CN110297028B - 一种检测h1n1流感病毒的电化学传感器及其制备和检测方法 - Google Patents

一种检测h1n1流感病毒的电化学传感器及其制备和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测H1N1流感病毒的电化学传感器及其制备和检测方法。该传感器采用能够特异性识别H1N1的DNA核酸适配体。将核酸适配体组装在金电极上，基于病毒与核酸适配体特异识别所产生的电化学阻抗的变化来实现对灭活的完整的H1N1流感病毒的高灵敏高特异性的检测，对于其它病毒的选择性大于100倍。本方法包括金电极表面的打磨和清洁、将巯基修饰的H1N1的特异性核酸适配体组装到电极表面并对电极表面进行封闭、将金电极与样品孵育检测金电极表面电阻的变化值并根据标准曲线确定样品中病毒的浓度。该方法的检测对象是灭活病毒，而且识别对象不是变异性强的病毒表面蛋白。因此，本发明的传感器更安全，适用性更好。

Description

一种检测H1N1流感病毒的电化学传感器及其制备和检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于DNA核酸适配体的流感病毒电化学传感器及其制备和检测方法，属于生物分析技术领域。
背景技术
常见的流感病毒有三种类型：A型、B型和C型。A型病毒是最具毒性和最容易变异的人类病原体，由于其显著的抗原漂移和抗原转变的特性而使病毒具有流行病的威胁。由于相同的原因，很难开发抗流感类药物、疫苗和诊断试剂盒。A型流感病毒的快速现场检测对于保护公共健康和减少传染病暴发极为重要。目前的病毒检测方法分为两类：基于基因检测的方法和基于抗体的方法。第一类方法基于聚合酶链式反应(PCR)检测病毒的遗传物质，例如实时定量PCR技术、基于测序技术的测试、基于核酸扩增技术的测序(Journal ofVirological Methods.2010,170,173–176)和基于等温循环介导扩增的测定法(Journalof Microbiology.2015,53(1),1-5)。尽管这些方法通常很灵敏，但也具有一些缺点，如：病毒分离费时，要考虑生物安全性以及在扩增核酸期间易发生交叉污染而可能出现的假阳性结果。通过直接检测病毒表面蛋白或宿主抗体的方法简化了检测过程并提高了检测的特异性。然而，除了抗体具有较高的合成成本和有限的稳定性之外，在制备病毒蛋白时仍然存在生物安全问题。
核酸适配体通过高通量筛选技术(通过指数富集配体的系统进化技术：SELEX)获得(Nature,1990,346(6287),818-822；Science,1990,249(4968),505-510.)。是一类短的具有识别各类靶标能力的核苷酸，靶标包括：小分子、蛋白质、完整细胞、甚至组织载体。核酸适配体具有高亲和力和特异性，而且，在成本、稳定性、批次间重复性、易于合成和直接标记等方面更有优势，被认为是理想的诊断试剂和潜在的抗体替代品。以核酸适配体为基础的生物传感器(核酸适配体传感器)已经成为一类主要的传感器，用于环境和食物污染物、病原体、癌细胞等物质的灵敏性和特异性检测(Curr.Opin.Biotechnol.2017,,45,15-23.；Chem.Rev.2014,114(15),7631-7677.；Curr.Opin.Chem.Biol.2012,16(3-4),429-435)。
目前，已经成功筛选出40多种针对流感病毒蛋白或活性病毒的高亲和力的DNA和RNA适配体(Pharmaceuticals,2016,9,78)。大部分核酸适配体使用重组血凝素(HA)(Biochem.Biophys.Res.Commun.,2008,366(3),670-674)或小肽(Mol.Cells,2011,32(6),527-533)作为靶标。为了对直接对病毒进行识别，一些研究小组开发了以整个病毒为靶标的特异性核酸适配体的筛选(J.Gen.Virol.2006,87,479-487.；J.Virol.Methods.2013,189(2),362-369；Biosensors&Bioelectronics,2016,86,293-300.)。这些高亲和力的核酸适配体适配体对流感病毒显示出良好的特异性。
