KR20160083167A - 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법 - Google Patents

나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160083167A
KR20160083167A KR1020140193008A KR20140193008A KR20160083167A KR 20160083167 A KR20160083167 A KR 20160083167A KR 1020140193008 A KR1020140193008 A KR 1020140193008A KR 20140193008 A KR20140193008 A KR 20140193008A KR 20160083167 A KR20160083167 A KR 20160083167A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
probe
biosensor
target substance
target
virus
Prior art date
Application number
KR1020140193008A
Other languages
English (en)
Inventor
정봉현
조현민
김유정
Original Assignee
재단법인 바이오나노헬스가드연구단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 filed Critical 재단법인 바이오나노헬스가드연구단
Priority to KR1020140193008A priority Critical patent/KR20160083167A/ko
Publication of KR20160083167A publication Critical patent/KR20160083167A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • G01N2333/055—Marek's disease virus

Abstract

본 발명은 본 발명은 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서는 표적물질의 존재에 따른 나노 갭 양 전극 사이에 연결된 금속 나노구조물을 이용해 전기적 신호를 측정함으로써, 표적물질에 대한 민감도 및 선택도가 우수하여 표적물질의 농도 분석이 용이하고, 상기 바이오센서를 이용하여 표적물질을 검출하는 경우, 단순하고 경제적이며, 실시간으로 표적물질을 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법{Biosensor for detecting target material using nano-gap electrode and metal-nanostructure and method for preparing the same}
본 발명은 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 바이오센서를 이용한 생체 내 표적물질 검출방법에 관한 것이다.
최근 바이러스를 검출하기 위해 다양한 진단센서가 개발되고 있으며, 특히 신종플루와 같은 변이된 고병원성 조류인플루엔자에 의해 사망자 수가 급격히 증가함에 따라 조기 진단을 위한 신속한 진단센서가 요구되고 있다. 바이러스를 검출하기 위한 가장 기본적인 방법으로 PCR을 이용하고 있으며, 인플루엔자 바이러스의 경우, 총 16개 타입의 HA(Hemaglutinin)와 9개 타입의 NA(neuramidase)를 코딩하고 있는 유전자를 증폭시켜 바이러스의 감염 여부를 확인하고 있으며, 이때, 각 타입별로 특이성을 가진 프라이머를 필요로 한다. 또한, PCR을 이용한 검출방법은 통상 하루 정도의 시간이 소요되며 실험실상에서만 가능한 시스템이기 때문에 현장진단을 할 수 없는 단점을 가지고 있다. 최근에는 바이러스 표면에 존재하는 단백질에 의해 생성된 항체나 바이러스 안에 존재하는 RNP(RNA + nucleoprotein) 등을 검출하는 방식으로 ELISA(효소면역측정법)나 스트립센서의 개발이 이루어지고 있으나, 바이러스 자체는 전도성이 없어 바이러스 자체를 전기적으로 검출하는 방법은 아직 개발되지 않은 실정이다. 또한, ELISA의 경우, 분광광도계와 같은 고가의 실험실 장비를 갖추어야 하는 단점이 있으며, 민감도가 높지만(highly sensitive), 특이도(specificity)가 떨어지는 단점이 있다.
전기적 바이오센서는 그 간단성, 민감도, 선택도, 및 경제성 때문에 질병의 진단, 음식의 분석, 환경의 관찰 및 분석의 분야에서 우수한 분석 기술로 발전되어 왔다. 또한, 다른 바이오센서에 비해서 그 성능의 저하 없이도 소형화를 할 수 있다는 장점이 있다. 새로운 바이오센서의 플랫폼과 전략을 이용하여 전기적 바이오센서의 민감도와 선택도 등을 더욱 향상시키기 위한 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도 나노 갭 전극을 이용한 바이오센서의 플랫폼에 대한 관심이 높아지고 있다. 나노 갭 전극이란 두 개의 물체가 나노미터 간격만큼 사이를 두고 마주보고 있는 평판형 전극 구조를 말하며, 나노 크기 구조물의 전기적인 특성을 연구하거나 극미량의 화학물질 또는 생체물질을 감지하는 센서로서의 활용이 가능하다. 특히, 분자 수준에서 전기적인 특성 변화 등을 측정하기 위해서는 나노 갭 전극이 필수적으로 요구된다. 이에 따라, 특허문헌(출원번호: 10-2010-0000360)은 나노 갭 전극사이를 금속 나노와이어로 연결하여 전기적 신호를 측정함으로써 DNA를 검출하는 방법을 공개하였다. 그러나, 상기 방법은 나노 갭 전극 사이를 금속 나노입자로 연결한 후, 금속 인핸싱 과정을 포함하기 때문에 제조과정이 복잡하고, 실시간으로 전기적 신호를 확인할 수 없는 문제가 있다.
