KR20200077058A - Ito 나노 입자를 이용한 바이오센서용 작업 전극 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 소변 내 항원 농도 측정 방법 - Google Patents

Ito 나노 입자를 이용한 바이오센서용 작업 전극 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 소변 내 항원 농도 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 바이오센서용 작업 전극 제조 방법 (a) ITO 글래스(glass) 전극을 제공하는 단계; (b) 상기 ITO 글래스 전극 상에 ITO 나노 입자를 코팅하는 단계; (c) 상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 연결 화합물을 고정시키는 단계; 및 (d) 상기 연결 화합물에 항체를 고정하는 단계를 포함한다. 본 개시는 상기 제조 방법에 의해 제조된 바이오센서용 작업 전극 및 이를 포함하는 바이오센서를 이용한 소변 내 항원의 농도를 측정하는 방법 또한 개시한다.

Description

ITO 나노 입자를 이용한 바이오센서용 작업 전극 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 소변 내 항원 농도 측정 방법{Method for manufacturing working electrode for biosensor using ITO nanoparticles, an electode manufactured by the method and method for measuring concentration of antigen in urine by using the electrode}
본 개시는 소변 내 존재하는 방광암 또는 전립선암의 바이오마커의 농도를 측정하기 위한 바이오센서에 사용되는 작업 전극의 제조 방법, 상기 제조 방법에 의해 제조된 전극 및 이를 사용한 소변 내 항원 농도 측정 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 ITO 글래스(glass) 전극에의 ITO 나노 입자 코팅을 사용하는 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 소변 내 항원 농도 측정 방법에 관한 것이다.
소변을 이용한 질병진단에 관한 연구는 1958년 당과 단백질을 검사할 수 있는 요 검사지가 개발되면서 본격적으로 주목을 받기 시작하였으며, 이후 소변을 이용하여 보다 많은 질병들을 진단하기 위한 시스템 및 이를 이용한 검사법에 대한 연구가 진행되고 있다. 전립선암 또는 방광암을 포함하는 다양한 질병들을 소변을 이용하여 진단하는 경우, 채혈과 같은 침습적인 방법과 달리, 비침습적인 방법을 통해 시료를 얻는 것이 가능하여, 환자의 심적, 육체적 부담을 줄일 수 있다는 이점을 갖는다.
또한, 종래의 요 검사지가 질병 유무를 판단함에 변색 등의 시각적인 판단에 의존한 것과 달리, 전기화학센서를 이용하여 소변 내 존재하는 질병의 바이오마커의 농도를 측정하는 경우, 수치로서 질병의 유무를 판단하는 것이 가능해져 그 신뢰도는 더욱 상승할 수 있다.
다만, 바이오센서에 사용되는 종래의 금속, 고분자 등으로 제조된 작업 전극의 경우 전기 화학적 신호의 측정 시 노이즈 신호가 동시에 측정되어, 측정된 전기 화학적 신호의 신뢰성이 저하되는 문제점 및 바이오마커가 결합될 수 있는 작업 전극의 표면이 2차원적 평면으로 제한되어, 보다 선명한 전기 화학적 신호를 얻기 위하여는 높은 전압을 인가하여야 한다는 문제점이 존재하였다.
선행 기술 KR10-2016-0083167은 나노 갭 전극 및 금속 나노구조물을 이용한 표적물질검출용 바이오센서의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 바이오센서를 이용한 생체 내 표적물질 검출방법에 대해 개시하고 있다. 그러나 상기 선행 기술은 80~300 nm, 실험예에서는 200~300 nm의 길이를 갖는 ITO 나노 로드(rod)를 포함하는 바이오센서 작업 전극 및 이를 사용한 H-1 돼지(swine) 인플루엔자 바이러스의 검출에 대하여만 개시하고 있을 뿐, 그 이하의 입자 직경을 갖는 ITO 나노 입자를 포함하는 바이오센서 작업 전극 및 이에 의한 표적 물질 측정 방법에 대하여는 전혀 인지하고 있지 않다.
이에, 종래의 바이오센서에 비해 보다 낮은 전압을 인가하여도 일정 수준 이상의 바이오센서에 의한 표적 물질 농도 측정의 정확성을 보장하는 바이오센서용 작업 전극에 대한 연구가 진행되어 왔다.
따라서, 본 개시의 관점은 낮은 전압을 인가한 경우에도 높은 정도의 바이오센서 측정 정확도를 달성하기 위해 소정의 크기의 ITO 나노 입자를 포함하는 방광암 또는 전립선암을 진단하기 위한 전기 화학적 바이오센서에 사용되는 작업 전극을 제조하는 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 상기 제조된 전극을 사용한 소변 내 항원 농도 측정 방법을 제공하는데 있다.
