CN111077313A - 一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，包括底板，所述底板上固定有硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸和样品垫，所述结合垫上固载有链霉亲和素化胶体金，所述硝酸纤维素膜上由前向后依次设有测试线和控制线，所述测试线上固载有金黄色葡萄球菌单克隆抗体，所述控制线上固载有与金黄色葡萄球菌适配体互补的单链DNA。该胶体金试纸条能够实现金黄色葡萄球菌的即时检测，检测时间缩短至5‑10分钟，且不需要大型仪器设备以及复杂的实验步骤。可通过对比反应前后体系的胶体金试纸条的颜色变化对金黄色葡萄球菌进行定性识别，也可通过读取胶体金卡读卡仪数据进行定量检测。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条及制备方法
技术领域
本发明涉及医疗卫生用品技术领域，特别涉及一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，以及制备该试纸条的方法。
背景技术
据世界卫生组织报道，全球每年有42万人因食源性疾病死亡，绝大部分的食源性疾病是由食源性致病菌引起。金黄色葡萄球菌是最常见的食源性致病菌，它在食物中的不同条件下均有显著的生长能力和产生葡萄球菌肠毒素类能力，导致葡萄球菌食物中毒。食物在加工过程中很容易受到污染，而牛奶是金黄色葡萄球菌生长的良好基质，所以乳制品是常见的中毒源。开发有效的方法来检测金黄色葡萄球菌，对预防食源性疾病的爆发有重大意义。
目前，已有的金黄色葡萄球菌检测方法主要包括传统生物培养法、聚合酶链反应(PCR)分析和酶联免疫吸附(ELISA)测定法。而传统生物培养法耗时长，PCR需要洁净的环境，容易被污染，不适合现场快速检测，ELISA需要多步操作，灵敏度不高，均不适合现场快速筛查。因此，亟需建立致病菌的快速、准确、灵敏的检测方法，为食品卫生、医学诊断、环境检测等提供可靠的科学依据。
胶体金免疫层析技术是将胶体金标记技术与免疫层析等技术进行结合的新型技术，这种技术具有胶体金试剂稳定，且储存方便、操作简单、检测所需时间短、所得结果容易判断等优点，被广泛应用于现场快速检测。
发明内容
本发明针对上述问题，提供一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
为实现对金黄色葡萄球菌的快速即时诊断检测，本发明提供了稳定性好、特异性强、灵敏度高的检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条：
一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，包括底板，所述底板上固定有硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸和样品垫，所述硝酸纤维素膜的后端与所述吸水纸接触，其前端与所述结合垫接触，所述结合垫的后端与硝酸纤维素膜接触，其前端与所述样品垫接触，所述结合垫上固载有链霉亲和素化胶体金，所述硝酸纤维素膜上由前向后依次设有测试线和控制线，所述测试线上固载有金黄色葡萄球菌单克隆抗体，所述控制线上固载有与金黄色葡萄球菌适配体互补的单链DNA。
进一步，所述控制线至硝酸纤维素膜后端的距离为9-10mm，所述控制线与所述测试线之间的距离为8-10mm。
进一步，所述样品垫与结合垫的前端搭接；所述结合垫的后端与所述硝酸纤维素膜的前端搭接；所述吸水纸与硝酸纤维素膜的后端搭接；所述搭接的覆盖部分宽度为1-2mm。
进一步，所述底板为条形PVC构件，其宽度3-4mm。
进一步，所述吸水纸的长度为18-20mm、所述硝酸纤维素膜的长度为25-27mm、所述结合垫的长度为8-10mm，所述样品垫的长度为18-20mm。
本发明令一方面提供了制备上述检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条的方法，包括步骤：
1)胶体金溶液的制备：将50mL 0.01％的HAuCl4溶液加入到圆底烧瓶中，边加热边搅拌至沸腾；然后，在搅拌条件下向上述溶液中加入5mL 1％柠檬酸钠，待溶液变为酒红色后，继续煮沸10min，停止加热后，继续搅拌15min，得到胶体金溶液，4℃避光保存；
2)生物素化胶体金的制备：向1mL的胶体金溶液中加入0.1mol /L K2CO3(5μL)混匀，5min后加入8μg的链霉亲和素，室温震荡 30min，加入100μL浓度10％的牛血清白蛋白封闭30min，4℃离心 10min，弃清液，用100μL浓度为0.2mol/L硼酸缓冲液重悬生物素化胶体金；
3)将所述生物素化胶体金固载在结合垫内，并将带有测试线和控制线的硝酸纤维素膜、固载有生物素化胶体金的结合垫以及吸水纸和样品垫依次粘结在底板上。
