JP2001188068A

JP2001188068A - 細菌検出方法およびその方法を利用したキット

Info

Publication number: JP2001188068A
Application number: JP37519999A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nakayama; 浩中山
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1999-12-28
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2001-07-10

Abstract

(57)【要約】【課題】従来の方法に比べて選択性、感度および迅速
さの点で著しく改善された細菌検出方法を提供すること
を目的とする。【解決手段】試料中の細菌の検出方法。この方法は、
少なくとも試料導入部と細菌捕捉部とを有する試料泳動
体と、検出対象である細菌に特異的に結合し得る抗体と
を備えた免疫クロマトデバイスを提供する工程であっ
て、該抗体は該細菌捕捉部に固定化されている、工程；
該試料導入部に試料を導入して該細菌を該抗体に結合さ
せる工程；該抗体に結合した細菌を、細菌増殖培地を用
いて増殖させる工程；および該増殖させた細菌を検出す
る工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫クロマトデバ
イスおよび細菌増殖培地を用いて試料中の細菌を検出す
るための方法およびキットに関し、特に、試料から微量
の細菌を高感度かつ迅速に検出し得る、環境、食品及び
医療の分野で有用な方法およびキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来の細菌検出方法としては、標識抗体
を有する免疫クロマトデバイスを用いる方法、および培
養による方法の２つが挙げられる。

【０００３】免疫クロマトデバイスを用いる細菌検出方
法では、通常、検出対象細菌に結合し得る抗体を有する
免疫クロマトデバイスに、検出対象細菌を含む試料を導
入し、泳動し、そして検出対象細菌をサンドイッチ状に
捕捉する。この方法では、一般に、少なくとも一種類の
抗体は免疫クロマトデバイス上に固定化されており、他
の抗体は泳動し得る状態で担持されている。抗体の標識
物としては、色素または酵素を用い得る。標識物として
色素を用いた場合は呈色により、そして酵素を用いた場
合は発色性基質との酵素反応による可視化により、細菌
を検出する。

【０００４】培養による細菌検出方法では、細菌が増殖
し得る培地成分を有する寒天培地に、適切な濃度に希釈
した試料を播き、インキュベートすることにより細菌を
増殖させる。細菌の増殖により形成されたコロニーの数
をカウントすることにより、細菌を検出する。

【０００５】しかし、これら従来の細菌検出方法は、そ
れぞれ欠点がある。免疫クロマトデバイスを用いる細菌
検出方法は、検出対象細菌に結合する抗体の親和性、お
よび標識物を測定する検出器の感度が限定要因となり、
検出限界は、試料１ｍｌあたり細菌約１０００個程度で
あって、満足のいくものではない。

【０００６】他方、培養による細菌検出方法は、検出限
界はより高いものの、細菌を含む試料をそのまま添加し
て培養するため、検出対象細菌以外の細菌も増殖させる
可能性が高い。つまり、細菌増殖により形成されたコロ
ニー数を計測するとき、他の細菌が増殖していると誤っ
た検出結果をもたらす。検出対象ではない細菌の増殖を
防ぐために、検出対象細菌を選択的に増殖させる培地を
使用することも試みられている。しかし、その選択性は
低いことが多く、検出対象細菌のみを増殖させることは
しばしば困難である。細菌選択性が高い選択培地を用い
る場合は、選択圧によって細菌に強いストレスが与えら
れるので長期の増殖時間が必要となり、結果として、細
菌の検出に時間がかかる。

【０００７】以上のことから、検出対象細菌を選択的
に、高感度かつ迅速に検出し得る細菌検出方法が望まれ
ている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
の解決を意図するものであり、従来の方法に比べて選択
性、感度および迅速さの点で著しく改善された細菌検出
方法を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、検出対象で
ある細菌に特異的に結合し得る抗体を固定化した免疫ク
ロマトデバイスに試料を導入して、多数種の細菌を含み
得る試料から検出対象細菌のみを選択的に捕捉した後、
この捕捉された細菌を細菌増殖培地を用いて増殖させる
ことにより、形成される細菌のコロニー数のカウントま
たは培地中の色変化の容易な観察が可能となり、検出対
象細菌のみを高感度かつ迅速に検出し得ることを見出
し、これに基づいて本発明を完成させた。

【００１０】本発明の方法は、試料中の細菌の検出方法
であって、少なくとも試料導入部と細菌捕捉部とを有す
る試料泳動体と、検出対象である細菌に特異的に結合し
得る抗体とを備えた免疫クロマトデバイスを提供する工
程であって、該抗体は該細菌捕捉部に固定化されてい
る、工程；該試料導入部に試料を導入して該細菌を該抗
体に結合させる工程；該抗体に結合した細菌を、細菌増
殖培地を用いて増殖させる工程；および該増殖させた細
菌を検出する工程を包含する。

【００１１】上記細菌増殖培地は、上記免疫クロマトデ
バイス上の少なくとも固定化された上記抗体を含む領域
に添加され得る。

【００１２】上記抗体に結合した細菌は、上記細菌増殖
培地を含むデバイスに転写され得る。

【００１３】本発明のキットは、試料中の細菌を検出す
るためのキットであって、免疫クロマトデバイスと、細
菌増殖培地を含むデバイスとを包含し、ここで、該免疫
クロマトデバイスは、少なくとも試料導入部と細菌捕捉
部とを有する試料泳動体と、検出対象である細菌に特異
的に結合し得る抗体とを備え、該抗体は該細菌捕捉部に
固定化されている。