본 개시의 제1 관점은 바이오센서용 작업 전극 제조 방법으로서, (a) ITO 글래스(glass) 전극을 제공하는 단계; (b) 상기 ITO 글래스 전극 상에 ITO 나노 입자를 코팅하는 단계; (c) 상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 연결 화합물을 고정시키는 단계; 및 (d) 상기 연결 화합물에 항체를 고정하는 단계를 포함한다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 단계 (b)의 ITO 나노 입자는 스핀 코팅(spin coating)에 의해 코팅된다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 연결 화합물은 비오틴-아비딘, 비오틴-스트렙타비딘(streptavidin), 카보디이미드(carbodiimide) 가교제 및 석신이미드(succinimide) 가교제 중 어느 하나이다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 단계 (c)는 상기 ITO 전극의 표면에 산소 플라즈마 처리하는 단계를 포함한다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 산소 플라즈마 처리하는 단계는 1 내지 5분의 처리 시간, 500 내지 1000 sccm의 산소 유량, 10 내지 100 W의 전력 및 50 mTorr 분위기 하에서 수행된다.
본 개시의 제2 관점은 상기 제조 방법에 의해 제조된 바이오센서용 작업 전극에 관한 것이다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 ITO 나노 입자의 직경은 1-20 nm이다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 ITO 나노 입자의 직경은 5-12 nm이다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 ITO 나노 입자의 용매에 대한 중량비 w/w%는 0.3 내지 3이다.
본 개시의 제3 관점은, 바이오센서를 이용한 소변 내 항원의 농도를 측정하는 방법으로서, 1) 상기 소변에 상기 작업 전극을 침지하는 단계; 2) 상기 침지된 작업 전극에 전기적 산화환원반응 효소를 처리한 후, 전기적 산화환원반응 기질을 포함하는 용액에 침지하고 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 항원은 전립선암 또는 방광암 진단의 바이오마커이다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 바이오마커는 Metrix Metallo Peptidase-9(MMP-9), Apolipoprotein A-1(ApoA1), prostate-specific antigen(PSA), Prostate specific membrane antigen (PSMA), Annexin A3(ANX A3), nuclear matrix protein 22(NMP22), bladder tumor antigen(BTA), 및 urinary bladder carcinoma antigen(UBC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 전기적 산화환원반응 효소는 HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), 글루코스옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라이제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinestrerase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 효소이다.
본 개시의 일 구체예를 따르면, 상기 전기적 시그널의 측정은 순환전압(CV)법을 이용하며, 상기 전기적 시그널은 순환전압법을 통해 측정된 최대의 전류값이다.
본 개시의 바이오센서용 작업 전극 제조 방법을 통해, 전기 화학적 신호 측정 시, 노이즈가 적고 저전압에서도 높은 전류 값을 갖는 피크를 측정할 수 있는 바이오센서용 작업 전극을 제조할 수 있다.
또한, 상기 제조 방법에 의해 제조된 바이오센서용 작업 전극을 소변 내 항원 농도의 측정에 사용하는 경우, ITO 글래스는 낮은 백그라운드 전류(background current)를 나타내는 바, 노이즈가 적으며, ITO 나노 입자를 적용하여 기존 ITO 전극의 단점인 낮은 전자촉매 활성도(electorcatalytical activity)를 보완함으로써 저전압에서도 피크를 측정할 수 있어 측정에 소모되는 비용을 절감할 수 있고, 측정되는 피크의 높은 전류 값으로 인해 피크를 선명하게 인식 가능하므로, 소변 내 항원 농도 측정의 정확도를 보다 향상시킬 수 있다.
도 1은 ITO 글래스 전극 표면에 ITO 나노 입자를 코팅하고, 이에 연결 화합물을 고정시키는 공정 및 전기적 산화 환원 반응 효소에 의한 산화 환원 반응 기질의 전환 및 이의 산화 환원 반응을 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 개시의 일 구체예에 따른 작업 전극 표면 상에 고정된 항체, 상기 항체와 결합하는 바이오마커, 및 상기 바이오마커에 처리된 전기적 산화환원반응 효소에 관한 개략도이다.
도 3은 본 개시의 실시예에 따라 ITO 나노 입자의 면적 당 농도를 달리하여 얻은 작업 전극 표면의 SEM 이미지이다.
도 4는 ITO 나노 입자의 중량비가 바이오센서의 전기 화학적 신호에 미치는 영향을 파악하기 위해 본 개시의 실시예에 따라 전기적 산화 환원 반응 효소의 농도 및 ITO 나노 입자의 중량비를 달리하여 측정한 순환전압전류곡선이다.
도 5는 ITO 나노 입자의 중량비가 산화 피크의 전압에 미치는 영향을 파악하기 위해 본 개시의 실시예에 따라 전기적 산화 환원 반응 효소의 농도 및 ITO 나노 입자의 중량비를 달리하여 측정한 순환전압전류곡선이다.
본 개시의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이나, 본 개시가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 개시를 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
바이오센서용 작업 전극 제조 방법
본 개시는 바이오센서용 작업 전극 제조 방법으로서, (a) ITO 글래스(glass) 전극을 제공하는 단계; (b) 상기 ITO 글래스 전극 상에 ITO 나노 입자를 코팅하는 단계; (c) 상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 연결 화합물을 고정시키는 단계; 및 (d) 상기 연결 화합물에 항체를 고정하는 단계를 포함한다.