其中，步骤2所述离心速率为10×103rpm。所述硼酸缓冲液的 pH为9.0。
本发明与现有技术相比具有优点：
(1)本发明所述一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条能够实现金黄色葡萄球菌的即时检测，检测时间缩短至5-10分钟，且不需要大型仪器设备以及复杂的实验步骤。可通过对比反应前后体系的胶体金试纸条的颜色变化对金黄色葡萄球菌进行定性识别，也可通过读取胶体金卡读卡仪数据进行定量检测。
(2)一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条能够实现对金黄色葡萄球菌的高灵敏检测，灵敏度达1CFU mL-1，常见食源性致病菌对其检测不产生干扰。
(3)该试纸条检测准确度高。对实际样品进行检测，检测结果与传统平板计数法结果一致。
附图说明
图1是实施例2制得的检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条的结构示意图；
图2是实施例4所述检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条的特异性检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1，链霉亲和素化胶体金的制备
(1)胶体金(AuNP)溶液的制备：将50mL 0.01％的HAuCl4溶液加入到圆底烧瓶中，边加热边搅拌至沸腾；然后，在搅拌条件下向上述溶液中加入5mL 1％柠檬酸钠，待溶液变为酒红色后，继续煮沸10min，停止加热后，继续搅拌15min，得到胶体金(AuNP)溶液， 4℃避光保存。
(2)生物素化胶体金的制备：向1mL的胶体金溶液中加入 0.1mol/L K2CO3(5μL)混匀，5min后加入8μg的链霉亲和素(SA)，室温震荡30min。加入10％BSA(100μL)封闭30min，4℃离心(10 ×103rpm，10min)，得到胶体金-链霉亲和素(AuNP-SA)探针。弃清液，用100μL硼酸缓冲液(0.2mol/L，pH9.0)重悬AuNP-SA探针。
实施例2，一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条的制备
如图1所示，一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条包括PVC 底板1、硝酸纤维素膜2、结合垫3、吸水纸4、样品垫5；
将所述硝酸纤维素膜2，粘结在所述PVC底板1的中部；将结合垫3和吸水纸4分别粘贴在所述硝酸纤维素膜2的两端，将所述样品垫5粘贴在所述结合垫3上；所述结合垫3上固定实施例1制备的链霉亲和素化胶体金。
所述硝酸纤维素膜2上自靠近吸水纸4端依次设有控制线6、测试线7，所述测试线7上包被有金黄色葡萄球菌单克隆抗体。所述控制线6上喷洒有与金黄色葡萄球菌适配体互补的单链DNA。
所述样品垫5和结合垫3端部覆盖部分宽度为1mm，结合垫3 和硝酸纤维素膜2端部覆盖部分宽度为1mm，硝酸纤维素膜2和吸水纸4端部覆盖部分为1mm。
所述底板1为宽4mm的条形PVC底板；所述吸水纸4、硝酸纤维素膜2、结合垫3和样品垫5的长度分别为18mm、25mm、8mm 和18mm。
所述控制线6距离硝酸纤维素膜2上沿(靠近吸水纸4端)的距离为9mm，控制线6与测试线7之间的距离为8mm。
实施例3，一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条的灵敏度检测
(1)金黄色葡萄球菌的培养和计数
金黄色葡萄球菌用L-B培养基在37℃条件下增菌24h。然后用 PBS缓冲液进行梯度稀释。通过平板计数法获得细菌数目：将100微升不同稀释梯度的分散液分别均匀地涂在结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)平板上，在37℃下培养48h后，计生长的菌落总数以确定指定稀释度下细菌个数，用CFU/mL为单位表示。
(2)生物素化适配体与金黄色葡萄球菌结合
将100μL的生物素化的金黄色葡萄球菌适配体(Biotinylated aptamer)和1000μL浓度分别为108、107、106、105、104、103、102、 101和1CFU/mL的金黄色葡萄球菌样品混合均匀，室温反应30min 后，4℃离心3次，弃上层清液，用100μL硼酸缓冲液(0.2mol/L， pH9.0)重悬金黄色葡萄球菌-适配体-生物素。
(3)取金黄色葡萄球菌-适配体-生物素溶液60μL，滴加到所述试纸条的样品垫上，5-10min后，观察现象。可通过对比反应前后体系的胶体金试纸条的颜色变化对金黄色葡萄球菌进行定性识别，也可通过读取胶体金卡读卡仪数据进行定量检测。根据胶体金读卡仪读取的实验结果，该试纸条的最低检测限为1CFU/mL。
