TARIFNAME ANTIBIYOTIK DIRENÇ GENI TAYINI IÇIN ELEKTROKIMYASAL NANOBIYOSENSÖRE DAYALI KULLANIMA HAZIR TANI KITI Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, antibiyotik direncine neden olan karbapenemaz enzimi geni içerisindeki OXA-48 ve VIM gen bölgelerinin moleküler düzeyde, analiz öncesi hiçbir hazlültga gerek kalmadan tespit edebilen tan` kiti, tani kiti üretim yöntemi ve tan` kiti tespit yöntemi ile ilgilidir. Bulusla Ilgili Teknigin Bilinen Durumu (Önceki Teknik) Günümüzde antibiyotiklerin yogun ve bilinçsiz olarak kullanEnÇ bakterilerde antibiyotiklere kars :direnç enzimlerinin ve mekanizmalarßß olusmas Ea neden olmaktadî Dünya Saglü& Örgütü verilerine göre her yE[ 700.000 kisi antibiyotik direnci sebebiyle ölmektedir. Herhangi bir önlem al ßmazsa 2050 ymma kadar antibiyotik direnci nedeniyle tedavi edilemeyerek ölen kisi say 3 Et Il 10 milyona ulasacag Jahmin edilmektedir. Günümüze kadar yap [[an antibiyotik arastEmalarEida direnç mekanizmalarElEi önüne geçebilmek amac yla yeni antibiyotiklerin gelistirilmesinin, bakteri tarafindan yeni direnç mekanizmalar ri n gelistirilmesine sebep olabildigi bulunmustur. Bunun yerine. gelisen direncin teshisinin ve direnç mekanizmalarinln aydlnlatllarak önüne geçilmesinin daha etkili bir çözüm olacagTl düsünülmektedir. Bununla birlikte insan patojenlerinde antibiyotik direncinin ulastEgÜendise verici oran, antibiyotik tedavisi ve hasta yönetimi ile ilgili hâl: karar vermeyi gerektirmektedir. Bu nedenle en öneinli nokta hâlEteshis konmas Dve etkili ilaç tedavisine hemen baslanmas Elm. Karbapenemaz enzimine sahip bakterilerde, beta-laktam sEiIfüantibiyotiklere karsjdirenç gelisimi görülmektedir. Diger bir ifadeyle, bakteride bu enzimin olmasEantibiyotik direnç gelisimi varl Ig îla isarettir. Bir diger konu, bu enziminin kodlanmas ndan sorumlu direnç genlerinin tarklLtürdeki birçok patojen grubuna aktarllrnas \ ve bunun sonucunda çoklu antibiyotik direncinin ortaya çkmas d 11 ki bu durum antibiyotik direnci sorununu daha da arttirmaktadir. Bu nedenlerle Karbapenemaz enzim varlgüîi hall-?ve hassas tayini önem tas Wnaktad E. HÜIT tayin sonras Eida hastalar& hâlütedavisi yap [Barak bakteri kaynakljsalgEilarîi önlenmesi mümkün olabilecektir. Teknigin bilinen durumunda karbapenemaz üreten bakterilerin saptanmasßda kullanEan birçok tanüyöntemi, hglEtedavi amaçlarEile uyusmayan bir zaman-sonuç gratigine sahiptir. Tayin için en çok kullanman yöntemler fenotipik yöntemler, Modifiye Hodge testi (MHT) Kombinasyon disk testleri, E-testler, Kromojenik agarlar, Matriks Destekli Lazer Desorpsiyon/ Iyonizasyonu-Uçus Zamanl Kütle Spektrometresi (MALDI TOF MS) ve genotipik yöntemler say Tabilir. Çesitli çallSmalarada özellikle OXA-48 enzimi üreten bakterilerin ülkemizde endemik hale geldigi ve enzimi üreten suslarlîi salglîilara neden oldugu bildirilmektedir. Bu suslarîi erken tespit edilmesi, infeksiyon kontrol önlemleri ve aktif Sürveyans açßßdan büyük önem tas miaktad B. Bu amaçla teknigin bilinen durumunda karbapenemaz üreten bakterilerin saptanmasßda kullanilan fenotipik testler asagîia baslklar altmda sEalanmakta ve dezavantajlarE aç klanmaktad 1. Modifiye Hodge test (MHT): Çesitli antibiyotik disklerinin agar