본 개시의 바이오센서용 전극은 ITO 글래스로 이루어진다. ITO 글래스 전극의 경우, 바이오 센서에 적용 시, 노이즈 신호를 줄일 수 있고 별도의 점착층 없이도 유기 기판 상에 ITO 박막이 침적된 기판을 그대로 사용할 수 있는 장점이 있다. 상기 ITO 글래스 전극은 디스플레이 산업 등에서 대형 기판 상에 높고 안정적인 전기전도성 특성을 갖는 박막 기판 제조 공정을 동일하게 활용할 수 있으므로, 매우 저렴하게 전극으로 제작이 가능하다는 이점을 갖는다.
상기 ITO 나노 입자는 스핀 코팅(spin coating)에 의해 코팅될 수 있다. 본 개시의 ITO 나노 입자는 전극 표면을 형성하는 것으로, 나노 입자의 본래의 형태를 유지하면서 코팅시키는 것이 중요하므로, 스핀 코팅을 사용한다.
스핀 코팅은 평탄한 기판에 박막을 균일하게 침착(deposit)시키기 위한 공정이다. 소량의 ITO 나노 입자를 ITO 글래스 전극의 중심에 도포한 후, 이를 회전시켜, 원심력에 의해 ITO 나노 입자가 ITO 글래스 전극 전체로 분산되게 함으로써 ITO 나노 입자를 코팅한다. 스핀 코팅의 각속도(angular speed)가 빠를수록 ITO 나노 입자의 분산이 활발하므로, 보다 얇은 코팅이 생성된다. 따라서, 스핀 코팅의 각속도를 조절하여 ITO 나노 입자의 코팅 두께를 제어하는 것이 가능하다. 뿐만 아니라, 스핀 코팅은 스퍼터링(sputtering), 진공 증착 등과 같은 나노 입자를 이온화시켜 침착시키는 공정과 달리 본래의 나노 입자의 형태를 유지시키면서 침착시키는 것이 가능하고, 공정에 소모되는 비용 또한 저렴하다는 이점을 갖는다.
본 개시의 ITO 나노 입자의 스핀 코팅은 2단계에 걸쳐 진행된다. 먼저, ITO 나노 입자는 100 내지 500 rpm, 바람직하게는 100 내지 400 rpm, 100 내지 300 rpm, 100 내지 200 rpm, 200 내지 500 rpm, 200 내지 400 rpm, 200 내지 300 rpm, 300 내지 500 rpm, 300 내지 400 rpm, 보다 바람직하게는 150 내지 250 rpm에서 5 내지 20초, 바람직하게는 5 내지 15초, 보다 바람직하게는 10초 간 스핀 코팅된다.
이후, 본 개시의 ITO 나노 입자는 1000 내지 2000 rpm, 바람직하게는 1000 내지 1800 rpm, 1000 내지 1700 rpm, 1000 내지 1600 rpm, 1000 내지 1500 rpm, 1000 내지 1400 rpm, 1000 내지 1300 rpm, 보다 바람직하게는 1200 내지 1600 rpm 또는 1200 내지 1500 rpm에서 30초 내지 1분, 바람직하게는 30초 내지 50초, 30초 내지 40초, 보다 바람직하게는 40초 내지 55초 동안 재차 스핀 코팅된다.
상기 스핀 코팅 후, ITO 나노 입자가 스핀 코팅된 ITO 글래스 전극은 핫 플레이트(hot plate)에서 45 ℃의 온도로 30분 간 인큐베이션(incubation)된 후, 200 ℃의 온도로 60분 간 인큐베이션된다.
상기 ITO 나노 입자의 상기 ITO 나노 입자의 직경은 1-20 nm, 1-15 nm, 1-14 nm, 1-13 nm, 1-12 nm, 1-11 nm, 1-10 nm, 1-9 nm, 1-8 nm, 1-7 nm, 1-6 nm, 5-20 nm, 5-15 nm, 5-14 nm, 5-13 nm, 5-12 nm, 5-11 nm, 5-10 nm, 5-9 nm, 5-8 nm, 5-7 nm, 및 5-6 nm일 수 있다. 상기 ITO 나노 입자의 직경은 바람직하게는 5-12 nm일 수 있다. 상기 ITO 나노 입자의 직경이 1 nm 미만인 경우, 나노 입자 제조에 어려움이 있을 뿐 아니라 지나치게 작은 ITO 나노 입자 크기로 인해 스핀 코팅 공정에 부적합하며, 직경이 20 nm 초과인 경우 ITO 나노 입자가 조밀하게 코팅될 수 없어 ITO 나노 입자에 의해 형성된 3차원적 표면의 면적이 2차원적 표면인 평면의 면적에 비해 오히려 감소되는 결과가 초래될 수 있다. 이론에 국한됨이 없이, 상기 범위 내의 직경을 갖는 ITO 나노 입자가 바이오센서용 작업 전극에 코팅되는 경우, 입체적 형상을 갖는 ITO 나노 입자로 인해 작업 전극 표면이 2차원적 평면이 아닌 3차원적인 구조를 갖게 되는 바, 전극 표면적이 극대화되어, 전극 표면에 결합하는 연결 화합물 및 연결 화합물에 결합하는 항체, 바이오마커 및 효소의 양이 증가되며, 기질이 상기 효소에 의해 전환된 후의 산화 환원 반응 물질(예를 들어, 기질이 AAP(ascorbic acid-2-phosphate)인 경우 AA(ascorbic acid))이 전극 표면에 보다 많이 부착되어 결과적으로 이러한 전극을 사용하는 바이오센서에 의해 측정되는 전기화학적 신호의 세기를 보다 증가시킬 수 있다.