KR 10-2010-0000360
본 발명자들은 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서에 대해 탐색하던 중, 표적물질의 존재에 따른 나노 갭 양 전극 사이에 연결된 금속 나노구조물을 이용해 전기적 신호를 측정하는 경우, 표적물질에 대한 민감도 및 선택도가 우수하여 표적물질의 농도 분석이 용이하고, 단순하고 경제적이며, 실시간으로 표적물질을 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다. 또한 본 발명은 상기 바이오센서를 이용한 생체 내 표적물질 검출방법을 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은
나노 갭 양 전극; 상기 양 전극에 고정되고, 표적물질에 결합하는 제 1탐침; 금속 나노구조물; 및 상기 금속 나노구조물에 고정되고, 상기 제 1탐침에 결합한 표적물질에 결합하는 제 2탐침;을 포함하는, 표적물질 검출용 바이오센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서에 표적물질를 가하는 단계; 및 상기 바이오센서의 나노 갭 양 전극 사이의 전기적 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 표적물질 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(1) 나노 갭 양 전극, 및 금속 나노구조물을 준비하는 단계;
(2) 상기 나노 갭 양 전극에 제 1탐침을 고정하는 단계;
(3) 상기 금속 나노구조물에 제 2탐침을 고정하는 단계; 및
(4) 상기 제 1탐침이 고정된 나노 갭 양 전극에 상기 제 2탐침이 고정된 금속 나노구조물 및 표적물질을 가하는 단계;를 포함하는, 표적물질 검출용 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 나노 갭 양 전극; 상기 양 전극에 고정되고, 표적물질에 결합하는 제 1탐침; 금속 나노구조물; 및 상기 금속 나노구조물에 고정되고, 상기 제 1탐침에 결합한 표적물질에 결합하는 제 2탐침;을 포함하는, 표적물질 검출용 바이오센서를 제공한다.
상기 나노 갭 전극은 기판위에 패터닝된 30~50 nm의 간격을 가지는 전극을 의미하는 것으로, 작업 전극, 기준 전극 또는 상대 전극을 포함할 수 있다. 또한, 상기 전극은 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 금, 은, 구리, 백금, 카본, 인듐 주석 산화물(Indium Tin Oxide, ITO), 알루미늄 등의 전극일 수 있고, 금 전극인 것이 바람직하다.
또한 기판 위에 다수의 나노 갭 양 전극을 패터닝함으로써, 동시적으로 같거나, 서로 다른 여러 개의 표적물질을 검출할 수 있다.
상기 표적물질은 생체 내 존재하는 물질로, 제 1탐침 및 제 2탐침과 물리적 또는 화학적 상호작용에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 제한 없이 검출될 수 있다. 즉 표적물질은 생체 내 존재하는 DNA, RNA, ATP, 단백질, 펩티드, 항체, 호르몬, 금속 이온 등의 표적분자, 및 박테리아, 바이러스 등의 표적세포와 같은 화학 또는 바이오 물질을 말한다.
상기 단백질로는 PSA(prostate specific antigen), 트로포닌아이(troponin I), 트로포닌티(troponin T), 단백질 분해효소(protease), 트롬빈(thrombin), 피브리노겐(fibrinogen), 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG), 면역글로불린 M(IgM), 면역글로불린 A(IgA), 면역글로불린 D(IgD), 헤모글로빈(hemoglobin), 미오글로빈(myoglobin), 알부민(albumin), 카제인(casein), 프롤라민(prolamin), 액틴(actin), 미오신(myosin), 콜라겐(collagen), 및 케라틴(keratin) 등 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 바이러스는 조류인플루엔자 바이러스, 돼지(swine)인플루엔자 바이러스, AIDS(Acquired immune deficiency syndrome) 바이러스, 코로나 바이러스, SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome) 바이러스, HMPV(Human Meta pneumo virus), 인플루엔자 A+B, 아데노 바이러스, RSV(Respiratory Syncytial Virus), 리노 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스 등 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 바이오센서에 신종플루인 H1-돼지(swine)인플루엔자 바이러스를 포함하는 시료를 가한 경우, 큰 전류 신호를 나타내어 표적물질을 고감도로 검출하는 우수한 효과를 나타내었다.
