CN103308361A - 一种染色体制片方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种染色体制片方法。该方法包括步骤：提供染色体样本；将玻片置于水中在2-8℃保持2小时以上进行玻片的预处理；固定染色体样本和滴片。通过本发明改进的染色体制片方法获得的染色体分散充分、无重叠、无丢失且条带清晰、形态规则，利于染色体核型的分析与疾病的诊断。

Description

一种染色体制片方法

技术领域

本发明属于遗传学技术领域。具体而言，本发明涉及染色体分析的技术领域；更具体来说，涉及一种染色体制片的方法。 

背景技术

染色体是细胞核中的遗传物质。血液中的淋巴细胞在一定条件下培养后，经收获、制片、胰酶消化后染色显带，可在显微镜下观察到染色体。人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为决定性别的性染色体。染色体上载有遗传信息的基因。染色体数目增加或减少，或染色体有缺失、易位等结构异常称染色体病，可出现相应的临床症状。染色体数目和结构正常与否，需根据淋巴细胞培养后制备的染色体片中染色体长短、形状、分散程度和染色等良好的情况下才能辨别出来。如果培养、接种以及吸附有淋巴细胞的玻片制备等方法不良就无法得到或得到较少的含有分散，无重叠，无丢失，条带清晰，形态规则的染色体的中期淋巴细胞，直接影响结果的准确性甚至无法诊断染色体病。 

在制备吸附有淋巴细胞的玻片过程中，将含有淋巴细胞的细胞悬液滴加到玻片上，对于获得分散充分、无重叠、无丢失以及条带清晰、形态规则的染色体有显著的影响。 

目前染色体制片的方法（简称为干式滴片法）：即是将干燥的玻片预先在-20℃冰箱内冷冻1小时，直接取出预冷的玻片，并将含有淋巴细胞的细胞悬液直接滴加到玻片上。该方法的缺点是对空气的湿度要求比较高，空气的湿度须超过60%；并且要求滴片的操作迅速，否则玻片不能快速在空气中形成水膜。滴到玻片上的细胞悬液因玻片表面张力大，液体分散所遇到的阻力大，得到的染色体分裂相往往因分散不充分而呈团状或叠加严重，无法或很少得到分散充分、条带清晰且形态规则的染色体，不能用于染色体计数及核型分析。 

因此，建立能使染色体充分分散的滴片方法，获得充分分散、条带清晰且形态规则的染色体，用于染色体计数及核型分析是目前亟待解决的问题。 

发明内容

根据本发明的一方面，提供一种改进的染色体制片方法（此处称为湿式滴片法），其包括步骤： 

1）提供染色体样本； 

2）将玻片置于水中在2-8℃保持2小时以上进行玻片的预处理； 

3）固定染色体样本； 

4）将染色体样本滴加到预处理的玻片上； 

5）获得染色体片。 

根据本发明的方法适用于来自人的染色体的制片。在一些实施方式中，染色体来自于人全血中的淋巴细胞、人成体干细胞或人的肿瘤细胞。在一些具体的实施方式中，染色体来自于人全血中的淋巴细胞。 

在一些实施方式中，在样本滴加到玻片上之前，对玻片进行预处理，即将玻片置于水中在2-8℃保持2小时以上。可以通过任何方便的方式将玻片保持在2-8℃中，例如冰箱的冷藏室、冷库、恒温箱中。在一些实施方式中，将玻片保持在2-8℃；优选4-5℃。 

在一些实施方式中，将玻片保持2小时以上。应当理解，本发明的方法，从理论上讲，对于时间并没有上限的要求。只要能够保持预处理的状态恒定，放置多久都是允许的。然而，鉴于实际应用中的各种情况，例如水的挥发、在冰箱中放置过久增加了被污染的可能、长时间放置玻片占据过多储存空间等。通常而言，优选2小时至4天；更优选2至24小时。本领域技术人员能够理解，可以根据实际工作需要来确定保持玻片的时间。例如为了工作方便，可以在下班前对玻片进行预处理，过夜放置（相当于8-16小时）以便于第二天早上的工作需求。 

在一些实施方式中，所用的水是不含染色体的水。本领域技术人员能够理解，玻片上不应含有影响染色体分析的污染物质。由于制得的片要用于染色体观察，如果存在其它染色体将得到不正确的结果。 因此，可以理解玻片不应被其它染色体污染。鉴于此，在本发明方法所用的水不能携带污染源，污染源主要指的是染色体。一般而言，本发明的方法所用的水包括但不限于：饮用水（也称为自来水）（满足《GB5749生活饮用水卫生标准》的水）、实验室用水（满足《GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法》的水）、纯化水（满足《中华人民共和国药典》的水）、去离子水、蒸馏水、注射用水（满足《中华人民共和国药典》的水）、或者和上述类型的水级别相当的水。 