본 개시에 있어서, 항체는 상기 바이오마커와 결합할 수 있는 항체로서, 작동 전극 상에 바이오마커를 캡처할 수 있는 항체를 의미한다. 상기 캡처 항체의 종류는 해당 바이오마커를 캡처하는 것이 가능하다면 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 작동 전극의 표면 상에 직접적 또는 간접적으로 고정될 수 있다. 본 개시에서, 직접적 고정 또는 결합이란 두 물체의 사이에 별도의 매개, 물질, 또는 물체의 존재 없이 두 물체가 고정 또는 결합된 것을 의미한다. 또한, 간접적 고정 또는 결합이란, 두 물체의 사이에 별도의 매개, 물질, 또는 물체가 존재하여 이들을 고정 또는 결합시키는 것을 의미한다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 항체는 작동 전극의 표면 상에 연결 화합물을 통해 간접적으로 고정될 수 있다. 여기서 연결 화합물이란 작동 전극 및 항체를 연결하는 화합물을 의미하며, 상기 연결 화합물로서 생화학적 반응 결합물인 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘(streptavidin)이 이용될 수 있다. 또한, 화학적 공유 결합물로서, 단백질의 프라이머리 아민과 결합하는 카보디이미드(carbodiimide) 가교제 또는 석신이미드(succinimide) 가교제가 이용될 수 있다. 본 개시의 상기 연결 화합물은, 바람직하게는 비오틴-아비딘일 수 있다.
종래의 연결 화합물 고정 방법은 ITO 글래스 전극 표면의 카르복실 또는 알데하이드 등에 의한 화학 처리를 통해, 아비딘과 전극 표면 간 결합을 형성하는 것이다. 이러한 종래의 연결 화합물 고정 방법에 의하면, 평탄한 2차원적 평면이 아닌 본 개시의 ITO 나노 입자가 코팅된 3차원적 전극 표면 상에 아비딘과 같은 연결 화합물이 약하게 결합되어, 충분한 양의 효소를 전극 표면에 결합시키지 못해 이를 사용한 바이오센서에 의해 측정된 전기화학적 신호가 약하게 나타나 측정의 신뢰도가 떨어질 수 있다는 문제점이 존재하였으며, 항체 자체에 대하여도 화학적 처리가 요구되어 항체의 변형이 발생할 수 있다는 문제점이 존재하였다.
산소 플라즈마에 의한 ITO 전극의 처리 시, ITO 전극에 존재하던 산소의 라디칼화가 진행되고, 생성된 산소 라디칼에 수소 이온이 라디칼 결합 반응에 의해 결합하여, ITO 전극 표면에 -OH 기가 도입된다. -OH 기를 갖는 ITO 전극 표면은 친수성 물질에 대한 높은 결합력을 갖는다. 이에, 상기 연결 화합물이 비오틴-아비딘인 경우, ITO 작업 전극과 결합을 형성하는 것은 아비딘 부분이며, 아비딘은친수성 단백질인 바, 연결 화합물의 ITO 작업 전극에의 고정화가 보다 강하게 이루어질 수 있다. 이는 이후 상기 연결 화합물에 결합되는 항체 및 항체에 결합되는 바이오마커의 강한 고정화를 가능하게 하는 바, 제조된 작업 전극을 사용한 항원 농도 측정의 정확도를 향상시킨다.
상기 산소 플라즈마 처리하는 단계는 1 내지 30분의 처리 시간, 50 내지 1000 sccm(Standard Cubic Centimeter per Minute)의 산소 유량, 10 내지 1000 W의 전력 및 10 내지 100 mTorr 분위기 하에서 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 산소 플라즈마 처리하는 단계는 1 내지 30분, 1 내지 25분, 1 내지 20분, 1 내지 15분, 1 내지 10분, 1 내지 9분, 1 내지 8분, 1 내지 7분, 1 내지 6분, 및 1 내지 5분의 처리 시간, 50 내지 1000 sccm, 50 내지 500 sccm, 50 내지 400 sccm, 50 내지 300 sccm, 50 내지 200 sccm, 및 50 내지 100 sccm의 산소 유량, 10 내지 1000 W, 10 내지 500 W, 10 내지 300 W, 10 내지 200 W, 10 내지 100 W, 50 내지 500 W, 50 내지 400 W, 50 내지 300 W, 50 내지 200 W, 및 50 내지 100W의 전력 및 10 내지 100 mTorr의 분위기 하에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바이오센서용 작업 전극
본 개시는 전술한 제조 방법에 의해 제조된 바이오센서용 작업 전극에 관한 것이다. 상기 바이오센서용 작업 전극은 ITO 글래스(glass) 전극, 상기 ITO 글래스 전극 상에 코팅된 ITO 나노 입자, 상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 고정된 연결 화합물 및 상기 연결 화합물에 고정된 항체를 포함한다.