또한, 상기 표적물질은 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭될 수 있으며, 비오틴(biotin), 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소, 압타머(aptamer), 종양마커(tumor marker), 형광분자(Cy5, Cy3, FAM, FITC) 등으로 표지될 수 있다.
일반적으로 "탐침"이란 검출하고자 하는 표적물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 표적물질과 특이적으로 결합하는 DNA 분자, RNA 분자, 항체, 압타머, 합성 리셉터, 이오너포어, 에피토프, 비오틴, 스트렙타비딘, 단백질 수용체 등일 수 있다. 본 발명의 제 1탐침 또는 제 2탐침은 전극 표면 또는 금속 나노구조물과의 결합 효율을 높이기 위해, 티올 또는 아민 등으로 개질될 수 있고, 또는 탄소 6개를 추가적으로 포함할 수도 있으며, 표적물질과 특이적으로 결합하여 제 1탐침-표적물질-제 2탐침의 혼성화된 결합을 형성할 수 있다.
상기 금속 나노구조물은 나노 갭 양 전극사이에 연결되어 전기적 신호를 흐르게 하는 물질로서, 상기 제 1탐침-표적물질-제 2탐침의 결합을 통해 나노 갭 양 전극 사이에 연결될 수 있다. 상기 금속으로는 실리콘, 게르마늄, 카본, 금, 은, 구리, 크롬, 백금, 철, 인듐 주석 산화물(ITO), 알루미늄 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노구조물은 나노 크기를 갖는 구조물로서, 나노와이어, 나노로드 또는 나노튜브 등일 수 있으며, 일 실시예에 따라 80~300 nm의 나노로드일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서에 표적물질를 가하는 단계; 및 상기 바이오센서의 나노 갭 양 전극 사이의 전기적 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 표적물질 검출방법을 제공한다.
상기 표적물질은 생체 내 존재하는 물질로, 제 1탐침 및 제 2탐침과 물리적 또는 화학적 상호작용에 의해 결합할 수 있는 물질이라면 제한 없이 검출될 수 있다. 즉 표적물질은 생체 내 존재하는 DNA, RNA, ATP, 단백질, 펩티드, 항체, 호르몬, 금속 이온 등의 표적분자, 및 박테리아, 바이러스 등의 표적세포와 같은 화학 또는 바이오 물질을 말한다.
상기 바이러스는 조류인플루엔자 바이러스, 돼지(swine)인플루엔자 바이러스, AIDS(Acquired immune deficiency syndrome) 바이러스, 코로나 바이러스, SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome) 바이러스, HMPV(Human Meta pneumo virus), 인플루엔자 A+B, 아데노 바이러스, RSV(Respiratory Syncytial Virus), 리노 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스 등 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오센서를 이용한 표적물질의 검출은 나노 갭 양 전극에 흐르는 전기적 신호를 측정하는 것을 의미하며, 표적물질이 있을 경우에만 나노 갭 전극 사이에 금속 나노구조물이 연결되기 때문에 전기적 측정을 통하여 표적물질을 검출할 수 있다.
