JP2014505235A - 微生物の検出および定量方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、試料中の少なくとも１つの微生物を検出するための方法であって、微生物に特異的な少なくとも１種のリガンドおよびリガンドよりも微生物に対する親和性が低い少なくとも１種のスカベンジャーの存在下における液体培地中での試料を培養するステップであって、リガンドへの化合物の結合によって第１の測定可能なシグナルが産生され、スカベンジャーへの化合物の結合によって第２の測定可能なシグナルが産生されるステップ；少なくとも１つの培養期間について第１および第２シグナル値を決定するステップを含み、ここで、同一培養期間に関して第１シグナルおよび第２シグナルの値が異なる場合に、試料は微生物を含むと推定される、方法に関する。
【選択図】図２

Description

本発明は、試料中の微生物の検出および定量方法に関する。
特定の試料の生きている微生物を検出することは、特に医療分野および食品加工業において極めて重要である。
検出の標準的な方法は、被検査微生物を同定するための十分な数の微生物を得るのに数日を要すことが多い、微生物培養のままである。患者に由来する試料を用いてテストする場合は、結果を得る前のこの遅れは、広域性の予防的抗生物質が患者へ投与される必要があることを意味することが多い。したがって病原性細菌の場合には、抗生物質耐性株の数の増加は、特定の細菌ではなく多数の他の細菌種を標的するこの薬物プロトコールの起こり得る結果である。
細菌学的診断は、慣習的に２つのステップで行われる。
− 十分な細菌数を獲得し問題とする細菌を分離するための、一般に固形培地上で行う、細菌を生育させる第１フェーズ。この段階では、固形の培養培地上でのコロニーの形状調査によって、予備的な細菌同定が可能になる。加えて、このフェーズは、培養培地の酸性化または例えば光散乱による培地の光学特性の変化に基づく、液体培地で培養することによる細菌の非特異的な検出をしばしば伴い、これによって、試料中に細菌が存在する可能性について見当がつく。
− 特定の細菌種の結果を得るために、選択培地で生育させ、次に最も大きな特性から最も詳細なことまでにわたって生化学的および免疫学的特徴を二分式検索表に従って調査することによって、細菌を同定する第２フェーズ。
医学的適用では、治療処置前にさらなるステップが必要になることが多い。これは、薬局方の様々な抗生物質に対する細菌の抵抗性レベルを検査するために、耐性記録を実施することにある。
この方法は、少なくとも２４時間の生育を必要とし、特定の細菌種に関しては、視覚識別前に数日までの培養を必要とする。いずれにしても、解析するのに要する時間の長さが極めて重要であり、増菌および解析ステップが非常に長い（１日から数日）。
この遅さを低減するために、細菌の生育を検出するためのより速いｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法が開発されてきた。しかし、これら全てのアプローチは、最初の、試料中に存在する細菌数を増加させるための培養フェーズ、その後の、少なくとも１つの同定および特徴づけのフェーズを含む、多段階システムに基づく。
細菌の生育をモニタリングするための自動装置が最近市場に投入されており、例えばＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＢａｃｔｅｃ９０００およびＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＢａｃＴ／Ａｌｔｅｒである。こうした自動装置は、細菌が増殖する間に放出されるＣＯ２をアッセイすることに基づいて機能する。血液培養に関してこうした自動装置を使用することによって、特に血液培養中の検査感度を増大させることが可能になり、その結果、応答時間を減少させることが可能になった（Ｌａｍｙら（２００５）Ｂｉｏｔｒｉｂｕｎｅ１６：３７〜３９；Ｃｒｏｉｚｅｔら（２００７）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ１６０：４５〜５１）。しかし、こうした自動装置によって、細菌の属および種を具体的に同定できるようにはならない。
ごく最近、Ａｃｃｅｌｒ８という企業が、化学的に官能化されたポリマーの表面に非特異的に細菌を吸着する微小流体濃縮装置を発売した。この場合、微生物の生育の検出は、前記微生物の同定に先行する。実際には、細菌を最初に支持体上で増殖させ、次に免疫蛍光法に基づいて確認し、続いて顕微鏡検査で解析する。培養とその後の検出の２つのステップが連続的に行われるので、この方法は、それでも比較的面倒であることに留意するべきである。
付随する光学系を用いてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子を検出するためのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の濃縮用電気パルスシステムを含むかなり類似している方法が、Ｚｏｕｒｏｂら（２００５）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ５：１３５０〜１３６５によって開発された。この方法は、いかなる培養も必要とせず、試料中に存在する胞子を直接的に検出する。しかし、この方法は、かなり複雑なマイクロシステムの使用を必要とする。
