CN113687071A - 鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法 - Google Patents

鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113687071A
CN113687071A CN202111062380.8A CN202111062380A CN113687071A CN 113687071 A CN113687071 A CN 113687071A CN 202111062380 A CN202111062380 A CN 202111062380A CN 113687071 A CN113687071 A CN 113687071A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
sample
salmonella typhimurium
mouse igg
igg antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111062380.8A
Other languages
English (en)
Inventor
谭有将
林丽
漆彦斌
赵力超
梁德智
文媛怡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan Mosai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Foshan Mosai Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan Mosai Biotechnology Co ltd filed Critical Foshan Mosai Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111062380.8A priority Critical patent/CN113687071A/zh
Publication of CN113687071A publication Critical patent/CN113687071A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法，包括：样品垫、检测膜、吸水垫及底板；所述检测膜上分别设有包被鼠伤寒沙门氏菌抗体的检测线以及包被有羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的质控线；所述检测膜设置在所述底板上，所述样品垫与所述检测膜靠近所述检测线一端连接，所述吸水垫与所述检测膜靠近所述质控线一端连接。本发明提供的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法能有效区分死活菌，消除死菌带来的假阳性干扰，还能有效缩短检测时间，降低成本，实现现场快速检测，提高检测精度。

Description

鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，特别是涉及一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法。
背景技术
沙门氏菌是常见的食源性致病菌，是引发食源性疾病的主要致病菌之一，常在蛋及其制品、肉类、乳制品等食品中检出。鼠伤寒沙门氏菌在沙门氏菌感染中占主要地位，是引起小儿结肠炎的罪魁祸首。
传统的微生物检测方法通常是用国标检测方法，是检验的“金标准”，但费时费力、成本高、专业性强，无法实现及时有效的检测。而分子生物学，如基于DNA聚合酶链式反应(PCR)检测方法，具有准确性高、较为快速的特点，但是依赖于PCR仪和昂贵的耗材，并且需要专业的操作技术避免假阳性、假阴性和气溶胶污染，难以满足沙门氏菌检测快速准确和操作简便的要求。而免疫检测技术，尽管ELISA因其高灵敏度和准确性被誉为免疫检测的金标准，但其实施对检测仪器、环境条件和人员的操作要求高，并不适用于突发食品安全和公共卫生事件即时有效检测。
发明内容
基于此，有必要针对鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测中常见的检测方法耗时长，检测精度低，容易出现漏检情况，或检测精度高，但成本高，仪器操作复杂，不适合现场快速检测的问题，提供一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法，从而能有效缩短检测时间，降低成本，实现现场快速检测。该试纸条所使用的荧光染料能有效区分死活菌，消除死菌带来的假阳性干扰，提高检测精度。
一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，包括：样品垫、检测膜、吸水垫及底板；所述检测膜上分别设有包被鼠伤寒沙门氏菌抗体的检测线以及包被有羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的质控线；所述检测膜设置在所述底板上，所述样品垫与所述检测膜靠近所述检测线一端连接，所述吸水垫与所述检测膜靠近所述质控线一端连接。
在其中一个实施例中，所述样品垫的制备步骤如下：制备样品垫预处理液，所述样品垫预处理液为含tween-20和BSA的TBS缓冲液；将所述样品垫预处理液滴加至样品垫上，45℃烘干3～4小时，获得所述样品垫。
在其中一个实施例中，所述检测线的制备步骤如下：将PBS溶液稀释后的鼠伤寒沙门氏菌抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于所述检测膜上，包被量为0.5～1.0μL/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
在其中一个实施例中，所述质控线的制备步骤如下：将PBS溶液稀释后的羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于所述检测膜上，包被量为0.5～1.0μL/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
在其中一个实施例中，所述检测线与所述质控线之间的间隔为3～8mm。