【００１４】上記細菌増殖培地を含むデバイスは、該細
菌増殖培地を、上記免疫クロマトデバイス上の少なくと
も固定化された上記抗体を含む領域に添加するのに適し
た構造であり得る。

【００１５】上記細菌増殖培地を含むデバイスは、上記
抗体に結合した細菌を転写するのに適した構造であり得
る。

【００１６】本発明の方法およびキットにおいて、上記
細菌増殖培地は、細菌検出試薬を含み得、この細菌検出
試薬は、ｐＨ指示薬、発色性酵素基質、および不溶性の
塩を形成し得るイオンからなる群より選択され得る。

【００１７】上記細菌は、以下の分類のいずれかに属し
得る：ロドスピリルム、クロマチア、クロロビウム、ミ
クソコッカス、アルカンギウム、シストバクター、ポリ
アンギウム、サイトファーガ、ベギアトア、シモンシエ
ラ、リューコトリックス、アクロマチウム、ペロネー
マ、スピロヘータ、スピリルム、シュードモナス、アゾ
トバクター、リゾビウム、メチロモナス、ハロバクテリ
ウム、腸内細菌、ヴィブリオ、バクテロイデス、ナイセ
リア、ヴェイヨネラ、アンモニアまたは亜硝酸化細菌、
硫黄代謝細菌、酸化鉄および／または酸化マンガン沈着
細菌、シデロカプサ、メタノバクテリウム、好気性また
は通性嫌気性ミクロコッカス、ストレプトコッカス、嫌
気性ペプトコッカス、バチルス、乳酸桿菌、コリネフォ
ルム細菌、プロピオン酸菌、アクチノミセス、マイコバ
クテリウム、フランキア、アクチノプラーネス、デルマ
トフィルス、ノカルディア、ストレプトミセス、ミクロ
モノスポラ、リケッチア、バルトネラ、アナプラズマ、
クラミディア、マイコプラズマ、およびアコレプラズ
マ。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１９】本発明においては、他に特定されない限
り、当該分野で公知である、細菌の培養方法および検出
方法、ならびに免疫学的手法などが採用され得る。これ
らの手法は、市販のデバイス、抗体、標識物質などを使
用して行い得る。

【００２０】(検出対象試料および細菌）本発明の細菌
検出方法によれば、試料中の細菌を特異的に検出し得
る。試料は、水を溶媒または分散媒として含む任意の水
性試料であり得る。水性試料の例としては、尿、血液、
血漿、血清、唾液、乳、汗などの体液およびそれらの分
画物のような生体由来の試料；井戸水、地下水、水道
水、果汁のような天然由来の試料；ならびに食料品、野
菜、肉、卵などの粉砕物を水に懸濁した試料であり得
る。

【００２１】検出対象とされる細菌の例としては、以下
の分類のいずれかに属する細菌が挙げられる：Ｒｈｏｄ
ｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ（ロドスピリルム）、Ｃｈ
ｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ（クロマチウア）、Ｃｈｌｏｒ
ｏｂｉａｃｅａｅ（クロロビウム）、Ｍｙｘｏｃｏｃｃ
ａｃｅａｅ（ミクソコッカス）、Ａｒｃｈａｎｇｉａｃ
ｅａｅ（アルカンギウム）、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒａ
ｃｅａｅ（シストバクター）、Ｐｏｌｙａｎｇｉａｃｅ
ａｅ（ポリアンギウム）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａｃｅａｅ
（サイトファーガ）、Ｂｅｇｇｉａｔｏａｃｅａｅ（ベ
ギアトア）、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａｃｅａｅ（シモン
シエラ）、Ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ（リューコ
トリックス）、Ａｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ（アクロ
マチウム）、Ｐｅｌｏｎｅｍａｔａｃｅａｅ（ペロネー
マ）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ（スピロヘー
タ）、Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ（スピリルム）、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ（シュードモナス）、Ａ
ｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ（アゾトバクター）、
Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ（リゾビウム）、Ｍｅｔｈｙ
ｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ（メチロモナス）、Ｈａｌｏ
ｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（ハロバクテリウム）、Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（腸内細菌）、Ｖｉ
ｂｒｉｏｎａｃｅａｅ（ヴィブリオ）、Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄａｃｅａｅ（バクテロイデス）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉ
ａｃｅａｅ（ナイセリア）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃ
ｅａｅ（ヴェイヨネラ）、アンモニアまたは亜硝酸化細
菌（Ｏｒｇａｎｉｓｍｓｏｘｉｄｉｚｉｎｇａｍｍ
ｏｎｉａｏｒｎｉｔｒｉｔｅ）、硫黄代謝細菌（Ｏ
ｒｇａｎｉｓｍｓｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇｓｕｌ
ｆｅｒａｎｄｓｕｌｆｅｒｃｏｍｐｏｕｎｄ
ｓ）、酸化鉄および／または酸化マンガン沈着細菌（Ｏ
ｒｇａｎｉｓｍｓｄｅｐｏｓｉｔｉｎｇｉｒｏｎａ
ｎｄ／ｏｒｍａｎｇａｎｅｓｅｏｘｉｄｅｓ）、Ｓ
ｉｄｅｒｏｃａｐｓａｃｅａｅ（シデロカプサ）、Ｍｅ
ｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（メタノバクテリ
ウム）、好気性または通性嫌気性（Ａｅｒｏｂｉｃｏ
ｒｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅｌｙａｎａｅｒｏｂｉ
ｃ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（ミクロコッカ
ス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（ストレプト
コッカス）、嫌気性（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ）、Ｐｅｐｔ
ｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（ペプトコッカス）、Ｂａｃｉｌ
ｌａｃｅａｅ（バチルス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａ
ｃｅａｅ（乳酸桿菌）、コリネフォルム細菌（Ｃｏｒｙ
ｎｅｆｏｒｍｇｒｏｕｐｏｆｂａｃｔｅｒｉ
ａ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（プ
ロピオン酸菌）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ
（アクチノミセス）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ
ｅ（マイコバクテリウム）、Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ
（フランキア）、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅａｅ（ア
クチノプラーネス）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａ
ｅ（デルマトフィルス）、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ
（ノカルディア）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａ
ｅ（ストレプトミセス）、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒ
ａｃｅａｅ（ミクロモノスポラ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ
ａｃｅａｅ（リケッチア）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅ
ａｅ（バルトネラ）、Ａｎａｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ
（アナプラズマ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ（クラ
ミディア）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ（マイ
コプラズマ）、およびＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃ
ｅａｅ（アコレプラズマ）。