電気化学検出法を用いる技術も提唱されている。最も有効なものは、インペディメトリック（ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ）原理に基づく（Ｙａｎｇら（２００４）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：１１０７〜１３；Ｈｕａｎｇら（２０１０）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２５：１２０４〜１１）。こうした方法は、プローブとしてレドックスメディエーターの使用を必要とすることが多い。この場合、約１から１０ｍＭの濃度で使用されるメディエーター、典型的にはヘキサシアノフェレートがアッセイ培地に補充される。比較的高濃度（ｍＭ）のこの種類の化合物の被検出微生物への影響はまだ正しく理解されておらず、生物媒質の干渉源となる恐れがあるので、これは、大きな欠点を残したままである。
トレーサーを含まない光学技術は、原理上外来性化合物を添加しないで済ますことができるので、より直接的である。Ｔａｙｌｏｒら（２００６）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２２：７５２〜７５８によって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術が細菌溶解物の検出に適用された。この場合、検出に先行して細菌が溶解され、次に特異的な二次抗体と結合することによってシグナル増幅される。１０４から１０６細菌／ｍｌの間の検出限界が達成される。したがってこの方法は、こうした閾値を達成するために非常に汚染された試料または前培養のいずれかを必要とする。さらに、検出が細菌溶解物について行われることを考えれば、この方法は生きている細菌の同定に適さない。
最後に、マイクロカンチレバーを用いてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒおよびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ胞子の発芽の検出を可能にする他の研究が報告されている（Ｎｕｇａｅｖａら（２００７）Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｍｉｃｒｏａｎａｌ．１３：１３〜１７；Ｎｕｇａｅｖａら（２００５）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２１：８４９〜８５６）。この種類の検出は湿潤チャンバーの空気中で行われ、液体培地で行うことができないという欠点を有する。さらに、前もって捕えておいた菌の胞子発芽の検出にしか適用できない。
Ｌａｍｙら（２００５）Ｂｉｏｔｒｉｂｕｎｅ１６：３７〜３９ Ｃｒｏｉｚｅｔら（２００７）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ １６０：４５〜５１ Ｚｏｕｒｏｂら（２００５）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ５：１３５０〜１３６５ Ｙａｎｇら（２００４）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：１１０７〜１３ Ｈｕａｎｇら（２０１０）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２５：１２０４〜１１ Ｔａｙｌｏｒら（２００６）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２２：７５２〜７５８ Ｎｕｇａｅｖａら（２００７）Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｍｉｃｒｏａｎａｌ．１３：１３〜１７ Ｎｕｇａｅｖａら（２００５）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２１：８４９〜８５６ Ｇｒｏｓｊｅａｎら（２００５）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４７：１９３〜２００ Ｇｕｅｄｏｎら（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：６００３〜６００９ Ａｔｔａｌｉら（２００８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．７６：４６６〜７６
本発明は、微生物培養とリガンドが微生物に特異的に結合することにより発生する差動シグナルの測定との連結（すなわち、培養と差動シグナルの測定が同時に行われる）が、通常技術と比較して、微生物検出の閾値を低下させ有意に解析時間を減少させることを可能にしたという本発明者らの知見に基づく。