plak üzerine inoküle edilen bakterilerle temasLsonucu olusan zon çaplartna göre yapilan bir degerlendirmedir. Bakteri kültürünün üretilmesi sonrasl ve gözle degerlendirildiginden, hem zaman alldldlr, hem de kisiden kisiye degisen bir yorumlama ile sonuca ulas lmasl gibi dezavantajlar bulunmaktadln. Hatal`lpozitif veya negatif sonuçlar elde edilebilmektedir. Mutlaka genotipik testlerle de dogrulanmal Zi E. Kombinasyon disk testleri (boronik aeit, EDTA veya dipikolinik asit içeren diskler): Prosedür ve yorumlama bakmßdan MHT ile benzerdir. Ayn :dezavantaj lar bulunmaktad E. E-testler: Inoküle edilmis plaklar üzerine yerlestirilen antibiyotik gradient test stripleri ile yapjli Yukarmaki prosedürlere benzer bir metotla çalßlî Olusan zonlar net olmayabilir. Degerlendirilmeleri güçtür. Kromojenik agarlar: Besiyerine ekilen bakterinin direnç geni taskiltgtrltn tespiti biyokimyasal reaksiyonlar sonucu renk degisikligi ile saptanmaktadlrt Kontaminasyon olmadl g Sürece dogru sonuçlar al nabilir ancak yine de moleküler testlerle desteklenmelidir. Matrix-assisted laser desorption i0nizati0n-time of flight (MALDI-TOF) mass speetrometry: Izole edilen bakterideki direnç varlEgü cihaz ile uygun prosedür kullanilarak tespit edilir. Yalanc Epozitif degerlendirmeler yap Ühbilir. Maliyet açEEidan her laboratuvarda uygulanamayabilir. Deneyimli personel gerektirir. Blue-Carba Test (direkt koloniden): Rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarEida karbapenemaz olusturan suslarEsaptamak için kesin; ucuz, hîljbir tarama testi olarak kullaniiabilmektedir. Fakat Karbapenemaz enzim tipini belirleyememektedir. OXA-48 K-SeT Testi: Moleküler olmayan, teçhizat gerektirmeyen ve k sia sürede sonuç verebilen (10 dakika) immunokromatograiik bir testtir. OXA-48 karbapenemaz geninin yayîhîiiîkontrol altFria alinak ve ancak moleküler testler yapildiliitan sonra tedaviye yön vermek amacyla dogrulama testi olarak kullanlabilecegi bildirilmektedir. Bu amaçla günümüzde en çok kullanilan genotipik test ise Polimeraz Zincir Tepkimesi (PZT,PCR) testidir. Polimeraz Zincir Tepkimesi (PZT,PCR) testi, altii standart olarak genin varlgîiü net olarak göstermektedir. ArdEidan yapilan ve yaklask 2 saat süren jelde görüntüleme islemleri (agaroz jel elektroforezi) prosedürün daha uzun olmasîia neden olmaktadi Testin uygulanabilmesi için özel laboratuvar ve uzman gereksinimi bulunmaktad 1. Mevcut karbapenemaz tayin sistemlerinin yararlarü olsa da, tayin süresinin uzun olmasÇ uygulamas nn zor olmasLruzman ve özel laboratuvar ortam Lgerektirmesi, maliyetinin yüksek olmas gibi birçok nedenlerle yeni tayin sistemlerinin gelistirilmesi ihtiyaci duyulmaktadlr. Gelisen teknolojiler dogrultusunda son 20 yilda biyosensörler, çevre, glda ve tp gibi alanlardaki analizlerde yaygîi bir kullanüna sahiptir. Bu baglamda ise DNA biyosensörleri temel olarak; elektrot yüzeyine immobilize sentetik tek Zincirli DNA probu ile hedef DNA dizisi aras Eda olusan hibridizasyonunun hâlEbir sekilde analizi esas ma dayanmaktad E. Biyolojik maddeleri algiiiayEiD bu cihazlar, iki kßîndan meydana gelmektedir. Bunlar biyolojik kaan (alg [lama birimi) ve çevirici kEIi (dönüstürücü birimi)°dm. Hassas alg [lama birimi, hedef