KR20220071671A - 금속 나노 입자를 포함하는 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 시료 내 바이오마커의 농도 측정 방법 - Google Patents

금속 나노 입자를 포함하는 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 시료 내 바이오마커의 농도 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법으로서, (a) ITO(Indium Tin Oxide) 글래스 전극을 제공하는 단계; (b) 상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 고정 물질을 고정시키는 단계, 여기서 상기 고정 물질은 제1 화합물 및 제2 화합물을 포함하며, 상기 제2 화합물은 링커 화합물-금속 나노입자의 컨쥬게이트이며; 및 (c) 상기 고정 물질에 반응 인자를 고정하는 단계를 포함하는 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법을 제공하며, 이에 의해 제조되는 작업 전극, 및 상기 작업 전극을 포함하는 바이오센서를 이용한 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법 또한 제공한다.

Description

금속 나노 입자를 포함하는 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 시료 내 바이오마커의 농도 측정 방법{Method for manufacturing working electrode for biosensor comprising metal nanoparticles, an electode manufactured by the method and a method for measuring concentration of biomarker in sample by using the electrode}
본 개시는 시료 내 존재하는 특정 질병에 대한 바이오마커의 농도를 측정하기 위한 바이오센서에 사용되는 작업 전극의 제조 방법, 상기 제조 방법에 의해 제조된 전극, 및 이를 사용한 시료 내 바이오마커 농도 측정 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이오 지지체와 금속 나노 입자의 컨쥬게이트(conjugates)를 ITO(Indium Tin Oxide) 글래스 전극 표면 상에 바이오물질의 표면 처리와 동시에 표면 처리하는 공정을 포함하는 신규한 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극, 및 이를 사용한 시료 내 바이오마커 농도 측정 방법에 관한 것이다.
소변을 이용한 질병진단에 관한 연구는 1958년 당과 단백질을 검사할 수 있는 요 검사지가 개발되면서 본격적으로 주목을 받기 시작하였으며, 이후 소변을 이용하여 보다 많은 질병들을 진단하기 위한 시스템 및 이를 이용한 검사법에 대한 연구가 진행되고 있다. 전립선암 또는 방광암을 포함하는 다양한 질병들을 소변을 이용하여 진단하는 경우, 채혈과 같은 침습적인 방법과 달리, 비침습적인 방법을 통해 시료를 얻는 것이 가능하여, 환자의 심적, 육체적 부담을 줄일 수 있다는 이점을 갖는다.
또한, 종래의 요 검사지가 질병 유무를 판단함에 변색 등의 시각적인 판단에 의존한 것과 달리, 전기화학센서를 이용하여 소변 내 존재하는 질병의 바이오마커의 농도를 측정하는 경우, 수치로서 질병의 유무를 판단하는 것이 가능해져 그 신뢰도는 더욱 상승할 수 있다. 이에, 오늘날 현장 자가 진단이 가능한 바이오센서로서 소변 내 존재하는 질병의 바이오마커의 농도의 측정을 전기화학적인 신호로 측정하는 전기화학센서에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 나아가 상기 바이오센서의 민감도, 신뢰도 향상에 관한 연구도 더욱 주목되고 있는 실정이다.
한편, 종래 알려진 전기화학신호 측정 방법, 예컨대 CV(Cyclic Voltammetry)법 등을 이용하는 바이오센서는 바이오마커와 반응하여 결합할 수 있는 반응 인자를 작업 전극에 고정시키기 위한 바이오 지지체를 필요로 한다. 상기 바이오 지지체는 기본적으로 부도체이며, 이러한 바이오 지지체에 의한 작업 전극 표면 상의 표면 처리는 센싱 시의 전기화학신호의 측정의 민감도에 악영향을 미칠 수 있다는 문제점이 존재한다.
KR 10-2020-0077058 A1
따라서, 본 개시의 관점은 상기와 같은 바이오 지지체의 사용에도 불구하고, 보다 우수한 센싱 민감도의 제공이 가능한 새로운 작업 전극의 표면 처리 방법론에 기초한, 바이오센서용 작업 전극을 제조 하는 방법, 이에 의해 제조된 작업 전극, 및 상기 제조된 작업 전극을 포함하는 바이오센서를 이용하여, 시료 내 특정 질병의 바이오마커의 농도를 측정하는 방법을 제공하는데 있다.
