CN102492769A - 一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法，方法包括鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法，将收集的菌体或细胞湿重0.5g用PBS缓冲液5ml重悬、电泳、剥胶、胶片进行活性染色和透析法小量纯化得到烯醇化酶等步骤。本发明能直观化地鉴定及纯化细胞内烯醇化酶，该方法操作简便，实验周期短，价格低廉，经济实用。

Description

一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法

技术领域

本发明属于一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法。

背景技术

烯醇化酶(enolase)，又称2-磷酸甘油水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，能催化磷酸甘油酸盐向磷酸烯醇式丙酮酸转变，同时也在糖异生过程中催化逆向反应。通常对该酶蛋白活性进行测定的方法是采用体外模拟部分糖代谢反应链。过程为烯醇化酶催化2-磷酸甘油酸形成PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)，PEP脱去磷酸根成为丙酮酸，在乳酸脱氢酶作用下成为乳酸，并使NADH⁺(还原型辅酶I)转化为NAD(氧化型辅酶I)和H⁺。用波长340nm的分光光度计测定反应过程中单位时间内NADH转变为NAD的量，从而确定烯醇化酶活性。这个方法是现在所常用的方法，而对于研究新的细菌内烯醇化酶的特点，该方法只能定量检测，而无法直观化。对于直观化的鉴定方式，往往是基因工程表达相应的酶蛋白，依赖抗体的制备，运用Western Blotting、ELISA等方法鉴定，实验周期长，价格非常昂贵，不经济实用。

发明内容

本发明的目的是设计一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法，能直观化地鉴定及纯化细胞内烯醇化酶，该方法操作简便，实验周期短，价格低廉，经济实用。

为此，本发明的包括下步骤：

(1)配制非变性聚丙烯酰凝胶；

(2)将收集的菌体或细胞湿重0.5g用PBS缓冲液5ml重悬，置离心机中，离心速度2000rpm，4℃下离心5min后，弃去上清液；

(3)向5ml PBS缓冲液中加入蛋白酶抑制剂5μl，混匀后加入到上述的菌体或细胞收集管内，-80℃～30℃反复冻融3次～5次，每次融化后，15000rpm离心5min后重悬，最后一次离心直取上清液，冷冻；

(4)上述细胞冻融液为蛋白初提液，取100μl蛋白液，与100μl的2×溴酚蓝上样Buf混合后，点样电泳，每个点样孔20μl，共10个孔；

(5)电泳：4℃80V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶后；改换130V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程115～120min；

(6)剥胶：将胶片剥落后，切取两个泳道用于考马斯亮蓝染色，即胶条用考马斯亮蓝染色浸泡，摇床上过夜染色，摇床转速130～150rpm；

(7)剩下的胶片进行活性染色：取一次性塑料染色盘，将胶片剥落入盘，然后用纯水清洗一次，弃去废液后，用矿物油封住胶面，用10ml一次性注射器从配好的染色液管中吸取下层的紫黑色染色液r，每次吸取7.5ml，共吸取2次，注入染色盘矿物油下，与胶接触，使用量为刚刚没过胶面，吸取0.02g/ml的NaNO₂5ml注入染色盘底部，与染色液混合，轻轻摇晃振荡，暗处放置10～15min，将染色盘放置在凝胶读片灯下，观察到是否都已经染色均匀，凝胶取出后，置于纯水中，加入30％H₂O₂5～10μl放置在摇床上，轻轻摇动脱色2～5分钟，直至蓝紫色条带出现，立即取出拍照，割胶回收；

(8)透析法小量纯化得到烯醇化酶，将割下的胶条用纯水冲洗两次，然后放入透析袋中，透析袋中装入2ml的1X电泳缓冲液，放入水平电泳槽内，让电泳槽内的电泳液面高于小透析袋内的胶条，70V恒压电泳15min；

(9)将透析袋内的胶条弃去，袋内液体回收至3KD的4ml的超滤管内，5000rpm离心10分钟，超滤管截流下的液体为浓缩后的烯醇化酶纯化产物。

所述的配制非变性聚丙烯酰凝胶，用800ml蒸馏水溶解8g NaCl，0.2gKCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，用HCl调节pH值至7.4，加水至1升，高压蒸汽灭菌后使用。上述方法实现了本发明的目的。