analitle baglanarak onu tangi'an bir biyolojik molekülden olusmakta ve dönüstürücü (elektrokimyasal, optik, piezoelektrik, termal vb. özellikte) ise tanEna olaymE ölçülebilen ve degerlendirilebilen sayisal bir degere çevirmektedir. Özetle, biyomoleküler etkilesimlerin hassas ve h 21 ltayini, biyosensörlerle yap labilmektedir. DNA biyosensörleri, DNA°nin özgün dizilerini tayin etmek için genotipleme islemine alternatif olarak tasarlaninakta ve hibritlesme üzerinden gen analizi yapmaktadTlar. Ayrßa bilimsel çalîsiinalarda da görüldügü gibi gen dizilimi tayinleri için çoklu DNA ölçümü yapabilen mikrometre boyutlarîidaki cihazlar (mikroçip, vb), laboratuvarlarda gelistirilen tekli DNA biyosensörler tasar Bilar 1 Il bir örnegidir. Günümüzde medikal alanda (moleküler gen analizler, genetik hastalik tayini vb.) ürüne dönüstürülmüs ömekleri olan, biyosensörlerin eczac [[Ügta; ilaçlarda kalite kontrol analizleri (gene dayaljmikroorganizma, virüs analizleri vb.)_, biyolojik kaynaklEilaçlardaki DNA safs zlklarnn analizi, vb. birçok analizde güçlü bir alternatif tan|_| teknigi olarak kullan labilecegi hatta tercih edilecegi ve gelecekte oldukça degerli olacagl düsünülmektedir. Bu alanlar dlsilrlda DNA analizi yaplabilecek birçok alanda örnegin gida analizleri (gldada mikroorganizma, genetigi degistirilmis gFda vb.), çevre (çevre kirliligi etkeni mikroorganizma vb. tayinleri), adli analizler, biyolojik ajanlarln analizi(savas ajanlarl Ivb.) gibi konularda biyosensörler gelistirilmekte ve ürüne dönüstürülmektedir. Elektrokimyasal biyosensör tasarßnßda teknigin bilinen durumunda karsÜhSJhn en büyük sorunlardan biri çok basamakljön islem asamalarElm. Her ne kadar düsük maliyeti ve düsük tayin smmma sahip olsalar da analiz Öncesi gereken ön hazmltk asamasg tayin süresinin uzamas Ela neden olmaktadm. Bu noktada teknigin bilinen durumda Özellikle rutinde yap [[an polimeraz zincir tepkimesi (PZT) islemi için gelistirilen özel kitler dikkat çekmektedir. Biyosensörden cihaza dönüsüm öncesinde, cihazda kullanühcak olan analitik yöntemin gelistirilmesi en önemli konudur. Çünkü uygulanacak metodun tek ölçümle dogru, tekrarlanabilir, h 21 ive güvenilir yan tlvermesi gerekmektedir. Günümüzde nanoteknolojik ürünlerin elektrokimyasal biyosensör tasarlmlarlnda kullanilmaya baslamas yla artfk düsük tayin süîlarßa ulas Tabilen yöntemler gelistirilmis olup bu yöntemler, henüz hasta bas Eda kullanüabilecek cihazlara uygulanacak kadar basit ve güvenilir degildir. Bu amaçlarla gelistirilen nanobiyosensörlerde baz: ön basamaklarß azalthasj ve kullanEna haz& kit özelliginde test sistemlerinin gelistirilmesi önem arz etmektedir. Günümüzde hemen hemen her evde bulunan ve kandan seker ölçümü saglayan cihazlar (tek kullan &ilk çubuk içeren) ile gerçeklestirilen testlerin DNA için de gelistirilerek, uygulanabilir olmasE bu sayede mümkün olabilecektir. Kullan ila hazi biyosensörlerin tasarnina yönelik çalSmalar arttkça, hastann kendisinin kullanabilecegi, kolay ulaslebilir ve güvenilir cihazlar n üretilmesi gündeme gelecektir. Spesifik DNA sekanslar ri rt tayini için çesitli tanlsal testler mevcut olmas rta ragmen, kolay kullanînîlolan ve ksa sürede analiz saglayan yöntem ve cihazlar henüz istenen