KR20200066772A - 전기화학식 바이오 센서의 측정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전기화학신호 측정원리로 혈액, 배뇨, 타액 등 체액에 포함된 바이오마커를 검출하는 전기화학식 바이오 센서의 측정방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전기화학식 바이오 센서를 이용한 체외 진단기기에서 시간전류법 또는 시간전하법으로 측정함에 있어서 측정의 정확성 및 재현성을 개선할 수 있는 전기화학식 바이오 센서의 측정방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 바이오마커를 측정하기 위한 전기화학식 바이오 센서를 시간전류법 또는 시간전하법으로 측정함에 있어서, 전극을 측정용액에 담그고 일정시간 전극에 전압을 걸어주지 않은 후 전하값을 측정하거나 일정시간 전압을 걸어준 후 전류값을 측정함으로써 측정의 정확성 및 재현성을 개선할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

전기화학식 바이오 센서의 측정방법{Measuring method of electrochemical biosensor}
본 발명은 전기화학신호 측정원리로 혈액, 배뇨, 타액 등 체액에 포함된 바이오마커를 검출하는 전기화학식 바이오 센서의 측정방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전기화학식 바이오 센서를 이용한 체외 진단기기에서 시간전류법 또는 시간전하법으로 측정함에 있어서 측정의 정확성 및 재현성을 개선할 수 있는 전기화학식 바이오 센서의 측정방법에 관한 것이다.
종래의 전기화학방식 체외진단기기는 광학식 체외진단기기에 비하여 전기신호를 직접 측정할 수 있다. 전기신호를 직접 측정하므로 복잡한 광학계가 필요하지 않아 소형화 및 저가격화에 유리한 장점을 갖고 있어, 특히 현장진단기기 및 자가진단기기에 적합한 방식이다. 이러한 종래 선행기술로서 대한민국 등록특허 제10-0483093호는 전기 화학 전지에 관한 것으로, 작업 전극 및 작업 전극으로부터 소정 거리만큼 떨어져 있는 상대 전극을 포함하는 전기 화학전지 중에서 산화 환원 종의 환원형 (또는 산화형)의 농도를 측정하는 방법으로 구성되며, 이 방법은 전위 인가 후 및 정상 상태 도달 전에 시간에 따라 전류를 측정하고, 이로부터 산화 환원 종의 환원형 (또는 산화형)의 확산계수 및(또는) 농도를 표시하는 값을 얻는 구성을 개시하고 있다.
그러나, 종래의 바이오 마커를 검출하기 위한 전기화학방식 체외진단기기는 이러한 장점에도 불구하고 항원항체면역반응, 효소촉매반응, 전기화학반응 등의 세 가지 반응이 하나의 전극에서 일어나는 복잡한 반응으로 정확성과 재현성의 확보가 어려워 광학식 체외진단기기를 크게 대체하지 못하고 있다.
면역반응은 바이오센서 제작 시 항체를 고정화하고 시료 샘플의 항원과 반응하는 항원항체 면역반응으로 반응온도와 반응시간과 같은 반응 조건을 잘 제어하여 정확성과 재현성을 확보할 수 있다. 그렇지만 효소촉매반응과 전기화학반응을 제어하기 위한 방법은 아직 많이 제시되어 있지 않다.
따라서, 이러한 효소촉매반응과 전기화학반응을 적절히 제어하기 위한 측정방법을 제공하여 전기화학식 체외진단기기의 정확성과 재현성을 높이고자 하는 필요성이 요청되고 있다.