본 개시의 제1 관점은 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법에 관한 것으로서, ITO(Indium Tin Oxide) 글래스 전극을 제공하는 단계; 상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 고정 물질을 고정시키는 단계, 여기서 상기 고정 물질은 제1 화합물 및 제2 화합물을 포함하며, 상기 제2 화합물은 링커 화합물-금속 나노입자의 컨쥬게이트이며; 및 상기 고정 물질에 반응 인자를 고정하는 단계를 포함한다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 제1 화합물과 링커 화합물은 동종의 화합물이다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 제1 화합물과 링커 화합물은 아비딘이다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 아비딘은 뉴트라아비딘(neutravidin), 내츄럴 아비딘, 스트렙트아비딘(streptavidin), 캡트아비딘(captavidin) 또는 이들의 임의의 조합이다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 금속 나노 입자는 금(gold) 나노 입자이다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 고정 물질 내 금속 나노 입자의 함량은 1.20 x 10-3 A520 units 내지 6.5x10-3 A520 units이다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 반응 인자는 제3 화합물과 컨쥬게이트된 반응 인자이고, 상기 고정 단계에서 제3 화합물은 상기 제1 화합물과 결합한다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 제3 화합물은 비오틴이다.
본 개시의 제2 관점은 전술한 본 개시의 제1 관점의 제조 방법에 의해 제조되는 바이오센서용 작업 전극에 관한 것이다.
본 개시의 제3 관점은 바이오센서를 이용한 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법으로서, 상기 시료에 본 개시의 제2 관점에 따른 작업 전극을 침지하는 단계; 상기 침지된 작업 전극에 전기적 산화환원반응 효소를 처리한 후, 전기적 산화환원반응 기질을 포함하는 용액에 침지하고, 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 전기적 산화환원반응 효소는 HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), 글루코스옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라이제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinestrerase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 효소이다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 전기적 시그널의 측정은 순환전압(CV)법을 이용하며, 상기 전기적 시그널은 순환전압법을 통해 측정된 최대의 전류값이다.
본 개시가 제공하는 새로운 바이오센서용 작업 전극 제조 방법을 통해, 종래에 비해 센싱 민감도가 보다 우수한 바이오센서의 제작이 가능하며, 본 개시에 적용된 표면 처리법은 비교적 간단하고, 종래의 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 시스템을 채택하는 바이오센서에의 적용이 용이하여, 큰 노력 없이 기존 바이오센서의 품질을 증대시키는 것이 가능하다.
도 1은 작업 전극 표면 상에 고정된 반응 인자, 상기 반응 인자와 결합하는 바이오마커, 및 상기 바이오마커에 처리된 전기적 산화환원반응 효소에 관한 개략도이다.
도 2는 본 개시의 실시 예에 따른 작업 전극의 제조 과정에 대한 개략적인 모식도이다.
도 3은 본 개시의 제조 예 1, 2, 및 비교 제조 예 1의 작업 전극의 표면의 SEM 이미지이다.
도 4는 본 개시의 실험 예에 따른 전기화학신호 측정 결과를 도시한 그래프이다.
본 개시의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이나, 본 개시가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 개시를 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
바이오센서용 작업 전극 제조 방법
본 개시는 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법으로서, ITO(Indium Tin Oxide) 글래스 전극을 제공하는 단계; 상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 고정 물질을 고정시키는 단계, 여기서 상기 고정 물질은 제1 화합물 및 제2 화합물을 포함하며, 상기 제2 화합물은 링커 화합물-금속 나노입자의 컨쥬게이트이며; 및 상기 고정 물질에 반응 인자를 고정하는 단계를 포함한다.
본 개시의 바이오센서용 전극은 ITO 글래스로 이루어진다. ITO 글래스 전극의 경우, 바이오 센서에 적용 시, 노이즈 신호를 줄일 수 있고 별도의 점착층 없이도 유기 기판 상에 ITO 박막이 침적된 기판을 그대로 사용할 수 있는 장점이 있다. 상기 ITO 글래스 전극은 디스플레이 산업 등에서 대형 기판 상에 높고 안정적인 전기전도성 특성을 갖는 박막 기판 제조 공정을 동일하게 활용할 수 있으므로, 매우 저렴하게 전극으로 제작이 가능하다는 이점을 갖는다.
