gag gcg cgt gct gcg caá ggc gat tac gac gcc atc atc gca gct 733 Leu Giu A-La Arg Ala Ala Gln Gly A-jp Tyr ?ap ?la lio He ?la ?la 210 215 220 gcg gac gta ctg gtt aac cgt ggc atc gaa cag gtg ctt gtc a c Uy 761 Ala Asp Val Leu Val Asn Arg Gly He Glu Gln Val Leu Val Thr Leu 225 230 235 ggt gcc gca gga gcg gtg ttg gtc aac gca gaa ggt gcg tgg act gct 829 Giy Ala Ala Gly Ala Val Leu Val Asn Ala Glu Gly Ala Trp Thr Ala 240 245 250 act tet cea aaa att qat gtt qta tec acc gtt gga gct gga gac tgt 877 Thr Ser Pro Lys He Asp Val Val Ser Thr Val Gly Ala Gly Asp Cys 255 260 265 270 gct ctt gca ggt ttt gtt atg gca cgt tec cag aag aaa acá ctg gag 925 Ala Leu Ala Gly Phe Val Met Ala Arg Ser Gln Lys Lys Thr Leu Glu 275 280 285 gaa tet ctg ctg aat gcc gtg tet tac ggc tcg act gcg gcg tet ctt 973 J I U Se r Leu Le u As>u Ala Val Sci Tyi Gl y S C Tlii. Ala Al a Sex Leu 290 295 300 cet ggc act acc att cct cgt cct gac caá etc gcc acá gct ggt gca 1021 Pro Gly Thr Thr He Pro Arg Pro Asp Gln Leu Ala Thr Ala Gly Ala 305 310 315 acg gtc acc caá gtc aaa gga ttg aaa gaa tca gca tgaatagcgt 1067 Thr Val Thr Gln Vai Lys Gly Leu Lys Glu Ser Ala 320 325 330 ?ssrasfrrr tcgcttgtcc ggetggat?t cgatttcggc gactccacca cgg 1120 <210> 2 <211> 330 <212> PRT "^ 2 13 -" Cui yiiüLiai. L .i. uui ylu L U?lCum •- 4 C C -» 2 Met lie He Thr Phe Thr Pro Asn Pro Ser He Asp Ser Thr Leu Ser 1 5 10 15 leu G.y Glu Glu Leu Ser Arg Gly Ser Val Gln Arg Leu Ase Ser Va. 20 25 3C Thr Aia Val Ala Gly Gly Lys Giy He Asn Val Ala His Aia Va. Le- 35 40 45 Leu Aia G_y Phe Glu Thr Leu Ala Val Phe Pro Ala Gly Lys Leu Asp 50 55 60 Pro Phe Val Pro Leu Val Arg Asp He Gly Leu Pro Val Glu Tnr Val 65 70 75 80 Vai He Asn Lys Asn Val Arg Thr Asn Thr Thr Val Thr Glu Pro Asp 85 90 95 Gly Thr Thr Thr Lys Leu Asn Gly Pro Gly Ala Pro Leu Ser Glu Gln 100 105 110 Lys Leu Arg Ser Leu Glu Lys Val Leu He Asp Ala Leu Arg Pro Glu 115 120 12S Val Thr Trp Val Val Leu Ala Gly Ser Leu Pro Pro Gly Ala Prc Val 130 135 140 Asp Trp Tyr Ala Arg Leu Thr Ala Leu He His Ser Ala Arg Pro Asp 145 150 155 160 Val Arg Val Ala Val Asp Thr Ser Asp Lys Pro Leu Met Ala Leu Gly 165 170 l -> 5 Gl Ser Leu Asp Thr Pro Gly Ala Ala Pro Asn Leu He Lvs Pro Asn 180 185 190 Gly ;AH Glii I.pt] Gly ln T,<»?? Ala Asn Thr As Gl r.ln clu Ten úlp 195 200 205 Ma ?rg ?la ?la Gln Gly ?ßp Tyr ?ep ?la I c He ?la ?la ?la ?sp 210 215 220 Val L=u Val Aan Arg Gly lie Glu Gln Val eu Val Th_ Leu Gly Ala 225 230 235 240 Ala Gly la val Leu val Asn Ala Glu Giy Ala Trp Thr / a ihr _er 245 250 255 Pro Lys He Asp Val Val Ser Thr Val Gly Ala Gly Asp Cys Ala Leu 260 265 270 Ala Giy Phe Val Met Ala Arg Ser Gln Lys Lys Thr Leu Glu Glu Ser 275 280 285 .eu Leu Asn Ala Val Ser Tyr Gly Ser Thr Ala Ala Ser Leu Pro Gly 290 295 300 - ' ttut~,-~~f--* Thr Thr lie Pro Arg Pro Asp Gln Leu Ala Thr Ala Giy Aia hr va: 205 310 315 Thr Gln Val Lys Gly Leu Lys Glu Ser Ala

Claims

30 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Polinucleótido aislado de bacterias corineformes, caracterizado porque contiene una secuencia polinucleótida, seleccionada del grupo formado por: a) polinucleótidos que cuando menos son 70% idénticos a un polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, b) polinucleótidos que codifican a un polipéptido, que contiene una secuencia aminoácida que cuando menos es 70% idéntica a la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, c) polinucleótidos que son complementarios a los polinucleótidos de a) o b) , y d) polinucleótidos que contienen cuando menos 15 bases secuenciales de la secuencia polinucleótida de a) , b) o c) . 