【００２２】(免疫クロマトデバイス）本発明の細菌検
出方法では、免疫クロマトデバイスを用いる。免疫クロ
マトデバイスは、少なくとも試料導入部と細菌捕捉部と
を有する試料泳動体と、検出対象である細菌に特異的に
結合し得る抗体とを構成要素として含む。試料泳動体の
材料としては、検出対象の細菌に対する非特異的な吸着
を実質的に示すことがなく、かつ試料の移動を可能にす
る、任意の多孔質担体を用い得る。多孔質担体の例とし
ては、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維ろ
紙、スチロール樹脂、ビニル系樹脂などが挙げられる。
多孔質担体の水に対する親和性が低い場合は界面活性剤
を用いてもよい。試料泳動体の形状は特に限定されない
が、シート状に形成されていることが好ましい。試料泳
動体の試料導入部と細菌捕捉部とには、連続した同一の
多孔質担体を用いてもよいし、異なる材料を用いてもよ
い。試料導入部は、好ましくは、ガラス繊維ろ紙、セル
ロースである。細菌捕捉部は、好ましくは、ニトロセル
ロース、ガラス繊維ろ紙である。試料導入部と細菌捕捉
部とを、共にニトロセルロースで構成すると、試料の流
速が著しく低くなるので、細菌捕捉部だけをニトロセル
ロースで構成し、試料導入部には、試料の流速がより早
いガラス繊維ろ紙などを用いることが好ましい。

【００２３】試料泳動体の細菌捕捉部には、試料の移動
に伴う位置の変化が実質的に起きない強度で、検出対象
である細菌に特異的に結合し得る抗体が固定化されてい
る。この抗体は、検出対象の細菌に特異的に結合し得る
任意の抗体であり得る。「特異的に」結合し得るとは、
試料中の検出対象である細菌とは結合し得るが、同じ試
料中に存在し得る他の細菌とは実質的に結合し得ないこ
とをいう。ここでいう「結合」とは、抗原−抗体反応に
よる結合であり、非特異的な吸着などを含まない。

【００２４】検出対象である細菌に特異的に結合し得る
抗体は、当該分野で公知の方法により、適切な量で試料
泳動体に固定化され得る。例えば、細菌捕捉部がニトロ
セルロースである場合、抗体を含む溶液をニトロセルロ
ース上に滴下した後、乾燥、および洗浄することによ
り、抗体を非特異的に吸着させ得る。他の固定化法とし
て、例えば、特願平８−２８３２９７号公報に記載のよ
うな糖コンジュゲートを用いて、抗体をガラス濾紙など
に固定化してもよい。

【００２５】上記抗体は、ポリクローナル抗体であって
も、モノクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体、
Ｆａｂ抗体、（Ｆａｂ）₂抗体などの形態でもあり得
る。抗体のクラスは特に限定されないが、好ましくは、
ＩｇＧである。当業者は、検出対象の細菌に対応して適
切な抗体を選択し得る。一定の細菌に結合するポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体などは、当該分野
で公知であり、容易に入手し得る。抗体はまた、当該分
野で公知の免疫学的方法などに従って作製し得る。例え
ば、検出対象である細菌がサルモネラ菌である場合に
は、抗体として、一種類以上の抗サルモネラ菌モノクロ
ーナル抗体または抗サルモネラ菌ポリクローナル抗体を
用い得る。

