CN101762684A - 一种体外检测精子存活率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外检测精子存活率的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：(a)将精子悬浮液和膜通透性的核染料混合得到待测样品1；所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、SYTO或SYBR；(b)用荧光酶标仪检测待测样品1，得到第1次样品检测荧光强度；(c)将待测样品1和碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合得到待测样品2；(d)用荧光酶标仪检测待测样品2，得到第2次样品检测荧光强度；和(e)得到

Description

一种体外检测精子存活率的方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种体外检测精子存活量的方法，换言之是一种检测精子质膜损伤情况的新方法。

背景技术

目前，评价精子质膜完整性的主要方法有常规染色法、低渗膨胀试验(hypoosmotic swelling test，HOST)和荧光分子探针染色法。常规染色法至今还是国内临床男科实验室的常用方法，主要有伊红染色、伊红-苯胺黑(eosin-nigrosin stain)、台盼蓝(typan blue stain)染色以及伊红-苯胺黑-吉姆萨染色法等。这些方法操作要复杂，而且高估了死精子的比例，更重要的是不同的实验室之间，检测结果差异较大。

低渗膨胀试验由Jeyendran等于1984年报道，当精子处于低渗溶液中时，质膜外的水分子进入精子以达到细胞内外的渗透压平衡，这时精子尾部发生膨胀弯曲，说明精子质膜是完整的。这种方法廉价简单，但是准确性低，主观性强，只能用于粗略评价精子质膜完整性。

近年来利用能区分死活精子及非细胞成分的荧光探针染色方法，不仅具有简便、快速且准确的特点，而且一些荧光探针在一定时间内对细胞没有损伤作用，对精子的活率没有明显影响，在同一个视野中，既能观察精子的活率，又能获得存活率的结果，因此结果更一致。

目前市售的精子存活率荧光染色试剂盒只有Invitrogen公司推出的LIVE/DEAD Sperm Viability Kit，该试剂盒主要包括两个荧光探针SYBR-14和碘化丙锭(propidium iodide，PI)。PI是常规的死细胞特异性荧光探针，而SYBR-14具有膜通透性，因此死、活精子均着色。在荧光显微镜下，着绿色荧光的是活精子，红色荧光的是死精子。计算得到的精子存活率(viability)就反映了质膜完整的精子所占的比例。由于该试剂盒价格昂贵，因此荧光染色法没有在国内临床男科实验室普及。

通过荧光显微镜下人工计数红、绿精子比例的方法评价质膜完整性，受到主观因素的影响，且受视野所限，只能检测每份样品中极少量精子，死精子凝集等情况能造成死活精子分布不均匀，严重影响结果的可靠程度。有条件的实验室使用流式细胞仪可以较为可靠地进行检测，但是流式细胞仪价格昂贵难以普及，仅限于少数实验室使用，无法成为医院里的常规检查项目；且操作复杂技术要求较高，实际应用的效率较低。

因此本领域迫切需要提供一种简便、价廉、而有效的体外检测精子存活量，即评价精子质膜完整性的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种体外检测精子存活量的方法。

在本发明中，提供了一种体外检测精子存活率的方法，所述的方法包括步骤：

(a)将精子悬浮液和膜通透性的核染料混合得到待测样品1；所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、SYTO或SYBR；

(b)用荧光酶标仪检测待测样品1，得到第1次样品检测荧光强度；

(c)将待测样品1和碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合得到待测样品2；

(d)用荧光酶标仪检测待测样品2，得到第2次样品检测荧光强度；和

存活系数越大，精子存活量越大。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(a)将精子悬浮液和精子培养液分别同膜通透性的核染料混合得到待测样品1和对照样品1；所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、SYTO或SYBR；所述的精子培养液选自：HTF(Human Tubal Fluid人输卵管液)、BWW培养液、或M16培养液；

(b)用荧光酶标仪分别检测待测样品1和对照样品1，得到第1次样品检测荧光强度和第1次对照检测荧光强度；

(c)将待测样品1和对照样品1分别同碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合得到待测样品2和对照样品2；

