CN105445248A - 一种快速测定蓝藻细胞凋亡率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，利用磷脂酰丝氨酸细胞凋亡染料对待测样品进行染色，将染色处理好的样品在室温下避光静置孵化，最后通过流式细胞仪中的绿色荧光通道在Ex/Em=405/520处对其进行测定，根据蓝藻自身特性与细胞凋亡的特征分析比较流式细胞仪的结果图，得出受测蓝藻样品中的蓝藻细胞凋亡细胞个数，以此计算出整个蓝藻藻样总体的细胞凋亡率。本发明的快速测定蓝藻细胞凋亡的方法具有步骤简单、操作方便、染料用量少以及测定结果精确度高等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及一种蓝藻细胞，具体来说是一种快速测定蓝藻细胞凋亡率的方法。
背景技术
随着全球淡水水华的持续大规模的爆发，蓝藻大规模的存在于水体中，蓝藻与水体环境中各类污染物共存的可能大大增加。细胞凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，所以说细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程；不是病理条件下自体损伤的现象，而是为了更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。环境中各类污染物对蓝藻的生长影响错综复杂，为了有效控制蓝藻水华，了解蓝藻细胞凋亡并快速对其进行检测显得尤为重要。
细胞凋亡和细胞坏死是两种完全不同的细胞死亡过程，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子学上的差别可以区分二者。目前对于细胞凋亡可以用的的检测方法有形态学检测法、磷脂酰丝氨酸外翻分析法(AnnexinV-PI法)、线粒体膜势能的检测等。
1、形态学检测法：形态学检测法有普通光镜观察法、活细胞悬滴荧光染色电镜检测法、凋亡小体电镜观察法。在普通光学显微镜下很难获得满意效果；荧光显微镜检测虽然简便易行，但其定量、定位并不可靠。而用透射电镜可以观察到凋亡不同时期的细胞结构变化，虽然可以对细胞凋亡提供最确切的证据，但是透射电镜仪器设备价格昂贵，且设备占地大，对检测人员技术要求高。
2、磷脂酰丝氨酸外翻分析法(AnnexinV-PI法)：磷脂酰丝氨酸(PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
但是本发明中所述的蓝藻细胞本身就具有自荧光现象，自身就会发出红色荧光，无法与PI染色后的死亡细胞发出红色荧光区分开来。故此AnnexinV-PI法不能很好地适用于蓝藻细胞凋亡的检测。
3、线粒体膜势能检测：线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
但是本发明中所述的蓝藻细胞不具有线粒体结构，因此线粒体膜势能检测不能适用于蓝藻细胞凋亡的检测。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种快速测定蓝藻细胞凋亡率的方法，所述的这种快速测定蓝藻细胞凋亡率的方法要解决现有技术中测定蓝藻细胞凋亡的方法成本高、操作技术要求高、样品耗用量大，而且由于蓝藻自身的特性导致的不太准确的技术问题。
本发明提供了一种快速测定蓝藻细胞凋亡率的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)利用磷脂酰丝氨酸细胞凋亡染料对待测样品进行染色，将染色处理好的样品在室温下避光静置孵化，然后通过流式细胞仪中的绿色荧光通道在Ex/Em＝405/520处对其进行测定；
2)根据蓝藻自身特性与细胞凋亡的特征分析比较流式细胞仪的结果图，得出受测蓝藻样品中的蓝藻细胞凋亡细胞个数，以此计算出整个蓝藻藻样总体的细胞凋亡率。