본 개시에 있어서, 상기 바이오센서용 작업 전극은 1-20 nm의 직경을 갖는 ITO 나노 입자를 포함할 수 있다. 상기 ITO 나노 입자의 직경은 1-20 nm, 1-15 nm, 1-14 nm, 1-13 nm, 1-12 nm, 1-11 nm, 1-10 nm, 1-9 nm, 1-8 nm, 1-7 nm, 1-6 nm, 5-20 nm, 5-15 nm, 5-14 nm, 5-13 nm, 5-12 nm, 5-11 nm, 5-10 nm, 5-9 nm, 5-8 nm, 5-7 nm, 및 5-6 nm일 수 있다. 상기 ITO 나노 입자의 직경은 바람직하게는 5-12 nm일 수 있다. 상기 입자 직경을 갖는 ITO 나노 입자를 포함하는 바이오센서용 작업 전극은 전술한 바와 같이, 바이오센서에 의해 측정되는 전기화학적 신호의 세기를 보다 증가시킬 수 있다.
본 개시에 있어서, 바이오센서용 작업 전극 내 상기 ITO 나노 입자의 용매에 대한 중량비인 w/w% 값은 0.1 내지 5일 수 있다. 여기서 상기 용매는 ITO 나노 입자의 ITO 글래스 전극에 대한 부착력을 저하시키지 않는 것이면 어떠한 것이든 제한이 없으며, 바람직하게는 에탄올(EtOH), 보다 바람직하게는 30% EtOH이다. 바이오센서용 작업 전극 내 상기 ITO 나노 입자의 w/w% 값은 0.1 내지 5, 0.1 내지 4, 0.1 내지 3, 0.1 내지 2, 0.1 내지 1, 0.2 내지 5, 0.2 내지 4, 0.2 내지 3, 0.2 내지 2, 0.1 내지 1, 0.3 내지 5, 0.3 내지 4, 0.3 내지 3, 0.3 내지 2, 0.3 내지 1, 0.4 내지 5, 0.4 내지 4, 0.4 내지 3, 0.4 내지 2, 0.4 내지 1, 0.5 내지 5, 0.5 내지 4, 0.5 내지 3, 0.5 내지 2 및 0.5 내지 1일 수 있다. 바이오센서용 작업 전극 내 상기 ITO 나노 입자의 w/w% 값은 바람직하게는 0.3 내지 3일 수 있다. ITO 나노 입자의 중량비가 지나치게 높은 경우, 즉, 단위 면적당 ITO 나노 입자의 밀도가 지나치게 높은 경우 전극 표면 상에 존재하는 전극 표면 상에서의 전기적 산화 환원 기질의 산화 환원 반응을 방해할 우려가 있다. 0.3 내지 3 w/w%의 ITO 나노 입자 중량비는 작업 전극의 3차원적 표면적의 최대화 및 산화 환원 반응 저해의 최소화의 균형을 이루는 최적의 중량비이다. 보다 바람직하게는, ITO 나노 입자 중량비는 0.3 초과 내지 3 이하 w/w%일 수 있다.
ITO 나노 입자를 이용하여 제조된 작업 전극을 사용하는 바이오센서에 의한 소변 내 항원 농도 측정 방법
본 개시는 바이오센서를 이용한 소변 내 항원의 농도를 측정하는 방법으로서, 1) 상기 소변에 상기 작업 전극을 침지하는 단계; 2) 상기 침지된 작업 전극에 전기적 산화환원반응 효소를 처리한 후, 전기적 산화환원반응 기질을 포함하는 용액에 침지하고 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 항원은 질병 유무를 진단하는 지표가 되는 바이오마커일 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 항원은 전립선암 또는 방광암 진단의 바이오마커일 수 있다. 구체적으로 상기 바이오마커는 Metrix Metallo Peptidase-9(MMP-9), Apolipoprotein A-1(ApoA1), prostate-specific antigen(PSA), Prostate specific membrane antigen (PSMA), Annexin A3(ANX A3), nuclear matrix protein 22(NMP22), bladder tumor antigen(BTA), 및 urinary bladder carcinoma antigen(UBC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다. 본 개시에 있어서, 바람직하게는 상기 바이오마커는 MMP-9일 수 있다.