【００２６】本発明の細菌検出方法において、捕捉した
細菌を細菌増殖培地に転写させることを意図する場合、
上記抗体は、試料からの細菌の捕捉およびその後の転写
を効率良く行い得る範囲の結合親和力を有する。結合親
和力の程度は、「力価（タイター）」、すなわち、抗原
ペプチドへの結合が観察される最大の希釈倍率を用いて
表現され得る。具体的には、本発明における好適な抗体
のタイターは、１／１００〜１／１００００程度の範囲
である。

【００２７】本発明の細菌検出方法で用いられる免疫ク
ロマトデバイスは、上記試料泳動体において、細菌捕捉
部に対して、試料導入部とは反対側に、吸水部をさらに
含み得る。吸水部は、過剰の試料を迅速に吸収するため
に用いられる部分であり、優れた吸水力および給水容量
を有する多孔質物質から構成される。多孔質物質の例と
しては、ガラス繊維ろ紙、セルロースが挙げられる。

【００２８】本発明の細菌検出方法で用いられる免疫ク
ロマトデバイスの構成を、図１に例示する。図１に示す
ように、細菌捕捉部１０２の一方の端の上に試料導入部
１０１を、そして反対側の端の上に吸水部１０３を接着
させることにより、試料泳動体が組み立てられる。ある
いは、試料導入部１０１、細菌捕捉部１０２および吸水
部１０３を順次配置して、試料泳動体を組立ててもよ
い。細菌捕捉部は、検出対象である細菌に特異的に結合
し得る抗体が固定化された領域１０６を含む。試料泳動
体は、両面テープ１０４に貼り付けられ、そして両面テ
ープ１０４を介して、支持体１０５上に保持される。

【００２９】（細菌増殖培地）本発明の細菌検出方法で
は、捕捉した細菌を増殖させるための細菌増殖培地をさ
らに用いる。

【００３０】細菌増殖培地は、検出対象である細菌の増
殖を支持する任意の培地である。培地の成分の例として
は、アンモニア塩、硝酸塩、硫酸塩、塩化物塩、リン酸
塩、カリウム塩、マグネシウム塩などの無機塩；有機
塩；システインなどのアミノ酸；牛乳カゼイン、獣肉、
ダイズタンパク質などの種々のタンパク質を、ペプシ
ン、トリプシン、パパインなどのタンパク質分解酵素ま
たは酸で部分的に加水分解することにより得られる、種
々のペプトン；グルコース、マルトース、シュクロー
ス、デンプン（例えば、溶性デンプン）などの糖；ヘモ
グロビンなどのタンパク質；酵母抽出物、臓器抽出物
（脳抽出物、心臓抽出物、肝臓抽出物、肺抽出物）など
の抽出物；および発育素などの増殖因子が挙げられる。

【００３１】当業者は、検出対象である細菌に対応して
適切な培地を選択し得る。好ましい培地の例としては、
トリプテックソイブロス、ブレインハートインフュージ
ョン血液培地、およびチョコレート培地が挙げられる。
トリプテックソイブロスは、一般的な細菌および栄養要
求の厳しい細菌のいずれも増殖させ得、例えば、サルモ
ネラ菌の増殖に好適である。

【００３２】トリプテックソイブロス液体培地の組成
は、溶媒を水として培地１リットルあたりペプトン１５
ｇ、ダイズペプトン５ｇ、および塩化ナトリウム５ｇ
（ｐＨ７．２）であり、寒天培地の場合には、この組成
にさらに寒天を約１０〜２０ｇ含み得る。

【００３３】ブレインハートインフュージョン血液培地
の組成は、溶媒を水として培地１リットルあたり牛脳エ
キス末７．５ｇ、ハートエキス末８ｇ、ペプトン１０
ｇ、グルコース２ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、およびリン
酸一水素カリウム２．５g（ｐＨ７．２）であり、寒天
培地の場合には、この組成にさらに寒天を約１０〜２０
ｇ含み得る。ブレインハートインフュージョン血液培地
は、例えば、日水製薬から「ブレインハートインヒュー
ジョンブイヨンニッスイ」として市販される。

【００３４】チョコレート液体培地の組成は、溶媒を水
として培地１リットルあたりペプトン１５ｇ、溶性デン
プン１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、リン酸一水素カリウム
４．７ｇ、リン酸二水素カリウム０．４ｇ、発育素４．
３ｇ、Ｌ−システイン０．２５ｇ、およびヘモグロビン
１０．０ｇ（ｐＨ７．２）であり、寒天培地の場合に
は、この組成にさらに寒天を約１０〜２０ｇ含み得る。
チョコレート寒天培地は、例えば、日水製薬から「ニッ
スイプレートチョコレート寒天培地ＥＸ」として市販
される。

【００３５】細菌増殖培地は、固体および液体を含む任
意の形態であり得る。捕捉した細菌を細菌増殖培地に転
写させることを意図する場合には、固体培地が好まし
い。免疫クロマトデバイスに細菌増殖培地を添加するこ
とを意図する場合には、好ましくは、免疫クロマトデバ
イスの多孔質担体を通過しない程度の粘度を有する粘稠
な液体または柔らかいゲル状の半固体培地、または固体
培地である。培地は、例えば、寒天、アガロース、アガ
ロペクチン、カラギーナン、ジェランガムなどから選択
されるゲル化剤を含むことにより、半固体または固体の
形態に調製され得る。

