CN103725702A

CN103725702A - Eno2基因在植物生长发育调控中的应用

Info

Publication number: CN103725702A
Application number: CN201310684729.0A
Authority: CN
Inventors: 张根发; 叶盼; 施子晗; 高飞; 周宜君; 李晓峰; 张永华; 程慧梅
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2014-04-16

Abstract

本发明提供ENO2基因在植物生长发育调控中的应用，利用基因工程技术将ENO2基因整合至植物基因组中，从而调节植物的生长发育。研究表明：1、eno2产生的T-DNA插入突变使得拟南芥花粉形态异常，由此可见eno2在花粉的正常发育中起重要作用；2、eno2产生的T-DNA插入突变使得拟南芥的主根长度明显变短、莲座叶的叶片数目变少和总面积显著变小、所有叶片都成为网状叶和地上及地下部分重量明显降低。由此可见eno2在拟南芥的正常营养生长发育中起重要作用。

Description

ENO2基因在植物生长发育调控中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及ENO2基因在植物生长发育调控中的应用。

背景技术

烯醇化酶（enolase,eno）是参与糖酵解的一个关键酶，近年来发现烯醇化酶还表现出一些其他的、多样化的新功能。在植物体中，研究者早已观察到烯醇化酶在转录、转录后和翻译后水平上应答高盐、低温、缺氧等非生物胁迫，因此，推测烯醇化酶可能在植物非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。然而，目前为止鲜有文献报道烯醇化酶在植物生长发育中起作用。

发明内容

本发明的目的是提供ENO2基因在植物生长发育调控中的应用。

为了实现本发明目的，本发明利用基因工程技术将ENO2基因整合至植物基因组中，从而调节植物（优选拟南芥）的生长发育。其中，所述ENO2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。

根据GenBank上公布的拟南芥基因组信息，设计用于扩增eno2基因的引物，最终克隆得到完整的基因序列。

本发明对烯醇化酶2基因在植物（拟南芥）营养生长发育和花粉发育中的功能进行了探索。

从拟南芥生物资源中心购买拟南芥烯醇化酶2基因（enolase2,eno2）的T-DNA插入突变体，经鉴定得到烯醇化酶2基因的纯合T-DNA插入突变体，并进一步通过农杆菌介导的蘸花法用eno2分别转化eno2-纯合突变体和野生型拟南芥，得到回补型和过表达型拟南芥，结合其表型分析（主要包括花粉粒显微镜观察和杂交等方法）来确定烯醇化酶2基因在拟南芥营养生长和花粉发育中的功能。结果如下：

eno2^-纯合突变体的花粉粒较小，且形态异常，回补型的花粉粒大小和形态则与野生型一致。此外，eno2^-纯合突变体的主根长度只有野生型的1/3，它的莲座叶叶片数目只有野生型的1/2，莲座叶叶片总面积也只有野生型的1/10，地上和地下部分的重量分别只有野生型的1/2和1/3，而回补型的这些表型差异得以恢复到野生型水平。

本发明还提供利用基因工程技术将ENO2基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物根的生长发育。

本发明还提供利用基因工程技术将ENO2基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物叶片的生长发育。

本发明进一步提供利用基因工程技术将ENO2基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物花粉粒的发育。

本发明的优点在于：

（一）首次证明烯醇化酶2基因在植物花粉正常发育中具有重要的功能。

（二）证明了烯醇化酶2基因除了在植物耐逆中起作用，进一步证明了烯醇化酶2基因在植物正常营养生长发育中发挥着关键作用，拓展了烯醇化酶2基因的功能。

附图说明

图1为本发明实施例1中基因组水平鉴定拟南芥烯醇化酶2纯合突变体；其中，1和2为野生型拟南芥，3和4、5和6为杂合eno2^-拟南芥，7-10为纯合eno2^-拟南芥，11为DNA Marker。

图2为本发明实施例1中转录水平鉴定拟南芥烯醇化酶2纯合突变体。

图3为本发明实施例1中拟南芥烯醇化酶2纯合突变体鉴定原理图。

图4为本发明实施例3中生长23天的拟南芥；其中，左上角植株为纯合eno2^-拟南芥，左下角植株为转pCAMBIA-1302-GFP空载体的拟南芥，中间植株为野生型拟南芥，右上角为回补eno2基因的纯合回补型拟南芥，右下角植株为过表达eno2基因的纯合过表达型拟南芥。