したがって、本発明は、試料中に存在する少なくとも１つの微生物を検出するための方法であって、
− 微生物に対して特異的な少なくとも１種のリガンドおよびリガンドの親和性よりも微生物に対する親和性が低い少なくとも１種のセンサーの存在下で、液体培地中で試料を培養するステップであって、リガンドへの化合物の結合によって第１の測定可能なシグナルが産生され、センサーへの化合物の結合によって第２の測定可能なシグナルが産生されるステップ、
− 少なくとも１つの培養時間について第１および第２シグナル値を決定するステップ
を含み、ここで、同一培養時間に関して第１シグナルおよび第２シグナルの値が異なる場合に、試料は微生物を含むと推定される、方法に関する。
本発明による方法の特定の実施形態では、試料が微生物を含む場合は、培養開始時に試料中に存在する微生物の量もまた、培養時間の関数としての第１シグナル値の変化から決定される。
本発明による方法の別の実施形態では、試料が微生物を含む場合は、少なくとも１種の抗菌剤に対する微生物の感受性が、抗菌剤を培養物に入れた後の培養時間の関数としての第１シグナル値の変化から決定される。
本発明は、上記で定義されたような方法を実施するのに適した装置であって、液体培地中での微生物培養に適した少なくとも１つのチャンバーを備え、このチャンバーは微生物に対して特異的な少なくとも１種のリガンドおよび微生物に対して親和性を持たない少なくとも１種のセンサーを備え、リガンドへの化合物の結合によって第１の測定可能なシグナルが産生され、センサーへの化合物の結合によって第２の測定可能なシグナルが産生され、調査する液体培地と接触するようにリガンドおよびセンサーが支持体に取り付けられている、装置にも関する。
本明細書で理解されるように、微生物は、好ましくは単細胞または多細胞の原核生物または真核生物である。しかし、微生物が多細胞の場合は、多細胞微生物を構成する細胞は分化の観点から好ましくは均一であり、すなわち微生物は、種々の特殊化した細胞を含まない。好ましくは、本発明に係る微生物は生きている微生物であり、すなわち微生物は増殖することができる。さらに、本発明に係る微生物は、好ましくは単細胞微生物である。この点で、その発達または生殖段階によって、本発明に係る微生物は単細胞形態の多細胞生物でもよい。加えて、本発明に係る微生物はまた、後生動物の分離細胞または分離組織断片から構成されていてもよい。したがって本発明に係る微生物はまた、哺乳動物細胞、特にヒト細胞、例えば腫瘍細胞または血液細胞、例えばリンパ球または末梢血単核球でもよい。したがって、好ましくは本発明に係る微生物は、細菌、真菌、酵母、藻類、原生動物および後生動物の分離細胞からなる群から選択される微生物、特に単細胞微生物である。特に好ましくは、本発明に係る微生物は細菌、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌である。
本発明に係る試料は、それが微生物を含み得る限りにおいてどのような種類でもよい。好ましくは、本発明に係る試料は、生物試料、食品試料、水試料、特に排水、淡水もしくは海水試料、土壌試料、汚泥試料または大気試料からなる群から選択される。本発明に係る生物試料は、生きている生物または生きていた生物に由来し、特に動物または植物のものである。動物、特に哺乳動物に由来する試料は、液体でもよいし固体でもよく、特に、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、糞便、滑液、精液、膣分泌物、口内分泌物、特に肺、鼻もしくは咽頭由来の呼吸器検体、膿汁、腹水または皮膚もしくは結膜漿液の検体を含む。好ましくは、本発明に係る食品試料は、特に未加工の、料理されたもしくは調理された食品、食品原料、香辛料または前もって調理された食事に由来する。さらに好ましくは、本発明に係る試料は、本発明による培養にかけられる前に精製または濃縮されない。
当業者に明らかなように、本発明による液体培地中での培養は、培養にかけられる試料中に存在する可能性がある、検出を目的とする微生物を増殖させるために行われる。液体培地中での微生物培養に関する技術および条件は当業者に周知であり、当業者なら、それぞれの微生物に関して、特に、適切な栄養培地、最適な生育温度（例えば哺乳動物に対して病原性のある多くの細菌については３７℃）、さらに本発明に係る微生物の増殖に必要とされる雰囲気の決め方を知っている。さらに、弱い選択培養培地、すなわち、異なる種類の多数の微生物の生育を可能にする培地が優先的に使用される。培養時間は、その生育速度およびその世代時間、すなわち微生物が２つの娘微生物に分裂するのに必要な時間によって、それぞれの微生物に適合させることもできる。好ましくは、本発明による培養時間は、娘微生物の連続的な少なくとも２世代をもたらすのに必要な時間以上であり、したがって、このことにより、少なくとも１回の４倍増、すなわち、検出される微生物数の４倍の増殖が可能になる。当業者は、培養において微生物数の４倍増を実際に観察する必要はないことを容易に理解するであろう。なぜならば、被検出微生物は本発明に係る試料にいなくてもよいが、培養時間は、本発明の方法の条件と同一条件下で行われる実際に微生物を含む培養において微生物数の４倍増を得る時間に少なくとも相当するからである。したがって、本発明による培養時間については、被検出微生物の世代時間または倍加時間の２倍と少なくとも等しくなることも好ましい。当業者がよく理解するように、本発明による世代または倍加時間は、本発明による培養条件下で得ることができるものである。一般に、培養時間は７２時間、４８時間または２４時間未満である。加えて、求める情報、すなわち、検出、量の決定、または抗菌剤に対する感受性を得ることが可能になり次第、培養を止めてもよい。
