KR20120125898A - 아스코르브산 포스페이트를 이용한 전기화학적 바이오센서 - Google Patents

아스코르브산 포스페이트를 이용한 전기화학적 바이오센서 Download PDF

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양해식
아칸다무하마드라지불
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부산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 전기화학적으로 생체분자의 존재 또는 농도를 측정하는 바이오센서에 관한 것이다. 특히 ITO와 같은 주석산화물을 기본으로 하는 전극에서 포스파테이즈 생성물의 전극 반응속도가 매우 크고, 포스파테이즈 기질과 생성물의 표준환원전위 차이가 크고, 포스파테이즈 기질이 수용액에 높은 농도로 잘 녹아 들어가면서 장시간 안정하게 존재하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다. 이에 더하여 본 발명은 포스파테이즈 생성물의 산화가 '산화환원 순환용 환원제'의 산화와 '수용액에 녹아 있는 산소'의 환원이 쉽게 일어나지 않는 전위 영역에서 빠른 산화 및 산화환원순환이 일어나는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 주석산화물을 기본으로 하는 전극에서 포스파테이즈 생성물의 전극 반응속도를 느리게 하지 않으면서 항체 등의 생체분자를 안정하게 고정시킬 수 있는 표면을 구비하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서를 제공한다.

Description

아스코르브산 포스페이트를 이용한 전기화학적 바이오센서 {Electrochemical biosensors using ascorbic acid phosphate}
본 발명은 생체분자(biomolecule)의 존재 또는 농도를 고감도로 측정하는 바이오센서(biosensor)에 관한 것으로, 특히 포스파테이즈(phosphatase) 효소(enzyme)를 표지(label)로 사용하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.
점점 늘어나는 의료비 비용을 낮추고 수명을 연장하기 위해서는, 질병을 치료하는 것보다 질병을 조기에 진단하는 것이 효과적이다. 이러한 조기 진단을 이루기 위해서 매우 적은 농도로 시료 속에 존재하는 물질을 고감도로 빠르게 측정할 수 있는 바이오센서에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 지금까지 바이오센서의 감도(sensitivity)를 높이기 위해 신호를 증폭하는 방법들이 많이 개발되었고, 그 중에도 효소(enzyme)를 표지(label)로 이용하여 신호를 증폭시키는 방법이 가장 많이 연구되었다.
효소로는 호스 래디쉬 퍼옥시데이즈(horse radish peroxidase)와 같은 퍼옥시데이즈나 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)와 같은 포스파테이즈가 많이 이용되고 있다. 전기화학적 바이오센서에서는 퍼옥시데이즈 또는 포스파테이즈의 효소 반응에 의해 전기화학적으로 활성을 띄는 물질이 생성되게 함으로써 전기화학적 측정이 가능하게 된다.
전기화학적 바이오센서에서 높은 감도를 얻기 위해서는 높은 신호 대 배경 비(signal-to-background ratio)를 얻는 것이 필수적이다. 이를 위해서는 효소 반응에 사용되는 기질(substrate)과 효소 반응에 의해 형성된 생성물(product) 사이에 큰 전기화학적 활성의 차이가 존재하여야 한다. 즉, 생성물의 산화가 일어나는 전위(potential)에서 기질의 산화가 최소화되어야 한다. 두 물질의 전기화학적 활성의 차이는 표준환원전위(standard reduction potential)의 차이와 전극 반응속도(electrode reaction rate)의 차이에 의해서 생긴다.
포스파테이즈의 기질로 사용하는 '알코올 작용기에 포스페이트가 붙어 있는 물질'은 일반적으로 생성물인 '효소 반응에 의해 포스페이트가 떨어져 나간 물질'에 비해 표준환원전위가 높게 나타난다. 만약 생성물의 전극 반응속도가 빠르다면, 기질의 산화 전류를 최소화하면서 포스파테이즈 생성물의 산화전류를 얻을 수 있게 된다. 하지만, 생성물의 전극 반응속도가 느리다면, 기질에 의한 전기화학적 신호 간섭이 없이 큰 생성물의 신호를 얻는 것이 어려워진다.