滴加到样品垫上的金黄色葡萄球菌-适配体-生物素经层析作用，与结合垫上的链霉亲和素标记胶体金结合形成复合物。所述复合物经层析作用与检测线上包被的抗体结合，样品中的金黄色葡萄球菌含量越多，检测线上聚集的胶体金越多，检测线上红色越深。当样品中没有金黄色葡萄球菌时，适配体-生物素与结合垫上的链霉亲和素标记胶体金结合形成复合物，经层析作用不能与检测线上包被的抗体结合，继续层析，与控制线上的与适配体互补的单链DNA结合。
实施例4，一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条的特异性检测
为了考察所述试纸条的特异性，采用浓度均为104CFU/mL的大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌、志贺氏菌作为阴性样品按照实施例3 所述的方法进行检测，检测结果如图2(其中，1为金黄色葡萄球菌、 2为大肠杆菌O157∶H7、3为沙门氏菌、4为志贺氏菌)所示，其他致病菌的检测结果为阳性，只有浓度为104CFU/mL金黄色葡萄球菌样品检测到的结果为阴性。说明该试纸条特异性好。
实施例5，一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条对实际样品的检测
对牛奶样品中的金黄色葡萄球菌(样品中金黄色葡萄球菌的浓度为104CFU/mL)进行检测，检测结果与传统平板计数法一致，说明本方法的可靠性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是本发明不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，其特征在于，包括底板，所述底板上固定有硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸和样品垫，所述硝酸纤维素膜的后端与所述吸水纸接触，其前端与所述结合垫接触，所述结合垫的后端与硝酸纤维素膜接触，其前端与所述样品垫接触，所述结合垫上固载有链霉亲和素化胶体金，所述硝酸纤维素膜上由前向后依次设有测试线和控制线，所述测试线上固载有金黄色葡萄球菌单克隆抗体，所述控制线上固载有与金黄色葡萄球菌适配体互补的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，其特征在于，所述控制线至硝酸纤维素膜后端的距离为9-10mm，所述控制线与所述测试线之间的距离为8-10mm。
3.根据权利要求1所述的检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，其特征在于，所述样品垫与结合垫的前端搭接；所述结合垫的后端与所述硝酸纤维素膜的前端搭接；所述吸水纸与硝酸纤维素膜的后端搭接；所述搭接的覆盖部分宽度为1-2mm。
4.根据权利要求1所述的检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，其特征在于，所述底板为条形PVC构件，其宽度3-4mm。
5.根据权利要求1所述的检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，其特征在于，所述吸水纸的长度为18-20mm、所述硝酸纤维素膜的长度为25-27mm、所述结合垫的长度为8-10mm，所述样品垫的长度为18-20mm。
6.检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)胶体金溶液的制备：将50mL 0.01％的HAuCl4溶液加入到圆底烧瓶中，边加热边搅拌至沸腾；然后，在搅拌条件下向上述溶液中加入5mL 1％柠檬酸钠，待溶液变为酒红色后，继续煮沸10min，停止加热后，继续搅拌15min，得到胶体金溶液，4℃避光保存；
2)生物素化胶体金的制备：向1mL的胶体金溶液中加入0.1mol/LK2CO3(5μL)混匀，5min后加入8μg的链霉亲和素，室温震荡30min，加入100μL浓度10％的牛血清白蛋白封闭30min，4℃离心10min，弃清液，用100μL浓度为0.2mol/L硼酸缓冲液重悬生物素化胶体金；
3)将所述生物素化胶体金固载在结合垫内，并将带有测试线和控制线的硝酸纤维素膜、固载有生物素化胶体金的结合垫以及吸水纸和样品垫依次粘结在底板上。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述离心速率为10×103rpm。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述硼酸缓冲液的pH为9.0。
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