MMP-9의 경우, 주로 종양 세포 자체에서 생산되며, 암세포의 전이가 일어나는 과정에서 세포 외 기질을 분해시키는 중요한 효소로 알려져 있다. 오늘날 방광암과 관련하여 주로 MMP-1, 2, 9 등이 연구되고 있으며, 특히 MMP-2, 9 및 Tissue inhibitor of metalloproteinases 2(TIMP-2)가 고등급, 고병기 방광암 및 방광암의 재발에 관여한다는 사실이 보고되고 있다. 상기 MMP-9의 Cut-off value는 8.7ng/ml (european urology, 2007, (52), 1388-1397)이며, 소변 내 상기 value 이상의 MMP-9이 존재하는 경우, 방광암으로 진단하고 있다.
도 3을 참조하면, 작동 전극의 표면 상에 간접적으로 고정된 캡처 항체가 도시되어 있으며, 구체적으로 상기 항체는 연결 화합물로서 비오틴-아비딘을 이용하여 작동 전극의 표면 상에 고정되어 있다. 전술한 바와 같이, 본 개시에서는 연결 화합물로서 바람직하게는 비오틴-아비딘 결합 화합물이 이용될 수 있다. 화학적 공유결합을 이용하여 효소를 고정하는 방법의 경우, 고정화되는 효소의 방향성의 무작위성이 존재하지만, 비오틴-아비딘 결합 화합물을 이용하는 경우, 고정화되는 효소의 바인딩 사이트의 표면적 표출 방향성의 제어가 용이하여, 표면 상에 효소의 적절한 방향성 제어로 효소의 바인딩 사이트의 표면적 표출을 극대화할 수 있고, 이를 통해 시료 내 목적 물질의 검출 능력을 극대화시킬 수 있다.
환자로부터 얻어진 소변에 전기화학센서의 작동 전극을 침지한다. 상기 작동 전극을 소변에 침지함으로써, 소변 내에 존재하는 특정 질병의 바이오마커로 기능하는 항원과 작동 전극의 표면 상에 고정된 항체가 항원 항체 반응을 통해 결합된다.
상기 작동 전극을 소변에 침지한 후에, 상기 침지된 작동 전극에 전기적 산화환원반응 효소를 처리한다. 이후, 상기 처리된 작동 전극을 전기적 산화환원반응 기질을 포함하는 용액에 침지하고 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정한다. 본 개시에서 전기적 산화환원반응 효소란 전기적 산화환원반응 기질이 산화환원 반응이 가능하도록 활성화시키는 물질을 의미한다. 또한, 본 개시에서 전기적 산화환원반응 기질이란 활성화된 후, 작동 전극을 통해 전압이 인가되었을 때, 상기 인가된 전압에 의해 산화환원 반응이 진행되어 전자를 흡수 또는 방출함으로써 전류를 발생시키는 물질을 의미한다.
본 개시에 따른 구체예가 도시된 도 1을 참조하여 다시 설명하면, 예컨대, 도 1에는 전기적 산화환원반응 효소로서 ALP(alkaline phosphatase)가 사용되며, 전기적 산화환원반응 기질로서 AAP(ascorbic acid-2-phosphate)가 사용된다. 상기 AAP는 ALP에 의해 포스페이트작용기가 분리되어 효소 반응 생성물로서 AA(ascorbic acid)로 전환된다. 상기 AA는 작동 전극을 통해 인가된 산화 전압에 의해서 탈수소아스코르브산염(dehydroascorbate)로 산화된다. 상기 산화 반응 시 발생하는 전기적 시그널, 예컨대, 전류값이 측정되어, 이로부터 시료 내 원하는 목적 물질의 농도를 계산할 수 있다.
상기 전기적 산화환원 반응 효소는 상기 소변에 침지된 작동 전극에 처리되어 도 3과 같이, 상기 항원에 결합될 수 있다. 여기서 상기 효소의 처리는 작동 전극의 표면 상에 고정된 항체와 결합한 항원에 균일하게 효소를 결합시키는 것이 가능하다면 그 방법이 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 효소는 분사, 침지, 담금 등의 공지의 방법을 통하여 상기 항원과 결합될 수 있다.
효소는 기질 특이성을 가지므로, 본 개시에서 상기 항원 및 효소는 직접적 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 간접적으로 결합되는 경우, 작동 전극의 표면 상에 고정되어 있는 1차 항체와는 상이하면서 항원과 결합할 수 있는 2차 항체 및 상기 2차 항체와 결합하는 전기적 산화환원반응 효소가 부착된 전기적 산화환원반응 효소 연결 항체가 사용될 수 있다.
예컨대 도 3을 참조하면, MMP-9 Biotinylated Antibody와 상이한 MMP-9 Antibody가 2차 항체로 사용되며, 상기 2차 항체에 결합 가능한 전기적 산화환원반응 효소 연결 항체로서 ALP가 부착된 Anti-mouse IgG가 사용된다.
전기적 산화환원반응 효소가 작동 전극 상에 고정된 항체와 결합한 항원과 결합한 경우에만 전기적 산화환원반응 기질의 산화환원 반응이 수행되는 것인바, 하므로, 상기 전기적 산화환원반응을 통해 측정되는 전기적 시그널은 소변 내 항원의 농도에 의존하며, 이에, 상기 전기적 시그널으로부터 소변 내 항원의 농도를 역산하는 것이 가능하다.