상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 고정 물질이 고정된다. 본 개시에서 상기 고정 물질이란 ITO 글래스 전극의 표면 상에 고정되는 물질을 가리키며, 상기 고정 물질은 제1 화합물 및 제2 화합물을 포함할 수 있다.
여기서 상기 제1 화합물은 후술하는 반응 인자를 고정시킬 수 있는 바이오 지지체에 해당한다. 본 개시에 있어서, 상기 반응 인자는 시료 내 존재하는 바이오마커와 반응하여 결합할 수 있는 물질(예컨대 바이오 마커가 항원인 경우, 반응 인자는 상기 항원에 결합할 수 있는 항체를 의미함)을 의미한다. 바이오센서의 작업 전극에 상기 반응 인자를 안정적으로 고정시키기 위하여 제1 화합물과 같은 바이오 지지체가 사용될 수 있다.
이에, 본 개시에 있어서, 상기 제1 화합물은 반응 인자를 ITO 글래스의 표면 상에 (간접적으로) 고정할 수 있으면서 본 개시의 목적을 저해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 예시적으로 상기 제1 화합물은 아비딘일 수 있다. 본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 아비딘은 뉴트라아비딘(neutravidin), 내츄럴 아비딘, 스트렙트아비딘(streptavidin), 캡트아비딘(captavidin), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
종래의 바이오센서용 작업 전극들은 상기 제1 화합물만으로 이루어진 고정물질을 상기 작업 전극의 표면 상에 고정시킨 것이었으나, 본 개시의 바이오센서용 작업 전극은 고정 물질이 상기 제1 화합물 뿐만이 아니라, 제2 화합물도 포함하는 것을 특징으로 한다. 후술하는 바와 같은 제2 화합물의 구성을 추가함으로써, 종래의 바이오센서용 작업 전극에 비해 우수한 센싱 민감도를 갖는 바이오센서용 작업 전극을 제공하는 것이 가능해진다. 특정 이론에 구속되길 원하는 것은 아니나, 제2 화합물 내의 나노 금속 물질의 존재가 ITO 글래스로의 전자 전달 효과를 현저히 증가시키는 것으로 생각된다.
또, 본 개시에 있어서, 상기 제2 화합물은 링커 화합물 및 금속 나노 입자의 컨쥬게이트(conjugates)(링커 화합물-금속 나노 입자 컨쥬게이트)이다. 상기 링커 화합물은 상기 금속 나노 입자를 ITO 글래스의 표면 상에 (간접적으로) 고정할 수 있으면서 본 개시의 목적을 저해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 예시적으로 상기 링커 화합물은 아비딘일 수 있다. 본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 아비딘은 뉴트라아비딘(neutravidin), 내츄럴 아비딘, 스트렙트아비딘(streptavidin), 캡트아비딘(captavidin), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 개시에 있어서, 상기 제1 화합물 및 링커 화합물은 서로 동종의 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 동일한 물질일 수 있다. 이에, 상기 제1 화합물 및 링커 화합물이 동일한 물질(예컨대 스트렙트아비딘)이 사용되는 경우, ITO 글래스 작업 전극 표면 상에 고정 물질이 고정되면, ITO 글래스 전극 표면 상에는 금속 나노 입자가 컨쥬게이트되지 않은 스트렙트아비딘 및 금속 나노 입자가 컨쥬게이트된 스트렙트 아비딘이 랜덤하게 고정된다.
본 개시의 상기 금속 나노 입자에 있어서, 금속은 금, 은, 니켈, 백금, 구리, 알루미늄, 이들 중 2 이상의 합금, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 본 개시의 일 구현 예에 있어서 상기 금속은 금일 수 있다.
상기 금속 나노 입자의 입자 직경은 약 1 nm 이상 내지 약 100 nm 이하일 수 있다. 또, 본 개시의 상기 작업 전극 표면 상의 금속 나노 입자의 함량은 약 1.20 x 10-3 A520 units 내지 6.5x10-3 A520 units, 바람직하게는 1.25 x 10-3 A520 units 내지 6.25x10-3 A520 units일 수 있다. 전극 표면 상의 금속 나노 입자의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 금속 나노 입자의 추가로 인한 센싱 민감도의 증대 효과를 기대하기가 어려운 문제가 존재하며, 상기 범위를 초과하는 경우, 작업 전극 표면 상의 바이오마커와 반응하는 반응 인자 대비 금속 나노 입자의 밀도가 너무 커져 오히려 센싱 민감도를 저해하는 문제가 발생할 수 있다.