本发明的优点是能直观化地鉴定及纯化细胞内烯醇化酶，该方法操作简便，实验周期短，价格低廉，经济实用。

具体实施方式

按配制非变性聚丙烯酰凝胶，将收集的菌体或细胞(湿重0.5g)用PBS缓冲液5ml重悬。置离心机中，离心速度2000rpm，4℃下离心5min后，弃去上清。向5ml PBS缓冲液中加入Protease Inhibition Cocktail(GE公司购买)蛋白酶抑制剂5μl，混匀后加入到上述的菌体或细胞收集管内，-80℃～30℃反复冻融3次(不超过5次)，每次融化后，15000rpm离心5min后重悬(重新悬浮)，最后一次离心直取上清液，冷冻。上述细胞冻融液为蛋白初提液，取100μl蛋白液，与100μl的2×溴酚蓝上样Buf混合后，点样电泳，每个点样孔20μl。共10个孔。

电泳：4℃80V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换130V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约120min。剥胶：将胶片剥落后，切取两个泳道用于考马斯亮蓝染色，即胶条用考马斯亮蓝染色浸泡，摇床上过夜染色，摇床转速不超过150rpm。

剩下的胶片进行活性染色：取一次性塑料染色盘，将胶片剥落入盘，然后用超纯水清洗一次，弃去废液后，用矿物油封住胶面。用10ml一次性注射器从配好的染色液管中吸取下层的紫黑色染色液，每次吸取7.5ml，共吸取2次，注入染色盘矿物油下，与胶接触，使用量为刚刚没过胶面。吸取0.02g/ml的NaNO₂5ml注入染色盘底部，与染色液混合，轻轻摇晃振荡。暗处放置10～15min，将染色盘放置在凝胶读片灯下，可以观察到是否都已经染色均匀。凝胶取出后，置于超纯水中，加入30％H₂O₂5～10μl放置在摇床上，轻轻摇动脱色2～5分钟，直至蓝紫色条带出现。立即取出拍照，割胶回收。

透析法小量纯化得到烯醇化酶：将割下的胶条用纯水冲洗两次，然后放入透析袋中，透析袋中装入2ml的1×电泳缓冲液(由10×电泳Buf(pH8.8Tris-Gly)稀释而得到)。放入水平电泳槽内，让电泳槽内的电泳液面高于小透析袋内的胶条，70V恒压电泳15min。将透析袋内的胶条弃去，袋内液体回收至3KD的4ml的超滤管内，5000rpm离心10分钟，超滤管截流下的液体为浓缩后的烯醇化酶纯化产物。

本发明的药品缩写名称对照：PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液。Acr：丙烯酰胺。Bis：甲叉双丙烯酰胺。Buf：缓冲液。Tris-HCl：三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(缓冲液)。Trisbase：三(羟甲基)氨基甲烷。HCl：盐酸。dH₂O：单蒸馏水。APS：过硫酸铵。HAc：冰醋酸。TEMED：N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。Tris-Gly：三(羟甲基)氨基甲烷-甘氨酸(缓冲液)。NaHCO₃：碳酸氢钠。Na₂S₂O₄：连二亚硫酸钠(保险粉)。NaNO₂：亚硝酸钠。H₂O₂：过氧化氢(双氧水)。

非变性聚丙烯酰胺凝胶工作液配制：

用800ml蒸馏水溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用HCl调节pH值至7.4，加水至1升。高压蒸汽灭菌后使用。其中：

40％胶贮液(Acr∶Bis＝29∶1)。

4×分离胶Buf(1.5M Tri s-HCl，pH 8.8)：18.2g Tri sbase溶于80ml水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存。

4×浓缩胶Buf(0.5M Tri s-HCl，pH 6.8)：6g Tri sbase溶于80ml水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存。

10×电泳Buf(pH8.8Tris-Gly)30.3g Trisbase，144g甘氨酸，加水定容到1L，4℃贮存。

2×溴酚蓝上样Buf：1.25ml pH6.8，0.5M Tri s-HCl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5％溴酚蓝，5ml dH₂O；-20℃贮存。

10％APS。

0.25％考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2502.5g，甲醇450ml，HAc 100ml，dH₂O 450ml。