【００３６】培地は、当該分野で公知の方法により調製
される。例えば、液体培地は、水に培地成分を溶解し、
必要に応じてｐＨを適切に調整することにより調製され
る。当業者は、各種の検出対象細菌に対応して適切な培
地ｐＨを選択し得る。固体培地は、液体培地を調製した
後、ゲル化剤を加え、加熱してゲル化剤を溶解させた
後、適切な容器に培地を分注し、ゲル化剤の融点より低
い温度まで温度を下げることにより、ゲル化させ得る。
雑菌の繁殖を防ぐため、調製後、培地を殺菌もしくは滅
菌することが好ましい。培地の殺菌条件は当該分野で公
知であり、例えば、１気圧、１２０℃にて１５分間の高
圧蒸気滅菌が用いられ得る。種々の培地は、培地成分の
混合物として、または調製済みの培地として市販されて
おり、容易に入手し得る。

【００３７】細菌増殖培地を含むデバイスは、細菌増殖
培地を任意の形状の容器に収容して提供され得る。容器
の形状の例として、プレート、ディッシュ、ビーカー、
フラスコ、チューブ、セル、バイアル、ボトルなどが挙
げられる。細菌増殖培地を含むデバイスは、免疫クロマ
トデバイス上に固定化された細菌を転写するために用い
得る（この場合のデバイスを「転写用デバイス」とも呼
ぶ）。転写用デバイスは、プレート、ディッシュなどの
ように開口部が大きい形状であって、開口部から露出し
た細菌増殖培地の表面が、免疫クロマトデバイス上の抗
体が固定化された領域の面積よりも大きい面積の平面を
有することが好ましい。転写用デバイスは、さらに、開
口部を覆って細菌増殖培地の乾燥を防ぐための任意のシ
ートを備え得る。シートは、水分を透過させない限り任
意の材質および厚さで作製され得る。シートの材料の例
としては、ポリエチレン、塩化ビニル共重合体、塩化ビ
ニル酢酸ビニル共重合体などが挙げられる。透明シート
をかぶせた寒天培地パッドの例を図２に示す。

【００３８】他方、細菌増殖培地は、免疫クロマトデバ
イス上の少なくとも固定化された抗体を含む領域に添加
され得る（この場合のデバイスを「添加用デバイス」と
も呼ぶ）。添加用デバイスは、それぞれの形態の培地
を、その添加に適した任意の形状の容器に収容して提供
され得る。当業者は培地の形態などに応じて適切なデバ
イスを選択し得る。

【００３９】細菌増殖培地のための容器の材質は、特に
限定されないが、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネートのようなプラス
チック；ガラス；シリコン樹脂が挙げられる。容器に収
容される試薬の容量は、免疫クロマトデバイスの大き
さ、特に固定化された抗体の量を考慮して適宜設定され
得、代表的には約０．１ｍＬ〜約１Ｌ、好ましくは約１
ｍＬ〜約１００ｍＬであり得る。

【００４０】（細菌検出方法およびキット）本発明の細
菌検出方法では、まず、上記のような、少なくとも試料
導入部と細菌捕捉部とを有する試料泳動体と、検出対象
である細菌に特異的に結合し得る抗体とを包含する免疫
クロマトデバイスの試料導入部に試料を導入して細菌を
抗体に結合させる。試料は、免疫クロマトデバイスの試
料導入部に添加されると、試料導入部から細菌捕捉部を
通過する方向へと泳動する。細菌捕捉部中の抗体固定化
領域に到達した検出対象細菌は、検出対象に特異的に結
合し得る抗体と結合して固定化される。抗体と結合しな
い細菌および試料中の他の成分は、細菌捕捉部を通過し
て移動する。試料の泳動は、好ましくは、抗体と結合し
ない細菌および他の成分が実質的に細菌捕捉部に残留し
なくなるのに十分な時間、行われる。

【００４１】抗体に結合した細菌は、細菌増殖培地を用
いて増殖させる。細菌増殖培地は、例えば、免疫クロマ
トデバイスの細菌捕捉部のうちの少なくとも抗体固定化
領域に添加され得る。好ましい一態様においては、細菌
増殖培地は、細菌捕捉部以外、特に吸水部には接触しな
いように添加される。このように位置選択的に細菌増殖
培地を添加することにより、検出対象以外の細菌の増殖
を容易に防止し得るという利点がある。他方、免疫クロ
マトデバイス全体に細菌増殖培地を添加することも可能
であり、この場合、他の細菌を拡散させない程度に半固
体または固体の培地を用い、そして細菌の検出を、細菌
捕捉部でのみ行なうことが好ましい。免疫クロマトデバ
イス全体に細菌増殖培地を添加することは、免疫クロマ
トデバイスが小さい場合でも操作が行い易い、および測
定対象細菌の検出を自動化し易いなどの利点がある。