예시적으로 본 개시의 전기적 산화환원반응 효소는 ALP, HRP(Horseradish peroxidase), 글루코스옥시다제(Glucose Oxidase), 루시퍼라제(luciferase), 베타-디-갈락토시다제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase) 등일 수 있다. 특히 바람직하게는 상기 효소는 ALP 또는 HRP일 수 있다. ALP 및 HRP는 매우 민감한 반응성을 갖는 이점이 있으며, 특히 HRP의 경우 저렴하여 비용 측면에서 이점이 있다. 또한, ALP의 경우 약 24 내지 48시간의 긴 시그널 유지 시간을 갖는 점에서 유리한 이점이 있다.
또한, 본 개시의 전기적 산화환원반응 기질은 예컨대 도 1에서 ALP에 의해 활성화되는 AAP와 같이, 상기 전기적 산화환원반응 효소에 대응되는 기질이 사용된다.
상기 전기적 시그널의 측정에 있어서, 공지의 전기화학적 측정 방법이 사용될 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 순환전압(Cyclic Voltammetry, CV)법이 사용될 수 있다. 순환전압법은 작동 전극에 인가되는 전압을 일정 속도로 순환시켜 전류를 측정하는 방법으로서, 이를 통해 순환전압전류 곡선을 얻을 수 있다. 여기서, 순환전압법을 통해 측정되는 전기적 시그널은 상기 순환전압전류 곡선에 도시된 전류값의 최대값을 의미한다. 특정 전압에서, 예컨대, 전기적 산화환원반응 효소로서 ALP를 사용하는 선행특허출원 KR 10-2017-0154148에서 개시하고 있는 바와 같이, 0.34V의 전압에서 전류 값을 측정하는 것, 즉, 바이오마커에 결합된 전기적 산화 환원 반응의 효소에 의한 전기적 산화 환원 기질의 산화 환원 반응의 정도를 측정하는 것에 의해 소변 내 항원의 농도를 측정할 수 있다.
이하, 본 개시의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 개시를 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 개시가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
제조예 1. ITO 나노입자 코팅된 바이오센서 작업 전극의 제조
약 160 nm의 두께, 10 Ω/sq의 비저항(resistivity) 및 9:1의 In:Sn 원자 조성을 갖는 ITO 글래스 전극(Buwon-PS, Taoyuan District, Taiwan) 표면에 상기 ITO 글래스를 볼 밀링에 의해 분쇄하여 얻어진 5 nm의 평균 입자 직경을 갖는 ITO 나노 입자를 Spin process controller (Midas)에 의해 200 rpm으로 10초 간 스핀 코팅한 후, 1500 rpm으로 50초 간 재차 스핀 코팅하였다. 상기 ITO 나노 입자의 30% EtOH에 대한 중량비는 3 w/w%였다. 그 후, ITO 나노 입자 코팅된 전극 표면에 3분의 처리 시간, 1000 sccm의 산소 유량, 100 W의 전력 및 50 mTorr 분위기 하에서 산소 플라즈마를 FEMTO SCIENCE 사의 CUTE에 의해 분사하고, 이어서 아비딘을 전극 표면에 고정시켰다. 그리고 상기 전극과 비오틴이 부착된 ALP 15㎕를 4℃에서 약 30분간 반응시켰다.
제조예 2. ITO 나노입자 코팅된 바이오센서 작업 전극의 제조
ITO 나노 입자의 중량비가 0.3 w/w%인 점을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 공정에 의해 바이오센서 작업 전극을 제조하였다.
비교 제조예 1. ITO 나노입자를 사용하지 않는 바이오센서 작업 전극의 제조
ITO 나노 입자의 스핀 코팅을 거치지 않는다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 공정에 의해 바이오센서 작업 전극을 제조하였다.
실험 1. ITO 나노 입자의 농도에 따른 전기화학적 신호의 분석
제조예 1 및 제조예 2에 의해 작업 전극을 제조하였고, 비교 제조예 1에 의하여 ITO 나노 입자가 없는 작업 전극을 제조하였다.
상기 3개의 전극 각각에 대해 결합되는 효소 ALP의 농도를 0 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL으로 달리하였고, 각각의 전극을 아스코르브산-2-포스페이트(AAP)를 포함하는 15℃의 시료 내에 침지하였다. 침지 후 순환전압법을 이용하여 전압에 대한 전류값을 측정하였다. 전압은 0 내지 0.6V 사이에서 순환되었다. ALP를 포함하는 작동전극을 시료 내에 침지하면 ALP와 시료 내 AAP가 반응하여 아스코르브산(AA)을 생성하고, 이는 ITO 표면 상에 침착(deposit)된다. 이후 상기 전극 상에 전압을 인가하면 AA가 탈수소아스코르브산염으로 산화되면서 전류를 생성한다. 이에 측정되는 전류값이 크면 클수록 산화반응이 잘 이루어진 것인바, AA가 시료 내에 많이 생성되었음을 알 수 있고, 이는 동일한 침지 시간 동안에 특정 온도에서의 효소의 활성화가 잘 되었음을 알 수 있게 해준다. 그 결과는 비교 제조예 1의 전극(도 4(a), 도 5(a)), 제조예 2의 전극((도 4(b), 도 5(b))), 제조예 1의 전극(도 4(c), 도 5(c))으로 나누어 도 4 및 도 5에 도시된다. 또한 도 3에는 각각의 경우의 작업 전극 표면의 SEM 이미지가 도시된다.