图5为本发明实施例3中生长28d的拟南芥的莲座叶叶片。

图6为本发明实施例3中生长15d拟南芥的主根的生长情况；其中，从左至右依次为回补型拟南芥、野生型拟南芥、纯合eno2^-拟南芥、纯合回补型拟南芥和纯合过表达型拟南芥，纯合eno2^-拟南芥的主根长度较短，回补型拟南芥的主根长度则恢复到了野生型的长度，过表达型拟南芥主根略长，但差异不明显。

图7为本发明实施例3中生长23d拟南芥的侧根的生长情况；其中，从左至右依次为回补型拟南芥、野生型拟南芥、纯合eno2^-拟南芥回补型拟南芥和过表达型拟南芥，纯合eno2^-拟南芥的侧根较少，回补型拟南芥的侧根数目则恢复到了野生型的水平。

图8为本发明实施例2中拟南芥成熟花粉粒扫描电子显微镜下观察结果；其中，从左至右依次为转空载拟南芥、野生型拟南芥、纯合eno2^-拟南芥、纯合回补型拟南芥和纯合过表达型拟南芥，纯合eno2^-拟南芥花粉发育不正常，花粉粒较小，且形态异常，回补型拟南芥花粉粒大小和形态则恢复正常。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 拟南芥烯醇化酶2纯合突变体鉴定

1.1 基因组水平鉴定

从拟南芥生物资源中心购买拟南芥烯醇化酶2基因（enolase2,eno2）的T-DNA插入突变体，经鉴定得到烯醇化酶2基因的纯合T-DNA插入突变体。鉴定方法如下：

针对插入序列，设计特异性引物LP和RP，位于T-DNA插入序列的两侧，BP为根据T-DNA插入序列所设计的引物（一般含有LBa1、LBb1和LBb1.3），以待测拟南芥基因组DNA为模板，分别以LP、RP和RP、BP两对引物进行PCR扩增。

其中引物LP序列为：5’-CCATCCAAATTTCAAACATGG-3’；引物RP序列为：5’-CGATGATGTTGTTCACATTGC-3’。

引物BP（LBa1）序列为：5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’。

PCR鉴定原理图如图3所示。

若待测植株为野生型拟南芥，则只有LP、RP引物对可以扩增出条带；若待测植株为杂合体，则两对引物均能扩增出特异性条带；若待测植株为纯合突变体，则只有RP、BP引物对可以扩增出条带。

结果如图1所示，成功鉴定出烯醇化酶2基因的纯合T-DNA插入突变体。

1.2 转录水平鉴定

鉴定方法如下：

提取拟南芥叶片总RNA，反转录生成cDNA，然后以actin2为内参，并以反转录合成的cDNA为模板进行RT-PCR鉴定，所用的引物分别为：

eno2:sense：5’-AATGGATGTTGCCGCTTCAGAGTTC-3’

antisense:5’-TAAGTCAGCAATGAATGTGTCCTCG-3’

actin2:sense：5’-TAACTCTCCCGCTATGTATGTCGCC-3’

antisense:5’-TTTCTGTGAACGATTCCTGGACCTG-3’

结果如图2所示，从图2可以看出，烯醇化酶2纯合突变体的eno2表达量明显下降。

1.3 突变体中T-DNA插入位点

对RP和LBa1扩增得到的片段进行测序，然后根据拟南芥基因组信息，通过生物信息学方法找到T-DNA插入的精确位点。结果见表1。

表1 突变体中T-DNA插入位点

1.4 杂合eno2^-后代的分离比分析

共鉴定了107株拟南芥植株，其中WT为28株，杂合突变体为53株，纯合突变体为26株，杂合eno2^-的后代分离比为1.07:2.04:1，经卡方检验后，符合孟德尔第一定律，即该突变体是由单一基因引起的突变，又因为杂合eno2^-没有表型，所以该突变体是由单一基因引起的隐性突变。图3为本发明实施例1中拟南芥烯醇化酶2纯合突变体鉴定原理图。

实施例2 转基因植株的获得

为了证实纯合eno2^-突变体拟南芥的特殊表型确实是由于eno2基因的缺失造成的，本发明通过构建植物真核表达载体pCAMBIA1302-eno2-GFP，浸花法分别导入拟南芥eno2^-纯合突变体和野生型拟南芥，进行基因的回补和过表达研究，验证基因功能。此外，本实施例中为了排除pCAMBIA-1302-GFP空载体对拟南芥的影响，也将pCAMBIA-1302-GFP空载体通过相同的方法导入野生型拟南芥，最终成功获得了回补eno2基因的纯合回补型拟南芥，过表达eno2基因的纯合过表达型拟南芥和转pCAMBIA-1302-GFP空载体的纯合转空载拟南芥。具体方法如下：