基于这些核酸适配体的发现而开发的病毒核酸适配体传感器包括表面等离子体共振(Sensors,2012,12(9),12506-12518.)、电化学(Anal.Chem.2012,84(3),1677-1686；Anal.Chem.2012,84(4),1813-1816)、比色法(Nanotechnology,2016,27(43),435102)和荧光生物传感器(Res.Commun.2007,358(1),47-52)。在这些传感器中，基于电化学阻抗谱(EIS)的核酸适配体传感器由于其简单的制备方法，快速检测过程和高灵敏度而特别具有吸引力。EIS核酸适配体传感器已经用于检测小分子(Electrochim.Acta,2015,182,516-523.；J.Am.Chem.Soc,2006,128,13666-13667.)、蛋白质(Anal.Chem.2009,81(10),3944–3949)、活病毒(Anal.Chem.2012,84(3),1677-1686；Anal.Chem.2012,84(4),1813-1816.)。但是当核酸适配体针对活性病毒或病毒表面蛋白检测时，生物安全问题依然存在。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测H1N1流感病毒的电化学传感器及其制备和检测方法，可以快速检测流感病毒H1N1。
本发明的提供的一种检测H1N1流感病毒的电化学传感器，包括金电极和核酸适配体探针HS-A20S。其中所述核酸适配体探针HS-A20S的密度是(4.82±0.85)×1011探针/cm2或(1.40±0.07)×1012探针/cm2。
另外，本发明提供一种检测H1N1流感病毒的电化学传感器的制备方法，取1μL浓度为20μM至100μM的核酸适配体探针HS-A20S加入197μL的缓冲溶液中，用封口膜封好，95℃水浴加热十分钟，缓冷到室温，将金电极依次用1,0.3，0.05μm的氧化铝粉末在打磨片上分别打磨五分钟，用去离子水冲洗电极表面，然后依次放入超纯水和乙醇中超声五分钟，然后将电极放入0.5M的硫酸溶液中，用循环伏安法以0.1V/S的速率扫描电极表面，向冷却到室温的DNA溶液中加入2μL，100mM的TCEP，震荡，室温下还原一小时，把清洁的金电极放入上述HS-A20S溶液中，室温下孵育6-12小时，将孵育好的电极取出，用缓冲溶液清洗三次，放入配置好的1mM的MCH溶液中，室温下封闭一小时，取出封闭好的电极，用缓冲溶液清洗三次。在上述步骤中，所述核酸适配体探针HS-A20S的浓度为20μM或100μM。
进一步，本发明提供一种使用前述的电化学传感器检测H1N1流感病毒的方法，包括如下步骤：步骤一：用电化学工作站检测所述的电化学传感器的电极表面的电化学阻抗谱图；步骤二：使用所述的电化学传感器与含有不同浓度的流感病毒溶液进行孵育，分别测定电化学阻抗谱，根据步骤1与步骤二中所测得的电化学阻抗的变化绘制标准工作曲线；步骤三：使用所述的电化学传感器测与待测样品进行孵育，测定电化学阻抗谱，根据所述标准工作曲线确定待测样品中病毒的浓度。
本发明的具体实验步骤：
1)金电极的清洁；
2)配置一定浓度巯基修饰的核酸适配体溶液，加热、缓冷到室温、加入三(2-羧乙基)膦孵育一小时；
3)将金电极放入一定体积配置好的核酸适配体溶液中，室温孵育过夜；
4)将一定量的缓冲溶液清洗电极表面，然后在、一定浓度的巯基己醇中孵育半小时；
5)将电极用缓冲溶液冲洗，将不同浓度的流感病毒溶液中，37℃孵育半小时；
6)用电化学工作站检测电极表面的电化学阻抗谱图；
7)根据与含有不同浓度的流感病毒溶液孵育的电极的电化学阻抗谱绘制标准曲线；
8)根据工作曲线检测未知样品中病毒的浓度。
本发明方法具有如下优势：1)本发明方法的检测对象是灭活的完整病毒,无需提取病毒基因，不具有病原活性，样品前处理简单，安全性高；2)本发明方法将病毒表面的多位点识别的协同效应、靶标结合诱导的核酸适配体的大的构象变化和电化学阻抗法的高灵敏性相结合，检测灵敏度比传统酶联比色法高2-3个数量级；3)本发明方法所使用核酸适配体的特异性识别对象不是变异性强的病毒表面蛋白，能够更好适用变异病毒的检测；4)利用DNA核酸适配体实现对流感病毒的特异性识别，费用低且批次与批次间重复性好。
附图说明
图1是本发明方法的原理图。
图2是本发明方法的修饰在电极表面的低密度(左侧A示出)和高密度核酸适配体探针(右侧B示出)的进行探针密度测定的计时库伦的信号图。图中下曲线和上曲线分别是不加入和加入50μM三氯六氨合釕的测量线。