一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试剂盒，包括：样品标记液、时间分辨荧光微球标记小鼠IgG抗体、检测卡以及前述任一一项的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，所述检测卡具有检测腔，并设有与所述检测腔连通的加样槽和观察窗，所述鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条安装在所述检测腔内。
在其中一个实施例中，所述样品标记液的制备步骤如下：将SYTO-9和PI两种核酸荧光染料储液各取1～5μL于1mL无菌超纯水中，混匀，得到SYTO-9与PI混合工作液，获得所述样品标记液。
在其中一个实施例中，所述时间分辨荧光微球标记小鼠IgG抗体的制备步骤如下：
将时间分辨荧光微球加入到HEPES偶联缓冲液中，再加入待标记的小鼠IgG抗体，所述小鼠IgG抗体与时间分辨荧光微球的比例为10～100μg/100μL微球，超声偶联5～30min，加入封闭液进行封闭，高速离心5～30min，用保存液洗涤重悬2～4次，4℃冰箱中保存。
一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测方法，包括如下步骤：
将待测样品与样品标记液按比例混匀，避光染色；
用稀释液将时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体进行稀释，加入待测样品中；
开启免疫荧光分析仪，读取标准曲线；
向所述鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条加入所述经时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体标记的待测样品，反应5～20min；
将所述鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条插入免疫荧光分析仪中，读取检测线和质控线的荧光强度，给出T值、C值以及T/C值，通过标准曲线可获取样品中鼠伤寒沙门氏菌活菌的浓度，并进行判断。
在其中一个实施例中，所述将待测样品与样品标记液按比例混匀，所述待测样品与样品标记液的体积比为0.5:1～2:1，所述避光染色时间为5～20min。
在其中一个实施例中，所述用稀释液将时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体进行稀释，稀释倍数为50～200倍，加样量为待测样品体积的2％～10％。
在其中一个实施例中，所述向所述鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条加入所述经时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体标记的待测样品，滴加待测样品的体积为50～100μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(一)、本发明采用的荧光染料PI和SYTO-9是核酸染料，两种染料同时对细菌染色，荧光照射下有完整质膜结构的细胞呈绿色，细胞膜结构被损坏的细胞呈红色，而且两种染料的激发光谱和发射光谱不同，其中SYTO-9激发波长为485nm，发射波长为530nm，在合适的波段下可以有效区分细菌的死活性；
(二)、本发明制备的荧光免疫层析试剂条能进行定量检测，具有灵敏度高、检测方便、快捷、价格便宜、无需专业人员操作等优势，有利于基层的现场快速检测，并且能消除死菌带来的假阳性干扰。
附图说明
图1为本发明所述鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条的结构示意图；
图2为本发明所述鼠伤寒沙门氏菌活菌检测标准曲线图。
1、底板；2、样品垫；3、检测膜；4吸水垫；5、检测线；6、质控线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
下面参照附图描述本发明一些实施例所述一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法。
实施例一：
本实施例提供了一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条。
如图1所示，包括：样品垫2、检测膜3、吸水垫4及底板1；检测膜3上分别设有包被鼠伤寒沙门氏菌抗体的检测线5以及包被有羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的质控线6；检测膜3设置在底板1上，样品垫2与检测膜3靠近检测线5一端连接，吸水垫4与检测膜3靠近质控线6一端连接。
上述的一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，检测膜3的检测线5上包被有鼠伤寒沙门氏菌抗体，可以特异性地结合待测样品中的鼠伤寒沙门氏菌菌体，并固定在检测线上，从而提高了鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条对鼠伤寒沙门氏菌菌体的检测灵敏度和准确性，且通过免疫层析技术进行鼠伤寒沙门氏菌菌体的检测，操作简便、快捷，能够有效提高检测速度。
实施例二：
本实施例提供了一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条的制备方法。
(1)、样品垫的制备
制备样品垫预处理液，样品垫预处理液为含0.1～0.5％tween-20和0.1～0.5％的BSA的TBS缓冲液(pH7.0～7.5)；
将样品垫预处理液滴加至样品垫上，45℃烘干3～4小时，获得样品垫。优选地，样品垫预处理液为含0.2％tween-20和0.2％BSA的TBS缓冲液(pH7.4)。
(2)、检测膜上的检测线的制备
将经浓度为0.005～0.02mol/L，pH值为7.2～7.4的PBS溶液稀释后的鼠伤寒沙门氏菌抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于检测膜上，包被量为0.5～1.0μL/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
(3)、检测膜上的质控线的制备
将经浓度为0.005～0.02mol/L，pH值为7.2～7.4的PBS溶液稀释后的羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于所述检测膜上，包被量为0.5～1.0μL/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