考马斯亮蓝脱色液：100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH₂O。

电泳胶的配制及电泳条件(上槽电极为负，下槽电极为正)：

碱性非变性胶10％分离胶(10ml)4％浓缩胶(5ml)。

40％胶贮液(40％分离胶，3.3％堆积胶)4.25ml 0.5ml。

4×分离胶Buf(1.5M Tri s-HCl，pH 8.8)2.5ml。

4×堆积胶Buf(0.5M Tri s-HCl，pH 6.8)1.25ml。

超纯水3.2ml。

10％APS  35μl。

TEMED 15μl。

10×电泳Buf(pH8.8Tris-Gly)：100ml稀释到1L。

染色液配制：

1，溶解Buffer：配制0.29M的NaHCO₃；

2，还原液：取15ml溶解Buffer移入30ml大离心管，称200mg取Na₂S₂O₄溶于其中。

3、迅速称取0.025g甲基紫精溶于上述混合液中，5ml矿物油封住液面。

实验主要参数：

检测仪器型号：LTQ XL Thermo

离子源：      ESI(+)；      毛细管电压：3KV；

脱溶剂气流量：20unit/min    检测器电压：200V

鉴定结果：

检索参数

检索软件：Proteomics Discovery 1.2(Thermo)

检索算法：Sequest

数据库：Uniprot_Sprot

峰误差   1 Da

数据筛选：Xcorr＞1.9 if Charge＝1

          Xcorr＞2.2 if Charge＝2

          Xcorr＞3.75if Charge＝3

检索结果

UniprotSprot，检索到可信度极高的蛋白，可由实验结合Native-PAGE结果以及物种来源综合判断为烯醇化酶(enolase)。

总之，本发明能直观化地鉴定及纯化细胞内烯醇化酶，该方法操作简便，实验周期短，价格低廉，经济实用。

Claims (2)

1.一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法，其特征在于：包括如下步骤，

(1)配制非变性聚丙烯酰凝胶；

(2)将收集的菌体或细胞湿重0.5g用PBS缓冲液5ml重悬，置离心机中，离心速度2000rpm，4℃下离心5min后，弃去上清液；

(3)向5ml PBS缓冲液中加入蛋白酶抑制剂5μl，混匀后加入到上述的菌体或细胞收集管内，-80℃～30℃反复冻融3次～5次，每次融化后，15000rpm离心5min后重悬，最后一次离心直取上清液，冷冻；

(4)上述细胞冻融液为蛋白初提液，取100μl蛋白液，与100μl的2×溴酚蓝上样Buf混合后，点样电泳，每个点样孔20μl，共10个孔；

(5)电泳：4℃80V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶后；改换130V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程115～120min；

(6)剥胶：将胶片剥落后，切取两个泳道用于考马斯亮蓝染色，即胶条用考马斯亮蓝染色浸泡，摇床上过夜染色，摇床转速130～150rpm；

(7)剩下的胶片进行活性染色：取一次性塑料染色盘，将胶片剥落入盘，然后用纯水清洗一次，弃去废液后，用矿物油封住胶面，用10ml一次性注射器从配好的染色液管中吸取下层的紫黑色染色液，每次吸取7.5ml，共吸取2次，注入染色盘矿物油下，与胶接触，使用量为刚刚没过胶面，吸取0.02g/ml的NaNO₂5ml注入染色盘底部，与染色液混合，轻轻摇晃振荡，暗处放置10～15min，将染色盘放置在凝胶读片灯下，观察到是否都已经染色均匀，凝胶取出后，置于纯水中，加入30％H₂O₂5～10μl放置在摇床上，轻轻摇动脱色2～5分钟，直至蓝紫色条带出现，立即取出拍照，割胶回收；

(8)透析法小量纯化得到烯醇化酶，将割下的胶条用纯水冲洗两次，然后放入透析袋中，透析袋中装入2ml的1X电泳缓冲液，放入水平电泳槽内，让电泳槽内的电泳液面高于小透析袋内的胶条，70V恒压电泳15min；

(9)将透析袋内的胶条弃去，袋内液体回收至3KD的4ml的超滤管内，5000rpm离心10分钟，超滤管截流下的液体为浓缩后的烯醇化酶纯化产物。

2.按权利要求1所述的一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法，其特征在于：所述的配制非变性聚丙烯酰凝胶，用800ml蒸馏水溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，用HCl调节pH值至7.4，加水至1升，高压蒸汽灭菌后使用。