대한민국 등록특허 제10-0483093호 (2005.04.04)
따라서 본 발명의 목적은 전기화학식 바이오 센서를 이용한 체외 진단기기에서 시간전류법 또는 시간전하법으로 측정함에 있어서 측정의 정확성 및 재현성을 개선할 수 있는 전기화학식 바이오 센서의 측정방법을 제공하는데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 실시예에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법은 전기화학식 바이오센서의 전극을 기질이 포함된 용액에 담그는 단계; 및 일정시간 상기 전극에 전압을 걸어주지 않은 후 특정 시점(1)에 전압을 걸어서 일정시간 동안의 전하량을 시간전하법으로 측정하거나, 일정시간 상기 전극에 전압을 걸어준 후 특정 시점(2)에 흐르는 전류값을 시간전류법으로 측정하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법에 있어서, 상기 특정 시점(1)은 상기 전극을 기질이 포함된 용액에 담근 후 일정시간 상기 전극에 전압을 걸어주지 않은 후이고 상기 특정 시점(2)는 상기 전극을 기질이 포함된 용액에 담근 후 일정시간 상기 전극에 전압을 걸은 후인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법에 있어서, 상기 전극은 ITO 전극인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법에 있어서, 상기 ITO 전극은 시료 샘플의 항원과 표지자 항체와 결합하기 위한 항체가 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법에 있어서, 상기 표지자 항체는 반응 효소와 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법에 있어서, 상기 반응 효소는 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법에 있어서, 상기 알칼리 포스파타제는 기질 용액인 AAP(ascorbic acid 2-phosphate)와 반응하여 아스코르브산(ascorbic acid)를 생성하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법에 있어서, 상기 일정시간 상기 전극에 전압을 걸어주지 않은 후에 상기 아스코르브산(ascorbic acid)이 상기 전극의 표면에 쌓이는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법에 있어서, 상기 일정시간이 2분인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 전기화학식 바이오센서의 측정방법에 있어서, 상기 2분의 일정시간 후에 50초 동안의 전하량을 시간전하법으로 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 바이오마커를 측정하기 위한 전기화학식 바이오 센서를 시간전류법 또는 시간전하법으로 측정함에 있어서, 전극을 측정용액에 담그고 일정시간 전극에 전압을 걸어주지 않은 후 전류값 또는 전하값을 측정함으로써 측정의 정확성 및 재현성을 개선할 수 있는 우수한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 효소농도에 따른 변화를 시간전류법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 전압을 인가하지 않고 기질용액에 담가두는 시간에 따른 측정값의 변화를 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 실시 예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 이하의 설명에서 사용되는 구성요소에 대한 접미사 "모듈" 및 "부"는 명세서 작성의 용이함만이 고려되어 부여되거나 혼용되는 것으로서, 그 자체로 서로 구별되는 의미 또는 역할을 갖는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 개시된 실시 예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 명세서에 개시된 실시 예의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 첨부된 도면은 본 명세서에 개시된 실시 예를 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 명세서에 개시된 기술적 사상이 제한되지 않으며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 출원에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명하기로 한다. 본 발명은 본 발명의 정신 및 필수적 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
실시예 1: 시간전류법으로 측정한 효소농도에 따른 변화
전기화학식 바이오센서에서의 효소촉매 반응속도은 v=Vmax=kcat[ALP]0로 나타낼 수 있다. 여기서 속도를 결정하는 인자는 반응속도상수인 kcat와 효소의 초기 농도인 [ALP]0 이다. 이 속도 결정 인자 중에서 kcat는 주로 반응온도에 의해서 결정되므로 측정온도가 같은 경우 효소촉매 반응속도는 [ALP]0에 의해서 결정된다. [ALP]0는 ITO(Indium Tin Oxide) 전극에 항원항체 면역반응으로 결합된 항체에 붙어 있는 효소 ALP(알칼리 포스파타제, alkaline phosphatase)의 양이다. 이 양은 바이오마커인 항원의 양에 비례하므로 ALP의 양을 측정하여 바이오마커의 농도를 검출하게 된다.
반응 효소와 측정 기질용액으로 ALP와 AAP(ascorbic acid 2-phosphate)를 사용하고 항체를 고정화하고 전기화학반응을 일으키는 전극으로 ITO를 사용하여 효소촉매 반응 실험을 수행하였다. 고정화 반응 시 사용한 ALP의 농도에 변화를 주어서 ITO 전극에 고정화되는 ALP의 양을 변화시켰다. [ALP]0에 의한 효소촉매 반응속도의 변화를 관찰하기 위해서, ALP의 농도를 0, 1, 10 μg/mL의 세 가지 조건으로 변화시키면서 시간전류법(CA, Chronoamperometry)으로 측정한 실험결과는 도 1과 같다.
시간전류법으로 측정된 전류 값이 약 30초 이후에 안정화되고, 그 안정화된 값은 농도가 커짐에 따라서 증가하는 실험결과를 얻었다. 이 결과로부터 효소촉매 반응은 [ALP]0에 반응속도가 비례하고, 측정 초기에 큰 전류 값을 보이다가 점점 작아지고 어느 정도 시간이 지나면 일정한 값을 계속 유지함을 확인할 수 있다. 즉, 30초 이내에서 측정 시점을 채택하면 측정값이 변화하여 정확한 측정이 어려워짐을 알 수 있다.
ALP-ITO 전극을 AAP 기질 용액에 담그는 순간에, 우선 효소 ALP가 기질 AAP를 반응시켜 AA(아스코르브산, ascorbic acid)를 계속 생성하여 ITO 전극 표면에 쌓을 것이다. 이 때 전극에 전압을 걸어주지 않으면 전기화학반응이 일어나지 않으므로 ITO 전극에는 AA가 포화될 때까지 최대한 많이 쌓이게 된다. 그 후 전극에 전압을 걸어주는 순간부터 표면에 쌓인 AA는 감소하고 전체 반응은 안정화된다. 이를 실험으로 확인하기 위해서 전극에 전압을 인가하지 않고 AAP 기질 용액에 담가두는 시간을 변수로 하여 시간전류법으로 전류 값의 변화를 측정하였다. 이 때 작업전극과 상대전극 사이에 걸어준 전압은 Ag/AgCl 기준전극에서 0.45V이었다.