상기 고정 물질을 ITO 글래스 전극 표면 상에 고정시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 공지의 기술을 통해 수행될 수 있다. 예컨대 상기 제1 화합물 및 제2 화합물은 혼합되어 ITO 글래스 표면 상에 동시에 처리될 수 있다.
본 개시의 제조 방법에서, 상기 반응 인자는 고정 물질에 고정된다. 보다 구체적으로 상기 반응 인자는 고정 물질 중 제1 화합물에 고정될 수 있다. 본 개시의 일 구현 예에 따르면, 상기 반응 인자는 제3 화합물과 컨쥬게이트된 반응 인자일 수 있다. 상기 제3 화합물은 제1 화합물과 반응하여 결합하는 물질로, 제1 화합물에 의존하여 변경될 수 있으며, 예컨대 제1 화합물이 아비딘인 경우, 상기 제3 화합물은 비오틴일 수 있다. 상기 제3 화합물이 제1 화합물과 결합함으로써, 상기 반응인자는 고정 물질에 고정될 수 있다.
본 개시의 다른 구현 예에 있어서, 상기 제조 방법은 ITO 글래스 전극의 표면 상에 고정 물질을 고정시키는 단계에 앞서, 고정 물질에 반응 인자를 고정하는 단계를 수행할 수도 있다. 즉, 반응 인자와 컨쥬게이트된 제3 화합물 및 제1 화합물의 결합을 통해 제1 화합물에 반응 인자를 고정시킨 후, 상기 반응 인자가 고정된 제1 화합물 및 제2 화합물을 고정 물질로 하여, 상기 고정 물질을 ITO 글래스 전극 표면 상에 고정시킬 수도 있다.
바이오센서용 작업 전극
본 개시는 전술한 제조 방법에 의해 제조된 바이오센서용 작업 전극에 관한 것이다. 상기 바이오센서용 작업 전극은 ITO 글래스 전극, 상기 전극의 표면 상에 고정된, 제1 화합물 및 제2 화합물을 포함하는 고정 물질, 및 상기 고정 물질에 고정되는 반응 인자를 포함한다.
본 개시의 작업 전극을 포함하는 바이오센서를 이용한 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법
본 개시는 바이오센서를 이용한 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 시료에 본 개시의 일 구현 예에 따른 작업 전극을 침지하는 단계; 상기 침지된 작업 전극에 전기적 산화환원반응 효소를 처리한 후, 전기적 산화환원반응 기질을 포함하는 용액에 침지하고, 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
본 개시에서 측정에 사용되는 시료는 동물로부터 얻어지는 체액일 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 시료는 인체로부터 얻어지는 체액일 수 있다. 여기서 상기 체액은 예컨대 혈액, 배뇨, 타액 등을 의미하며, 상기 예에 한정되지 않고, 분석하고자 하는 목적 물질이 체액 내 존재한다면 이용 가능하다. 본 개시의 일 구현 예에서, 상기 시료는 소변일 수 있다.
본 개시에 있어서, 상기 바이오마커는 항원, 항체, 비타민, 단백질, 면역 분자, DNA, 및 RNA 등일 수 있다. 상기 바이오마커는 일반적으로 자체적으로 산화 반응 또는 환원 반응이 불가능한 물질일 수 있다. 이러한 바이오마커의 존부 판단을 위하여 전기적 산화환원반응 효소 및 기질의 사용이 고려된다.
본 개시에 있어서, 상기 바이오마커는 바람직하게는 항원일 수 있다. 이 경우, 작업 전극의 반응 인자는 상기 항원과 반응할 수 있는 항체이어야 한다. 본 개시의 일 구현 예에 있어서, 상기 바이오마커는 전립선암 또는 방광암 진단의 바이오마커일 수 있고, 이 때의 항원으로는 Metrix Metallo Peptidase-9(MMP-9), Apolipoprotein A-1(ApoA1), prostate-specific antigen(PSA), Prostate specific membrane antigen (PSMA), Annexin A3(ANX A3), nuclear matrix protein 22(NMP22), bladder tumor antigen(BTA), 및 urinary bladder carcinoma antigen(UBC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이 선택될 수 있다. 특히 바람직하게는, 상기 항원은 MMP-9일 수 있다.