图3是核酸适配体在低探针密度条件特异性识别H1N1流感病毒的电化学阻抗谱图，其中左侧(A)和右侧(B)分别是核酸适配体修饰电极进行H1N1和B型流感病毒检测的电化学阻抗谱图。
图3C是本发明的电化学传感器的选择性测试的结果图。
图4是核酸适配体在高探针密度条件识别H1N1(左侧A示出)和B型流感病毒(右侧B示出)的电化学阻抗谱图。
图4C是阻抗变化与病毒浓度关系的柱状图。
图5是应用本发明的方法检测咽拭子中H1N1(左侧A示出)和B型病毒(右侧B示出)的电化学阻抗谱图。
具体实施方式
图1是本发明方法的原理图。如图1所示，核酸适配体在低探针密度条件下与H1N1病毒的特异性结合。在低探针密度下，核酸适配体能够与H1N1病毒特异性结合，发生构象变化，引起表面阻抗的减小，实现对H1N1病毒的特异性检测。在高探针密度下，由于核酸适配体探针的界面集合效应，对H1N1病毒的亲和力增强，灵敏度提高；但是同时提高对B型病毒的亲和力，特异性下降。图2是本发明方法的修饰在电极表面的低密度(左侧A示出)和高密度核酸适配体探针(右侧B示出)的进行探针密度测定的计时库伦的信号图。图中下曲线和上曲线分别是不加入和加入50μM三氯六氨合釕的测量线。图3是核酸适配体在低探针密度条件特异性识别H1N1流感病毒的电化学阻抗谱图，其中左侧(A)和右侧(B)分别是核酸适配体修饰电极进行H1N1和B型流感病毒检测的电化学阻抗谱图。图3C是本发明的电化学传感器的选择性测试的结果图。图4是核酸适配体在高探针密度条件识别H1N1(左侧A示出)和B型流感病毒(右侧B示出)的电化学阻抗谱图。图4C是阻抗变化与病毒浓度关系的柱状图。图5是应用本发明的方法检测咽拭子中H1N1(左侧A示出)和B型病毒(右侧B示出)的电化学阻抗谱图。
实施例1.电化学传感器的制备。
以下所有实施例中所使用到的脱氧核糖寡核苷酸探针HS-A20S(5’-HS-(CH2)6-GGACCAGTTGTCTTTCGGTCTCTACCCCAGCCCGT-3’)、流感病毒溶液、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、巯基己醇(MCH)、清洗液均由磷酸缓冲液(10mM(毫摩尔)的磷酸一氢钠和磷酸氢二钠，5mM的氯化镁，pH 7.4)配置。
图1所示的具有高探针密度的电化学传感器按照下面的操作制备。取1μL(微升)(100μM(微摩尔))的核酸适配体探针HS-A20S加入197μL的缓冲溶液中，用封口膜封好，95℃(摄氏度)水浴加热十分钟，缓冷到室温。将金电极依次用1,0.3，0.05μm(微米)的氧化铝粉末在打磨片上分别打磨五分钟，用去离子水冲洗电极表面，然后依次放入超纯水和乙醇中超声五分钟。然后将电极放入0.5M(摩尔浓度)的硫酸溶液中，用循环伏安法(CV)以0.1V/S(伏特/秒)的速率扫描电极表面。向冷却到室温的DNA溶液中加入2μL，100mM的TCEP，震荡，室温下还原一小时。把清洁的金电极放入上述HS-A20S溶液中，室温下孵育12小时。将孵育好的电极取出，用缓冲溶液清洗三次，放入配置好的1mM的MCH溶液中，室温下封闭一小时。取出封闭好的电极，用缓冲溶液清洗三次。图1所示的具有低探针密度的电化学传感器的制备步骤与上述具有高探针密度的电化学传感器的制备步骤相同。仅将上述1μL(100μM)的核酸适配体探针HS-A20S换为1μL(20μM)；将电极在HS-A20S溶液中的孵育时间由12小时改为6个小时。具有不同探针密度的核酸适配体传感器的成功制备通过计时库伦定量测定探针密度得到证实。
如图2所示，按照上述条件制备的电化学传感器上核酸适配体探针HS-A20S的密度分别是(1.40±0.07)×1012探针/cm2和(4.82±0.85)×1011探针/cm2。
实施例2.本发明的具有低探针密度的电化学传感器的工作曲线和选择性测试。
本发明中所有电化学阻抗的测定均采用下面的参数设置：振幅10mV(毫伏)、频率变化0.03赫兹到200000赫兹、电解液为1M NaCl，5mM K3Fe(CN)6/5mM K4Fe(CN)6。用三电极体系(工作电极为本发明实施例1所制备的电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极)进行工作电极电化学阻抗的测定。所有测量之前，均首先测定实施例1中所制备的电极的电化学阻抗。
