NUEVAS SECUENCIAS NUCLEOTIDAS QUE CODIFICAN AL GEN eno Descripción de la Invención El objeto de la invención son secuencias nucleótidas codificantes para el gen eno y un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina utilizando bacterias corineformes, en las cuales se refuerza el gen de eno. Estado de la Técnica Los L-aminoácidos, en especial L-lisina se utilizan en la medicina humana y en la industria farmacéutica, pero en especial en la alimentación animal. Se conoce que esos aminoácidos se producen por fermentación de cepas de bacterias corineformes en especial con Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia de ese grupo de productos se trabaja continuamente a la mejora de esos procedimientos de preparación. Las mejoras del procedimiento pueden consistir en medidas técnicas de fermentación como por ejemplo agitación y alimentación de oxígeno, o la composición de los medios nutritivos como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o la post-elaboración a la forma de un producto, por medio de cromatografía de intercambio de iones o por medio de propiedades intrínsecas propias de lo.s microorganismos. Para mejorar las propiedades de rendimiento de esos
REF.: 122044 microorganismos se utilizan métodos como mutagenesis, selección y selección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra los antimetabolitos como por ejemplo el análogo de lisina S- (2-aminoetil) -cistenina o auxótropas para los aminoácidos regulatoriamente importantes y que producen L-aminoácidos. Desde hace algunos años se han utilizado métodos de técnica de recombinación de ADN para el mejoramiento de cepas, de cepas que producen L-aminoácidos de Corynebacterium glutamicum, en la cual genes de biosintesis de aminoácidos individuales se amplifican y se estudia su efecto sobre la producción de los L-aminoácidos. Un artículo sobre esto se encuentra entre otros el de Kinoshita ("Glutamicum Acid Bacteria" en Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, Londres, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Jetten y Sins ey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sahm et al., (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996) ) . Tarea de la Invención Los inventores se propusieron la tarea de obtener nuevas medidas para mejorar la preparación por fermentación de aminoácidos, en especial L-lisina. Descripción de la Invención La L-lisina tienen aplicación en la medicina humana, en industria farmacéutica y en especial en la alimentación animal. Por lo tanto existe un interés general en un procedimiento nuevo y mejorado para la producción de esa L-lisina. Cuando a continuación se mencionen L-lisina o lisina, se implican no solo las bases sino también las sales como por ejemplo monoclorhidrato de lisina o sulfato de lisina. El objeto de la invención es un polinucleótido aislado de bacterias corineformes, que contiene la secuencia nucleótida, seleccionada del grupo formado por: a) Polinucleótidos que cuando menos son 70% idénticos con un polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, b) Polinucleótidos que codifican a un polipéptido, que contiene una secuencia aminoácida que cuando menos es 70% a la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, c) Polinucleótidos que son complementarios a los polinucleótidos de a) o b) , y d) Polinucleótidos que contienen cuando menos 15 bases secuenciales de la secuencia polinucleótida de a) , b) o c) . El objeto de la invención es igualmente el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde preferentemente se trata de un ADN replicable, que contiene: (i) la secuencia nucleótida, mostrada en SEQ-ID no. 1, o (ii) cuando menos una secuencia que corresponda a la secuencia (i) dentro del rango de degeneración del código genético, o (iii) cuando menos una secuencia que se hibridice con la secuencia complementaria a la secuencia (i) o {ii) , o (iv) mutaciones de sentido de función neutra en (i) . Otros objetos son un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, que contiene la secuencia nucleótida representada en SEQ ID no. i, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, que codifica a un polipeptido que contiene la secuencia aminoácida como se representa en la SEQ. ID no. 2, un vector que contiene el polipeptido de acuerdo con la reivindicación 1, en especial un vector péndulo o un vector de plasmido, y bacterias corineformes que sirven como células anfitrionas, que contiene el vector. El objeto de la invención también lo son polinucleótidos que en esencial consisten de una secuencia polinucleótida que pueden obtenerme por medio de selección por medio de hibridización de un banco genético correspondiente, que contiene completamente al gen con la secuencia polinucleótida correspodiente a la SEQ ID no.l, con una sonda que contiene la secuencia del polunucleótido mencionado de acuerdo con SEQ ID No. l o una fragmento de esta y aislado de la secuencia de ADN mencionada. Las secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención son adecuadas como sondas de hibridización para ARN, cADN y ADN, para aislar cADN con longitud completa, que codifiquen a enolasa y aislar aquellos ADN o genes, que presenten una alta similitud con la secuencia del gen de enolasa. Las secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención además son adecuadas como cebadores para la preparación de ADN de genes que codifican a enolasa, por medio de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Esos oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores contienen cuando menos 30, preferentemente cuando menos 20, mas especialmente cuando menos 15 bases secuenciales. Adecuados son igualmente los oligonucleótidos con una longitud de cuando menos 40 o 50 pares de bases. "Aislado" significa que se retira de su ambiente natural. "Poligonucleótido" se refiere en general a poliribonucleótidos y polidesoxiribunucleótidos, en donde se puede tratar de ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados. Bajo "polipeptidos" se entiende peptidos o proteínas, que contienen dos o mas aminoácidos unidos a través de enlaces de peptidos . Los polipeptidos de acuerdo con la invención incluyen un polipeptido de acuerdo con la SEQ. ID no . 