전기화학 센서에서는 ITO(indium tin oxide)와 같은 주석산화물(tin oxide)을 기본으로 하는 전극이 많이 사용되고 있다. 이 전극은 매우 작고 재현성 있는 배경 전류(background current)를 제공해 주기 때문에, 센서로 사용되었을 때 큰 신호 대 배경 비(signal-to-background ratio)를 얻는 것을 가능하게 해 준다. 하지만, 이 전극의 전기촉매 특성은 좋지 않기 때문에, 전기촉매 특성을 높이기 위해서 전기촉매 특성이 우수한 물질(금속촉매 혹은 전자전달 매개체)로 전극 표면을 변화시켜야 하는 문제점이 있다.
포스파테이즈의 기질로 많이 사용하는 파라-아미노페닐 포스페이트(p-aminophenyl phosphate)는 효소 반응에 의해 파라-아미노페놀(p-aminophenol)로 변환된다. 이 파라-아미노페놀은 주석산화물을 기본으로 하는 전극에서 (특히 주석산화물 전극에 바이오센서 층이 입혀져 있을 때) 전기화학적 활성이 높지가 않다. 따라서, 이 파라-아미노페놀을 ITO 전극에서 산화시키기 위해서는 ITO 전극을 탄소나노튜브(carbon nanotube), 페로센(ferrocene), 금 나노입자 등으로 변화시켜 전극의 전기촉매 특성을 높여야 하는 수고로움이 있다.
또한, 파라-아미노페닐 포스페이트의 표준환원전위와 파라-아미노페놀의 표준환원전위의 차이는 크지가 않아서, 파라-아미노페놀의 산화가 일어나는 표준환원전위보다 조금만 높은 전위를 걸어도 파라-아미노페닐 포스페이트의 산화가 일어나서 배경 전류가 크게 나타난다는 문제점이 있다.
이와 같이 주석산화물을 기본으로 하는 전극에 전기촉매 특성이 우수한 물질을 입히는 것은 추가적인 작업이 필요하므로, 주석산화물을 기본으로 하는 전극에 전기촉매 특성이 우수한 물질을 입혀서 사용할 필요가 없는 바이오센서의 개발이 필요하다. 아울러, 기질의 표준환원전위와 생성물의 표준환원전위 사이에 큰 차이를 보이는 포스파테이즈 기질을 주석산화물을 기본으로 하는 전극에 사용하는 바이오센서의 개발이 필요하다.
한편, 높은 신호 증폭을 위해서는 파라-아미노페놀 포스페이트의 농도를 높게 하는 것이 좋지만, 파라-아미노페놀 포스페이트는 높은 농도로 녹지 않는다는 문제점이 있다. 또한, 파라-아미노페놀은 물에 빨리 쉽게 녹아 들지 않고, 파라-아미노페놀을 물에서 장시간 보관하면 천천히 분해된다는 문제점이 있다. 따라서, 파라-아미노페놀 포스페이트는 랩온어칩(lab-on-a-chip) 등에 사용하기에는 적합하지 않는 기질이다.
이와 같은 문제점을 극복하기 위해서 물에 녹였을 때 높은 농도로 잘 녹아 들어가고 수용액에서 장시간 안정하게 존재할 수 있는 기질을 사용하는 바이오센서의 개발도 필요하다.
일반적인 전기화학적 바이오센서에서는 전극 표면을 자기조립단분자막(self-assembled monolayer) 등으로 입힌 뒤 항체 등을 고정시키게 된다. 이때 전극 표면에 형성된 자기조립단분자막에 의해 포스파테이즈 생성물의 전극 반응속도는 크게 느려지게 된다. 항체 등을 전극 표면에 바로 흡착을 시킬 경우, 항체들 사이에 빈 공간을 통해 포스파테이즈 생성물이 전극으로 쉽게 도달할 수 있어 전극 반응속도가 크게 감소하지 않을 수 있다는 장점이 있다. 하지만, 흡착된 항체는 그 활성이 쉽게 감소하기 때문에 항체를 바로 전극에 흡착시키는 것은 바이오센서에 적용할 수가 없다.
따라서, 주석산화물을 기본으로 하는 전극에서 포스파테이즈 생성물의 전극 반응속도를 느리게 하지 않으면서 항체 등의 생체분자를 안정하게 고정시킬 수 있는 표면을 제공하는 것이 요구된다.