도 1을 참조하여, MMP-9을 바이오마커로 하여 소변 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법을 예로 들어, 본 개시의 측정 방법을 설명하면, 먼저, 본 개시의 일 구현 예에 따른 작업 전극을 포함하는 바이오센서가 준비된다. 도 1에 나타난 바와 같이, ITO 글래스 작업 전극의 표면 상에는 제3 화합물(비오틴)과 컨쥬게이트된 반응 인자(MMP-9 항체)가 제1 화합물(아비딘)에 의해 간접적으로 고정된다. 상기 제1 화합물 및 제3 화합물로서 아비딘 및 비오틴을 각각 사용하는 경우, 고정화되는 효소의 바인딩 사이트의 표면적 표출 방향성의 제어가 용이하여, 표면 상에 효소의 적절한 방향성 제어로 효소의 바인딩 사이트의 표면적 표출을 극대화할 수 있고, 이를 통해 시료 내 목적 물질의 검출 능력을 극대화시킬 수 있다는 장점이 존재한다.
이후, 환자로부터 얻어진 소변에 상기 작업 전극을 침지한다. 상기 작업 전극을 소변에 침지함으로써, 소변 내에 존재하는 특정 질병의 바이오마커(MMP-9 항원)와 작업 전극의 표면 상에 고정된 반응 인자(항체)가 반응(항원 항체 반응)을 통해 결합된다.
상기 작업 전극을 소변에 침지한 후에, 상기 침지된 작업 전극에 전기적 산화환원반응 효소를 처리한다. 이후, 상기 처리된 작업 전극을 전기적 산화환원반응 기질을 포함하는 용액에 침지하고 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정한다. 본 개시에서 전기적 산화환원반응 효소란 전기적 산화환원반응 기질이 산화환원 반응이 가능하도록 활성화시키는 물질을 의미한다. 또한, 본 개시에서 전기적 산화환원반응 기질이란 활성화된 후, 작업 전극을 통해 전압이 인가되었을 때, 상기 인가된 전압에 의해 산화환원 반응이 진행되어 전자를 흡수 또는 방출함으로써 전류를 발생시키는 물질을 의미한다.
도 1은 전기적 산화환원반응 효소로서 ALP(alkaline phosphatase)가 사용된 예를 도시하고 있으며, 이 경우, 전기적 산화환원반응 기질로서 AAP(ascorbic acid-2-phosphate)가 사용된다. 상기 AAP는 ALP에 의해 포스페이트작용기가 분리되어 효소 반응 생성물로서 AA(ascorbic acid)로 전환된다. 상기 AA는 작동 전극을 통해 인가된 산화 전압에 의해서 탈수소아스코르브산염(dehydroascorbate)로 산화된다. 상기 산화 반응 시 발생하는 전기적 시그널, 예컨대, 전류값이 측정되어, 이로부터 시료 내 원하는 목적 물질의 농도를 계산할 수 있다.
상기 전기적 산화환원 반응 효소는 상기 소변에 침지된 작업 전극에 처리되어 도 1과 같이, 상기 바이오마커에 결합될 수 있다. 여기서 상기 효소의 처리는 작동 전극의 표면 상에 고정된 반응 인자와 결합한 바이오마커에 균일하게 효소를 결합시키는 것이 가능하다면 그 방법이 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 효소는 분사, 침지, 담금 등의 공지의 방법을 통하여 상기 바이오마커와 결합될 수 있다.
효소는 기질 특이성을 가지므로, 본 개시에서 상기 바이오마커 및 효소는 직접적 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 간접적으로 결합되는 경우, 작업 전극의 표면 상에 고정되어 있는 반응 인자(이른바, 1차 항체)와는 상이하면서 바이오마커(항원)와 결합할 수 있는 2차 항체 및 상기 2차 항체와 결합하는 전기적 산화환원반응 효소가 부착된 전기적 산화환원반응 효소 연결 항체가 사용될 수 있다.
예컨대 다시 도 1을 참조하면, (MMP-9 Biotinylated Antibody(1차 항체)와 상이한 MMP-9 Antibody가 2차 항체로 사용되며, 상기 2차 항체에 결합 가능한 전기적 산화환원반응 효소 연결 항체로서 ALP가 부착된 Anti-mouse IgG가 사용되고 있다.