2, en especial aquellos con actividad biológica de la enolasa y también aquellos que sean cuando menos en un 70% idénticos con el polipeptido de acuerdo con la SEQ, ID no. 2, preferentemente en un 80% y en especial posean cuando menos un 90 a 95% de identidad con el polipeptido de acuerdo con la SEQ ID No. 2, y que presenten la actividad mencionada. La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación por fermentación de aminoácidos, en especial L-lisina * utilizando bacterias corineformes que en especial ya produzcan los aminoácidos deseados y en los cuales se refuerza, en especial se sobre-expresa, las secuencias nucleótidas que codifican al gen eno. El concepto "refuerzo" describe a este respecto el aumento de la actividad intracelular de una o varias enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el ADN correspondiente, para lo cual por ejemplo se aumenta el número de copias del gen o de los genes, se utiliza un fuerte promotor o un gen que codifica a la enzima correspondiente con alta actividad, y eventualmente se combinan esas medidas. Los microorganismos que son. objeto de la presente invención pueden producir L-aminoácidos, en especial L-lisina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones, celulosa o de g?icerina y etanol. Puede tratarse de un representante de las bacterias corineformes en especial del genero Corynebacterium. En el genero Corynebacterium debe mencionarse en especial el tipo Corynebacterium glutamicum, que se conoce en la técnica por su capacidad de producir L-aminoácidos. Cepas adecuadas del genero Corynebacterium en especial del tipo Corynebacterium glutamicum, son por ejemplo las cepas tipo nativo conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium ace oglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoácidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCCC14067- Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020 y los mutantes o cepas preparados de ellas que produzcan L-lisina, como por ejemplo Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 y Corynebacterium glutamicum DSM5715. Los inventores pudieron aislar el nuevo gen de eno codificante a la enzima enolasa {EC 4.2.1.11) . Para aislar el gen eno o también otros genes de C.glutamicum primero se introduce un banco genético de ese microorganismo en E. coli. La introducción de los bancos genéticos es en general conocido, y se describen en libros y manuales. Ejemplos de ellos son el texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentec nologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el Manual de Sambrook et al.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un banco genético muy conocido es la cepa W3110 de E. coli K-12, que fue depositada por Ko ara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) en vectores ?. Bathe et al., (Molecular and General Genetics, 252 ,-255-265, 1996) describen un banco genético de C. glutamicum ATCC13032, que con la ayuda del vector de cosmido SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences US, 84:2160-2164) en la cepa NM554 de E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Bórmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) describe otra vez un banco genético de C. glutamicum ATCC13032 utilizando el cosmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-2989 (1980)) . Para la preparación de un banco genético de C:glutamicum en E. coli también pueden utilizarse los plasmidos como pBR322 (Bolívar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC (Viera et al., 1982, Gene, 19:259-268). Como anfitriones son adecuados en especial aquellas cepas de E.coli, que están defectuosas en restricción y recombinación. Un ejemplo de esto es la cepa DHSamicr, que fue descrita por Grant et al. {Proceedings of the National Academy of Sciences US, 87 (1990) 4645-4649) . Los fragmentos de ADN largos clonados con la ayuda de los cosmidos pueden ser subclonados y subsecuentemente secuenciados en vectores adecuados para la secuenciación, como lo describe por ejemplo Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America US, 74:5463-5467, 1977) . De esta manera se obtuvieron las nuevas secuencias de ADN de C. glutamicum que codifican al gen eno, que como SEQ ID NO. 1 son parte de la presente invención. Además a partir de la presente secuencia de ADN puede seleccionarse la secuencia aminoácida de la proteína correspondiente por medio de los métodos antes descritos. En la SEQ ID NO. 2 se representa la secuencia aminoácida obtenida del producto genético de eno. Las secuencias de ADN, que se obtienen de la SEQ ID NO. 1 por medio de la unidad de degeneración del código genético, también son parte de la invención. De la misma manera son parte de la invención, las .secuencias de ADN, que se hibridizan con la SEQ ID NO . l o con partes de SEQ ID NO.