(d)用荧光酶标仪分别检测待测样品2和对照样品2，得到第2次样品检测荧光强度和第2次对照检测荧光强度；和存活系数越大，精子存活量越大。

在另一优选例中，精子悬浮液和所述的膜通透性的核染料的混合大于等于20分钟后用荧光酶标仪检测待测样品1，得到第1次样品检测荧光强度。

在另一优选例中，所述的精子悬浮液是将精液和精子培养液混合。

在另一优选例中，所述的待测样品1、对照样品1、待测样品2、和对照样品2都在酶标板上。

在另一优选例中，所述的荧光酶标仪检测波长为470nm或516nm。

在另一优选例中，所述的荧光酶标仪检测时，激发光波长为485nm，吸收波长为515nm。

在另一优选例中，所述的精子悬浮液中的精子来自人、鼠、猪、牛、羊、狐等动物。

据此，本发明提供了一种简便、价廉、而有效的体外检测精子存活量，即评价精子质膜完整性的方法。

附图说明

图1显示了Transgreen/PI复染法荧光显微镜下的示意图。

图2显示了Transgreen进入精子过程中荧光强度变化的曲线。

图3显示了使用Transgreen/PI和荧光酶标仪测定存活系数，两次重复测量值之间的散点图。

图4显示了使用Transgreen/PI在荧光显微镜下计数法测定存活率，两次重复测量值之间的散点图。

图5显示了同一份精子悬浮液稀释为5种不同密度时的存活系数。

图6显示了存活系数和存活率的相关分析结果。

具体实施方式

发明人经过充分的研究和深入地思考，建立了将荧光染料结合荧光酶标仪体外检测精子存活量的方法，该方法充分利用荧光酶标仪不受主观因素影响而且没有视野所限的优势；另外由于特定波长下激发的荧光强度的强弱可以标定DNA的量，因此通过荧光染料与DNA结合，可以间接定量细胞数，通过荧光强度的对比获得一个新的指标，即存活系数。由于存活系数是一个比值，没有单位，不受绝对荧光强度的影响，因此不论精子数量多少，荧光强度多高，只要质膜完整的精子比例恒定，存活系数也是一个定值。本发明的方法无需事先处理精子，无需调整密度，可以直接加样测量，十分方便。

具体地，发明人发现当精子悬浮液中只有膜通透性的核染料染色时，膜通透性的核染料的荧光强度间接代表了精子悬浮液中所有细胞的DNA总量；当用膜通透性的核染料/PI染色时，根据PI只与死细胞DNA结合且与DNA结合能力强于膜通透性的核染料的特点，膜通透性的核染料只与活细胞的DNA结合，膜通透性的核染料的荧光强度间接代表精子悬浮液中活细胞DNA的总量，两种染色方法分别测得的荧光强度的比值就可以代表精子悬浮液中活细胞在所有细胞中的比例，即存活系数，代表活精子(质膜完整的精子)的发光强度与所有精子发光强度的比值。

更佳地，所述的检测方法将精子悬浮液和精子培养液分别同染料Transgreen混合得到待测样品1和对照样品1；然后用荧光酶标仪分别检测待测样品1和对照样品1，得到第1次样品检测荧光强度和第1次对照检测荧光强度；再将待测样品1和对照样品1分别同PI混合得到待测样品2和对照样品2；然后用荧光酶标仪分别检测待测样品2和对照样品2，得到第2次样品检测荧光强度和第2次对照检测荧光强度；从而得到存活系数，存活系数越大，精子存活量越大。所述的存活系数以下式计算：

如本文所用，“精子悬浮液”或“精子悬液”可以互换使用，都是指将精液和精子培养液混合得到的溶液。较佳地，是等精液完全液化检测，即25℃放置60分钟。精液是附睾液、前列腺、精囊和尿道球腺的分泌物混合物，人类精液具有凝固并在短时间内液化的特点。本发明中还可以选择一般的缓冲溶液如PBS或生理盐水和精液混合得到精子悬浮液。

如本文所用，“精子培养液”是指在体外进行精液处理过程中，保证精子在人工授精时能迅速上游到输卵管与卵子受精，在体外受精时能穿透卵子的卵丘和透明带，顺利进入卵质中，与卵子完成受精过程的人工配制的培养液。精子脱离了体内环境，处于人工配制的培养液中。除了培养液的pH、渗透压要对精子的存活有利外，更需要为精子提供生存和活动的能量。本发明可以使用本领域熟知的精子培养液，例如但不限于，HTF(Human Tubal Fluid)、BWW、M16培养液等。