进一步的，所述的磷脂酰丝氨酸染料为适用于流式细胞仪绿色荧光通道。
进一步的，上述的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，包括如下步骤：
1)一个培养待测蓝藻藻液样品的步骤；
取若干个容量瓶分别加入经过培养基稀释后的蓝藻藻液，通过控制其吸光度，从而使得实验组和对照组的藻细胞个数保持一致；
在每组藻样中依次加入不同浓度的受试物以此来诱导细胞凋亡，放入光照培养箱培养20～30h。
上述样品中，设置未加药品的蓝藻细胞液作为空白对照，且每组样品设置2～4个平行样；
所述的培养基为高压灭菌的BG-11；所述的受试物为除草剂草甘膦；
2)一个样品预处理的步骤；
依次取一定量的上述步骤(1)中培养好的藻液于1.5mL的离心管中，确保每管样品中含有1～5×105个蓝藻细胞，在4500r/min的转速下离心2～5min后，再弃去上层的藻液培养基；
在剩下的每管藻细胞沉淀样品中分别加入200μL的细胞分析缓冲液，重新制成藻细胞悬液；
然后每管加入2μL的磷脂酰丝氨酸染料，在室温条件下进行孵化，然后避光保存，静置30～60min；
在用流式细胞仪进行分析前，加入300μL细胞分析缓冲液以增加样品体积；
3)使用流式细胞仪分析受试样品的细胞凋亡状况；
将步骤(2)中经过染色、孵化预处理后的蓝藻藻液样品，用流式细胞仪进行测定，从流式细胞仪的结果图中分析比较，得出表示蓝藻细胞凋亡的区域，
测定条件：Ex/Em＝405/520，横纵坐标轴分别选择RedFluorescence(RED-HLog)和GreenFluorescence(GRN-HLog)；
4)蓝藻细胞凋亡率计算
根据步骤(3)中流式细胞仪分析得出的图谱经过分析比较得出图中显示的早期凋亡细胞个数按下列公式计算蓝藻细胞早期凋亡率：
蓝藻细胞早期凋亡率％＝CX/C0×100；
式中：
CX为第x个藻液样品中的早期凋亡细胞个数；
C0为使用流式细胞仪时设定的每次分析时所收集的细胞个数。
进一步的，上述蓝藻细胞早期凋亡率计算公式中，C0为5000,具体可以根据各自实验中的设定作出相应调整。
进一步的，所述流式细胞仪的型号为GuavaeasyCyte5,默克化工技术上海有限公司生产；所用的ApopxinTMViolet500磷脂酰丝氨酸染料为美国加州ATTBioquest艾美捷科技有限公司生产的磷脂酰丝氨酸细胞凋亡试剂盒中的组分A,货号为22836。
本发明利用磷酯酰丝氨酸(PS)染料对蓝藻藻样细胞进行染色，根据蓝藻细胞自身特性和发生细胞凋亡的特征，通过流式细胞仪直接定量得测定出进样细胞中发生凋亡的蓝藻细胞个数，从而对其细胞凋亡率快速测定。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，与形态学检测法中的普通光学显微镜检测法、荧光显微镜检测法相比，其定量可靠、且适合大批量的样品测定。而与透射电镜检测法相比，其操作简便，检测成本低。
本发明的方法，样品预处理简单易行，上机分析检测操作方便、耗用样品极少，很好地利用蓝藻自身荧光效应与发生凋亡的特征荧光，定量得分析蓝藻细胞凋亡率。因此，本发明具有步骤简单、操作方便、分析速度快、样品消耗少、易于自动化以及测定结果精确度高等优点。
附图说明
图1是不同浓度除草剂草甘膦条件下蓝藻细胞凋亡流式细胞仪分析结果图；具体其中编号图A～F分别表示了0、0.2、1、2、5、10mg/L草甘膦药剂作用下蓝藻细胞凋亡流式细胞仪分析结果图；而每张图的左上区域表示正常生长的蓝藻细胞，右下区域表示发生凋亡的蓝藻细胞。
图2是蓝藻细胞凋亡率与施用除草剂草甘膦浓度的关系图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明所用的灭菌的BG-11培养基，购自于中科院水生生物研究所淡水藻种库。
本发明所用的流式细胞仪的型号为GuavaeasyCyte5,默克化工技术上海有限公司生产。