1. En la técnica se conocen además intercambios conservadores de aminoácidos como por ejemplo intercambio de glicina por alanina o de ácido asparagínico por ácido glutámico en proteínas como "mutaciones de sentido" (sense mutations) , que no conducen a modificaciones fundamentales de la actividad del la proteína, esto es que son de función neutra. Además se sabe que las modificaciones en la terminal N y/o C de una proteína, no pueden influir de manera esencial o hasta estabilizarla. Los datos sobre esto las encuentra el técnico entre otros en Ben-Bassat et al . (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), por 0 ' Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), por Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), por Hochuli et al. {Bio/Technology 6:1321-1325 (1988) ) y en textos conocidos de genética y biología molecular. Las secuencias aminoácidas, que se dan correspondientemente en SEQ ID no. • 2 también son parte constitutiva de la invención. De igual manera son parte de la invención las secuencias de ADN que hibridizan con la SEQ ID no . l o partes de SEQ ID No. i. Finalmente también son partes constitutivas de la invención las secuencias de ADN que se prepararon por medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores, que se obtienen de la SEQ ID . no. 1. Ese tipo de oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de cuando menos 15 pares de bases Indicaciones respecto a la identificación de secuencias de ADN por medio de hibridización las encuentra el tencico entre otros en el Manual "The DIG System Users Guide for Filter Hibridization" , de la firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993), y por Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-260) . Indicaciones sobe la amplificación de secuencias de ADN con la ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se encuentran entro otros en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, •Oxford, UK, 1984) y por Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994) . Los inventores encontraron que las bacterias corineformes después de la sobre-expresión del gen eno producen L-lisina de forma mejorada. Para obtener la sobre-expresión puede aumentarse el número de copias del gen correspondiente o puede mutarse la región promotora y reguladora o el punto de ligado de las ribosomas, que se encuentra corriente arriba del gen estructural. De igual manera sirven los cartuchos de expresión que se construyen corriente arriba del gen estructural . Por medio de promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción por fermentación de .L-lisina. Por medio de medidas para alargar la vida del m-RNA se mejora igualmente la expresión. Además evitando la reducción de la proteína enzimática se refuerza la actividad enzimática. Los genes o las construcciones genéticas pueden encontrarse en los plasmidos con diferentes números de copias o estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente puede obtenerse una sobre-exprésion de los genes en cuestión por medio de la modificación de la composición del medio y la realización del cultivo. Datos sobre esto los encuentra el técnico entre otros en los escritos de Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/tec nology 6, 428-430 (1988)) de Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el escrito de patente europeo EP-B 0 472 869, en la patente de US 4,601,893, de Schwarzer y Pühler (Bio/technology 9, 84-87
(1991), de Reinscheid et al. (Applied and Enviromental
Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud de patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134,15-24 (1993) ) , el la publicación japonesa JP-A-lO-229891, de Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195
(1998)), de Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538
(1996) ) y en los textos conocidos de Genética y Biología