有利には、本発明の方法は感度がよく、通常、特にバイオセンサーを使用して直接的に検出不可能な低濃度の微生物、例えば１に等しいまたは１０、１０２もしくは１０３微生物／ｍｌ未満を含む試料中の微生物の存在を検出することを可能にする。したがって、本発明の方法は、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２もしくは１０微生物／ｍｌ以下または１微生物／ｍｌに等しい濃度で被検出微生物を含むことが疑われる試料に好ましくは適用される。
本発明によるリガンドは、微生物またはいくつかの関連微生物に特異的に結合することを可能にする任意の種類のものである。特にそれは以下のものでもよい。
− 微生物に対する天然のレセプター。例えば、多糖類の糖または複合脂質、すなわち少なくとも１つの非脂質基を含む、特にタンパク質、炭水化物、リン含有または窒素含有型の脂質；タンパク質または糖タンパク質、例えばプラスミノーゲン（例えばそれはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のいくつかの細菌種に結合する）；バクテリオファージまたはウイルスの全体（場合により不活性化されたバクテリオファージもしくはウイルスの断片またはバクテリオファージもしくはウイルスのタンパク質）、
− 免疫グロブリン。例えば、プロテインＡまたはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）断片を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌によって結合され得る、特異的に抗原を標的化する可変部または定常部を含む抗体およびその断片、特に可変部を含むその断片。
− 合成化合物、特に、
・特に１から１００個の炭素原子を含む有機低分子、
・ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）などのペプチド性化合物、
・アプタマーなどのポリヌクレオチド性化合物、または
・多糖類性化合物、
− 生きている生物または組織の粉砕した材料、ライセートまたは抽出物；
− 微生物を吸着する表面を有する合成材料、または
− 上記で定義された２つ以上のリガンドを含む混合物。
したがって、本発明によるリガンドは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、アプタマー、タンパク質または糖タンパク質、バクテリオファージの全体（場合により不活性化されたバクテリオファージ断片およびバクテリオファージタンパク質）からなる群から好ましくは選択される。
本発明によるセンサーは、ネガティブコントロールとして働く。したがって、センサーはリガンドの性質と類似している性質が好ましい。さらに、本発明によるセンサーは、被検出微生物に対する親和性がリガンドのものよりも低い。すなわち本発明によれば、センサーは、微生物に対するリガンドの親和性よりも少なくとも１０倍低い、特に少なくとも１００倍、１０００倍、１００００倍、１０００００倍または１００００００倍低い微生物に対する親和性を好ましくは有する。特に、微生物に対するリガンドの親和性およびセンサーの親和性は、同一実験条件下におけるスキャッチャードの方法によって決定することができる。より好ましくは、本発明によるセンサーは微生物に対して親和性を持たない。
好ましくは、第１シグナルと第２シグナルの差の値が測定したバックグラウンドノイズシグナルの２倍以上である場合は、同一培養時間に対する第１シグナルおよび第２シグナルの値は異なると本発明によってみなされる。測定したバックグラウンドノイズシグナルは、特に微生物非存在で測定した第１シグナルに相当する。
本明細書で理解されるように、本発明による測定可能なシグナルは、化合物、特に微生物がリガンドまたはセンサーに付着または結合することによって直接的に発生する。
特に、本発明による測定可能なシグナルは、本発明によるリガンドおよびセンサー以外の、培地中に存在するまたは培地に添加された、酸化還元プローブなどのメディエーター、またはマーカーから好ましくは生じない。したがって、好ましくは、本発明による測定可能なシグナルは、微生物に対して特異的なマーカーがリガンドまたはセンサーに既に結合している微生物へさらに付着することからは生じない。