özelliklerde ve kullanEnda olmadfgßdan halen yeni yöntem arayslarjsürmektedir. Bu alanda alternatif olarak gelistirilen DNA (nano) biyosensörlerini bir hasta bas Danaliz (POC) cihazEla entegre etmek için önce numune ve reaktif hacimlerinin azalt Tmas Dgerekmektedir. Bunun yanEksßa, analize haz] stabil biyosensör yüzeylerinin tasarEnDda önemlidir. Uygulama için ayrEJa dogru biyosensör materyalini seçmek ve toplam tasarim maliyetlerini azaltmak da önemlidir. Bulusun K Sa Aç klamasl tve Amaçlari \ Bulus ile geleneksel biyosensörler ile mikro-dizi analiz cihazlar3(mikroçip) arasEida yer alacak ve günümüz thbnda klinik laboratuarlarda ve hastanelerde kullanman cihazlara alternatif olarak tasarlanana "kit tipinde" elektrokimyasal nanobiyosensör ile hizli, basit ve DNA testlerine uygun bir yöntem ortaya ç karlm sm. Bulus ile yararlTlözelliklere sahip olarak gelistirilen kit tipindeki bu test sisteminin kullan iha haz Il olmasl, karbon elektrot yüzeyine sabitlenmis DNA parçalarl içermesi ve bu algll'ayle'l I yüzeyin stabil kalarak uzun süre sonra dahi tekrarlanabilir ve güvenilir DNA analizleri yapabilmesi hedeflenmistir. Bu hedeflere ulasmak amaegtla sensördeki kalem grafit elektrot (KGE) adlEalgtîayEEyüzeye önce karbon nanotüp (CNT) modifiye edilmis, daha sonra CNT içeren yüzeye kovalent baglanma yöntemi ile sentetik prob dizileri immobilize edildikten ve yüzey blokaj :Bagland Ertan sonra +40C°de tutularak DNA analizi öncesi hiçbir haz Elga gerek kalmadan tayin saglayacak kit tipi biyosensör tasarßiîtamamlanmßtî Gelistirilen tasarîhda kit tipi nanobiyosensörün yüzey stabilitesi ve cevaplarîlîl güvenilirligi de çok sayEla deney yapilarak kontrol edilmistir. Ayrda yüzey modifikasyonunun sensör stabilitesine olan etkisi de yapllan deneylerle arastlrllmlstlr. Gelistirilen kit ile 150 gün sonras nda bile 30 dakika sürede direnç geni tayini yap labilmektedir. Bulus ile nitelikli Özelliklere sahip ve antibiyotik direncini tayin eden CNT tabanlT elektrokimyasal DNA analiz kiti ortaya ç Earllnßti. Bulus ile antibiyotik direnci yüzünden meydana gelen ölümlerin %50`sinden fazlas Eidan sorumlu karbapenemaz enziminin moleküler düzeyde (DNA düzeyinde) tayini için, kit tipinde elektrokimyasal nanobiyosensör (tanEkiti) gelistirilmistir. Gelistirilen nanobiyosensör ile, karbapenemaz enzim varlEgübu enzimin kodlanmas fidan sorumlu, OXA-48 ve VIM adlüiki farkl:gen bölgesinin analizi üzerinden tayin edilmistir. Bu bulus ile gelistirilen kit tipindeki nanobiyosensör (tanLkiti) ile OXA-48 ve VIM direnç gen bölgelerinin varllgl tani kitinin raftan al nd l edilebilmektedir. Bulus ile; antibiyotik direnç geni tayininde (Karbapenemaz enzim tipinin belirlenmesinde) kullanjlan tüm bu yöntemlere ve test sistemlerine alternatif olacak potansiyelde, hasta bas: testleri (POC) için uygun altyapßta sahip hülüve kolay uygulanabilir, elektrokimyasal temelli kullan îha hazE kit tipi nanobiyosensör (tan jçiti) tasarßi:gerçeklestirilmistin Bulus, karbapenemaz enzimini kodlayan OXA-48 ve VIM genlerinin gerçek örneklerden (simetrik ve asimetrik polimeraz zincir tepkimesi, PZT ürünleri) tayinine yönelik kit tipinde nanobiyosensör gelistirilmesi üzerinedir. Bulus, bir nanobiyosensör sistemidir