2.1 真核表达载体的构建

按照Invitrogen公司的TRIzol RNA提取试剂盒的说明书所列方法步骤，对野生型拟南芥叶片样品进行总RNA提取，进一步反转录获得拟南芥eno2全长cDNA，以此为模板，用一对具有BlnI和NcoI酶切位点的引物进行PCR扩增eno2基因的ORF，然后与具有相应酶切位点的pCAMBIA 1302-GFP载体进行双酶切和连接反应，用得到的pCAMBIA 1302-eno2-GFP转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌落PCR，并扩大培养，提取质粒进行双酶切，用以检测阳性克隆。

2.2 蘸花法转化拟南芥

制备农杆菌的感受态细胞，并将2.1所获得的真核表达载体和空载体分别转化到农杆菌感受态细胞中。采用蘸花法将含有pCAMBIA1302-eno2-GFP的农杆菌分别转化野生型和纯合突变体拟南芥，得到过表达型拟南芥和回补型拟南芥，将含有pCAMBIA 1302-GFP空载体的农杆菌转化野生型拟南芥，得到转空载型拟南芥。并在基因组水平上鉴定阳性植株，最终通过3代的潮霉素筛选得到了纯合的回补eno2型拟南芥、过表达eno2型拟南芥和转空载型拟南芥。

实施例3 ENO2基因在植物营养生长中的功能分析

3.1 eno2与叶片的发育有关

本发明成功鉴定到了拟南芥eno2基因的纯合突变体eno2^-，但纯合eno2^-植株在整体上生长得很弱小，回补型长势则恢复到正常水平，过表达植株与野生型相比长势更好（图4），发现纯合eno2^-具有很明显的表型，对于种植于营养土中的植株而言，与野生型相比，纯合eno2^-的莲座叶叶片明显地变小，莲座叶叶片在数目上明显地变少和在莲座叶叶片总面积上也明显地变小（图5），而回补型拟南芥的莲座叶数目和大小以及总面积则与野生型无差异，由此可见eno2与拟南芥叶片的正常发育有关。

3.2 eno2与根发育有关

为了研究eno2是否在拟南芥根的发育中起作用，本发明考察了MS固体培养基上纯合突变体根的生长情况。将纯合eno2^-的种子种植于MS固体培养基上，生长15和23天后，分别进行观察根长和侧根数量，发现与野生型拟南芥相比，eno2^-纯合突变体的根生长速度变慢，主根变短，侧根数目变少，且地下部分重量也发生了明显的下降，而回补型拟南芥相应的表型则与野生型一致，由此可知eno2确实与拟南芥根的正常发育有关（图6）。

图7为生长23d拟南芥的侧根的生长情况。其中，从左至右依次为回补型拟南芥、野生型拟南芥、纯合eno2^-拟南芥回补型拟南芥和过表达型拟南芥，纯合eno2^-拟南芥的侧根较少，回补型拟南芥的侧根数目则恢复到了野生型的水平。

3.3 eno2与花粉粒发育有关

在实验中，将杂合eno2^-的F1代种子种植在MS固体培养基上，然后进行种子萌发率的测定，经过统计计算发现杂合突变体种F1代种子的萌发率与野生型拟南芥种子萌发率没有差异，均接近100%。因此确定eno2^-不是纯合致死的。

进一步观察发现纯合eno2^-的角果长度明显变短，而且角果所结的种子数发生了明显的下降，有的角果甚至一粒种子都没有，而回补型拟南芥的角果长度和种子数则恢复正常，由此可以判断eno2可能与拟南芥雄配子（花粉）或雌配子的发育有关。

通过扫描电镜观察花粉粒形态发现，与野生型花粉粒相比，纯合eno2^-花粉粒直径只有野生型的一半，并且形态异常，而回补型拟南芥花粉粒直径和形态都恢复到了野生型水平（图8）。表明eno2确实影响了拟南芥花粉粒的发育。

以上结果表明：1、eno2产生的T-DNA插入突变使得拟南芥花粉形态异常，由此可见，eno2在花粉的正常生长发育中起重要作用；2、eno2产生的T-DNA插入突变使得拟南芥的主根长度明显变短、莲座叶的叶片数目变少和总面积显著变小。由此可见，eno2在拟南芥的正常营养生长中起重要作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.ENO2基因在植物生长发育调控中的应用，其特征在于，利用基因工程技术将ENO2基因整合至植物基因组中，从而调节植物的生长发育。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ENO2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用基因工程技术将ENO2基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物根的生长发育。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用基因工程技术将ENO2基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物叶片的生长发育。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用基因工程技术将ENO2基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物花粉粒的发育。