シグナルは、少なくとも２つのシグナルの同時測定に適した任意の技術によって測定されてもよく、これは、特に直接的であり、および特に顕微鏡検査、表面プラズモン共鳴、共振ミラー、インピーダンス測定、水晶振動子マイクロバランスまたはフレキシブルビームなどのマイクロエレクトロメカニカルシステム（ＭＥＭＳ）、光、特に紫外光または可視光の吸収の測定、さもなければ特に微生物がそれ自体蛍光性の場合は蛍光測定、によるものであり、これらは当業者に周知である。この点で、当業者に明らかなように、上記で定義されたマーカーは本発明に係る微生物を意味しない。したがって、微生物がリガンドまたはセンサーに結合している場合は、本発明によるシグナルは微生物から生じてもよい。表面プラズモン共鳴が本発明で特に好ましい。
好ましくは、リガンドおよびセンサーは支持体に取り付けられる。より好ましくは、特にシグナルが上述の技術で測定され得るように、支持体は、リガンドおよび／またはセンサーへの化合物の結合によって産生されるシグナルの伝達を可能にする。そうした支持体は当業者に周知であり、特に、連続的なまたは不連続な金属表面で覆われている、表面プラズモン共鳴による測定に適する透明な基材を備える。したがって、本発明の好ましい実施形態では、リガンドおよびセンサーは、それ自体バイオチップを構成している同一または異なる支持体に取り付けられる。さらに、本発明によるリガンドおよびセンサーまたは支持体（複数可）または装置は、微生物を含む可能性のある液体の収集を目的とするまたは微生物培養を目的とする容器、例えば血液培養フラスコまたはストマッカーバッグなどに備えられ得る。
さらに好ましくは、特にシグナルを測定するために培養試料を採集することを必要とせずに、シグナルはリアルタイムで測定される。測定シグナルは、例えば時間の関数としての測定シグナルの強度を示す曲線の形で好ましくは記録される。リガンドおよびセンサーの微生物による占有レベルまたは程度を決定するために、本発明によるリガンドおよびセンサーが取り付けられた支持体の画像を記録することも可能である。
本発明の特定の実施形態では、本発明による方法は、いくつかの異なる微生物の存在を検出すること、試料中に存在する様々な微生物の量を決定すること、または１種または複数の抗菌剤に対する様々な微生物の感受性を決定することを可能にし、その場合は、それぞれ様々な微生物に対して特異的ないくつかのリガンドを使用する必要がある。その後、こうした方法は多重方法といわれる。
本明細書で理解されるように、用語「抗菌剤」は、微生物の生育を抑制する、またはその増殖を減らす任意の抗菌性化合物を指し、特に、エリスロマイシンなどの任意の抗生、殺菌または静菌性の化合物を指す。さらに、用語「抗菌剤」は、特に本発明に係る微生物が腫瘍細胞である場合は、微生物を破壊するまたはその増殖を減らすことが意図された任意の抗癌性の、特に化学療法の化合物も指す。
好ましくは、少なくとも１種の抗菌剤に対する微生物の感受性が本発明によって決定される場合、培養時間の関数としての第１シグナル値の変化は、微生物の分裂に必要とされる時間、すなわち世代時間の変動に部分的にまたは完全に由来し、ひいては第１のリガンドに結合する微生物数の経時変化に由来する。当業者なら理解するように、微生物の世代時間が有意に増加するならば、微生物数の変動は、抗菌剤なしで得られる変動よりも小さいであろう。したがって、好ましくは、第１シグナル値の変化は、本発明による第１のリガンドに付着した微生物の抗菌剤による破壊によるものではない。
３つの独立した実験に由来し、（ｉ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗ＣｂｐＥ抗体（大きな星印、３重）、（ｉｉ）プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）（大きな円、３重）、（ｉｉｉ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して非特異的なＩｇＧ（大きな三角形、３重）および（ｉｖ）ピロールのみ（大きな正方形）を用いて機能化され、５００μｌの試料容量中に１０２細菌／ｍｌ（図１）、１０３細菌／ｍｌ（図２）および１０４細菌／ｍｌ（図３）の初期濃度（すなわち、それぞれ５０、５００および５０００細菌）でのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ６株の培養物の存在下に置かれたバイオチップの、培養時間（ｘ軸、時間（分））の関数としての、表面プラズモン共鳴イメージングによって測定した反射率の変動（ｄＲ、ｙ軸、％として）を表す図である。さらに、非接種培養培地の存在下に置かれた同一のバイオチップを用いて得られた曲線もコントロールとして示し、（ｃ）で表示する。 ３つの独立した実験に由来し、（ｉ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗ＣｂｐＥ抗体（大きな星印、３重）、（ｉｉ）プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）（大きな円、３重）、（ｉｉｉ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して非特異的なＩｇＧ（大きな三角形、３重）および（ｉｖ）ピロールのみ（大きな正方形）を用いて機能化され、５００μｌの試料容量中に１０２細菌／ｍｌ（図１）、１０３細菌／ｍｌ（図２）および１０４細菌／ｍｌ（図３）の初期濃度（すなわち、それぞれ５０、５００および５０００細菌）でのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ６株の培養物の存在下に置かれたバイオチップの、培養時間（ｘ軸、時間（分））の関数としての、表面プラズモン共鳴イメージングによって測定した反射率の変動（ｄＲ、ｙ軸、％として）を表す図である。さらに、非接種培養培地の存在下に置かれた同一のバイオチップを用いて得られた曲線もコントロールとして示し、（ｃ）で表示する。 ３つの独立した実験に由来し、（ｉ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗ＣｂｐＥ抗体（大きな星印、３重）、（ｉｉ）プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）（大きな円、３重）、（ｉｉｉ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して非特異的なＩｇＧ（大きな三角形、３重）および（ｉｖ）ピロールのみ（大きな正方形）を用いて機能化され、５００μｌの試料容量中に１０２細菌／ｍｌ（図１）、１０３細菌／ｍｌ（図２）および１０４細菌／ｍｌ（図３）の初期濃度（すなわち、それぞれ５０、５００および５０００細菌）でのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ６株の培養物の存在下に置かれたバイオチップの、培養時間（ｘ軸、時間（分））の関数としての、表面プラズモン共鳴イメージングによって測定した反射率の変動（ｄＲ、ｙ軸、％として）を表す図である。さらに、非接種培養培地の存在下に置かれた同一のバイオチップを用いて得られた曲線もコントロールとして示し、（ｃ）で表示する。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗ＣｂｐＥ抗体（陽性スポット）およびピロールのみ（陰性スポット）を用いて機能化され、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの培養物の存在下にあるバイオチップの、培養時間（ｘ軸、ｔ（分））の関数としての、表面プラズモンイメージングによって測定した反射率の変動（ΔＲＳＰＲ、ｙ軸、％として）、ならびに抗ＣｂｐＥ抗体を用いて機能化されたスポットの反射率をモデル化する曲線（計算曲線）を表す図である。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗ＣｂｐＥ抗体、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して非特異的なＩｇＧおよびピロールのみを用いて機能化され、並行する２つの容器中における初期濃度が１０４細菌／ｍｌであるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ６株の培養物（それぞれに、（ｉ）終濃度が０．０８％のエタノールで希釈された、終濃度が４０ｍｇ／ｍｌのエリスロマイシン（＋ＡＴＢ）、（ｉｉ）終濃度が０．０８％のエタノール（ＥｔＯＨ）をｔ＝２５０分の時間にそれぞれ添加される）の存在下に置かれた、バイオチップの反射率の変動（ｄＲ、ｙ軸、％として）を表すグラフである。
試料中の微生物の検出
バイオチップの構築
Ｇｒｏｓｊｅａｎら（２００５）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４７：１９３〜２００によって説明されているように、遊離ピロールの存在下でタンパク質−ピロールコンジュゲートを用いて、金でコーティングされたプリズム（作用電極として使用される）上にタンパク質を電気重合する方法を使用して、プロテインバイオチップを調製した。手短に述べると、遊離ピロールの、およびピロール−ＮＨＳに連結されたタンパク質の電気重合を、対電極として働く白金ロッドを含むピペットチップを用いて行い、重合を、特にＧｕｅｄｏｎら（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：６００３〜６００９によって説明されているように、作用電極と対電極間の１００ｍｓ（２．４Ｖ）という急速電気パルスによって行う。方法の再現性を評価するために、各プロテインエンティティを、金でコーティングされたプリズム表面に３重で配置した。
使用したリガンドは以下のものである。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを認識するリガンド。
（ｉ）Ａｔｔａｌｉら（２００８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．７６：４６６〜７６に従って調製した抗ＣｂｐＥ抗体、
（ｉｉ）ヒトプラスミノーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。