本发明所用的ApopxinTMViolet500磷脂酰丝氨酸染料为美国加州ATTBioquest艾美捷科技有限公司生产的磷脂酰丝氨酸细胞凋亡试剂盒中的组分A,货号为22836。
实施例1
一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，具体包括如下步骤：
(1)、藻液样品的培养
取18个100mL容量瓶分别编号1～18，均加入经过培养基稀释后的蓝藻藻液，通过控制其吸光度，从而使得实验组和对照组的藻细胞个数都尽量保持一致；
三个藻样为一组，依次加入草甘膦药剂，使每组藻样中草甘膦浓度依次为0、0.2、1、2、5、10mg/L，以此来诱导蓝藻细胞发生凋亡，随后将其全部放入光照培养箱培养24h。
所述的培养基为高压灭菌的BG-11。
(2)、样品的预处理
依次取一定量的上述步骤(1)中培养好的藻液于1.5mL的离心管中，注意确保每管样品中含有1～5×105个蓝藻细胞，在4500r/min的转速下离心3min后，再弃去上层的藻液培养基；
在剩下的每管藻细胞沉淀样品中分别加入200μL的细胞分析缓冲液，重新制成藻细胞悬液。
然后每管加入2μL的ApopxinTMViolet500磷脂酰丝氨酸染料，在室温条件下进行孵化，即将加好燃料的样品避光保存，静置30～60min。
最后在用流式细胞仪进行分析前，加入300μL细胞分析缓冲液以增加样品体积。
(3)、使用流式细胞仪分析受试样品的细胞凋亡状况
将步骤(2)中经过染色、孵化等一系列预处理后的蓝藻藻液样品，用流式细胞仪进行测定。分析流式细胞仪的结果图如图1，利用蓝藻细胞自身在405nm波长激发下产生红色荧光，在发生细胞凋亡时磷脂酰丝氨酸外翻，被ApopxinTMViolet500染料染色产生绿色荧光的特点，通过流式细胞仪定量的测定出凋亡细胞的个数，进而直接可以计算出蓝藻细胞的细胞凋亡率。
具体对其进行分析比较可知，生长正常的蓝藻细胞表现为红色荧光强、绿色荧光弱，即为流式细胞仪结果图的左上区域；发生凋亡的蓝藻细胞，由于磷酯酰丝氨酸外翻与染料结合，表现为红色荧光较弱、绿色荧光较强，即为流式细胞仪结果图的右下区域；因此在流式细胞仪结果图如图1中每张流式细胞仪结果图的右下区域为表示蓝藻细胞凋亡的区域。
测定条件：流式细胞仪参数设定为，单次采集细胞总个数为5000；Ex/Em＝405/520，式中Ex为激发波长，Em为发射波长。
横纵坐标轴分别选择RedFluorescence(RED-HLog)和GreenFluorescence(GRN-HLog)。
(4)、蓝藻细胞凋亡率计算
根据步骤(3)中流式细胞仪分析得出的图谱经过分析比较，因为本发明中所述的蓝藻带有自荧光现象，自身会发红色荧光，因此正常的活细胞会检测出很强的红色荧光。而出现早期凋亡的蓝藻细胞会出现磷脂酰丝氨酸外翻的现象，被ApopxinTMViolet500染料染色后会在405nm波长处激发出绿色荧光。因此我们分析得出图中右下区域显示的为早期凋亡细胞个数，并按下列公式计算蓝藻细胞早期凋亡率：
蓝藻细胞早期凋亡率％＝CX/C0×100；
式中：
CX为第x个藻液样品中的早期凋亡细胞个数；
C0为使用流式细胞仪时设定的每次分析时所收集的细胞个数。
上述蓝藻细胞凋亡率计算公式中，C0为5000，具体可以根据各自实验中的设定作出相应调整。
从图1的流式细胞仪结果图中根据上述蓝藻细胞凋亡率的计算公式，可以计算得出藻液样品中草甘膦浓度为0、0.2、1、2、5、10(mg/L)时，分别对应的细胞凋亡率为3.78、4.42、4.82、5.06、6.50、7.70(％)。可以看出随着作用于蓝藻样品中草甘膦浓度的增大，其细胞凋亡率也明显地出现了递增的趋势，如图2所示。