本发明提供的存活系数的时间(观察者内)可靠性明显优于荧光显微镜计数法，且不受精子密度的影响，能够直接对原始精液标本进行测量。与荧光显微镜目测计数法相比，流式细胞仪可以克服因检测细胞数少而带来的误差，且具有计数自动化和计数时间短的特点，但流式细胞仪对样品中的细胞密度以及样品的缓冲体系有一定的要求，因此原始的精液需经过洗涤和密度调整的预处理。由于精子是一类特殊的形状不规则的细胞，有些流式细胞仪会发生因不能识别而漏检的现象；再加上流式细胞仪价格昂贵，使用成本也高，操作人员还需经过专业培训。因此与流式细胞仪相比，荧光酶标仪价格不高容易在医院普及，十分易于操作，不需要特殊的辅助设备。因此结合荧光酶标仪和荧光染料来评价精子质膜完整性，具有十分广阔的应用前景。

本发明提供的检测方法，可以用于体检，也可以用于牲畜或宠物的配种。

精子存活率是对影响人类精液质量的众多因素进行毒理学评价的一个重要指标。包括遗传因素、环境因素、个人行为方式以及一些其它不明的因素。环境因素是最重要的一组影响因素。对生殖系统有影响的环境因素可分为物理因素和化学因素两类。物理因素主要包括热、离子辐射、电磁场和微波、嘈声和全身震动等。化学因素主要包括杀虫剂、重金属、麻醉气体、有机溶剂、环境类激素等。个人行为方式包括吸烟、酗酒等不良生活方式。因此本发明提供的检测方法可以了解环境因素和/或个人行为模式对精子存活率的影响，从而为相关部门提供科学的数据。

动物精子存活率是对动物精液品质的定量评定的一个重要指标，也是

动物精液品质评定的一项重要的常规指标。它与精子活力共同说明精子生活力，且与精子活力呈高度正相关.二者又与受胎率显著相关。

利用体外方法准确评价精子的受精能力和功能状态是体外受精和人工输精技术成功的关键，还可以减少每次输精的精子量，达到最优利用优良遗传资源的目的。随着家畜动物精子体外保存技术的进步，必然伴随着体外评价精子功能状态方法的进步。

随着科学技术的发展，动物繁殖学也以惊人的速度进入高科技生物工程时代随着超数排卵、屠宰场采卵和胚胎移植技术的发展，体外受精技术已由实验阶段进入实用阶段，这就对动物离体精液品质的要求也相应提高。

精子存活率是珍稀野生动物生育能力的评价指标。例如目前，狐人工授精技术作为养狐业的一项重大技术，在引进芬兰蓝狐改良我国现有蓝狐品质的过程中，已愈来愈被广大养狐者所重视。如何正确使用这一技术提高狐品种改良的效果，是关系到我国养孤业发展的当务之急。影响人工授精母狐受孕率的因素是复杂而多方面的，其中公狐的精液品质为重要因素之一。在实际工作中，精子在体外一定环境下的生命力与受精能力呈正相关，即存活的指数越高受精能力越强，这种精子生命力的差异就具体公狐而言，若是显著而又相对稳定的，则可为狐的人工授精工作提供重要的参考。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、用新指标存活系数代替传统的存活率来评价精子质膜完整性，该指标适合描述用荧光酶标仪间接检测出的质膜完整精子百分比。用荧光酶标仪测量精子存活系数的可靠性很高。而常用的荧光显微镜下计数法主观因素强，样品在载玻片上分布不均匀，测量的精子数量十分有限，因此误差较大。而荧光酶标仪以样品所有精子DNA的荧光强度为基础进行测量，测量的精子数量巨大，对样品信息的利用更多，很好地避免了随机误差。且基本上克服了研究者主观因素的影响，提高了检测效率；

2、存活系数是一个比值，没有单位，不受绝对荧光强度的影响。不论精子数量多少，荧光强度多高，只要质膜完整的精子比例恒定，存活系数也是一个定值。因此，使用荧光酶标仪无需事先处理精子，无需调整密度，可以直接加样测量，十分方便；

3、经过相关性分析，荧光酶标仪和荧光显微镜下计数法的结果相关性较高，说明新指标存活系数能够很好地反映存活率，用存活系数可以有效地评价精子质膜的完整性。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