도 5(b)에서 볼 수 있듯, 비교 제조예 1의 전극에 의해 측정된 경우, 약 0.5 V의 산화 전위에서 산화 피크가 나타났으며, 제조예 2의 전극에 의해 측정된 경우 약 0.1 V의 산화 전위에서 산화 피크가 나타났고, 제조예 1의 전극에 의해 측정된 경우 약 0.05 V 부근의 산화 전위에서 산화 피크가 나타났다.
산화 피크에서의 전류 값은 도 4에 도시된 바와 같이, ALP 농도가 1 ㎍/mL인 경우 비교 제조예 1의 전극에서 약 4.0×10-6 A, 제조예 2의 전극에서 약 4.5×10-6 A, 제조예 1의 전극에서 약 5.5×10-5 A였다.
상기 실험 결과로부터, ITO 나노 입자의 농도가 클수록, AA(ascorbic acid)의 Dehydro ascorbate로의 산화 반응에 요구되는 산화 전위가 감소하며, 산화 반응에 의해 발생되는 산화 전류는 증가함을 알 수 있다.
즉, 0.3 내지 3의 w/w%의 ITO 나노 입자 중량비 범위 내에서는, ITO 나노 입자의 중량비가 증가할수록 산화 피크 측정을 위해 인가되어야 하는 전압이 낮아지고, 측정되는 전류 값은 높아지는 바, 저전압에서 높은 선명도의 피크 측정이 가능해진다.

Claims (14)

  1. (a) ITO 글래스(glass) 전극을 제공하는 단계;
    (b) 상기 ITO 글래스 전극 상에 ITO 나노 입자를 코팅하는 단계;
    (c) 상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 연결 화합물을 고정시키는 단계; 및
    (d) 상기 연결 화합물에 항체를 고정하는 단계를 포함하는 바이오센서용 작업 전극 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (b)의 ITO 나노 입자는 스핀 코팅(spin coating)에 의해 코팅되는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 작업 전극 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 연결 화합물은 비오틴-아비딘, 비오틴-스트렙타비딘(streptavidin), 카보디이미드(carbodiimide) 가교제 및 석신이미드(succinimide) 가교제 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 작업 전극 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (c)는 상기 ITO 전극의 표면에 산소 플라즈마 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 작업 전극 제조 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 산소 플라즈마 처리하는 단계는 1 내지 5분의 처리 시간, 500 내지 1000 sccm의 산소 유량, 10 내지 100 W의 전력 및 50 mTorr 분위기 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 작업 전극 제조 방법.
  6. 청구항 1 내지 5의 제조 방법에 의해 제조된 바이오센서용 작업 전극.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 ITO 나노 입자의 직경은 1-20 nm인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 작업 전극.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 ITO 나노 입자의 직경은 5-12 nm인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 작업 전극.
  9. 청구항 6에 있어서,
    상기 ITO 나노 입자의 용매에 대한 중량비 w/w%는 0.3 내지 3인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 작업 전극.
  10. 바이오센서를 이용한 소변 내 항원의 농도를 측정하는 방법으로서,
    1) 상기 소변에 청구항 6의 작업 전극을 침지하는 단계;
    2) 상기 침지된 작업 전극에 전기적 산화환원반응 효소를 처리한 후, 전기적 산화환원반응 기질을 포함하는 용액에 침지하고 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함하는 소변 내 항원의 농도를 측정하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 항원은 전립선암 또는 방광암 진단의 바이오마커인 것을 특징으로 하는 소변 내 항원의 농도를 측정하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 바이오마커는 Metrix Metallo Peptidase-9(MMP-9), Apolipoprotein A-1(ApoA1), prostate-specific antigen(PSA), Prostate specific membrane antigen (PSMA), Annexin A3(ANX A3), nuclear matrix protein 22(NMP22), bladder tumor antigen(BTA), 및 urinary bladder carcinoma antigen(UBC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 소변 내 항원의 농도를 측정하는 방법.
  13. 청구항 10에 있어서,
    상기 전기적 산화환원반응 효소는 HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), 글루코스옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라이제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinestrerase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 효소인 것을 특징으로 하는 소변 내 항원의 농도를 측정하는 방법.
  14. 청구항 10에 있어서,
    상기 전기적 시그널의 측정은 순환전압(CV)법을 이용하며, 상기 전기적 시그널은 순환전압법을 통해 측정된 최대의 전류값인 것을 특징으로 하는 소변 내 항원의 농도를 측정하는 방법.
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