综上所述，本发明的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，利用蓝藻细胞自身的红色荧光及发生细胞凋亡时磷脂酰丝氨酸被染色产生绿色荧光的特点，通过流式细胞仪定量的测定出凋亡细胞的个数，进而直接可以计算出蓝藻细胞的细胞凋亡率。并且本发明的测定方法结合蓝藻自身特点，比传统的形态学检测法和DNA片段分析法更加方便快捷，适用于大批量的样品测定且其成本远低于，更适合于普遍使用。
上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种快速测定蓝藻细胞凋亡率的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)利用磷脂酰丝氨酸细胞凋亡染料对待测样品进行染色，将染色处理好的样品在室温下避光静置孵化，然后通过流式细胞仪中的绿色荧光通道在Ex/Em＝405/520处对其进行测定；
2)根据蓝藻自身特性与细胞凋亡的特征分析比较流式细胞仪的结果图，得出受测蓝藻样品中的蓝藻细胞凋亡细胞个数，以此计算出整个蓝藻藻样总体的细胞凋亡率。
2.如权利要求1所述的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，其特征在于：所述的磷脂酰丝氨酸染料为适用于流式细胞仪绿色荧光通道。
3.如权利要求1所述的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)一个培养待测蓝藻藻液样品的步骤；
取若干个容量瓶分别加入经过培养基稀释后的蓝藻藻液，通过控制其吸光度，从而使得实验组和对照组的藻细胞个数保持一致；
在每组藻样中依次加入不同浓度的受试物以此来诱导细胞凋亡，放入光照培养箱培养20～30h。
上述样品中，设置未加药品的蓝藻细胞液作为空白对照，且每组样品设置2～4个平行样；
所述的培养基为高压灭菌的BG-11；所述的受试物为除草剂草甘膦；
2)一个样品预处理的步骤；
依次取一定量的上述步骤(1)中培养好的藻液于1.5mL的离心管中，确保每管样品中含有1～5×105个蓝藻细胞，在4500r/min的转速下离心2～5min后，再弃去上层的藻液培养基；
在剩下的每管藻细胞沉淀样品中分别加入200μL的细胞分析缓冲液，重新制成藻细胞悬液；
然后每管加入2μL的磷脂酰丝氨酸染料，在室温条件下进行孵化，然后避光保存，静置30～60min；
在用流式细胞仪进行分析前，加入300μL细胞分析缓冲液以增加样品体积；
3)使用流式细胞仪分析受试样品的细胞凋亡状况；
将步骤(2)中经过染色、孵化预处理后的蓝藻藻液样品，用流式细胞仪进行测定，从流式细胞仪的结果图中分析比较，得出表示蓝藻细胞凋亡的区域，
测定条件：Ex/Em＝405/520，
横纵坐标轴分别选择RedFluorescence和GreenFluorescence；
4)蓝藻细胞凋亡率计算
根据步骤(3)中流式细胞仪分析得出的图谱经过分析比较得出图中显示的早期凋亡细胞个数按下列公式计算蓝藻细胞早期凋亡率：
蓝藻细胞早期凋亡率％＝CX/C0×100；
式中：
CX为第x个藻液样品中的早期凋亡细胞个数；
C0为使用流式细胞仪时设定的每次分析时所收集的细胞个数。
4.如权利要求3所述的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，其特征在于：上述蓝藻细胞早期凋亡率计算公式中，C0为5000。
5.如权利要求3所述的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，其特征在于：所述流式细胞仪的型号为GuavaeasyCyte5,默克化工技术上海有限公司生产；所用的ApopxinTMViolet500磷脂酰丝氨酸染料为美国加州ATTBioquest艾美捷科技有限公司生产的磷脂酰丝氨酸细胞凋亡试剂盒中的组分A,货号为22836。
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