상기 전기적 신호는 전류 또는 전압일 수 있으며, 상기 전기적 신호의 크기을 측정함으로써, 검출되는 표적물질의 양을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) 나노 갭 양 전극, 및 금속 나노구조물을 준비하는 단계;
(2) 상기 나노 갭 양 전극에 제 1탐침을 고정하는 단계;
(3) 상기 금속 나노구조물에 제 2탐침을 고정하는 단계; 및
(4) 상기 제 1탐침이 고정된 나노 갭 양 전극에 상기 제 2탐침이 고정된 금속 나노구조물 및 표적물질을 가하는 단계;를 포함하는, 표적물질 검출용 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
상기 바이오센서의 제조방법은 상기 (2)단계 후에, 제 1탐침이 고정되지 않은 전극 부분을 머캅토-헥산올(mercapto-hexanol), 머캅토-운데카놀(mercapto-undecanol) 또는 에탄올 아민(ethanol amine)으로 블로킹(blocking)시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 블로킹은 전극이 더 이상 다른 물질과 반응하지 않도록 처리하는 것으로, 상기 제 1탐침과 반응하지 않은 전극 부분을 티올 또는 아민을 포함하는 선형(linear)구조의 화합물로 블로킹할 수 있다. 바람직하게는 머캅토-헥산올(mercapto-hexanol), 머캅토-운데카놀(mercapto-undecanol) 또는 에탄올 아민(ethanol amine)으로 블로킹시킬 수 있다. 또한, PEG계열의 고분자 말단이 티올이나 아민으로 개질된 고분자를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 티올-PEG(thiol-PEG) 또는 아민-PEG(amine-PEG)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 바이오센서는, 표적물질의 존재에 따른 나노 갭 양 전극 사이에 연결된 금속 나노구조물을 이용해 전기적 신호를 측정함으로써, 표적물질의 농도 분석이 용이하고, 실시간으로 표적물질을 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서는 표적물질의 존재에 따른 나노 갭 양 전극 사이에 연결된 금속 나노구조물을 이용해 전기적 신호를 측정함으로써, 표적물질에 대한 민감도 및 선택도가 우수하여 표적물질의 농도 분석이 용이하고, 상기 바이오센서를 이용하여 표적물질을 검출하는 경우, 단순하고 경제적이며, 실시간으로 표적물질을 검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 실시예 1 내지 3에 따른 표적물질 검출용 바이오센서의 제조과정을 나타내는 도이다.
도 2는 실시예 1 내지 3에 따른 바이오센서에 표적 DNA를 가한 경우, 주사전자현미경(SEM) 이미지를 나타내는 도이다.
도 3은 실시예 1 내지 3에 따른 바이오센서에 표적 DNA를 가한 경우, 전기적 신호(전압 vs. 전류) 측정 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 실시예 4에 따른 바이오센서의 각각 3개의 나노 갭 양 전극에 각각 H1-돼지(swine)인플루엔자 바이러스 및 H1-계절인플루엔자 바이러스를 가한 경우, (a) 전기적 신호 및 (b) 형광 신호 측정 결과를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물의 준비
실험에 사용된 나노갭 전극은 (주) 미코바이오메드 사에서 제작하여, 이를 사용하였다.
또한, 금 나노로드는 문헌에 기재된 방법을 이용하여 제작하였다 (참조: Nano Letters, (2013), 13(2). 765~771). 보다 구체적으로는, 먼저 플라스크에 0.5 mM HAuCl4 5 mL와 0.2 M Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 5 mL를 넣고 충분히 혼합한 후, 상기 혼합 용액을 교반하면서 0.00375 M NaBH4 1.6 mL를 가하고 2 분 동안 반응시켰고, 용액의 색 변화를 통해 금 나노입자의 형성을 확인하였다. 이렇게 형성된 금 나노입자를 30 분 동안 성장시킨 후, 종(種) 입자로 사용하였다. 상기 금 나노입자를 나노로드로 성장시키기 위한 용액은 다음과 같이 제조하였다. 7.0 g CTAB와 1.234 g 올레산 나트륨(sodium oleate, NaOL)을 250 mL 증류수를 넣고 50 ℃에서 충분히 교반시킨 후, 30℃로 냉각하고, 이 용액에 4 mM AgNO3 24.0 mL와 1 mM HAuCl4 250 mL를 가하여 90 분 동안 교반시킨 후, 다시 34 wt% HCl 5.4 mL를 가하여 15분 동안 교반시켰다. 그리고 0.064 M 아스코르브산 용액 1.25 mL을 가한 후, 30 초 동안 교반시킨 후, 상기 제조된 금 나노입자 용액 0.8 mL를 가하고 30 초 동안 교반시킨 후, 30℃에서 12 시간동안 방치하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 7000 rpm으로 30 분동안 원심분리하여 금 나노로드를 분리시키고 증류수로 충분히 세척한 후, 증류수 300 mL에 분산시켰다.