신호를 증폭시키는 방법으로, 전기화학적 활성 물질이 전기화학적으로 산화가 일어난 뒤 용액 속에 존재하는 환원제에 의해 다시 원래의 형태로 환원이 된 뒤 다시 전기화학적으로 산화가 되는 것을 반복하는 산화환원 순환(redox cycling)이 있다. 이 방법은 용액 속에 환원제만을 첨가하여 큰 신호의 증폭을 얻을 수 있기 때문에 간단하게 신호를 증폭을 얻을 수 있다는 장점이 있다. 이 산화환원 순환은 포스파테이즈를 표지로 사용하는 전기화학적 바이오센서에 쉽게 적용이 가능하다.
ITO 전극 등에서 환원제의 산화 전류가 작다고 하더라도, 걸어주는 전위가 증가할수록 환원제의 산화 전류는 증가한다. 따라서, 낮은 전위에서 산화가 쉽게 일어나는 포스파테이즈 생성물을 이용하는 것이 바람직하다. 산화 전위가 너무 낮게 되면 그 전위에서 수용액에 녹아 있는 산소의 환원이 쉽게 일어나 배경 전류가 증가하고 재현성이 떨어지는 문제점이 있다. 따라서, 가능하면 Ag/AgCl 기준 전극 대비 0 V 근처에서 산화가 일어날 수 있는 포스파테이즈 생성물을 사용하는 것이 필요하다.
본 발명은 포스파테이즈를 표지로 사용하고 ITO와 같은 주석산화물을 기본으로 하는 전극을 이용하는 전기화학적 바이오센서에서 전기촉매 특성이 우수한 물질을 추가적으로 입히지 않고 큰 신호 대 배경 비를 얻을 수 있는 전기화학적 바이오센서를 제공하고자 한다.
본 발명은 ITO와 같은 주석산화물을 기본으로 하는 전극에서 포스파테이즈 생성물의 전극 반응속도가 매우 크고, 포스파테이즈 기질과 생성물의 표준환원전위 차이가 크고, 포스파테이즈 기질이 수용액에 높은 농도로 잘 녹아 들어가면서 장시간 안정하게 존재하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
이에 더하여 포스파테이즈 생성물의 산화가 '산화환원 순환용 환원제'의 산화와 '수용액에 녹아 있는 산소'의 환원이 쉽게 일어나지 않는 전위 영역에서 빠른 산화 및 산화환원순환이 일어나는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 주석산화물을 기본으로 하는 전극에서 포스파테이즈 생성물의 전극 반응속도를 느리게 하지 않으면서 항체 등의 생체분자를 안정하게 고정시킬 수 있는 표면을 구비하는 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것을 추가적인 목적으로 한다.
본 발명은 금속 촉매 또는 전자전달 매개체를 포함하지 않는, 주석산화물을 기본으로 하는 금속산화물 전극; 상기 전극에 연결되는 포스파테이즈 효소 및 상기 포스파테이즈 효소에 의해 아스코르브산으로 활성화되는 아스코르브산 포스페이트를 포함하며, 상기 아스코르브산의 전기화학적 반응에 의한 신호로부터 생체분자의 존재 또는 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다.
바람직하게, 상기 바이오센서는 환원제에 의해 산화환원 순환시킴으로써 신호의 증폭을 일으키는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 전극에는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘이 흡착된 표면으로부터 생체분자가 고정되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 바이오센서에서 전극과 효소의 기질 조합은 센서의 측정 감도를 향상시킨다. 즉, 본 발명에 의한 바이오센서는 큰 전극 반응속도를 가지는 아스코르브산을 포스파테이즈 효소 반응에 의해 생성함으로써, 배경 전류가 작지만 전기촉매 특성이 나쁜 주석산화물 전극에서도 큰 신호 대 배경 비를 얻을 수 있도록 한다.