以下实施例中所使用的材料和统计方法如下：

研究对象

研究对象来自2005.1-2007.5在上海市计划生育科学研究所附属生殖医院不孕不育门诊进行精液检查的男性。

主要试剂

※Transgreen：淦峰生物技术发展有限公司

※propidium iodide(PI)：Sigma公司

※Human Tubal Fluid(HTF)：Life Global公司

主要仪器设备

※荧光显微镜：Nikon eclipse 50i

※Video Test Cytogenetics自动精子图像分析系统  安莱公司

※Macro精子计数板

※荧光酶标仪：infinite M200 Tecan

※电热恒温水箱DK-80上海一恒科技有限公司

※二氧化碳培养箱：Heraeus

※离心机：Anke TGL-16B上海安亭科学仪器厂

※培养管：FALCON 352001

※荧光酶标板：96孔，Greiner

统计学方法

使用SAS 9.0，对实验数据进行spearman相关分析。

实施例1

荧光显微镜下存活率计数法

根据WHO标准(参自：赵洪鑫，袁瑶，华敏敏，张慧琴，施惠娟用Transgreen/PI荧光复染法检测精子的存活率中国男科学杂志22(4)：1-4)留取精液，37℃水浴中放置至完全液化，取50ul至Eppendorf管内，各加1ul A液(成分为Transgreen)和B液(成分为PI)混合，室温静置20min后从管内取10ul于Macro精子计数板，荧光显微镜下观察，统计绿色精子和红色精子数量，共计数至少200个精子，精子存活率＝绿色精子数/(绿色精子数+红色精子数)×100％。

结果见图1，Transgreen/PI复染法荧光显微镜下示意图。结果表明，荧光显微镜下，质膜完整的精子激发绿色荧光，质膜损伤的精子激发红色荧光。

实施例2

用荧光酶标仪检测Transgreen进入精子并与DNA结合的时间曲线

按照WHO标准留取精液，37℃水浴中放置至完全液化，并做上游处理，优选精子后取精子悬液50ul加样于96孔酶标板，加入1ul A液(成分为Transgreen)，用酶标仪每隔1min一次连续检测样品荧光强度，设置激发光波长为485nm，吸收波长515nm，并用50ul HTF加入1ul A液作为空白对照。

结果见图2，Transgreen穿膜进入精子过程中荧光强度的变化曲线。

活精子染料有膜通透性，但是其进入质膜需要一定的时间，需要在其完全进入所有精子后才能测得准确的存活系数。因此我们连续测量加入Transgreen后绿色荧光强度的变化，结果表明，Transgreen进入精子并与染色体结合即可检测到绿色荧光，约20min到达平衡。

实施例3

用荧光酶标仪检测精子存活系数

按照实施例1的方法准备精液一份，取50ul加样于96孔酶标板，加入1ul A液(成分为Transgreen)，37℃放置30min后检测荧光强度，设置激发光波长为485nm，吸收波长515nm。另一孔用50ul HTF加入1ul A液作为空白对照。检测之后两个孔均加入1ul B液(成分为PI)。10min后同样的参数条件下再次检测荧光强度。

定义精子存活系数(Viability Coefficient)＝(第2次检测荧光强度-第2次检测对照孔荧光强度)/(第1次检测荧光强度-第1次检测对照孔荧光强度)。

实施例4

评价荧光酶标仪和人工计数两种方法时间(观察者内)的可靠性

用Transgreen/PI和荧光酶标仪对同一份精子标本间隔5分钟测量2次存活系数，共计检测10份标本。比较T₀时刻测量值和T_5min两组测量值的相关性。用同样的方法评价荧光显微镜下人工计数法。

用荧光酶标仪检测Transgreen单染和Transgreen/PI复合染色后470nm处(SYBR-14为516nm处)，每间隔5min重复检测同一份精液标本存活系数，共检测10份，结果见图3，两次重复测量结果相关系数R＝0.971，p＜0.001。

用Transgreen/PI结合荧光显微镜下计数法间隔5min重复两次检测同一份精液标本存活率，共检测10份，结果见图4，两次重复测量结果相关系数R＝0.869，p＜0.01。

本发明采用了较为常用的统计方法来比较两种方法的时间(观察者内)可靠性(重复性)，即用同种方法在不同时间(t1，t2)对同一组对象进行测量，然后计算两组观察结果的相关系数。相关系数＝1说明测量是完美可靠的；相反，相关系数＝0测量是完全不可靠的。