전기적 산화환원반응 효소가 작동 전극 상에 고정된 항체와 결합한 항원과 결합한 경우에만 전기적 산화환원반응 기질의 산화환원 반응이 수행되는 것인바, 하므로, 상기 전기적 산화환원반응을 통해 측정되는 전기적 시그널은 소변 내 항원의 농도에 의존하며, 이에, 상기 전기적 시그널으로부터 소변 내 항원의 농도를 역산하는 것이 가능하다.
본 개시에 있어서, 상기 전기적 산화환원반응 효소는 ALP, HRP(Horseradish peroxidase), 글루코스옥시다제(Glucose Oxidase), 루시퍼라제(luciferase), 베타-디-갈락토시다제(β말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase) 등일 수 있다. 특히 바람직하게는 상기 효소는 ALP 또는 HRP일 수 있다. ALP 및 HRP는 매우 민감한 반응성을 갖는 이점이 있으며, 특히 HRP의 경우 저렴하여 비용 측면에서 이점이 있다. 또한, ALP의 경우 약 24 내지 48시간의 긴 시그널 유지 시간을 갖는 점에서 유리한 이점이 있다.
본 개시의 전기적 산화환원반응 기질은 예컨대 ALP에 의해 활성화되는 AAP와 같이, 상기 전기적 산화환원반응 효소에 대응되는 기질이 사용된다.
상기 전기적 시그널의 측정에 있어서, 공지의 전기화학적 측정 방법이 사용될 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 순환전압(Cyclic Voltammetry, CV)법이 사용될 수 있다. 순환전압법은 작동 전극에 인가되는 전압을 일정 속도로 순환시켜 전류를 측정하는 방법으로서, 이를 통해 순환전압전류 곡선을 얻을 수 있다. 여기서, 순환전압법을 통해 측정되는 전기적 시그널은 상기 순환전압전류 곡선에 도시된 전류값의 최대값을 의미한다. 특정 전압에서, 예컨대, 전기적 산화환원반응 효소로서 ALP를 사용하는 선행특허출원 KR 10-2017-0154148에서 개시하고 있는 바와 같이, 0.34V의 전압에서 전류 값을 측정하는 것, 즉, 바이오마커에 결합된 전기적 산화 환원 반응의 효소에 의한 전기적 산화 환원 기질의 산화 환원 반응의 정도를 측정하는 것에 의해 소변 내 항원의 농도를 측정할 수 있다.
이하, 본 개시의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 개시를 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 개시가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시 예
제조 예 1. 고농도 AuNP를 포함하는 작업 전극의 제조
ITO 전극 표면(24mm2)을 10mL의 Trichloroethylene 용액, 에탄올 용액, 및 DI water 각각에서 15분간 Sonication처리를 하고 난 후 30% KOH 용액에 전극을 10분간 담근 후, DI water에 전극을 씻어 최종적으로 전극 표면 상에 OH기를 활성화 시켰다. 이후 작업 전극에 3-Aminopropyl)triethoxysilane(APTES) 및 Glutaraldehyde (GA) 처리를 하고 100㎍/ml의 스트렙트아비딘-ALP 15㎕ 및 스트렙트아비딘- 10 nm 금(6.25x10-3 A520 units) 컨쥬게이트 15㎕의 혼합물과 상온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 공유 결합 작용을 통해 스트렙트 아비딘 및 컨쥬게이트가 ITO 전극 표면 상에 화학적으로 흡착되었다. 도 2에서 상기 작업 전극의 제조 과정에 대한 개략적인 모식도를 도시하였다.
제조 예 2. 저농도 AuNP를 포함하는 작업 전극의 제조
작업 전극에 100㎍/ml의 스트렙트아비딘-ALP 15㎕ 및 스트렙트아비딘- 10 nm 금(6.25x10-3 A520 units) 컨쥬게이트 15㎕의 혼합물 대신 100㎍/ml의 스트렙트아비딘-ALP 15㎕ 및 스트렙트아비딘- 10 nm 금(1.25x10-3 A520 units) 컨쥬게이트 15㎕의 혼합물을 반응시킨 것을 제외하고는 제조 예 1과 동일한 공정에 의해 작업 전극을 제조하였다.