또한, 본 발명에 의한 바이오센서는 환원제를 이용함으로써 산화환원 순환에 의해 더 큰 신호 대 배경 비를 얻을 수 있도록 한다. 따라서, 저가격이면서 고감도인 바이오센서의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
아울러, 본 발명에서 포스파테이즈 효소의 기질로 사용되는 아스코르브산 포스페이트는 안정하고 물에 잘 녹아 들어가므로 랩온어칩에 쉽게 적용이 가능할 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명은 항원 또는 항체를 분석하는 면역분석법(immunoassay)과 DNA를 분석하는 DNA 센서(DNA sensor) 등의 핵심 기술로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 바이오센서 개념도
도 2는 생체특이적인 결합을 이용하는 바이오센서에서 표지를 사용하여 생체분자의 존재 또는 농도를 측정하는 원리를 나타내는 개념도
도 3은 본 발명의 바이오센서에 산화환원 순환이 추가되어 신호의 증폭이 이루어지는 과정을 나타내는 개념도
도 4는 주석산화물을 기본으로 하는 전극(41)에 생체분자를 고정시키는 아비딘, 스트랍타비딘, 혹은 뉴트라아비딘(42)이 흡착된 모습을 나타내는 개념도
도 5는 배경전류를 비교하기 위해 얻은 순환전압전류도
도 6a는 아스코르브산과 아스코르브산 포스페이트의 산화가 일어나는 전위를 비교하기 위해 ITO 전극에서 얻은 순환전압전류도
도 6b는 아스코르브산과 아스코르브산 포스페이트의 산화가 일어나는 전위를 비교하기 위해 아비딘이 입혀진 ITO 전극에서 얻은 순환전압전류도
도 7a는 아스코르브산 및 아스코르브산 포스페이트와의 비교를 위해 두 개의 벤젠고리를 포함하는 물질인 1-나프톨과 1-나프틸 포스페이트에 대해 ITO 전극에서 얻은 순환전압전류도
도 7b는 아스코르브산 및 아스코르브산 포스페이트와의 비교를 위해 두 개의 벤젠고리를 포함하는 물질인 1-나프톨과 1-나프틸 포스페이트에 대해 아비딘이 입혀진 ITO 전극에서 얻은 순환전압전류도
도 8은 아스코르브산 포스페이트를 기질로 사용하여 급성심근경색 마커인 트로포닌 아이(Troponin I)을 검출하는 바이오센서의 개념도
도 9a는 도 8의 바이오센서를 이용하여 트로포닌 아이 농도(저농도)에 따라 (트리스(2-카복시에틸)포스핀이 존재하지 않는 상황에서) 얻은 순환전환전류도
도 9b는 도 8의 바이오센서를 이용하여 트로포닌 아이 농도(고농도)에 따라 (트리스(2-카복시에틸)포스핀이 존재하지 않는 상황에서) 얻은 순환전환전류도
도 10은 도 9a 및 도 9b의 0.035V에서 얻은 산화 전류를 농도에 따라 표시한 보정 그래프
도 11a는 도 8의 바이오센서를 이용하여 트로포닌 아이 농도(저농도)에 따라 (트리스(2-카복시에틸)포스핀이 존재하는 상황에서) 얻은 순환전환전류도
도 11b는 도 8의 바이오센서를 이용하여 트로포닌 아이 농도(고농도)에 따라 (트리스(2-카복시에틸)포스핀이 존재하는 상황에서) 얻은 순환전환전류도
도 12는 도 11a 및 도 11b의 0.2 V에서 얻은 산화 전류를 농도에 따라 표시한 보정 그래프
본 발명의 목적과 여러 가지 장점은 이 기술 분야의 숙련된 사람들에 의해 첨부된 도면을 참조하여 후술되는 바람직한 실시예로부터 더욱 명확하게 될 것이다.
본 발명은 금속 촉매나 전자전달 매개체를 포함하지 않으면서 주석산화물을 기본으로 하는 금속산화물 전극(이하, '주석산화물을 기본으로 하는 전극' 또는 '주석산화물 전극'이라 한다), 상기 전극에 연결된 포스파테이즈 효소 및 상기 포스파테이즈 효소에 의해 아스코르브산으로 활성화되는 아스코르브산 포스페이트를 포함하며, 상기 활성화된 기질의 전기화학적 반응에 의한 신호로써 생체분자의 존재 또는 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다. 아스코르브산과 아스코르브산 포스페이트의 표준환원전위의 차이는 크고, 아스코르브산의 산화는 '산화환원 순환용 환원제'의 산화와 '수용액에 녹아 있는 산소'의 환원이 쉽게 일어나지 않는 전위 영역에서 빨리 일어나며, 아스코르브산 포스페이트는 물에 잘 녹아 들어가며 안정하게 존재함으로써 재현성 및 응용성이 우수한 바이오센서를 제공한다.