Molecular. Por ejemplo el gen eno de acuerdo con la invención se sobre-expresa con la ayuda de plasmidos. Como plasmidos son adecuados aquellos que se replican en bacterias corineformes . Muchos vectores de plasmidos conocidos como por ejemplo pZl (Menkel et al., Applied and Enviromental Microbiology, (1989) 64: 549-554), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 107:69-74 (1991)) o pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) se basan en los plasmidos crípticos pHMi5l9, pBLí o pGAl. Otros vectores de plasmido como por ejemplo aquellos que se basan en pCG4 (US-A-4, 489, 160) o pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAGl (US-A 5,158,891), pueden utilizarse de igualmente. Además puede ser ventajoso para la producción de L-lisina el sobre-expresar además del gen eno, una o varias enzimas de la vía de biosintesis, de la glicólisis, de la anapletórica, del ciclo del ácido cítrico o de la exportación de aminoácidos . Así por ejemplo para la preparación de L-lisina se puede sobre-expresar: • simultáneamente el gen dapA que codifica a la sintasa de dihidropicolinato (EP-B 0 197 335) , o • simultáneamente el gen gap codificante a la dihidrogenasa de 3 -fosfato de gliceraldehido (Eikmanns
(1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086), o
• simultáneamente el gen tpi codificante a la isomerasa de fosfato de tíosa (Eikmanns (1992) . Journal of Bacteriology 174:6076-6086), o • simultáneamente el gen pgk codificante a la quinasa de 3-fosfoglicerato (Eikmanns (1992) . Journal of Bacteriology 174:6076-6086), o • simultáneamente el gen pyc codificante a la carboxilasa de piruvato (Eikmanns (1992) . Journal of Bacteriology 174:6076-6086) , o • simultáneamente al gen lysE codificante al exportador de lisina (DE-A-195 48 222) . Además puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, en especial L-lisina, además de la sobre-expresión del gen accDA, el desactivar reacciones indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", en: Overproduction of Amino Acid Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982) . Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse continua o discontinuamente en procedimientos por lotes o en procedimiento de alimentación (fed batch) o procedimiento de alimentación repetitivo
(repeated fed batch) con el fin de producir L-aminoácidos. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el texto de Chmiel (Bioprozestechnik i. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einric tungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). El medio de cultivo utilizado debe de una forma adecuada ser suficiente para los requisitos de las cepas microorganismos en cuestión. La descripción de medios de cultivo de diferentes microorganismos se encuentra en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., US, 1981) . Como fuente de carbono pueden utilizarse azucares y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones y celulosa, aceites y grasas como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como por ejemplo ácido palmitíco, ácido estearínico y ácido linoléico, alcoholes como por ejemplo glicerina y etanol y ácidos orgánicos como por ejemplo ácido acético. Esas substancias pueden utilizarse individualmente o en mezclas. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de soya y urea o compuesto inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o como mezclas. Como fuentes de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe además contener sales de metales como por ejemplo sulfato de magnesio o de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente pueden utilizarse promotores del crecimiento como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las substancias mencionadas. Al medio de cultivo pueden agregarse precursores adecuados. Los aditivos mencionados pueden agregarse al cultivo en forma de una carga única o en una forma adecuada agregarse durante el cultivo. Para controlar el pH del cultivo se utilizan compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico en forma adecuada. Para controlar la formación de espuma pueden utilizarse agentes anti-espumantes como por ejemplo poliglicoléster de ácido graso o aceites de silicona. Para mantener la estabilidad de los plasmidos pueden agregarse al medio substancias de efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas se introducen al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contengan oxígeno como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente a 20 °C a 45 °C y preferentemente a 25°C a 40°C. El cultivo se continua hasta que se ha formado una cantidad máxima de L-aminoácido. Este objetivo se alcanza normalmente en el .transcurso de 10 a 160 horas.