配置不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)，B型流感病毒，H7N9流感病毒和H1N1流感病毒(9ng/L(纳克/升),90ng/L,900ng/L,9000ng/L)。将实施例1中所制备的具有低探针密度的电极分别放入上述溶液中孵育半小时。用缓冲溶液清洗三次后，用电化学阻抗法检测阻抗谱。
结果如图3和图3C所示，具有低探针密度的电化学传感器对H1N1的检测具有高的灵敏度和选择性。电化学阻抗信号的下降与H1N1病毒浓度成正比，检测限可以达到0.9pg/μL(皮克/微升)。在H1N1病毒浓度低于0.9pg/μL时(9ng/L,90ng/L)，电化学阻抗信号没有显著下降,但是同等浓度的其它病毒(B型病毒和H7N9)以及牛血清白蛋白出现大幅的阻抗增加，且该阻抗随着样品浓度的增加而显著增加。当H1N1病毒浓度高于0.9pg/μL时，电化学阻抗信号显著下降,但是同等浓度的其它病毒(B型病毒和H7N9)以及牛血清白蛋白出现大幅的阻抗增加。其中B型病毒在9pg/μL时没有电化学阻抗信号的显著变化，说明核酸适配体与B型病毒间的也存在较弱的亲和力，在高浓度病毒存在时核酸适配体也能够与病毒结合，发生构象变化，引起表面阻抗的减小。该减小值与其在表面上非特异性吸附所造成的阻抗增加相抵消，因此体现为极小的阻抗变化。
实施例3.本发明的具有高探针密度的电化学传感器对H1N1和B型病毒进行检测的工作曲线。
配置不同浓度的B型流感病毒和H1N1流感病毒(9ng/L,90ng/L,200ng/L,400ng/L,900ng/L,9000ng/L)。将实施例1中所制备的具有高探针密度的电极分别放入上述溶液中孵育半小时。用缓冲溶液清洗三次后，用电化学阻抗法检测阻抗谱。
结果如图4和图4C所示，具有高探针密度的电化学传感器对H1N1的检测具有比具有低探针密度的电化学传感器更高的灵敏度。电化学阻抗信号的下降与H1N1病毒浓度成正比，检测限可以达到9ng/L。但是传感器的选择性下降，B型病毒也出现显著的阻抗下降，但是都比同等浓度的H1N1病毒的阻抗的下降值小很多。这是由于核酸适配体与B型病毒间的也存在较弱的亲和力，在高探针密度下，由于核酸适配体探针的界面集合效应，对B型病毒的亲和力增强，发生构象变化，引起表面阻抗的减小。该阻抗减小的效应超出了与其在表面上非特异性吸附所造成的阻抗增加的效应，因此体现为阻抗减小变化。
实施例4.按照本发明的方法测定的咽试子中H1N1流感病毒的检测结果
按照实施例1的方法制备具有低探针密度的电化学传感器。将修饰好的电极与100μL的咽试子溶液中孵育半小时，缓冲溶液清洗电极三次后，用电化学阻抗法检测其电极表面电阻值得变化，计算信号降与工作曲线对比。
如图5所示，含有H1N1的真实样本中检测到电化学阻抗的下降(26.1±3.0％)，含有B型病毒的咽拭子样品检测到的电化学阻抗的变化很小(2.5±0.3％)。该结果表明本发明的方法可以适用于咽拭子中流感病毒H1N1的检测。

Claims (3)

1.一种检测H1N1流感病毒的电化学传感器，其特征在于，包括金电极和核酸适配体探针HS-A20S,所述核酸适配体探针HS-A20S的密度是(4.82±0.85)×1011探针/cm2，H1N1流感病毒为灭活H1N1病毒，在所述(4.82±0.85)×1011探针/cm2的低探针密度下，电化学阻抗信号的下降与H1N1病毒浓度成正比，核酸适配体能够与H1N1病毒特异性结合，发生构象变化，引起表面阻抗的减小，实现对H1N1病毒的特异性检测。
2.一种检测H1N1流感病毒的电化学传感器的制备方法，其特征在于，取1μL浓度为20μM至100μM的核酸适配体探针HS-A20S加入197μL的缓冲溶液中，用封口膜封好，95℃水浴加热十分钟，缓冷到室温，将金电极依次用1,0.3，0.05μm的氧化铝粉末在打磨片上分别打磨五分钟，用去离子水冲洗电极表面，然后依次放入超纯水和乙醇中超声五分钟，然后将电极放入0.5M的硫酸溶液中，用循环伏安法以0.1V/S的速率扫描电极表面，向冷却到室温的DNA溶液中加入2μL，100mM的TCEP，震荡，室温下还原一小时，把清洁的金电极放入上述HS-A20S溶液中，室温下孵育6-12小时，将孵育好的电极取出，用缓冲溶液清洗三次，放入配置好的1mM的MCH溶液中，室温下封闭一小时，取出封闭好的电极，用缓冲溶液清洗三次，其中所述核酸适配体探针HS-A20S的密度是(4.82±0.85)×1011探针/cm2，H1N1流感病毒为灭活H1N1病毒，在所述(4.82±0.85)×1011探针/cm2的低探针密度下，电化学阻抗信号的下降与H1N1病毒浓度成正比，核酸适配体能够与H1N1病毒特异性结合，发生构象变化，引起表面阻抗的减小，实现对H1N1病毒的特异性检测。