【００４２】あるいは、免疫クロマトデバイス上の少な
くとも固定化された抗体を含む領域は、液体の細菌増殖
培地を含むデバイス中の当該培地に浸漬され、そしてイ
ンキュベートされ得る。このような浸漬法も、細菌増殖
培地がクロマトデバイス上に「添加される」態様に含ま
れる。この場合、吸水部を取り外した免疫クロマトデバ
イスを浸漬することが好ましい。

【００４３】以上のように培地が添加された免疫クロマ
トデバイスは、検出対象である細菌の増殖に好都合な温
度（一般に、約２０℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃
〜約４５℃でインキュベートされ得る。好ましくは、培
地の乾燥を防ぐために、培地が添加された免疫クロマト
デバイスを、水分が蒸発しにくい収容装置に入れた状態
で、または多湿条件を維持するための他の任意の手段を
伴って、インキュベートされる。当業者は、種々の検出
対象の細菌の特性に対応して、嫌気性または好気性条件
を含む種々の要因について適切な培養条件を選択し得
る。

【００４４】抗体に結合した細菌はまた、細菌増殖培地
を含むデバイスに転写され、転写の過程で、または転写
後にインキュベートされ得る。細菌が固定化された後
に、免疫クロマトデバイスの細菌捕捉部のうちの少なく
とも抗体固定化部を含む領域と、転写用デバイス中の細
菌増殖培地の表面とを接触させ、次いで抗体固定化部を
含む領域と、細菌増殖培地を含む転写用デバイスとを引
き離す。これにより、検出対象細菌は、免疫クロマトデ
バイス上に固定化された抗体から剥がれて、細菌増殖培
地に転写される。免疫クロマトデバイスの細菌捕捉部の
うちの少なくとも抗体固定化領域と細菌増殖培地の表面
とは、例えば、細菌増殖培地を含む転写用デバイスを免
疫クロマトデバイスの上に反転して重ねることにより、
または逆に免疫クロマトデバイスを転写用デバイスの上
に反転して重ねることにより、接触させ得る。免疫クロ
マトデバイスを、デバイス中の細菌増殖培地の表面と接
触させた状態のままインキュベートを行っても、転写後
にインキュベートを開始してもよい。免疫クロマトデバ
イスを、デバイス中の細菌増殖培地の表面と接触させた
状態のままインキュベートする場合、接触（すなわち、
インキュベート）を行う時間は、代表的には約３０分間
以上、好ましくは約６０分間〜１２時間であり得る。転
写後にインキュベートを行う場合、接触時間は、代表的
には約１０秒間以上、好ましくは約１０秒間〜１０分間
であり得る。インキュベート条件は、上記に準ずる。転
写用デバイスを用いる場合、検出対象でない細菌を含む
可能性がある吸水部は、細菌増殖培地と接触させないこ
とが好ましい。

【００４５】次いで、増殖させた細菌が検出される。細
菌の検出は、形成されるコロニーの数をカウントするこ
と；または細菌増殖培地に細菌検出試薬に由来する細菌
増殖培地の呈色度の測定によって行なわれ得る。細菌検
出試薬は予め細菌増殖培地に含まれていてもよく、上記
インキュベート終了後に添加されてもよい。好ましく
は、細菌増殖培地は、予め細菌検出試薬を含む。本明細
書中では、「細菌検出試薬」とは、検出対象細菌の作用
により外部から観測し得る変化を与える物質であり、例
としては、ｐＨ指示薬、発色性酵素基質、不溶性の塩を
形成し得るイオンなどが挙げられる。ｐＨ指示薬の例と
しては、ブロムフェノールブルー、フェノールレッドな
どが挙げられる。発色性酵素基質の例としては、ペルオ
キシダーゼの基質、β-ガラクトシダーゼの基質（例え
ば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド、すなわちｘ−ｇａｌ）などが挙げられ
る。例えば、検出対象細菌がサルモネラ菌である場合、
サルモネラ菌は硫化水素を放出するため、細菌検出試薬
は、鉄イオン、銀イオンなどの硫化水素検出指示薬であ
り得る。培地に予め添加する場合、細菌の成育を妨げな
い（毒性のない）イオンであることが好ましい。細菌検
出試薬を用いることにより、コロニー形成が確認できな
い程度の極少量の細菌を可視化することができ、コロニ
ーの数をカウントするよりも容易にかつ迅速に細菌を検
出し得る。試料中の検出対象細菌は、抗体検出試薬によ
る細菌増殖培地の着色または変色に基づいて、目視また
は吸光光度計での測定などにより検出し得る。

【００４６】本発明のキットは、上記の免疫クロマトデ
バイスと、細菌増殖培地を含むデバイスとを備える。本
発明のキットはさらに、細菌検出試薬を備え得る。細菌
検出試薬は、細菌増殖培地を含むデバイスに予め混合さ
れていてもよいし、免疫クロマトデバイスまたは細菌増
殖培地を含むデバイスとは異なる容器に収容されてもよ
い。本発明のキットの各成分は、通常、雑菌の混入を避
けるために包装により密封され、適切な使用説明書と共
に梱包されて提供され得る。