실시예 2. 제 1탐침, 제 2탐침의 고정 및 표적물질의 준비
제 1탐침으로 사용된 DNA는 Bioneer에서 합성하였다 (하기 표 1 참조). DNA 혼성화 할때 사용된 버퍼는 5X SSC 버퍼(0.1% SDS 포함)를 사용하였다. 먼저, 준비된 나노갭 전극에 티올이 있는 제 1탐침 DNA의 10 uM을 12시간 동안 반응시켰다. 그 후, 제 1탐침 DNA가 반응하지 않은 전극 부분을 블로킹하기 위해 10 mM mercapto-hexanol을 12시간 동안 반응시킴으로써, 제 1탐침 DNA를 나노 갭 전극위에 고정시켰다.
또한, 제 2탐침으로는 스트렙타비딘을 사용하여 금 나노로드에 고정시켰다. 먼저, 1mL의 금 나노로드에 20uL MUA(Mercaptoundecanoicacid,ETOH, 2OmM)을 가한 후, 12시간 이상 반응시키고, 다시 100 uL m-PEG-SH (Sunbio, 5K, DW)를 가한 후, 12시간 이상 반응시켰다. 그 후, 상기 혼합물을 7000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 금 나노로드를 분리하였고, 이를 다시 1 mL 0.2% tween 20으로 용해한 후. EDC/NHS (0.4M/0.1M) 100 uL를 가하고 1시간 동안 초음파 처리하여 반응시켰다. 그 후, 상기 혼합물을 5000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 금 나노로드를 분리하였고, 이를 다시 950 uL PBST(0.2% tween 20)으로 용해한 후, 스트렙타비딘 (1mg/ml, PBS) 50 uL를 가하고 2시간 이상 초음파 처리하여 반응시켰다. 마지막으로 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 하여, 금 나노로드에 결합하지 않은 스트렙타비딘을 제거하고, BSA(0.1mg/ml)가 포함된 PBS 버퍼에 용해시킴으로써, 금 나노로드에 제 2탐침인 스트렙타비딘을 고정시켰다.
또한, 표적물질로는 비오틴으로 표지된 표적 DNA를 사용하였다 (표 1 참조).
이름 DNA 서열(5'-3)
비오틴 표적 DNA CAGTCTCAATTTTGTGCTTTT-비오틴
탐침 DNA 1(SW-1) AAAAGCACAAAATTGAGACTGTTTTTTTTT[3THIOLC3]
탐침 DNA 2(SW-2) AGCTTCTACAAAAATTTAATATGGTTTTTTTTT[3THIOLC3]
탐침 DNA 3(SW-3) TCGAACAAAGGTGTAACGGTTTTTTTTT[3THIOLC3]
비교 탐침 DNA 1(SE-1) AACTATTACTGGACCTTGCTATTTTTTTTT[3THIOLC3]
cDNA 합성용 primer GACTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGG
template 제작용 primer (1)GAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCT
(2)CTTTGTTAGTAATCTCGTCAATGGC
Asymmetric PCR primer (1)TGCAACCGCAAATGCAGA
(2)TGAATAGACGGGATATTCC
실시예 3. 표적물질의 PCR 증폭
인플루엔자 바이러스 검출을 위해, 전기적 DNA 어세이(assay)에 필요한 표적 PCR 산물(product)은 상기 표 1의 DNA 프라이머(primer)를 사용하였다. 표적 바이러스로는 신종플루 바이러스인 H1N1/A/California/04/2009을 사용하였다. 상기 표적 바이러스에서 PROMEGA cDNA 합성 키트를 이용하여 cDNA를 제작하였고, 표 1의 프라이머를 이용하여 1차 template DNA를 제작하였다. 그 후, 마지막으로 비오틴-11-DUTP를 Asymmetric PCR에 이용함으로써, 단일 가닥의 비오틴이 결합된 PCR 증폭된 표적물질를 제작하였다.
실시예 4. 바이오센서를 이용한 H1-돼지(swine)인플루엔자 바이러스의 검출
상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 바이오센서의 각각 3개의 나노 갭 양 전극에 H1-돼지(swine)인플루엔자 바이러스를 포함하는 시료를 가한 후(상기 표 1의 탐침 DNA 1, 2, 및 3), 전기적 신호를 측정하였다. 또한, 비교 실험으로 H1-계절인플루엔자 바이러스를 포함하는 시료를 바이오센서에 가한 후(상기 표1의 비교탐침 DNA 1), 전기적 신호를 측정하였다.