(4)、检测线与质控线在检测膜上的间隔为3～8mm。从而使免疫层析过程中，待测样品中的鼠伤寒沙门氏菌的菌体能有足够的时间和空间进行免疫结合反应，提高鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测结果的准确性。
实施例三：
本实施例提供了一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试剂盒，包括：样品标记液、时间分辨荧光微球标记小鼠IgG抗体、检测卡以及鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，检测卡具有检测腔，并设有与检测腔连通的加样槽和观察窗，鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条安装在检测腔内。
实施例四：
本实施例提供了一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试剂盒的制备方法。
(1)、样品标记液的制备
将SYTO-9和PI两种核酸荧光染料储液各取1～5μL于1mL无菌超纯水中，混匀，得到SYTO-9与PI混合工作液，获得样品标记液。
优选地，在一些实施例中，SYTO-9的储存浓度为3.34mM，PI的浓度为20mM，将SYTO-9和PI储液溶解在20％DMSO中，于-20℃避光保存。各取3uL SYTO-9储存液与PI储存液于1mL无菌超纯水中，混匀，得到SYTO-9与PI混合工作液，作为样品标记液。
(2)、时间分辨荧光微球标记小鼠IgG抗体的制备
将东莞汉诺生物技术有限公司生产的粒径为200nm～400nm的时间分辨荧光微球加入到HEPES偶联缓冲液中，再加入待标记的小鼠IgG抗体，小鼠IgG抗体抗体与时间分辨荧光微球的比例为10～100μg/100μL，超声偶联5～60min，加入封闭液进行封闭，封闭剂优选是牛血清白蛋白。高速离心5～30min，用保存液洗涤重悬2～4次，4℃冰箱中保存。
优选地，在一些实施中，将粒径为200nm～400nm的时间分辨荧光微球加入到0.025～0.2MHEPES偶联缓冲液中，再加入待标记的小鼠IgG抗体，抗体与微球的比例为50μg/μL，超声偶联10min。
(3)、样品垫的制备
将样品垫预处理液滴加在样品垫上，45℃烘3-4小时。其中，样品垫预处理液为含0.1～0.5％tween-20和0.1～0.5％的BSA的PBS缓冲液(pH7.0～7.5)。
(4)、检测膜的制备
将浓度为0.005～0.02mol/L，pH值为7.2～7.4的PBS溶液稀释后的鼠伤寒沙门氏菌抗体和羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体分别作为检测线和质控线，划线于检测膜上，检测线靠近样品垫，质控线靠近吸水垫，两条线之间的间隔为3～8mm，包被量为0.5～1μL/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
(5)、将处理好的样品垫、检测膜以及吸水垫依次粘贴于底板上，切割成3～4mm的试纸条，并装入检测卡壳中。
上述实施例提供的一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测免疫层析试剂盒，包括：样品标记液、时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体、检测卡以及鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，其中使用包含SYTO-9和PI两种核酸荧光染料的样品标记液对待测样品中的鼠伤寒沙门氏菌的活菌和死菌分别进行标记，SYTO-9是一种能穿透完整细胞膜的小分子，PI是一种可以渗透到细胞膜破损细胞内的大分子，且PI可以取代SYTO-9进行染色。两种染料染色后有完整质膜结构的细胞呈绿色，细胞膜结构被损坏的细胞呈红色，从而实现死菌和活菌的鉴别。标记后的待测样品再与时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体溶液进行混合，最终通过将待测样品液滴入检测卡内的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条上，使待测样品中被PI和SYTO-9染色的菌体与检测膜上检测线的鼠伤寒沙门氏菌的抗体特异性结合，并在试纸条上形成相应的红、绿荧光，待测样品中的时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体与检测膜上质控线的羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体特异性结合，通过免疫荧光分析仪读取检测线和质控线的荧光强度，给出T值、C值以及T/C值，通过标准曲线可获取样品中鼠伤寒沙门氏菌活菌的浓度，并进行判断。
实施例五：
本实施例提供了一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测方法，包括如下步骤：
(1)、将鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条以及待测样品恢复至室温，将待测样品与样品标记液按比例混匀，避光染色；
可选地，待测样品与样品标记液的体积比为0.5:1～2:1，避光染色时间为5～20min；
优选地，待测样品与样品标记液的体积比为1:1，避光染色时间为15min；
(2)、用稀释液将荧光微球标记的小鼠IgG抗体进行稀释，加入待测样品中；
可选地，用稀释液将荧光微球标记的小鼠IgG抗体进行稀释，稀释倍数为50～200倍，加样量为待测样品体积的2％～10％；
优选地，用稀释液将荧光微球标记的小鼠IgG抗体进行稀释，稀释倍数为100倍，加样量为待测样品体积的5％；
(3)、开启免疫荧光分析仪，插入相应基质的ID卡，读取标准曲线；
(4)、将鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条恢复至室温使用，向鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条加入添加了样品标记液和荧光微球标记的小鼠IgG抗体的待测样品，反应5～20min；
可选地，向鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条的加样槽中加入添加了样品标记液和荧光微球标记的小鼠IgG抗体的待测样品，滴加待测样品的体积为80～100μL，反应5～10min。
优选地，滴加待测样品的体积为80μL。