3.一种使用权利要求1所述的电化学传感器检测H1N1流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：用电化学工作站检测所述的电化学传感器的电极表面的电化学阻抗谱图；
步骤二：使用所述的电化学传感器与含有不同浓度的流感病毒溶液进行孵育，分别测定电化学阻抗谱，根据步骤1与步骤二中所测得的电化学阻抗的变化绘制标准工作曲线；
步骤三：使用所述的电化学传感器测与待测样品进行孵育，测定电化学阻抗谱，根据所述标准工作曲线确定待测样品中病毒的浓度。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20220373542A1 (en) * 2019-10-25 2022-11-24 University Of Utah Research Foundation Micro-Balance Biosensors to Detect Whole Viruses

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103237900A (zh) * 2010-12-01 2013-08-07 原子能与替代能源署 用于检测和定量微生物的方法
KR20160083167A (ko) * 2014-12-30 2016-07-12 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법
CN106399315A (zh) * 2015-07-31 2017-02-15 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一组特异性识别h1n1、h3n2型甲型流感病毒的寡核苷酸适配体的序列和应用
CN106706733A (zh) * 2016-11-14 2017-05-24 江苏大学 一种检测伏马毒素b1的电化学适配体传感器的制备方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9335292B2 (en) * 2011-10-13 2016-05-10 Auburn University Electrochemical proximity assay

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103237900A (zh) * 2010-12-01 2013-08-07 原子能与替代能源署 用于检测和定量微生物的方法
KR20160083167A (ko) * 2014-12-30 2016-07-12 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법
CN106399315A (zh) * 2015-07-31 2017-02-15 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一组特异性识别h1n1、h3n2型甲型流感病毒的寡核苷酸适配体的序列和应用
CN106706733A (zh) * 2016-11-14 2017-05-24 江苏大学 一种检测伏马毒素b1的电化学适配体传感器的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
High sensitive and selective electrochemical biosensor: Label-free detection of human norovirus using affinity peptide as molecular binder;Hye Jin Hwang等;《Biosensors and Bioelectronics》;20160812;第164-170页 *
Katrine Kiilerich-Pedersen等;Katrine Kiilerich-Pedersen等;《Biosensors andBioelectronics》;20130610;第374-379页 *

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