실험예 1. 바이오센서의 주사전자현미경( SEM ) 및 전기적 신호 분석
상기 실시예 1 내지 3에 따른 바이오센서의 나노 갭 양 전극에 비오틴으로 표지된 표적 DNA 및 스트렙타비딘이 고정된 금 나노로드를 가한 후, 상기 나노 갭 양 전극사이에 금 나노로드의 연결 여부를 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 확인하고, 전기적 신호를 측정하였다. 이의 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 나노 갭 양 전극 사이로 약 200~300nm 길이의 금 나노로드가 연결되어 있는 것을 알 수 있고, 도 3에 나타난 바와 같이, 전기적 신호(전류)가 크게 증가하는 것을 알 수 있다. 상기 결과로부터 본 발명의 바이오센서가 표적 DNA를 고감도로 검출할 수 있는 것을 확인하였다.
실험예 2. 바이오센서를 이용한 H1 -돼지( swine )인플루엔자 바이러스의 검출 분석
상기 실시예 4에 따른 바이오센서의 각각 3개의 나노 갭 양 전극에 각각 H1-돼지(swine)인플루엔자 바이러스(탐침 DNA 1, 2 및 3) 및 H1-계절인플루엔자 바이러스(비교탐침 DNA 1, 2, 및 3)를 가한 후, 이의 (a) 전기적 신호 측정결과 및 (b) 형광 신호 측정결과를 비교하여 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 3개의 H1-돼지(swine)인플루엔자 바이러스를 포함하는 시료(SW-1, SW-2 및 SW-3)에 대해 전기적 신호(전류)가 크게 증가하는 것을 알 수 있다. 그러나, H1-계절인플루엔자 바이러스를 포함하는 시료(SE-1, SE-2 및 SE-3)에 대해서는 거의 전기적 신호가 나타나지 않았다. 또한, 상기 전기적 신호 측정 결과는 형광 신호 측정 결과와 거의 동일한 결과를 나타내었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 바이오센서가 표적 인플루엔자 바이러스를 고감도로 검출할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (14)

  1. 나노 갭 양 전극; 상기 양 전극에 고정되고, 표적물질에 결합하는 제 1탐침; 금속 나노구조물; 및 상기 금속 나노구조물에 고정되고, 상기 제 1탐침에 결합한 표적물질에 결합하는 제 2탐침;을 포함하는, 표적물질 검출용 바이오센서.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 전극은 금, 은, 구리, 백금, 카본, 인듐 주석 산화물(Indium Tin Oxide, ITO), 알루미늄 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 바이오센서.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 표적물질은 물리적 또는 화학적 상호작용에 의해 제 1탐침 및 제 2탐침과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 바이오센서.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 표적물질은 DNA, RNA, ATP, 단백질, 펩티드, 항체, 호르몬 또는 금속 이온을 포함하는 표적분자, 및 박테리아 또는 바이러스를 포함하는 표적세포 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 바이오센서.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 바이러스는 조류인플루엔자 바이러스, 돼지(swine)인플루엔자 바이러스, AIDS(Acquired immune deficiency syndrome) 바이러스, 코로나 바이러스, SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome) 바이러스, HMPV(Human Meta pneumo virus), 인플루엔자 A+B, 아데노 바이러스, RSV(Respiratory Syncytial Virus), 리노 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 바이오센서.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 표적물질은 비오틴(biotin), 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소, 압타머(aptamer), 종양마커(tumor marker), 형광분자(Cy5, Cy3, FAM, 또는 FITC) 및 이들의 조합으로부터 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 바이오센서.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1탐침 또는 제 2탐침은 DNA 분자, RNA 분자, 항체, 압타머, 합성 리셉터, 이오너포어, 에피토프, 비오틴, 스트렙타비딘, 단백질 수용체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 바이오센서.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 금속은 실리콘, 게르마늄, 카본, 금, 은, 구리, 크롬, 백금, 철, 인듐 주석 산화물(ITO), 알루미늄 및 이들의 조합으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 바이오센서.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 나노구조물은 나노와이어, 나노로드 또는 나노튜브인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 바이오센서.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 바이오센서에 표적물질를 가하는 단계; 및
    상기 바이오센서의 나노 갭 양 전극 사이의 전기적 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 표적물질 검출방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 표적물질은 DNA, RNA, ATP, 단백질, 펩티드, 항체, 호르몬 또는 금속 이온을 포함하는 표적분자, 및 박테리아 또는 바이러스를 포함하는 표적세포 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 전기적 신호는 전류 또는 전압인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출방법.