2.- Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es ADN, preferentemente recombinante, replicable en bacterias corineformes. 3.- Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es ARN. 31 4.- Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque contiene una secuencia de ácidos nucleicos como se representa en la SEQ. ID. no. 1. 5.- ADN replicable de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque contiene: (i) la secuencia nucleótida, mostrada en SEQ-ID no. 1, o (ii) cuando menos una secuencia que corresponda a la secuencias (i) dentro del rango de degeneración del código genético, o (iii) cuando menos una secuencia que se hibridice con las secuencias complementarias a la secuencias (i) o (ii), y eventualmente (iv) mutaciones de sentido de función neutra en (i) . 6.- Secuencia polinucleótida de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque codifica a un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida representada en SEQ ID no. 2. 7.- Procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos en especial L-lisina, caracterizado porque se realizan los siguientes pasos: a) Fermentación de las bacterias corineformes que producen los L-aminoácidos deseados, en las cuales cuando menos se refuerzan en especial se sobe-expresan, el gen pfk, o las secuencias nucleótidas que lo codifican. b) enriquecimiento de los L-aminoácidos en el medio o en 32 las células de las bacterias y c) aislado de los L-aminoácidos. 8.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales adicionalmente se refuerzan otros genes de la via biosintética de los L-aminoácidos deseados. 9.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales están desactivadas cuando menos parcialmente las vias metabólicas, que reducen la formación de L-lisina. 10.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque se utiliza una cepa transformada con un vector de plásmido, y el vector de plásmido porta una secuencia nucleótida que codifica al gen pfk. 11.- Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque se utilizan bacterias corineformes, que producen L-lisina. 12.- Procedimiento de acuerdo con al reivindicación 6, caracterizado porque para la preparación de L-lisina, se fermentan bacterias en las cuales simultáneamente se refuerzan, en particular se sobre-expresan o amplifican uno o varios genes, seleccionados del grupo i) el gen dapA que codifica a la sintasa de dihidropicolinato, o ii) el gen pyc codificante a la carboxilasa de piruvato 33 iii) el gen tpi codificante a la isomerasa de fosfato de tiosa iv) el gen gap codificante a la dihidrogenasa de 3-fosfato de gliceraldehido v) el gen pgk codificante a la quinasa de 3-fosfoglicerato vi) el gen lysE codificante a la exportación de usina. 13.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque se fermentan bacterias para la producción de L-lisina, en las cuales simultáneamente se debilitan uno o varios de los genes, seleccionados del grupo de i) el gen pck codificante a la carboxiquinasa de fosfoenolpiruvato ii) el gen pgi codificante a la isomerasa de glucosa-6- fosfato. 14.- Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utilizan microorganismos del género Corynebacterium gl utamicum. 15.- Uso de secuencias polinucleótidas de acuerdo con la reivindicación 1 como cebadores para la preparación de ADN de genes, que codifican a la quinasa de fosfofructosa, por medio de la reacción de cadenas de polimerasa. 16.- Uso de secuencias polinucleótidas de acuerdo con la reivindicación 1 como sondas de hibridización.