ve kit tipinde gelistirilmistir. TanL kiti özelligi tas lmaktad n. Bulus kit tipi nanobiyosensör yüzeyinde karbon nanotüp bulunmaktadlr. Bu yönüyle ve tayin yöntemi bakFrhîidan teknigin bilinen durumundaki fenotipik ve genotipik tayin yöntemlerinden tamamen farki d ii. Bulus, karbon nanotüp modifiye ve kit tipinde hazlîlanan kalem grafit elektrot kullanilarak, alfa naftol sinyali ölçümü üzerinden antibiyotik direnci gen analizinin yapEdEgD ilk elektrokimyasal nanobiyosensör tasarEn E! E. Bulus ile gelistirilen yöntem ile nanobiyosensöre tan:[kiti seklinde analiz yapabilme özelligi kazand fln Et 1. Kalem grafit elektrotun yüzeyine özel yöntemle karbon nanotüp modifiye edilerek tasarEnD yaplan ve alfa naftol ölçümüne dayalEtayin saglayan bir biyosensör, nanosensör veya tam: kiti gelistirilmesi konusu teknigin bilinen durumunda bulunmamaktadtr. Özetle, belirtilen yüzey yaplsllnda gelistirilen ve bu yönteme sahip gen analizine dayall l"tanl kiti" ilk defa bulus sayesinde gelistirilmistir. Bulusu Aç klayan Sekillerin Tan Ihlarü Sekil 1: Kit-tipi nanobiyosensör yüzeyinin modifikasyonu ve analize kadar saklanmasila iliskin sematik gösterimi. (KGE: Kalem grafit elektrot, CNT: Karbon nanotüp, CV: Dönüsümlü voltametri, BSA: bovin serum albumin) Sekil 2: Gelistirilen tan [kiti ile analize iliskin çalßma basmaklarü Sekil 3: Kit tipi biyosensöre ait SEM görüntüleri; hülandßma potansiyeli 5 kV; çözünürlük prob immobilize CNT/KGE(yüzey blokaj ivar), (D) hibrit içeren CNT/KGB. Sekil 4: Tan. lkiti ile algllama sonrasinda hibrit içeren CNT/KGE yüzeyinden farkli çözünürlük degerlerinde elde edilen SEM görüntüleri. A: 200 um, B: 50 nm, C: 5 um. Bulusun Ayr ntllH Açlklamas l Bulusta öncelikle sensördeki hedefe özgü algEayEE kßmm tasarEnE gerçeklestirildi. Tasarmda hem nanomalzeme (karbon nanotüp) hem de biyomalzeme (sentetik kLsa DNA dizisi) kullanllarak sensör sistemi, nanobiyosensör haline getirildi. Bu dogrultuda, ilk olarak gelistirilen biyosensörün iletkenligi ve yüzey alan n n arttlrllmasl için sensördeki algllama birimine karbon nanotüp (CNT) modifikasyonu dönüsümlü voltametri (CV) teknigi kullanlarak geçeklestirildi. En uygun yüzey tasarim l ve modifikasyon kosullarlnln buluninas îldan sonra, tayini yaplfacak direnç genlerine (OXA-48 ve VIM adlFspesif'ik gen bölgeleri) ait 23 nükleotit içeren, amino grubu isaretli sentetik prob DNA dizileri nanosensör yüzeyine kovalent yolla immobilize edilerek tek kullanEnlÜî, kalem grafit sensör yüzeyleri haz Illandl Sensör yüzeyi daha sonra bovin serum albumin (BSA) bloke edilerek stabilize edildi. Sentetik prob dizileri immobilize edildikten ve yüzey blokajjsaglandüîtan sonra +4ÜC"de uygun kosullarda tutularak analiz öncesi hiçbir hazElfga gerek kalmadan tayin saglayacak kit tipi biyosensör tasarmu tamamlandk Analiz için kit tipi nanobiyosensör dolaptan al Lnarak yüzeyindeki yakalaylcl prob DNA ile içinde direnç geni bulunan analiz ömegindeki biotinli hedef DNA hibritlestirildi. Streptavidin-biyotin afinitesi ve alkalen fosfataz enzimine dayall tayin teknigi kullanilarak olusan ürün a-naftolün elektrokimyasal yükseltgenme sinyali ölçüldü ve bu sayede tayin 30 dakikada gerçeklestirildi. Elde edilen yüksek a-naftol