本领域技术人员能够理解，步骤1）中提供染色体样本的方法可以采用本领域已知的方法进行。当所分析的染色体来自于全血的情况时，血液中淋巴细胞几乎都处于G₀或G₁期，一般不分裂。当加入植物凝集素时，细胞开始有丝分裂。再用秋水仙素就可以得到大量处于中期分裂相的细胞，以便于观察核型。在一些具体的实施方式中，可以采用张贵友，2003和许树成，2005中所描述的处理方法来处理血液样本。当所分析的染色体来自于癌细胞的情况时，可以采用麦肯尼尔，2003中所描述的样本处理方法。当所分析的染色体来自于体细胞的情况时，可以参考曲敏等人，2007中所描述的样本处理方法。 

本领域技术人员能够理解，固定、滴片、烤片、消化、染色的操作可以采用本领域已知的方法进行。例如张贵友，2003年中描述的方法。在一些实施方式中，采用的是吉姆萨染色（Giemsa）。其它方法也可以使用，技术人员了解，染色体经过特定染料染色后，可见其臂上显示不同深浅颜色的条纹，称为染色体带。通过染色体的分带技术，可以使染色体组型分析更为准确。主要的显带技术有G带（Giemsa染色）、Q显带（奎丫因显带）、R显带（逆转显带）、C显带（着丝粒显带）、前期显带（如遗传学家J.J.Ron-neys建立的高分辨显带法）。此外，银染法、荧光原位杂交技术、光谱技术等任何适合染色体计数或核型分析的方法都可以使用（李钰，2004）。由于染色体的充分分散，上述这些分析方法都将得益于本发明的方法所带来的益处。 

附图说明

图1：采用传统方法获得的染色体滴片，染色体聚集不分散，并且重叠严重，放大倍数×100，图中深色圆点是未分裂的细胞。 

图2：采用本发明方法获得的染色体滴片，染色体分散充分，没有聚集与重叠，并且染色体间距较大，放大倍数×100，图中深色圆点是未分裂的细胞。 

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。 

术语 

蒸馏水：采用蒸馏法制备的水。 

去离子水：是指显著除去呈离子形式杂质后的水，可以采用离子交换法、反渗透法、超滤法等非热处理制备而获得。 

材料 

洁净间内细胞培养室的环境湿度45±1%； 

玻片购自江苏世泰实验器材有限公司； 

巴士滴管购自江苏省姜堰市新健医疗器械有限公司； 

人全血由四平市中心医院检验科馈赠； 

植物血凝素购自上海疾控生物科技有限公司； 

秋水仙素购自北京索莱宝生物科技有限公司； 

胰蛋白酶购自美国sigma公司； 

吉姆萨粉剂购自北京索莱宝生物科技有限公司。 

实施例 

实施例1：血液淋巴细胞的刺激活化 

在T12.5培养瓶中，加入8ml含有20%小牛血清的RPMI1640培养基，并加入终浓度为5mg/ml的植物血凝素（PHA），再缓慢加入1ml肝素抗凝的全血，37℃，5%CO₂培养72小时；植物血凝素能够刺激 处于G₀期的血液淋巴细胞进入G₁期，即细胞由静息期进入细胞分裂周期，并且68—72小时刺激进入细胞分裂中期淋巴细胞的量最多。每24小时摇动培养瓶一次，使血液混匀，避免出现凝块。以防止细胞因聚集而死亡。培养至71小时，加入50μg/ml的秋水仙素100μl，继续培养1小时。加入秋水仙素的目的是使处于细胞分裂周期的淋巴细胞最大限度地停滞于于细胞分裂中期。 

实施例2：淋巴细胞的收集与固定 

将培养的血液淋巴细胞悬液置于10ml的离心管内，2000rpm，离心8分钟，弃上清，保留沉淀部分，并注意不要破坏白膜层。加入8ml低渗液，混匀，37℃水浴30分钟。加固定液1ml，充分混匀，2000rpm，离心8分钟，吸弃上清。加固定液8ml，充分混匀，2000rpm，离心8分钟，弃上清，重复2次。视细胞沉淀量加入固定液0.5—1ml，混匀。 