  13. (1) 나노 갭 양 전극 및 금속 나노구조물을 준비하는 단계;
    (2) 상기 나노 갭 양 전극에 제 1탐침을 고정하는 단계;
    (3) 상기 금속 나노구조물에 제 2탐침을 고정하는 단계; 및
    (4) 상기 제 1탐침이 고정된 나노 갭 양 전극에 상기 제 2탐침이 고정된 금속 나노구조물 및 표적물질을 가하는 단계;를 포함하는, 표적물질 검출용 바이오센서의 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 (2)단계 후에, 제 1탐침이 고정되지 않은 전극 부분을 머캅토-헥산올(mercapto-hexanol), 머캅토-운데카놀(mercapto-undecanol) 또는 에탄올 아민(ethanol amine)으로 블로킹(blocking) 시키는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 바이오센서의 제조방법.
KR1020140193008A 2014-12-30 2014-12-30 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법 KR20160083167A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140193008A KR20160083167A (ko) 2014-12-30 2014-12-30 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140193008A KR20160083167A (ko) 2014-12-30 2014-12-30 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160083167A true KR20160083167A (ko) 2016-07-12

Family

ID=56504744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140193008A KR20160083167A (ko) 2014-12-30 2014-12-30 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20160083167A (ko)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018090053A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 University Of Notre Dame Du Lac Methods and apparatus for a shear-enhanced cnt-assembly nanosensor platform for ultra-sensitive and selective protein detection
KR20190015089A (ko) * 2017-08-04 2019-02-13 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 비기능화 나노갭 임피던스 센서 및 이를 이용한 핵산 증폭의 실시간 모니터링 방법
CN109444117A (zh) * 2018-11-05 2019-03-08 青岛科技大学 一种基于银纳米簇猝灭效应和多重放大技术的电化学发光生物传感器及其应用
CN109580743A (zh) * 2018-11-08 2019-04-05 青岛科技大学 一种基于离子交换技术及多重放大反应的光致电化学传感器的研制及其应用
CN110297028A (zh) * 2018-03-21 2019-10-01 首都师范大学 一种检测h1n1流感病毒的电化学传感器及其制备和检测方法
KR20190121247A (ko) * 2018-04-17 2019-10-25 한국화학연구원 멀티웰 전극 기반 바이오센서
CN111189900A (zh) * 2020-02-21 2020-05-22 云南大学 一种新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法
KR20200077058A (ko) * 2018-12-20 2020-06-30 전자부품연구원 Ito 나노 입자를 이용한 바이오센서용 작업 전극 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 소변 내 항원 농도 측정 방법
KR102323229B1 (ko) 2021-02-22 2021-11-05 주식회사 에이티전자통신 바이러스 검출 기반의 자동 공조 시스템
WO2021262739A1 (en) * 2020-06-22 2021-12-30 Roswell Biotechnologies, Inc. Methods for bonding molecules to ruthenium surfaces

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100000360A (ko) 2008-06-24 2010-01-06 박태랑 장갑의 제조방법 및 그러한 방법에 의한 장갑

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100000360A (ko) 2008-06-24 2010-01-06 박태랑 장갑의 제조방법 및 그러한 방법에 의한 장갑

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3538690A4 (en) * 2016-11-14 2020-11-25 University of Notre Dame du Lac PROCESSES AND APPARATUS FOR A SHEAR-IMPROVED NTC-ASSEMBLED NANOSENSOR PLATFORM FOR ULTRASENSITIVE AND SELECTIVE PROTEIN DETECTION
WO2018090053A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 University Of Notre Dame Du Lac Methods and apparatus for a shear-enhanced cnt-assembly nanosensor platform for ultra-sensitive and selective protein detection
US10955380B2 (en) 2016-11-14 2021-03-23 University Of Notre Dame Du Lac Methods and apparatus for a shear-enhanced CNT-assembly nanosensor platform for ultra-sensitive and selective protein detection
KR20190015089A (ko) * 2017-08-04 2019-02-13 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 비기능화 나노갭 임피던스 센서 및 이를 이용한 핵산 증폭의 실시간 모니터링 방법
CN110297028A (zh) * 2018-03-21 2019-10-01 首都师范大学 一种检测h1n1流感病毒的电化学传感器及其制备和检测方法
CN110297028B (zh) * 2018-03-21 2021-08-17 首都师范大学 一种检测h1n1流感病毒的电化学传感器及其制备和检测方法
KR20190121247A (ko) * 2018-04-17 2019-10-25 한국화학연구원 멀티웰 전극 기반 바이오센서