(5)、将鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条插入免疫荧光分析仪中，读取检测线和质控线的荧光强度，给出T值、C值以及T/C值，通过标准曲线可获取样品中鼠伤寒沙门氏菌活菌的浓度，并进行判断。
实施例六：
本实施例为实施例五中鼠伤寒沙门氏菌活菌进行定量检测中，标准曲线的建立方法，如图2所示：
本实施例中标准曲线建立所使用的鼠伤寒沙门氏菌菌株保藏于美国菌种保藏中心(ATCC)，菌株编号为：ATCC14028，任何公众都可以通过商业途径向其购买。
将OD值在0.5～1.0的菌液离心，用无菌TBS缓冲液重悬，得到数量级为108CFU/mL的菌液。十倍稀释菌液，使其浓度数量级范围依次为：104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL，共四个浓度梯度，每个浓度梯度设三个重复。将待测菌液与荧光染料混合，避光染色15min，然后加入标记好的时间分辨荧光微球混匀。取不同浓度的菌液80uL加入到鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条上，反应10分钟后，将试纸条插入到配套的免疫荧光分析仪，得到T/C值。后用平板法确定菌液浓度，以菌液活菌浓度为横坐标，T/C值为纵坐标，建立方程并拟合成标准曲线，具体数值如表1所示。
表1鼠伤寒沙门氏菌纯培养物定量检测值
Figure BDA0003256857620000101
根据表1的数据，以鼠伤寒沙门氏菌活菌浓度为横坐标，以T/C值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图2所示，该标准曲线线性良好，可以通过该曲线对纯培养物中活菌进行定量检测。由表1数据可知，该法的灵敏度可达4.85×104CFU/mL，各浓度点的CV在15％以内。
实施例七：
本实施例为使用本发明的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒以及检测方法对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的活菌进行定量检测。
利用根据实施例二制备的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条进行在牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的活菌定量检测。将25g牛肉样品搅碎，与225ml LB肉汤均匀混合，并在37℃下浓缩6小时。取0小时和6小时的LB肉汤混合物离心，用无菌TBS缓冲液重悬。将待测样品与荧光染料混合，避光染色15min，然后加入标记好的时间分辨荧光微球混匀。取80uL样品溶液加入到试剂条上，反应10分钟后，将试剂条插入到配套的免疫荧光分析仪，得到T/C值。将T/C值代入到实施例六的标准曲线中，得到该样品溶液的菌液浓度为105。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，其特征在于，包括：样品垫(2)、检测膜(3)、吸水垫(4)及底板(1)；所述检测膜(3)上分别设有包被鼠伤寒沙门氏菌抗体的检测线(5)以及包被有羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的质控线(6)；所述检测膜(3)设置在所述底板(1)上，所述样品垫(2)与所述检测膜(3)靠近所述检测线(5)一端连接，所述吸水垫(4)与所述检测膜(3)靠近所述质控线(6)一端连接。
2.根据权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，其特征在于，所述样品垫(2)的制备步骤如下：
制备样品垫预处理液，所述样品垫预处理液为含tween-20和BSA的TBS缓冲液；
将所述样品垫预处理液滴加至所述样品垫(2)上，45℃烘干3～4小时，获得所述样品垫。
3.根据权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，其特征在于，所述检测线(5)的制备步骤如下：
将PBS溶液稀释后的鼠伤寒沙门氏菌抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于所述检测膜(3)上，包被量为0.5～1.0μL/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
4.根据权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，其特征在于，所述质控线(6)的制备步骤如下：
将PBS溶液稀释后的羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于所述检测膜(3)上，包被量为0.5～1.0μL/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
5.根据权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，其特征在于，所述检测线(5)与所述质控线(6)之间的间隔为3～8mm。
6.一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试剂盒，其特征在于，包括：样品标记液、时间分辨荧光微球标记小鼠IgG抗体、检测卡以及如权利要求1～5所述任一一项的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条，所述检测卡具有检测腔，并设有与所述检测腔连通的加样槽和观察窗，所述鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条安装在所述检测腔内。
7.根据权利要求6所述的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试剂盒，其特征在于，所述样品标记液的制备步骤如下：
将SYTO-9和PI两种核酸荧光染料储液各取1～5μL于1mL无菌超纯水中，混匀，得到SYTO-9与PI混合工作液，获得所述样品标记液。
8.根据权利要求6所述的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试剂盒，其特征在于，所述时间分辨荧光微球标记小鼠IgG抗体的制备步骤如下：