본 발명은 추가적으로 환원제에 의해 상기 활성화된 기질을 산화환원 순환시킴으로써 신호의 증폭을 일으키는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다. 상기 환원제의 산화가 쉽게 일어나지 않는 영역에서 산화환원순환이 일어나므로 낮은 배경전류 하에서 큰 신호 증폭을 얻을 수 있게 된다.
또한 본 발명은 상기 전극에 생체분자를 고정하기 위해서 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 등을 흡착시켜 상기 아스코르브산이 전극에 도달하는 것이 용이하게 하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다. 상기 아비딘 등이 상기 전극에 흡착되게 되면 흡착된 아비딘 사이에 아스코르브산이 쉽게 통과할 수 있는 통로가 생기고 상기 전극 표면까지 쉽게 도달하여 아스코르브산의 빠른 산화가 일어날 수 있도록 해 준다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에서 제시하는 바이오센서의 개념도이다. 바이오센서의 측정 과정 중에 도 1에서와 같이 포스파테이즈(11) 효소와 주석산화물을 기본으로 하는 전극(12)의 연결이 일어나고, 그 뒤 아스코르브산 포스페이트(13)을 넣어 주면 아스코르브산(14)이 생성된다. 이렇게 생성된 물질(14)을 주석산화물을 기본으로 하는 전극(12)에서 산화시키면 산화된 물질(15)이 생성되면서 전자(16)가 발생한다. 이 전자(16)의 양을 측정함으로써 시료 속의 생체분자의 농도를 알 수 있게 된다. 아스코르브산(14)의 표준환원전위가 아스코르브산 포스페이트(13)의 표준환원전위보다 훨씬 낮고 아스코르브산(14)의 전극반응 속도가 매우 빨라서, 생성물(14)의 산화시 아스코르브산 포스페이트(13)의 산화는 일어나지 않는다. 주석산화물을 기본으로 하는 전극(12)으로는 주석산화물(tin oxide), ITO(indium tin oxide) 또는 FTO(fluorine-doped tin oxide)를 사용할 수 있다.
도 2는 생체특이적인 결합을 이용하여 생체지표물질의 농도를 측정하는 바이오센서에서 효소 표지가 어떻게 이용되는가를 나타내는 개념도이다. 전극(21)에 생체지표물질(23)과 생체특이적인 결합을 하는 항체 또는 생체분자(22)가 고정되고 있고, 여기에 생체지표물질(23)이 결합한다. 상기 생체지표물질(23)에 생체특이적인 결합을 하는 항체 또는 생체분자(24)가 한번 더 붙게 된다. 상기 생체분자(24)에 표지로 효소(25)가 붙어 있다. 생체지표물질(23)이 표면에 존재할 때만 표지가 붙어 있는 항체 또는 생체분자(24)가 결합하고, 시료 속에 있는 생체지표물질(23)의 양에 따라 표지가 붙어 있는 항체 또는 생체분자(24)의 붙는 양이 달라진다. 따라서, 표면에 존재하는 효소(25)의 양이 달라짐에 따라 효소 반응에 의해서 생성되는 생성물의 양도 달라진다. 이 생성물의 양을 측정함으로써 간접적으로 생체지표물질(23)의 양을 알 수 있게 된다. 본 발명은 이와 같이 샌드위치 형태의 바이오센서에 응용될 수 있다.
경쟁 반응(competitive reaction)과 치환 반응(displacement) 등을 이용한 바이오센서에서도 본 발명은 응용될 수 있다. 생체지표물질(26)과 표지로 효소(27)가 붙어 있는 생체지표물질(28)이 경쟁 또는 치환 반응을 통해 생체특이적인 결합을 하는 항체 또는 생체분자(22)에 결합하게 된다. 표면에 존재하는 효소(27)의 양이 많을수록 생체지표물질(26)이 적게 존재함을 의미한다. 따라서, 효소 반응에 의해서 생성되는 생성물의 양은 생체지표물질(26)이 많을수록 적어진다. 이와 같은 원리를 통해 생체지표물질(26)의 양을 측정할 수 있다. 생체지표물질(23, 26)은 DNA, RNA, 단백질, 유기물질 등이 될 수 있다.