El análisis de L-lisina puede realizarse por medio de una cromatografía de intercambio de aniones con la subsecuente derivación de ninhidrina tal como lo describe Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190). El procedimiento de acuerdo con la invención sirve para la preparación por fermentación de aminoácidos, en especial de L-lisina. Ejemplos La presente invención se explicara mas detalladamente con la ayuda de los ejemplos de realización. • Ejemplo 1 Preparación de un banco genético de cosmido genómíco a partir de Corynebacterium glucamicum ATCC 13032. ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 fue aislado como lo describe Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179), y se disoció parcialmente con enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo Alemania, descripción del producto Sau3AI, código no. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desfofosforilaron con la ayuda de fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP, código no. 1758250) . El ADN del vector de cosmido SuperCol (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences US 84:2160-2164) , en referencia a la firma Stratagene (La Jolla, US, descripción del producto SuperCosl Cosmid Vektor Kit, código no. 251301) se disoció con la enzima de restricción Xbal {Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto Xbal, código no. 27-0948-02) e igualmente se desfosforiló con fosfatasa alcalina. A continuación se disoció el ADN de cosmido con la enzima de restricción BAmHI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto BamHI, código no. 27-0868-04) . El ADN de cosmido tratado de esa manera se mezclo con el ADN ATCC13032 tasado y el producto se trato con ligasa de ADN T4, (Amersham Pharmacia Biotech. Friburgo, Alemania, descripción del producto ligasa de ADN T4, producto no. 27-0870-04) . La mezcla de ligado se empacó en fagos con la ayuda de Gigapack II XL Packing Extracts (Startagene, La Jolla, US, denominación del producto Gigapack II XL Packing Extracts, código no. 200217) . Para la infección de la cepa de E. coli NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575) , las células se tomaron en 10 mM MgS04 y se mezclaron con una alícuota de suspensión de fagos. La infección y la titulación del banco de Cosmido fueron realizadas como lo describe Sambrook et al.; (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor) , en donde las células se transplantan sobre agar LB (Lennox 1955, Virology, 1:190) con 100 µg/ml de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37 °C se seleccionaron las..colonias individuales recombinantes.
Ejemplo 2 Aislado y Secuenciación del gen eno EL ADN de cosmido de una colonia individual se aisló de acuerdo con las indicaciones del fabricante del Qiaprep Spin Miniprep Kit (producto no. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) y se disoció parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo Alemania, descripción del producto Sau3AI, código no. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desfofosforilaron con la ayuda de fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP, código no. 1758250) . Después de la separación electroforética de gel se realizó el aislado de los fragmentos de cosmido en el rango de 1500 a 200 bp con el equipo QiaEWxII Gel Extraction Kit (producto no. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania) . El ADN del vector de secuenciación pXero-1 en relación al de la firma Invitrogen (Groningen, Holanda, denominación del producto Zero Background Cloning Kit, producto no. K2500-01) se disoció con la enzima de restricción BAmHI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto BamHI, código no. 27-0868-04) . El ligado de los fragmentos de cosmido en el vector de secuenciación pZero-l se realizó como se describe por Sambrook et al.; (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor)., en donde la mezcla de ADN se incuba durante la noche con ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania) . Esa mezcla de ligado se electroporo a continuación en la cepa de E. coli DH5cvmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S. ., 87:4645-4649) (Tauch et al. 1994, FEMS microbiology Letters, 123:343-7), y sobre agar LB (Lennox 1955, Virology, 1:190) con 50 µg/ml de zeocina. La preparación de plasmido de los clones recombinantes se realizó con el Birobot 9600 (producto no. 900200, Qiagen, Hilden, Alemania) . La secuenciación se realizó de acuerdo con el método de ruptura de la cadena didesoxi de Sanger et al, (1977, Proceedings of the National of Sciences of the United States of America US, 74:5463-5467) y modificaciones de acuerdo con Zimmmerman et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se utilizó el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de PE Applied Biosystems (producto no. 403044, Weiterstadt, Alemania) . La separación electroforética y el análisis de la reacción de secuenciacion se realizó en un gel de "acrilamida/bisacrilamida para Rotiphoresis NF" (29:1) (producto no. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el aparato de secuenciación "ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . Loas datos de la secuencia en bruto obtenidos fueron procesados subsecuentemente utilizando el paquete de programación Staden (1986, Nucleic Ac.ids, Research, 14:217-231) versión 97-0. Las secuencias individuales de los derivadas de pZerol se ensamblaron en un Contig dependiente. El análisis de rango de codificación apoyado por computadora se realizó con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Otros análisis se realizaron con "BLAST search programs" (Altschiul et al., 1997, Nucleic Acids research, 25: 3389-3402), frente al banco de datos no redundante del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, US) . La secuencia nucleótida obtenida se representa en SEQ ID no . 1. Los análisis de la secuencia nucleótida dio un marcador de lectura abierto con 1275 pares de bases, que fue denominado como el gen eno. El gen eno codifica a una proteína de 425 aminoácidos.
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.