【００４７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。

【００４８】＜実施例＞以下に、本発明の細菌検出法を
利用する、サルモネラ菌検出の具体例を示す。

【００４９】（サルモネラ菌抗体の固定化）約５ｃｍ×
約０．９ｃｍのニトロセルロース（ミリポア社製）の短
辺の端から２ｃｍの上に、抗サルモネラ菌ポリクローナ
ル抗体１ｍｇ／ｍＬを含有するリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）溶液１０μＬを、ニトロセルロースの長辺に
対して垂直方向に端から端まで幅約１ｍｍのライン状に
滴下し、その後、４０℃２０分間遮光状態で乾燥するこ
とにより、抗サルモネラ菌ポリクローナル抗体を固定化
した。用いた抗サルモネラ菌ポリクローナル抗体の、サ
ルモネラ菌に対するタイターは、１／２０００であっ
た。得られた固定化ニトロセルロースを、１％スキムミ
ルクを含有する０．１Ｍトリス溶液（ｐＨ８．２）に浸
潤し、３０℃３０分間シェイカーにて振盪することによ
り、ブロッキングした。ブロッキング後、ニトロセルロ
ースを、０．１Ｍトリス溶液（ｐＨ８．２）で３０℃３
０分間にて３回洗浄した後、インキュベーター内で４０
℃にて４時間乾燥させた。乾燥後の抗体固定化ニトロセ
ルロースを、細菌捕捉部の多孔質担体として用いた。

【００５０】（免疫クロマトデバイスの構築）試料導入
部１０１および吸水部１０３の多孔質担体としては、そ
れぞれ、約２ｃｍ×約０．９ｃｍのガラス繊維片を用い
た。

【００５１】約７ｃｍ×約０．９ｃｍの両面テープ１０
４を、約７ｃｍ×約０．９ｃｍのポリビニル板の支持体
１０５の表面に張った。両面テープ１０４の反対側に、
上記の抗サルモネラ菌抗体固定化ニトロセルロース（細
菌捕捉部１０２）を接着し、次いでこのニトロセルロー
スの両端に、それぞれ試料導入部１０１および吸水部１
０３を、図１に示す配置と同様にして、ただし、試料導
入部１０１の一部と細菌捕捉部１０２の一部、および吸
水部１０３の一部と細菌捕捉部１０２の一部がかさなる
ように接着させることによって試料泳動体１００を構成
し、免疫クロマトデバイスを作製した。試料導入部は上
流側になり、吸水部は下流側になる。

【００５２】（サルモネラ菌分散液の泳動）サルモネラ
菌分散液２００μｌ（１、５、１０、１００、または１
０００細胞／ｍｌ）を、上記で作製した免疫クロマトデ
バイスの試料導入部１０１に添加し、５分間放置した。
この間に、添加された分散液は、試料導入部１０１か
ら、細菌捕捉部１０２中の抗体固定化部１０６を通過し
て吸水部１０３へと泳動した。

【００５３】（サルモネラ菌の培養）サルモネラ菌分散
液を試料導入部に添加して５分後の免疫クロマトデバイ
ス（図３（ａ））に、図２に示す培養パッド（本発明に
おける転写用デバイス）の透明シートを剥がし、反転さ
せて、寒天培地の表面が細菌捕捉部を含む領域に重なる
ように培養パッドを装着した（図３（ｂ））。図２に示
す培養パッドは、厚さ５ｍｍのポリスチレン製の２ｃｍ
×２ｃｍの培養プレートに、２ｍＬのトリプテックソイ
ブロス寒天培地を含んでいた。この培養パッドは、日水
製薬から、ニッスイプレートトリプトソーヤ固体寒天
培地（ＳＣＤ寒天培地：溶媒を水として培地１リットル
あたりペプトン１５ｇ、ダイズペプトン５ｇ、および塩
化ナトリウム５ｇ、および寒天１５ｇ（ｐＨ７．２））
を含むプレートとして市販される。

【００５４】次いで、培養キットと免疫クロマトデバイ
スとを重ねた状態のまま、４０℃にて５時間、好気条件
下でインキュベーションした（図３（ｃ））。インキュ
ベーション終了後、培養キットを、免疫クロマトデバイ
スから剥がすことにより、増殖した細菌を寒天培地に転
写した。寒天培地上のコロニー数を目視によりカウント
した（図３（ｄ））。その結果、サルモネラ菌分散液の
濃度が１細菌／ｍｌである場合まで検出可能であった
（図４）。このように、本発明の方法によれば、選択的
に、非常に高感度でかつ迅速に細菌を検出し得る。

【００５５】

【発明の効果】本発明の細菌検出方法を用いることによ
り、検出対象細菌を、選択的に、高感度かつ迅速に高い
信頼度で検出し得る。本発明により、環境測定、食品管
理測定及び医療診断の分野で有用な高性能の細菌検出キ
ットが提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いられる免疫クロマトデバイスの構
成図である。

【図２】図２は実施例で用いられた培養パッドを示す模
式図である。

【図３】図３は本発明の方法による細菌検出の作業プロ
セスを示す模式図である。（ａ）は、細菌を含む試料を
添加した免疫クロマトデバイスを示す。（ｂ）は、細菌
を含む試料を泳動した後の免疫クロマトデバイスに、培
養パッドを装着する操作を示す。（ｃ）は、免疫クロマ
トデバイスの少なくとも抗体固定化領域と、培養パット
に含まれる寒天培地とを接触させた状態で培養すること
を示す。（ｄ）は、培養後、免疫クロマトデバイスから
剥がした寒天培地上に形成されたコロニーのカウントを
示す。