CN109444117A (zh) * 2018-11-05 2019-03-08 青岛科技大学 一种基于银纳米簇猝灭效应和多重放大技术的电化学发光生物传感器及其应用
CN109580743A (zh) * 2018-11-08 2019-04-05 青岛科技大学 一种基于离子交换技术及多重放大反应的光致电化学传感器的研制及其应用
KR20200077058A (ko) * 2018-12-20 2020-06-30 전자부품연구원 Ito 나노 입자를 이용한 바이오센서용 작업 전극 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 소변 내 항원 농도 측정 방법
CN111189900B (zh) * 2020-02-21 2020-10-27 云南大学 一种新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法
CN111189900A (zh) * 2020-02-21 2020-05-22 云南大学 一种新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法
WO2021262739A1 (en) * 2020-06-22 2021-12-30 Roswell Biotechnologies, Inc. Methods for bonding molecules to ruthenium surfaces
KR102323229B1 (ko) 2021-02-22 2021-11-05 주식회사 에이티전자통신 바이러스 검출 기반의 자동 공조 시스템

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20160083167A (ko) 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법
Muniandy et al. Carbon nanomaterial-based electrochemical biosensors for foodborne bacterial detection
Kaya et al. Pathogen detection with electrochemical biosensors: Advantages, challenges and future perspectives
Pasinszki et al. Carbon nanomaterial based biosensors for non-invasive detection of cancer and disease biomarkers for clinical diagnosis
Sharma et al. Nano-carbon based sensors for bacterial detection and discrimination in clinical diagnosis: A junction between material science and biology
Abu-Salah et al. DNA-based nanobiosensors as an emerging platform for detection of disease
Lee et al. Nanomaterial-based biosensor as an emerging tool for biomedical applications
Matsumoto et al. Current and emerging challenges of field effect transistor based bio-sensing
Zheng et al. An electrochemical DNA sensor based on polyaniline/graphene: high sensitivity to DNA sequences in a wide range
Li et al. An aptamer-based biosensor for the detection of lysozyme with gold nanoparticles amplification
Chung et al. Electrochemical DNA biosensor based on avidin–biotin conjugation for influenza virus (type A) detection
Syed Advances in nanodiagnostic techniques for microbial agents
Zhao et al. Ag/CdO NP-engineered magnetic electrochemical aptasensor for prostatic specific antigen detection
Kim et al. Fabrication of MERS-nanovesicle biosensor composed of multi-functional DNA aptamer/graphene-MoS2 nanocomposite based on electrochemical and surface-enhanced Raman spectroscopy
Lin et al. A reversible surface functionalized nanowire transistor to study protein–protein interactions
Abazar et al. Chitosan-carbon quantum dots as a new platform for highly sensitive insulin impedimetric aptasensor
ES2730808T3 (es) Procedimiento de detección de material diana que usa aptámero
Hatami et al. Zinc oxide-gold nanocomposite as a proper platform for label-free DNA biosensor
KR20070000667A (ko) 압타머를 이용한 탄소 나노튜브 트랜지스터 바이오센서 및이것을 이용한 타겟물질 검출 방법
US9382580B2 (en) Detection units and methods for detecting a target analyte
Liu et al. Electrochemiluminescent biosensor with DNA link for selective detection of human IgG based on steric hindrance
Saatci et al. State-of-the-art colloidal particles and unique interfaces-based SARS-CoV-2 detection methods and COVID-19 diagnosis
Lyberopoulou et al. Nanotechnology-based rapid diagnostic tests
Zhang et al. Nanomaterials used in fluorescence polarization based biosensors
Chen et al. A novel chemiluminescence immunoassay for highly sensitive and specific detection of protein using rolling circle amplification and the multiplex binding system

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application