실시예 2: 전압을 인가하지 않고 기질용액에 담가두는 시간에 따른 측정값의 변화
도 2는 본 발명에 따른 전압을 인가하지 않고 기질용액에 담가두는 시간에 따른 측정값의 변화를 나타낸 그래프로서, 전압을 인가하지 않고 담가두는 시간을 5초에서 7분까지 변화시키면서 측정한 시간전류법의 전류 값을 보여준다. 이 실험결과로부터 반응속도는 이 담가둔 시간이 2분까지는 시간에 비례하여 증가하고 약 2분 이후에는 변하지 않음을 알 수 있다. 즉, ITO 전극 표면에 생성되는 AA가 2분 정도의 시간(생성물 포화 소요시간)에 포화되어 최댓값에 도달한다고 판단된다.
이 실험결과는 바이오 마커를 검사하는 체외진단기기 개발에 중요한 의미를 제공한다. 체외진단기기의 검사 정확도와 재현성을 높이기 위해서는 측정 시 전압 인가 없이 기질용액에 담가두는 시간을 일정하게 하거나 2분 이상의 충분한 시간을 주어야 한다. 또는 측정 시간이 50초 정도 지나면 안정화되므로 최소 안정화 시간인 50초 이후에 측정해야만 전기화학방식으로 정확하고 재현성있게 바이오마커의 농도을 측정할 수 있다.
일반적으로 전기화학식 바이오센서에서 전기화학 반응을 측정하는 방법으로 시간전류법과 시간전하법이 가장 많이 사용되고 있다. 이 두 가지 측정법에 각각 적용하여 전기화학식 바이오센서를 활용한 체외진단기기의 측정방법은 다음과 같다.
시간전류법의 경우에는 앞의 예에서와 같이 담가두는 시간을 자유롭게 하는 경우 측정값이 50초 이내에서는 변화한다. 이 변화를 제거하기 위해서 전극을 기질용액에 담가 최소 50초 이상 동안 전압을 걸고 그후 특정 시점에 흐르는 전류값을 측정한다. 이 담가두는 시간 50초는 사용하는 효소와 기질용액, 전극에 따라서 변할 수 있으므로, 도 2와 같이 전압을 걸지 않고 기질용액에 담가두는 시간에 따른 측정값의 변화를 측정한 후에 수렴하는데 걸리는 시간을 결정하여 측정방법에 적용한다.
시간전하법의 경우에는 전극표면에 효소반응에 의해 생성된 생성물이 포화되는 시간을 충분히 준 후에 일정 시간동안의 전하량을 측정해야 한다. 앞의 실험조건에서는 전극을 기질용액에 2분 동안 담가두면 포화되므로(3분, 5분, 7분은 2분과 같은 전류값을 보임) 2분 담가둔 후에 안정화 시간인 50초 동안의 전하량을 측정하면 전극표면의 효소 농도를 정확하고 재현성있게 측정할 수 있다. 이 포화되는 시간 2분도 사용하는 효소와 기질용액, 전극에 따라서 변할 수 있으므로, 그림2와 같이 기질용액에 담가두는 시간에 따른 측정값의 변화를 측정한 후에 결정하여 측정방법에 적용한다.
본 발명에 따르면, 효소촉매반응과 전기화학반응의 속도를 측정하여 측정시 측정시간을 제어함으로써 전기화학식 바이오센서의 정확도와 재현성을 높일 수 있다. 또한, 체외진단기기의 소형화 및 저가격화로 현장진단 및 자가진단에 적합하고, 적절한 전기화학식 측정방법을 제공하여 측정회로를 단순화할 수 있는 장점이 있다.
한편, 이상의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (10)

  1. 전기화학식 바이오센서의 전극을 기질이 포함된 용액에 담그는 단계; 및
    일정시간 상기 전극에 전압을 걸어주지 않은 후 특정 시점에 전압을 걸어서 일정시간 동안의 전하량을 시간전하법으로 측정하거나, 일정시간 상기 전극에 전압을 걸어준 후 특정 시점에 흐르는 전류값을 시간전류법으로 측정하는 단계;
    를 포함하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 특정 시점은 상기 전극을 기질이 포함된 용액에 담근 후 일정시간 상기 전극에 전압을 걸거나 걸어주지 않은 후인 것을 특징으로 하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전극은 ITO 전극인 것을 특징으로 하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 ITO 전극은 항체와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항체는 시료 항원과 반응 효소 결합 항체와 결합되는 것을 특징으로 하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 반응 효소는 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 알칼리 포스파타제는 기질 용액인 AAP(ascorbic acid 2-phosphate)와 반응하여 아스코르브산(ascorbic acid)를 생성하는 것을 특징으로 하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 일정시간 상기 전극에 전압을 걸어주지 않은 후에 상기 아스코르브산(ascorbic acid)이 상기 전극의 표면에 쌓이는 것을 특징으로 하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 일정시간이 2분인 것을 특징으로 하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 2분의 일정시간 후에 50초 동안의 전하량을 시간전하법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 전기화학식 바이오센서의 측정방법.
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