도 3은 본 발명에서 제시하는 바이오센서에 산화환원 순환을 통해 신호의 증폭을 얻는 것에 대한 개념도이다. 포스파테이즈(31) 효소와 주석산화물을 기본으로 하는 전극(32)의 연결이 일어나고, 그 뒤 아스코르브산 포스페이트(33)을 넣어 주면 아스코르브산(34)이 생성된다. 이렇게 생성된 아스코르브산(34)을 주석산화물을 기본으로 하는 전극(32)에서 산화시키면 산화된 물질(35)이 생성되면서 전자(36)가 발생한다. 이 때 전극(32)에서 쉽게 산화가 일어나지 않는 환원제(37)가 용액 속에 존재한다면 산화된 물질(35)은 환원제(37)에 의해 생성물(34)로 바뀌게 되고, 다시 전기화학적으로 전극(32)에서 산화가 일어난다. 이와 같은 과정 과정을 반복하는 산화환원 순환이 일어나면 전극(32)에서 측정되는 전류 값은 크게 증가하게 된다. 또한 아스코르브산의 산화가 환원제의 산화가 일어나는 전위보다 훨씬 낮은 전위에서 일어나므로 환원제의 산화에 의해 배경전류를 낮출 수 있다. 이와 같이 높은 신호 대 배경 비를 얻게 되고, 검출한계를 크게 낮출 수 있게 된다. 환원제(37)로는 포스파테이즈(31)의 활성에 큰 영향을 주지 않으면서 큰 환원 능력이 있는 히드라진(hydrazine)을 포함하는 히드라진 유도체(hydrazine derivative), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine)을 포함하는 포스핀 유도체 등이 사용될 수 있다.
도 4는 주석산화물을 기본으로 하는 전극(41)에 생체분자(43)를 고정시키기 위해 아비딘, 스트랍타비딘, 또는 뉴트라아비딘(42)이 흡착되어 있는 표면을 도시한 것이다. 상기 아비딘 등(42)을 통해 비오틴을 포함하는 생체분자(43)가 결합된다. 이때 상기 아비딘 등(42)의 사이에는 빈 공간(44)이 존재하므로 아스코르브산이 쉽게 통과하여 전극 표면에 도달할 수 있다. 따라서, 주석산화물을 기본으로 하는 전극(41)에 생체분자 층이 입혀져 있더라도 아스코르브산의 산화는 전극(41)에서 빨리 일어날 수 있게 된다.
도 5는 배경전류를 비교하기 위해 얻은 순환전압전류도(cyclic voltammogram)이다. 트리스 버퍼 용액(Tris buffer solution)에서 얻은 순환전압전류도와 1.0 mM 아스코르브산 포스페이트가 들어 있는 트리스 버퍼 용액에서 얻은 순환전압전류도를 비교해 보았을 때 아스코르브산 포스페이트의 산화는 0.3 V 이상에서 조금 관찰됨을 알 수 있다. 환원제인 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 있을 경우에도 배경전류가 크게 증가하지 않음을 알 수 있다.
도 6은 아스코르브산과 아스코르브산 포스페이트의 산화가 일어나는 전위를 비교하기 위해 얻은 순환전압전류도이다. 도 6a는 ITO 전극에서 얻은 것이고, 도 6b는 아비딘이 입혀진 ITO 전극에서 얻은 것이다. 두 경우 모두 아스코르브산의 산화 전류는 크게 나타나지만, 아스코르브산 포스페이트의 산화 전류는 거의 나타나지 않고 있다. 환원제인 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 있는 경우에는 산화환원순환에 의해 아스코르브산의 산화 전류가 크게 증가함을 보였다. 아스코르브산의 산화는 산소의 환원, 아스코르브산 포스페이트의 산화, 환원제의 산화가 잘 일어나지 않는 전위(0 V 근처)에서 잘 일어남을 알 수 있다. 그리고, ITO 전극 위에 아비딘이 입혀져 있더라도 아스코르브산의 산화 속도는 크게 감소하지 않음을 알 수 있다.