비교 제조 예 1. AuNP를 포함하지 않는 작업 전극의 제조
작업 전극에 100㎍/ml의 스트렙트아비딘-ALP 15㎕ 및 스트렙트아비딘- 10 nm 금 컨쥬게이트 15㎕의 혼합물 대신 100㎍/ml의 스트렙트아비딘 15㎕을 반응시킨 것을 제외하고는 제조 예 1과 동일한 공정에 의해 작업 전극을 제조하였다.
제조 예 1, 2, 및 비교 제조 예 1의 작업 전극의 표면의 SEM을 도 3의 (A), (B), 및 (C)로 순차적으로 나타냈다.
실험 1. AuNP 농도에 따른 전기화학적 신호 강도의 분석
제조 예 1, 제조 예 2, 비교 제조 예 1 및 비교 제조 예 1에서 비오틴이 부착된 ALP 15㎕를 4℃에서 약 30분간 반응시키는 단계를 생략하여 제조된 작업 전극을 각각 포함하는 바이오센서를 이용하여 전기화학적 신호 강도를 분석하였다.
각각의 전극을 아스코르브산-2-포스페이트(AAP)를 포함하는 15℃의 시료 내에 침지하였다. 침지 후 순환전압법을 이용하여 전압에 대한 전류값을 측정하였다. 전압은 0 내지 0.9V 사이에서 순환되었다.
그 결과는 그래프로서 도 4에 도시하였다. 파란색 곡선이 ALP 처리가 되지 않은 작업 전극에 관한 것이고, 빨간색 곡선이 AuNP 처리가 되지 않은 작업 전극에 관한 것이며, 초록색 곡선이 저농도 AuNP 처리된 작업 전극에 관한 것이며, 보라색 곡선이 고농도 AuNP 처리된 작업 전극에 관한 것이다.
상기 도 4를 통해 AuNP를 처리한 경우, AuNP를 처리하지 않은 경우에 비하여, 전기 시그널의 강도가 약 20% 이상, 특히 고농도 AuNP를 처리한 경우 약 60% 이상 향상되었음을 알 수 있다.
상기와 같은 결과에 기초하여, 본 개시의 제조 방법을 종래 작업 전극에 적용함으로써 우수한 감도를 갖는 전기화학 바이오센서를 제조하는 것이 가능할 것으로 예상된다.
본 개시의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 개시의 영역에 속하는 것이며, 본 개시의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (12)

  1. 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법으로서,
    (a) ITO(Indium Tin Oxide) 글래스 전극을 제공하는 단계;
    (b) 상기 ITO 글래스 전극의 표면 상에 고정 물질을 고정시키는 단계, 여기서 상기 고정 물질은 제1 화합물 및 제2 화합물을 포함하며, 상기 제2 화합물은 링커 화합물-금속 나노입자의 컨쥬게이트이며; 및
    (c) 상기 고정 물질에 반응 인자를 고정하는 단계를 포함하는 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 화합물과 링커 화합물은 동종의 화합물인, 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 화합물과 링커 화합물은 아비딘인, 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 아비딘은 뉴트라아비딘(neutravidin), 내츄럴 아비딘, 스트렙트아비딘(streptavidin), 캡트아비딘(captavidin) 또는 이들의 임의의 조합인, 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 금속 나노 입자는 금(gold) 나노 입자인, 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 고정 물질 내 금속 나노 입자의 함량은 1.20 x 10-3 A520 units 내지 6.5x10-3 A520 units인, 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 반응 인자는 제3 화합물과 컨쥬게이트된 반응 인자이고,
    상기 (c) 단계에서 제3 화합물은 상기 제1 화합물과 결합하는, 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 제3 화합물은 비오틴인, 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법.
  9. 청구항 1-8 중 어느 한 항의 제조 방법에 의해 제조된 바이오센서용 작업 전극.
  10. 바이오센서를 이용한 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법으로서,
    상기 시료에 청구항 9에 따른 작업 전극을 침지하는 단계;
    상기 침지된 작업 전극에 전기적 산화환원반응 효소를 처리한 후, 전기적 산화환원반응 기질을 포함하는 용액에 침지하고, 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함하는, 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 전기적 산화환원반응 효소는 HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), 글루코스옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라이제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinestrerase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 효소인 것을 특징으로 하는 소변 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 전기적 시그널의 측정은 순환전압(CV)법을 이용하며, 상기 전기적 시그널은 순환전압법을 통해 측정된 최대의 전류값인 것을 특징으로 하는 소변 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법.
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