将时间分辨荧光微球加入到HEPES偶联缓冲液中，再加入待标记的小鼠IgG抗体，所述小鼠IgG抗体与时间分辨荧光微球的比例为10～100μg/100μL微球，超声偶联5～30min，加入封闭液进行封闭，高速离心5～30min，用保存液洗涤重悬2～4次，4℃冰箱中保存。
9.一种鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待测样品与样品标记液按比例混匀，避光染色；
用稀释液将时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体进行稀释，加入待测样品中；
开启免疫荧光分析仪，读取标准曲线；
向所述鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条加入所述经时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体标记的待测样品，反应5～20min；
将所述鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条插入免疫荧光分析仪中，读取检测线和质控线的荧光强度，给出T值、C值以及T/C值，通过标准曲线可获取样品中鼠伤寒沙门氏菌活菌的浓度，并进行判断。
10.根据权利要求9所述的鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测方法，其特征在于，所述将待测样品与样品标记液按比例混匀，所述待测样品与样品标记液的体积比为0.5:1～2:1，所述避光染色时间为5～20min；和/或
所述用稀释液将时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体进行稀释，稀释倍数为50～200倍，加样量为待测样品体积的2％～10％；和/或
所述向所述鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条加入所述经时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体标记的待测样品，滴加待测样品的体积为50～100μL。
CN202111062380.8A 2021-09-10 2021-09-10 鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法 Pending CN113687071A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111062380.8A CN113687071A (zh) 2021-09-10 2021-09-10 鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111062380.8A CN113687071A (zh) 2021-09-10 2021-09-10 鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113687071A true CN113687071A (zh) 2021-11-23

Family

ID=78586055

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111062380.8A Pending CN113687071A (zh) 2021-09-10 2021-09-10 鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113687071A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101762684A (zh) * 2008-12-24 2010-06-30 上海市计划生育科学研究所 一种体外检测精子存活率的方法
CN103175768A (zh) * 2013-02-26 2013-06-26 东华大学 快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用
CN104297476A (zh) * 2014-10-11 2015-01-21 南昌大学 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒
US20170058314A1 (en) * 2014-10-31 2017-03-02 Ying Zhang Novel methodology for identifying anti-persister activity and antimicrobial susceptibility for borrelia burgdorferi and other bacteria
CN107340389A (zh) * 2017-06-22 2017-11-10 中国农业大学 基于核酸层析生物传感技术检测沙门氏菌的方法
WO2018045449A1 (en) * 2016-09-09 2018-03-15 Mitra Sushanta Kumar Method and apparatus for detection and treatment of e. coli in water
CN108226509A (zh) * 2017-12-15 2018-06-29 武汉市农业科学院 一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101762684A (zh) * 2008-12-24 2010-06-30 上海市计划生育科学研究所 一种体外检测精子存活率的方法
CN103175768A (zh) * 2013-02-26 2013-06-26 东华大学 快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用
CN104297476A (zh) * 2014-10-11 2015-01-21 南昌大学 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒
US20170058314A1 (en) * 2014-10-31 2017-03-02 Ying Zhang Novel methodology for identifying anti-persister activity and antimicrobial susceptibility for borrelia burgdorferi and other bacteria