도 7은 아스코르브산 및 아스코르브산 포스페이트와의 비교를 위해 두 개의 벤젠고리를 포함하는 물질인 1-나프톨(1-naphthol)과 1-나프틸 포스페이트(1-naphthyl phosphate)에 대해 얻은 순환전압전류도이다. 도 7a는 ITO 전극에서 얻은 것이고, 도 7b는 아비딘이 입혀진 ITO 전극에서 얻은 것이다. 두 경우 모두 1-나프톨의 산화 전류는 도 6의 아스코르브산 경우에 비해서 높은 전위에서 일어난다. 도 7b의 아비딘이 입혀진 ITO 전극에서는 도 7a의 ITO 전극에서 보다 1-나프톨의 산화가 더 높은 전위에서 일어나고 산화 전류가 더 작게 나타나고 있다. 도 7b에서 환원제인 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 있는 경우에도 산화환원순환에 의한 1-나프톨의 산화 전류가 크게 증가하지 않음을 알 수 있다. 따라서, 두 개의 벤젠고리를 포함하는 물질인 1-나프톨의 경우에 비해서 아스코르브산은 낮은 전위에서 산화가 일어나고, 생체분자가 입혀진 표면에서도 산화가 잘 일어나고, 환원제에 의해 산화환원순환이 잘 일어난다. 이러한 특징은 높은 신호 대 배경 비를 제공해 주고, 낮은 검출한계를 얻는 데 중요한 역할을 한다.
도 8은 아스코르브산 포스페이트를 기질로 사용하여 급성심근경색 마커인 트로포닌 아이(Troponin I)을 검출하는 바이오센서의 개념도이다. 환원제인 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 있을 때는 산화환원순환이 일어나고, 존재하지 않을 때는 아스코르브산의 산화만이 일어난다.
도 9a 및 도 9b는 도 8의 바이오센서를 이용하여 트로포닌 아이 농도에 따라 (트리스(2-카복시에틸)포스핀이 존재하지 않는 상황에서) 얻은 순환전환전류도를 나타낸 것이다. 트로포닌 아이 농도가 증가함으로써 아스코르브산의 산화 전류가 증가함을 알 수 있다.
도 10은 도 9a 및 도 9b의 0.035V에서 얻은 산화 전류를 농도에 따라 표시한 보정 그래프(calibration graph)이다. 넓은 범위에서 트로포닌 아이를 측정할 수 있음을 알 수 있고, 계산된 검출 한계는 약 100fg/mL이었다.
도 11a 및 도 11b는 도 8의 바이오센서를 이용하여 트로포닌 아이 농도에 따라 (트리스(2-카복시에틸)포스핀이 존재하는 상황에서) 얻은 순환전환전류도를 나타낸 것이다. 트로포닌 아이 농도가 증가함으로써 아스코르브산의 산화 전류가 증가함을 알 수 있다.
도 12는 도 11a 및 도 11b의 0.2 V에서 얻은 산화 전류를 농도에 따라 표시한 보정 그래프이다. 넓은 범위에서 트로포닌 아이를 측정할 수 있음을 알 수 있고, 계산된 검출 한계는 약 10fg/mL이었다. 산화환원순환을 이용하여 좀 더 낮은 검출한계로 트로포닌 아이를 측정할 수 있었다.
이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함으로 전술한 실시 예 및 첨부된 도면에 한정되는 것이 아니다.
11, 25, 27, 31: 포스파테이즈
12, 21, 32, 41: 주석산화물을 기본으로 하는 금속산화물 전극
13, 33: 아스코르브산 포스페이트
14, 34: 아스코르브산
15, 35: 디히드로아르코르브산
16, 36: 전자
22: 항체 또는 생체분자
23, 26: 생체지표물질
24: 표지가 붙어 있는 항체 또는 생체분자
28: 표지가 붙어 있는 생체지표물질
37: 환원제
38: 환원제가 산화된 물질
42: 아비딘, 스트랍타비딘, 또는 뉴트라비딘
43: 비오틴이 연결된 생체분자
44: 아스코르브산이 이동할 수 있는 빈 공간

Claims (3)

  1. 금속 촉매 또는 전자전달 매개체를 포함하지 않는, 주석산화물을 기본으로 하는 금속산화물 전극; 상기 전극에 연결되는 포스파테이즈 효소 및 상기 포스파테이즈 효소에 의해 아스코르브산으로 활성화되는 아스코르브산 포스페이트를 포함하며,
    상기 아스코르브산의 전기화학적 반응에 의한 신호로부터 생체분자의 존재 또는 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오센서
  2. 제 1 항에 있어서,
    환원제에 의해 산화환원 순환시킴으로써 신호의 증폭을 일으키는 것을 특징으로 하는 바이오센서
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 전극에는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘이 흡착된 표면으로부터 생체분자가 고정되는 것을 특징으로 하는 바이오센서
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