− ネガティブコントロール用のセンサー。
（ｉｉｉ）精製したウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）または抗ボツリヌス毒素モノクローナルＩｇＧ、
（ｉｖ）ピロール（Ｔｏｋｙｏ ｋａｓｅｉ、ＴＣＩ）。
これら全ての生成物をピロールに連結し、次いで、微生物培養用容器の形状に適した配置計画に従って、金でコーティングされたプリズム上にスポットの形で配置した。各容器は、１つはコントロールである２つの異なる試料を含むことができる、２つの独立したコンパートメントを備える。
細菌培養の調製
ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ Ｒ６−株をＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培養培地（Ｍａｓｔ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃのＴＨ）中で培養した。培養を、細菌の最適生育フェーズの間で、すなわち約１０８細菌／ｍｌの細菌濃度に相当する６００ｎｍ（ＯＤ６００）で測定した０．４の光学密度で止めた。ＴＨ培地で連続希釈を行い、１０２から１０４細菌／ｍｌの濃度を得た。
表面プラズモン共鳴イメージング（ＳＰＲｉ）による測定
Ｇｅｎｏｐｔｉｃｓ（Ｏｒｓａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）のＳＰＲｉ−Ｌａｂシステムを用いて、ＳＰＲイメージングによる測定を行った。
バイオチップを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝液で１５分間、前もってブロッキングした。細菌を含んでいる可能性がある０．５ミリリットルの試料を「試料」コンパートメントに設置し、一方ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉが存在しない培養培地を「コントロール」コンパートメントに設置する。このシステムを、３７℃に温めたＳＰＲｉ装置のチャンバーに設置する。容器にふたをして、撹拌なしで行われる生育中に培養培地が蒸発するのを防止した。
並行して、生育コントロールを行った。１０３細菌／ｍｌの１ｍｌの培養液を含むチューブをいくつか調製し、インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。時間の関数としての細菌の生育変化をモニターするために、およびそれをＳＰＲｉ生育曲線と比較するために、ＯＤ６００を毎時間測定した。細菌は１６時間培養した。
Figure 2014505235
選択性試験
５００細菌を注入後、抗ＣｂｐＥ抗体によるまたプラスミノーゲンによる細菌の捕獲と関係がある第１シグナルが約３００分後に検出可能であることが、図２で観察される。４００分を過ぎると、ネガティブコントロール（非特異的な付着）を含有するスポットに対するシグナルが見えるようになる。細菌を接種していないコントロール容器中で得られたシグナル（ｃ）は陰性のままである。
表１によると、３００から４００分の間にも有意な細菌の生育が観察された。
より小さな量（５０細菌、図１）の細菌の注入およびより大きな量（５００細菌、図３）の注入も、目に見えるシグナルの増加をもたらす。観察された時間の遅れは、約３０分の世代時間に明らかに一致する。
出発試料中に存在する細菌の定量化
図４は、抗ＣｂｐＥ抗体で機能化されたスポットおよびピロールのみを含むネガティブコントロールスポットに関して観察され、ＳＰＲイメージング（ΔＲＳＰＲ）によって測定した反射率の変動の経時変化を示す。
実験上のノイズによってシグナルの変化がマスクされる期間である約４００分の遅滞期の後、反射率の増大が明らかに指数関数的であることを理解することができる。
この点で、図４はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関する集団倍加時間に典型的であるτについての３０分の値を用いて、抗ＣｂｐＥ抗体で機能化されたスポットに関して観察されたΔＲＳＰＲの変化をモデル化する関数ΔＲＳＰＲ＝ＲＯ２（ｔ／τ）−ＲＯの代表的な曲線も示す。増殖係数ＲＯは、試料中に最初に存在する微生物数に比例する。したがって、この係数の決定によって、試料中に最初に存在する細菌の定量評価が可能になる。
５５０分から、この指数関数的システムからの逸脱がある。当業者なら気づくように、この生育速度の低下は、培養培地の変化、特に細菌の生育に著しく影響を及ぼしやすい培地の枯渇によってもたらされる制限に起因し得る。
ネガティブコントロールの曲線は、６００分までゼロに近いままである。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとスポット表面との間におけるコントロールの非特異的相互作用に起因し得るΔＲＳＰＲの増大が始まり、引き続いて観察することができる。
抗生物質添加による生育抑制