sinyali, hibritlesmenin varlgij yani numune içerisinde ilgili antibiyotik direnç geninin oldugunu kanßlamaktadm. Gelistirilen kit tipi nanobiyosensörün hedef gen dizilimini yakaladfgüida prob dizisine oranla yaklasü& 7 kat miktarda sinyal artSE gösterdigi saptandü AyrEla yapElan nanomalzeme modifikasyonu sonucu; nanomalzeme içermeyen sisteme kgrasla elde edilen hibrit sinyalinin nanomalzeme etkisi sayesinde 3 kat arttgLlsaptandL Bu durum, analizde tayin limitinin düsürülmesini saglayarak taanitinin hassasiyetini artt nm slt 11. Tasarm yap lan kit tipi nanobiyosensörün daha sonra analize yönelik en uygun kosullarl olan hedef konsantrasyonu, hibridizasyon süresi, hibridizasyon sonraslîsensör yüzeyinin ylkanma süresi, sensör seçimliligi, en düsük tayin siijve tekrarlanabilirlik Vb. bulundu. AyrEa sensör yüzeyinin, taramalEblektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonu yapJBHSekil 3 ve Sekil 4). Bulus ile gelistirilen CNT tabanljianobiyosensörün en düsük tayin siij 2.5pmol/50pL olarak tespit edilmistir. Antibiyotik direnci analizine yönelik gelistirilen nanobiyosensörle önce sentetik DNA içeren analizler ve sonrasîlda OXA-48 ve VIM"e ait simetrik ve asimetrik polimeraz zincir tepkimesi (PZT) ürünlerinin tayini yap Üldü Gerçek örnek analizinde PZT ürün tayini için en uygun sartlarEi bulunmas îldan sonra, gelistirilen biyosensörün 150 gün sonras @da bile hassas gen analizi yapabildigi bulundu. Bulusun tüm deneysel asamalaanda nanobiyosensörle aynL sartlarda hazlrllanmls fakat nanomalzeme içermeyen kit tipi biyosensörle de tayin saglanarak kars last rimalar yaplld .l Nanomalzeme modifikasyonunun etkisi sayesinde geçen süreye ragmen hassas tayin saglanabildi ve tayin süiilî 2.50 pikomol/SOpL olarak hesaplandî Gelistirilen kit tipi nanobiyosensörle DNA temelli antibiyotik direnç geni analizi yapilarak klasik tayin yöntemlerine yeni bir alternatif getirildi. Bulus, DNA hibritlesmesi üzerinden baz dizilim analizine (DNA sekans tayini) yöneliktir ve antibiyotik direnç genlerinin elektrokimyasal kit gelistirilerek, nanomalzemeye dayalütayin edildigi bir biyosensör sistemini kapsamaktadî. Tasarüij yap :Ilan hazm kit tipindeki nanobiyosensörün, literatüre yenilik getirmesi dßüida, geleneksel biyosensörler ve diger hill: tanjsistemleri (mikrodizilim cihaz] mikroçip) arasida bir model sistem olmasüda önem tas Enaktadi Bir diger konu ise gelistirilen kit tipindeki nanobiyosensörün laboratuvar dsndaki gerçek numune analizleri için, raftan aanarak dogrudan kullan Lllabileeek altyap ya sahip olmasldlr. Bu nedenle, ortaya çlkarllan kit tipindeki biyosensör, tas nabilir bir potansiyostat cihaz lile entegre edilebilirse hasta basl lDNA testleri gibi alanlarda da kullan Tabilecektir. Bulus, kalem grafit elektrot (KGE) adlE algühyElEyüzeyin karbon nanotüp ile modifiye edilerek tanEkiti haline getirilmesi ve kit ile alfa naftol ölçümüne dayanan ve 30 dakikalEk kîsla sürede gerçeklestirilen direnç geni analizi olmak üzere iki kßüidan olusmaktad E. Her iki asamada da izlenen yöntem basamaklarEiEi smas :dogru ve hassas ölçümler için gereklidir ve optimizasyonu (en uygun kit haz îllgjve kit için optimum analiz kosullar& bulus ile tespit edilmistir. A. Kit Hazmitgma Iliskin Yöntem 1. Kalem Grafit Elektrot (KGE) aktivasyonu: Diferansiyel puls voltametri (DPV) yöntemi kullan larak içerisinde en az 30 saniye süre ile elektroda 1.4 V gerilim uygulandîElektrokimyasal aktivasyon islemi bu sekilde gerçeklestirildi. 