WO2018045449A1 (en) * 2016-09-09 2018-03-15 Mitra Sushanta Kumar Method and apparatus for detection and treatment of e. coli in water
CN107340389A (zh) * 2017-06-22 2017-11-10 中国农业大学 基于核酸层析生物传感技术检测沙门氏菌的方法
CN108226509A (zh) * 2017-12-15 2018-06-29 武汉市农业科学院 一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALISON LACOMBE, ET AL.: "The effect of American cranberry (Vaccinium macrocarpon) constituents on the growth inhibition, membrane integrity, and injury of Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes in comparison to Lactobacillus rhamnosus.", 《FOOD MICROBIOLOGY》 *
W. SLEDZ, ET AL.: "DETECTING LIVE AND DEAD CELLS OF PECTOBACTERIUM ATROSEPTICUM BASED ON IMMUNOMAGNETICS SEPARATION AND STAINING.", 《JOURNAL OF PLANT PATHOLOGY》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bu et al. Ultra technically-simple and sensitive detection for Salmonella enteritidis by immunochromatographic assay based on gold growth
Song et al. Development of a lateral flow colloidal gold immunoassay strip for the simultaneous detection of Shigella boydii and Escherichia coli O157: H7 in bread, milk and jelly samples
Van Der Zee et al. Rapid and alternative screening methods for microbiological analysis
Bu et al. Applicability of biological dye tracer in strip biosensor for ultrasensitive detection of pathogenic bacteria
CN103018458B (zh) 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒
JP3034036B2 (ja) 水中のｅ．ｃｏｌｉを同定するための新規および改良された方法
Wang et al. Sensitive immunoassay of Listeria monocytogenes with highly fluorescent bioconjugated silica nanoparticles probe
Vasavada et al. Conventional and novel rapid methods for detection and enumeration of microorganisms
CN102818894A (zh) 一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡及其制备方法
Silliker et al. The Fluorescent Antibody Techniaue as a Means of Detecting Salmonellae in Foods
CN105527428B (zh) 一种快速检测大肠杆菌o157：h7的方法
CN113687071A (zh) 鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法
US7241626B2 (en) Isolation and confirmation of analytes from test devices
CN105785020A (zh) 一种针对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法
Cox et al. Rapid methods for the detection and identification of microorganisms in foods
CN116338171A (zh) 一种免洗均相检测方法
CN103383354B (zh) 一种检测肠毒素sea的磁微粒化学发光试剂盒的检测方法
CN113687072A (zh) 大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法
Goepfert et al. Salmonellae and the fluorescent-antibody technique: a current evaluation
CN113970637A (zh) 一种犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条及其制备方法
CN111077313A (zh) 一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条及制备方法
JPH03151896A (ja) 標本中の抗菌化合物の存在をアッセイする方法及びキット
CN112630436A (zh) 一种定量检测tex101浓度的荧光试剂条的制备方法及其应用
CN101696447B (zh) 用于测试冷藏食品中嗜冷菌的试纸条及其制备方法
Hartman et al. Automation for rapid identification of salmonellae in foods

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211123