図５は、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉを標的にする抗生物質（ＡＢＴ）（エリスロマイシン、Ａｌｄｒｉｃｈ）を４０ｍｇ／ｍｌの終濃度で、およびエタノール（ＥｔＯＨ）を０．０８％の終濃度で培養してから２５０分後に添加することの、１０３細菌／ｍｌで接種したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ培養物の反射率に対する影響を示す。
抗生物質の添加によって、反射率を示す曲線の傾きが明らかに低下することが観察され、これは、抗ＣｂｐＥ抗体およびプラスミノーゲンを含有するスポットで特に顕著である。したがって、この低下は、細菌生育の抑制に関連する。さらに、同一のエタノール濃度でコントロール溶液を添加した場合は、減少は観察されないことから、先に観察された細菌生育の抑制は、抗生物質の作用に直接的に起因し得、溶媒の影響に起因し得ないことが示される。
したがって、細菌生育を定量する本発明の方法は、耐性記録を確立するのに有用である。

Claims (15)

  1. 試料中に存在する少なくとも１つの微生物を検出する方法であって、
    − 微生物に対して特異的な少なくとも１種のリガンドおよびリガンドの親和性よりも微生物に対する親和性が低い少なくとも１種のセンサーの存在下において、液体培地中で試料を培養するステップであって、リガンドへの化合物の結合によって第１の測定可能なシグナルが産生され、センサーへの化合物の結合によって第２の測定可能なシグナルが産生されるステップ、
    − 少なくとも１つの培養時間について、第１および第２シグナル値を決定するステップ
    を含み、ここで、同一培養時間に関して第１シグナルおよび第２シグナルの値が異なる場合に、試料は微生物を含むと推定される、方法。
  2. 培養時間が微生物の世代時間の少なくとも２倍である、請求項１に記載の検出方法。
  3. 微生物が細菌、真菌、藻類、原生動物および後生動物の分離細胞からなる群から選択される、請求項１または２に記載の検出方法。
  4. リガンドが抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、アプタマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、タンパク質または糖タンパク質、バクテリオファージまたはウイルスの全体（場合により不活性化されたバクテリオファージまたはウイルス断片およびバクテリオファージまたはウイルスタンパク質）からなる群から選択される、請求項１から３のうちの一項に記載の方法。
  5. 試料が生物試料、食品試料、水試料、土壌試料および大気試料からなる群から選択される、請求項１から４のうちの一項に記載の方法。
  6. リガンドおよび／またはセンサーが、リガンドおよび／またはセンサーへの化合物の結合によって生じるシグナルを伝達するための支持体に取り付けられる、請求項１から５のうちの一項に記載の方法。
  7. 第１および第２シグナルがリアルタイムで測定される、請求項１から６のうちの一項に記載の方法。
  8. シグナルが顕微鏡検査、表面プラズモン共鳴、共振ミラー、インピーダンス測定、水晶振動子マイクロバランス、フレキシブルビーム、光吸収測定または蛍光微生物の蛍光測定によって測定される、請求項１から７のうちの一項に記載の方法。
  9. シグナルが、表面プラズモン共鳴によってリアルタイムで測定される、請求項１から８のうちの一項に記載の方法。
  10. 本発明による測定可能なシグナルが、本発明によるリガンドおよびセンサー以外の、培地中に存在するまたは培地に添加されたメディエーターからまたはマーカーから生じない、請求項１から９のうちの一項に記載の方法。
  11. 試料が微生物を含む場合は、培養開始時に試料中に存在する微生物の量もまた、培養時間の関数としての第１シグナル値の変化から決定される、請求項１から１０のうちの一項に記載の方法。
  12. 試料が微生物を含む場合は、少なくとも１種の抗菌剤に対する微生物の感受性が、抗菌剤を培養物に入れた後の培養時間の関数としての第１シグナル値の変化から決定される、請求項１から１１のうちの一項に記載の方法。
  13. 試料中のいくつかの異なる微生物の存在または量が決定される、請求項１から１１のうちの一項に記載の方法。
  14. 請求項１から１３のうちの一項に記載の方法を実施するのに適した装置であって、液体培地中での微生物培養に適した少なくとも１つのチャンバーを備え、このチャンバーは微生物に対して特異的な少なくとも１種のリガンドおよびリガンドの親和性よりも微生物に対する親和性が低い少なくとも１種のセンサーを備え、リガンドへの化合物の結合によって第１の測定可能なシグナルが産生され、センサーへの化合物の結合によって第２の測定可能なシグナルが産生され、液体培養培地と接触するようにリガンドおよびセンサーが支持体に取り付けられている、装置。
  15. 微生物を含む可能性のある液体の収集および／または微生物培養を目的とする容器に備えられる、請求項１４に記載の装置。
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