2. KGE yüzeyine çok duvarlEkarbon nanotüp (CNT) modifikasyonu: Aktive edilmis elektrotlara ABS tamponunda hazilanmß , 25 döngü dönüsümlü voltametri (CV) teknigi ile 5-8dk süreyle uygulandü Elektrokimyasal olarak nanomalzemenin yüzeye modifikasyonu saglandEHaz Elanan elektrot yüzeyleri daha sonra 45 dk süreyle kurumaya b EakJJdJ 3. Kovalent bag kimyasallarîiîl modifikasyonu: Sensör yüzeyine 8 mM N-hidroksi süksinimit (NHS) ve 5 mM etil karbodiimit (EDC), fosfat tamponunda (PBS) hazßlanarak bekletilmeden CNT modifiye elektrotlarla 50 uL"lik reaksiyon hacminde 45 dakika süreyle etkilestirildi. Sonraslnda elektrot yüzeyine baglanmayan kimyasallarln uzaklastlrllmasl liçin PBS tamponunda 3 sn süreyle y kand .l 4. Prob DNA immobilizasyonu: 5 ug/mL derisiminde OXA-48 veya VIM direnç genine ait amino grubu isaretli prob DNA çözeltileri dietanolamin (DEA) tamponu ile hazlrlandl. Sonrasida 200 uUlik plastik tüplere 50 uL hacimde dagffllarak 60 dk süreyle modifiye elektrotlari yüzeyine kovalent baglanma ile prob DNA immobilizasyonu saglandü Sensör yüzeyleri sonras Eda DEA tainponuyla 3 sn süreyle yEkandD . Yüzey blokajE Bovin serum albümin (BSA) çözeltisi 2 mg/mL konsantrasyonda sodyum sitrat tamponunda hazülandEve 50uL hacminde viallere dagmührak, kovalent yolla prob tuttumlan CNT modifiye KGE"lerle (CNT/KGB) 30 dk adsorbsiyonla etkilestirildi. Fazla kimyasalEl yüzeyden uzaklastEJhIas :için CNT/KGB sodyum sitrat tamponuyla 15sn süreyle ylstandd 6. Saklama kosullarlzl Sentetik prob DNA dizileri immobilize edildikten ve yüzey blokaj Baglandlktan sonra plastik tüp içerisine yerlestirilen 1.Sem uzunlugundaki CNT/KGB +40C3de analize kadar saklandî Böylece analiz öncesi hiçbir hazîlga gerek kalmadan tayin saglayacak kit tipi biyosensör tasarEhEtamamlandü Kitin parçalarü Tanükiti; yüzeyi nanomalzeme ve DNAile modifiye edilmis karbon grafit uç ve içine konuldugu 1.5mL hacimli plastik tüpten olusmaktad B. B. Direnç Geni Analizine iliskin yöntem 1. Hedef DNA ile hibridizasyon: PBS tamponu ile 10 ugfmL biyotin isaretli hedef DNA, biyotin isaretli simetrik PZT ürünü veya biyotin isaretli asimetrik PZT ürünü içeren çözelti hazliilanarak prob immobilize CNT/KGB ile 15 dk süreyle hibridizasyon saglandH Baglanmadan kalan DNA"lar ri uzaklast ri lmasl için sensör yüzeyi 20 sn süreyle kar st limall olarak DEA ile ykandîl 2. Enzim ile etkilesim: Hibiridizasyon sonras] DEA ile 10 mg/mL derisimde BSA içeren streptavidin alkalen fosfataz (S-ALP) enzim çözeltisi hazElandE Bu çözelti 50 uL hacminde 200 uL°lik plastik tüplere dag Illarak modifiye CNT/KGEilerle 10 dk etkilestirildi. Bu asamada yüzeyinde sadece sentetik hibrit, gerçek örneklere ait simetrik ve asimetrik PZT°lerle elde edilen hibrit yapüarla enzim etkilesiminin olmasE beklendi. Sensör seçimliliginin izlenebilmesi amac Sl'la yüzeyinde sadece i. prob DNA, ii. prob DNA ile rastgele DNA dizisi (veya rastgele PZT örnegi) birlikte ve iii. prob DNA ile PZT kör çözeltisi bir arada olan CNT/KGE"lerle