【図４】本発明の実施例によるサルモネラ菌の検出感度
を示すグラフである。

【符号の説明】

１０１試料導入部１０２細菌捕捉部１０３吸水部１０４両面テープ１０５支持体１０６抗体固定化領域

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の細菌の検出方法であって、少なくとも試料導入部と細菌捕捉部とを有する試料泳動
体と、検出対象である細菌に特異的に結合し得る抗体と
を備えた免疫クロマトデバイスを提供する工程であっ
て、該抗体は該細菌捕捉部に固定化されている、工程；
該試料導入部に試料を導入して該細菌を該抗体に結合さ
せる工程；該抗体に結合した細菌を、細菌増殖培地を用
いて増殖させる工程；および該増殖させた細菌を検出す
る工程を包含する、方法。
【請求項２】前記細菌増殖培地が、前記免疫クロマト
デバイス上の少なくとも固定化された前記抗体を含む領
域に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記抗体に結合した細菌が、前記細菌増
殖培地を含むデバイスに転写される、請求項１に記載の
方法。
【請求項４】前記細菌増殖培地が、細菌検出試薬を含
む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】前記細菌検出試薬が、ｐＨ指示薬、発色
性酵素基質、および不溶性の塩を形成し得るイオンから
なる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記細菌が、以下の分類のいずれかに属
する、請求項１に記載の方法：ロドスピリルム、クロマ
チア、クロロビウム、ミクソコッカス、アルカンギウ
ム、シストバクター、ポリアンギウム、サイトファー
ガ、ベギアトア、シモンシエラ、リューコトリックス、
アクロマチウム、ペロネーマ、スピロヘータ、スピリル
ム、シュードモナス、アゾトバクター、リゾビウム、メ
チロモナス、ハロバクテリウム、腸内細菌、ヴィブリ
オ、バクテロイデス、ナイセリア、ヴェイヨネラ、アン
モニアまたは亜硝酸化細菌、硫黄代謝細菌、酸化鉄およ
び／または酸化マンガン沈着細菌、シデロカプサ、メタ
ノバクテリウム、好気性または通性嫌気性ミクロコッカ
ス、ストレプトコッカス、嫌気性ペプトコッカス、バチ
ルス、乳酸桿菌、コリネフォルム細菌、プロピオン酸
菌、アクチノミセス、マイコバクテリウム、フランキ
ア、アクチノプラーネス、デルマトフィルス、ノカルデ
ィア、ストレプトミセス、ミクロモノスポラ、リケッチ
ア、バルトネラ、アナプラズマ、クラミディア、マイコ
プラズマ、およびアコレプラズマ。
【請求項７】試料中の細菌を検出するためのキットで
あって、免疫クロマトデバイスと、細菌増殖培地を含む
デバイスとを包含し、ここで、該免疫クロマトデバイス
は、少なくとも試料導入部と細菌捕捉部とを有する試料
泳動体と、検出対象である細菌に特異的に結合し得る抗
体とを備え、該抗体は該細菌捕捉部に固定化されてい
る、キット。
【請求項８】前記細菌増殖培地を含むデバイスが、該
細菌増殖培地を、前記免疫クロマトデバイス上の少なく
とも固定化された前記抗体を含む領域に添加するのに適
した構造である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】前記細菌増殖培地を含むデバイスが、前
記抗体に結合した細菌を転写するのに適した構造であ
る、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】前記細菌増殖培地が、細菌検出試薬を
含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１１】前記細菌検出試薬が、ｐＨ指示薬、発
色性酵素基質、および不溶性の塩を形成し得るイオンか
らなる群より選択される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】前記細菌が、以下の分類のいずれかに
属する、請求項７に記載のキット：ロドスピリルム、ク
ロマチア、クロロビウム、ミクソコッカス、アルカンギ
ウム、シストバクター、ポリアンギウム、サイトファー
ガ、ベギアトア、シモンシエラ、リューコトリックス、
アクロマチウム、ペロネーマ、スピロヘータ、スピリル
ム、シュードモナス、アゾトバクター、リゾビウム、メ
チロモナス、ハロバクテリウム、腸内細菌、ヴィブリ
オ、バクテロイデス、ナイセリア、ヴェイヨネラ、アン
モニアまたは亜硝酸化細菌、硫黄代謝細菌、酸化鉄およ
び／または酸化マンガン沈着細菌、シデロカプサ、メタ
ノバクテリウム、好気性または通性嫌気性ミクロコッカ
ス、ストレプトコッカス、嫌気性ペプトコッカス、バチ
ルス、乳酸桿菌、コリネフォルム細菌、プロピオン酸
菌、アクチノミセス、マイコバクテリウム、フランキ
ア、アクチノプラーネス、デルマトフィルス、ノカルデ
ィア、ストレプトミセス、ミクロモノスポラ、リケッチ
ア、バルトネラ、アナプラズマ、クラミディア、マイコ
プラズマ、およびアコレプラズマ。