结果表明，荧光酶标仪两时点测量存活系数的相关性高达0.971，而荧光显微镜下计数精子两时点存活率相关性为0.869。提示用荧光酶标仪测量精子存活系数的精确性很高。这主要是因为人工计数法主观因素强，样品在载玻片上分布不均匀，且一次测量的精子数量十分有限，因此误差较大。而荧光酶标仪以一定体积内所有精子DNA的荧光强度为基础进行测量，理论上只要每个检测孔内的细胞数量恒定，就可以避免随机误差。该方法能避免检测人员主观因素以及检测细胞数量大而导致检测时间长的影响，提高了检测的准确性和检测效率。

实施例5

用荧光酶标仪检测不同密度的精子

取一份精液按照WHO标准洗涤并离心浓缩处理，用HTF稀释混匀并调整为不同密度五组：10×10⁶/ml、20×10⁶/ml、50×10⁶/ml、100×10⁶/ml、200×10⁶/ml，各取50ul加入96孔酶标板的5个孔内。另一个孔加入50ulHTF作空白对照。用荧光酶标仪分别测量其存活系数。同样的方法检测10份精液，进行统计分析。

同一份精液稀释为5种不同密度，用荧光酶标仪结合Transgreen/PI检测存活系数。共检测10份精液，经区组设计方差分析各密度组差异无统计学意义(P＞0.05)(见图5)。

同一份精子稀释成不同密度后，其存活率理论上应该不变。结果表明，各密度组差异无统计学意义。由于存活系数是一个比值，没有单位，不受绝对荧光强度的影响。因此，不论精子数量多少，荧光强度多高，只要质膜完整的精子比例恒定，存活系数也是一个定值。因此，使用荧光酶标仪无需事先处理精子，无需调整密度，可以直接加样测量，十分方便。

实施例6

荧光酶标仪和荧光显微镜下计数两种方法检测结果的相关性

取10份临床精液标本，用Transgreen/PI结合荧光酶标仪测量其存活系数，同时用荧光显微镜下计数法检测存活率，将存活系数和存活率进行相关性分析。

对同一批精子标本，用Transgreen/PI结合荧光酶标仪检测存活系数，同时结合荧光显微镜下计数法检测存活率，两种方法相关性R＝0.897，P＜0.001(见图6)。

结果表明，新指标存活系数能够很好地反映存活率，用存活系数可以有效地测量精子质膜的完整性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种体外检测精子存活率的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)将精子悬浮液和膜通透性的核染料混合得到待测样品1；所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、SYTO或SYBR；

(b)用荧光酶标仪检测待测样品1，得到第1次样品检测荧光强度；

(c)将待测样品1和碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合得到待测样品2；

(d)用荧光酶标仪检测待测样品2，得到第2次样品检测荧光强度；和

(e)

存活系数越大，精子存活量越大。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)将精子悬浮液和精子培养液分别同膜通透性的核染料混合得到待测样品1和对照样品1；所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、SYTO或SYBR；所述的精子培养液选自：HTF(Human Tubal Fluid人输卵管液)、BWW培养液、或M16培养液；

(b)用荧光酶标仪分别检测待测样品1和对照样品1，得到第1次样品检测荧光强度和第1次对照检测荧光强度；

(c)将待测样品1和对照样品1分别同碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合得到待测样品2和对照样品2；

(d)用荧光酶标仪分别检测待测样品2和对照样品2，得到第2次样品检测荧光强度和第2次对照检测荧光强度；和

(e)

存活系数越大，精子存活量越大。

3.如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于，精子悬浮液和所述的膜通透性的核染料的混合大于等于20分钟后用荧光酶标仪检测待测样品1，得到第1次样品检测荧光强度。

4.如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于，所述的精子悬浮液是将精液和精子培养液混合。

5.如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于，所述的待测样品1、对照样品1、待测样品2、和对照样品2都在酶标板上。

6.如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于，所述的荧光酶标仪检测波长为470nm或516nm。

7.如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于，所述的荧光酶标仪检测时，激发光波长为485nm，吸收波长为515nm。

8.如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于，所述的精子悬浮液中的精子来自人、鼠、猪、牛、羊、狐等动物。

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