de enzim etkilesimi saglandi Sonras Lnda CNT/KGB elektrotlar istenmeyen baglanmalar n uzaklastlrllmas amaclyla 20 sn karlstlrmall olarak DEA içinde y kandl. Gerçek örneklerden simetrik PZT'ler; hibritlesme öncesinde çift sarmal yap Tarîiîi denatüre olmas îçin +94°Cide 5 dakika tutuldu. Rastgele Dizi: Tüm bazlar hedef DNAidan farkll Sentetik DNA veya PZT ürünü 3. Substrat ile etkilesim: a-naftil fosfat substrat] l mg/mL derisiminde olacak sekilde DEA ile hazElanarak modifiye elektrotlar ile 5 dakika etkilestirildi. Bu asamada enzim (alkalen fosfataz) ve substrat aras Eda gerçeklesen tepkime sonucu elektroaktif özellige sahip olan a-naftol olusmustur. Ölçüm: Enzime dayalüiibiridizasyon tayini d-naftol sinyali ölçülerek incelendi. Buna göre, OV ile +0,6V aras îida 33 mV/s tarama hüîida, 5 mV adEh geriliminde ve 70mV amplitütte DPV teknigiyle tarama yap Iarak DEA tamponunda ölçümler al Eldj YaklasEk +0.25V civarnda gözlenen enzimatik ürün a-naftol"e ait yükseltgenme sinyalindeki degisim incelendi. Tan lkiti özelligindeki bulus, aslinda gen analizi istenen tüm durumlarda kullanilabilme kapasitesine sahiptir. Çünkü bulusla elde edilen yüzey stabil kalabilmekte ve en az 150 gün sonras @da bile analiz saglamaktad Il. Gelistirilen hassas ve özel algtlama yüzeyine sahip bu nanobiyosensörün, tasElEgD prob DNA'nm degistirilmesiyle ilgilenilen çok farklE hedef DNA°larIi analizi de yap Iabilmektedir. Örnegin; TE› alanßda, genetik bir hastalga ait prob DNA nanobiyosensörde kullanEEsa, çesitli genetik hastaliklarEl analizi, Güalarda tayin edilecek bir mikroorganizmaya ait prob DNA nanobiyosensörde kullan lisa, gîlalarda DNA üzerinden mikroorganizma analizi, Genetigi degistirilmis ngaya ait prob DNA nanobiyosensörde kullan lJJisa, GDO"lu gtdalartn analizi! Suça karlstlglndan süphe edilen bir kisiye ait prob DNA nanobiyosensörde kullan lllnsa, birçok adli analizin degerlendirilmesi, Her türlü suya (içme suyu, at lt su, üretim tesisi sularü akarsu ve deniz Vb.) karTsan/karlsabilecek bir bakteriye ait prob DNA nanobiyosensörde kullanÜlEsa, sularda mikroorganizma analizi. Eezac [Hill alanEida gelistirilen yeni nesil ilaçlarda DNA analizi, DNA eslesmesi (hibritlesmesi) üzerinden tayin yapan yeni nesil barkod okuyucu gelistirilmesi çal :almalarj gibi birçok analiz gerçeklesebilmektedir. C. Kit tipi nanobiyosensör Yüzeyinin SEM ile Görüntülenmesi Bulus kapsam Elda tan: kiti yüzeyinin mikroskobik karakterizasyonu amac Slla Them10 Scientific Apreo S model SEM (scanning electron microscobe) cihaszullanürlL Bu amaçla, kit hazlrfllg lve analize iliskin olarak tüm çallsma basamaklarlna ait yüzey modifikasyonlarl görüntülenerek karakterize edildi. Ölçülen numuneler iletken karakterde oldugundan, yüzeye ayröa bir kaplama (altm, palladium vb.) yapülnadlî KGE ve CNT/KGB (karbon nanotüp içeren KGE) yüzeylerine mikroskobik karakterizasyon için uygulanan hlZlandlriina potansiyel aralgî kV ve çözünürlük 5, 50, ZOOum olarak kullanTdTl Görüntüleme için Yalß KGE, CNT/KGB, Bovin serum albumin (BSA) ile yüzey blokaj: yap Jhn prob/CNT/KGE (tanjkiti algEBama yüzeyi) ve hibrit/CNT/KGEiye ait (algllama sonrasü taramalüelektron mikroskobu ile elde edilen görüntüler Sekil 3"deki gibidir. TR TR