实施例3：玻片的处理（传统方法） 

1）视玻片的初始洁净程度，可以根据需要用自来水清洗玻片，然后蒸馏水冲洗若干次，如1-3次。 

2）空气中晾干。 

3）将干燥的玻片预先在-20℃冰箱内冷冻1小时，直接取出预冷的玻片用于滴片。 

实施例4：玻片的处理（本发明方法） 

1）视玻片的初始洁净程度，可以根据需要用自来水清洗玻片，然后蒸馏水冲洗若干次，如1-3次。 

2）可以无需晾干。 

3）将洗净的玻片放置在含有一定量蒸馏水的烧杯或其它容器内；置4℃冰箱冷藏2小时。 

实施例5：固定和淋巴细胞滴片 

新鲜配制甲醇和乙酸的固定液，二者体积比为3:1。首先，将装有细胞的离心管内加入0.075mol/L的氯化钾8ml，37℃水浴30分钟。再 加上述固定液1ml，充分混匀，2000rpm，离心8分钟，吸弃上清。加固定液8ml，充分混匀，2000rpm，离心8分钟，弃上清，重复2次。视细胞沉淀量加入固定液0.5—1ml，混匀。用巴士滴管（规格：3ml）将细胞固定悬液滴在实施例3或实施例4制备的玻片上。滴液距离为20至30厘米范围内，每张玻片滴3—4滴细胞悬液。80℃干烤15分钟，70℃干烤2.5小时。 

实施例6：胰酶消化 

每张玻片用0.25%胰蛋白酶消化3-5秒，PBS冲洗1次，这个过程要避免消化时间过长，否则易导致染色体条带减弱。 

实施例7：吉姆萨染色 

称取1克吉姆萨粉剂，先加少许甘油研磨，使粉剂充分溶解，再加入剩余的甘油，共计66ml，置于56℃烤箱3.5小时。倒入棕色瓶中，加入66ml甲醇，混匀后获得母液，置于阴凉处存放。 

按照1：9的体积比用PBS（pH7.4）稀释母液得到工作液。将制备好的淋巴细胞滴片放入吉姆萨工作液中染色5-7分钟。 

实施例8：核型分析 

将玻片放在低倍镜下（放大倍数为4倍）观察分散较好的染色体分裂相；再转到放大倍数较高的油镜下（放大倍数为100倍）对染色体分裂相进行拍照。采用上海北昂医疗技术有限公司的Beinosoft染色体分析软件对染色体核型进行分析，以寻找同源染色体配对方法，将杂乱无序分布的染色体进行配对排列分析。正常男性的染色体核型为46，XY；女性为46，XX。 

实验结果 

1）在实验室环境中，没有专门进行加湿处理。从图1可见，采用对照方法（干式滴片法），由于环境湿度未达到60%以上的要求，导致染色体整体聚集不分散，并且重叠严重。而从图2可见，采用本发明的方法对于环境湿度并不敏感，可获得分散充分，没有聚集重叠并 且间距较大的利于核型分析的染色体。 

2）从滴片操作过程中发现，采用对照方法（干式滴片法），滴片动作必须迅速，液滴在玻片上首先呈现液滴形，未能立即平铺于玻片上；之后需要大约3-5秒的时间才能平铺开。然而采用本发明的方法，对于滴片的动作没有过多的要求，液体滴加到玻片上后立即摊开。 

3）核型分析的结果：对照方法制得的片子在核型分析中，由于染色体之间存在重叠，难以进行染色体计数和配对。而本发明方法制得的片子不存在这种问题，核型分析结果正确。 

采用本发明的方法（湿式滴片法）替代以往的干式滴片法制备用于染色体技术或核型分析的染色体，克服了干式滴片法对空气的湿度要求高，以及染色体分裂相因分散不充分的不足。采用本发明的方法，在玻片上形成水化膜，改善了玻片的表面张力，容易获得分散充分、条带清晰且形态规则，适用于染色体计数及核型分析的染色体。 

参考文献 

张贵友.普通遗传学实验指导.实验15.清华大学出版社.2003年 

许树成.人微量全血培养与染色体标本制作技术研究.生物学杂志.2005年，第4期 

麦肯尼尔.癌的生物学基础.清华大学出版社，第四章.2003年 

曲敏等人.观察长穗偃麦草（Thinopyron elongatum）体细胞染色体制片的好方法.分子植物育种.2007年第3期 

李钰.医学遗传学实验指导.北京大学医学出版社.2004年。

Claims (8)

1.一种染色体制片方法，其包括步骤：

1）提供染色体样本；

2）将玻片置于水中在2-8℃保持2小时以上进行玻片的预处理；

3）固定染色体样本；

4）将染色体样本滴加到预处理的玻片上；

5）获得染色体的制片。

2.根据权利要求1所述的染色体制片方法，其中所述染色体来自人。

3.根据权利要求1所述的染色体制片方法，其中所述染色体来自于人全血中的淋巴细胞、人成体干细胞或人的肿瘤细胞。

4.根据权利要求3所述的染色体制片方法，其中所述染色体来自于人全血中的淋巴细胞。

5.根据权利要求1所述的染色体制片方法，其中步骤2）中将玻片置于4-5℃中。

6.根据权利要求1所述的染色体制片方法，其中步骤2）中将玻片保持2小时至4天。

7.根据权利要求6所述的染色体制片方法，其中步骤2）中将玻片保持2小时。

8.根据权利要求1所述的染色体制片方法，其中在步骤1）和步骤2）之间还包括清洗玻片的步骤。

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