KR101871895B1 - 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액기반의 퇴행성 신경질환 진단 방법 - Google Patents

응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액기반의 퇴행성 신경질환 진단 방법 Download PDF

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Abstract

응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액기반의 퇴행성 신경질환 진단 방법을 개시한다. 본 발명의 실시 예에 따른 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액기반의 퇴행성 신경질환 진단 방법은 체액 샘플을 준비하는 단계, 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소를 포함하는 체액 샘플과 응집 단백질이 결합되지 않은 항체 표지 효소를 포함하는 기준 샘플로 나누어 준비하는 단계; 체액 샘플과 기준 샘플에 효소-기질 반응을 수행하는 단계, 효소-기질 반응 이후에 체액 샘플과 기준 샘플에 지속적으로 광을 노출하여 광 산화 증폭 과정을 수행하는 단계, 광 산화 증폭 과정에서 생성물의 발광량을 광학적으로 검출하고 시간에 따른 광 산화 증폭 양상을 지표화하는 단계, 및 체액 샘플의 광 산화 증폭 양상 지표를 기준 샘플과 비교하여 체액 내 응집 단백질의 함량 분석을 통해 퇴행성 신경계 질환을 진단하는 단계를 포함하는바, 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질이 선택적으로 결합된 항체 표지 효소와 기질의 반응 후 광 산화 증폭을 이용하여 응집 단백질을 고감도로 검출함으로써, 체액 내에 미량으로 존재하는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질의 함량을 정량 분석하여 정상 또는 비정상적인 단백질 응집양을 측정함으로써 퇴행성 신경질환을 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액기반의 퇴행성 신경질환 진단 방법{METHOD FOR THE BODY-FLUID-BASED NEURODEGENERATIVE DISEASE DIAGNOSIS USING HIGH SENSITIVE IMMUNOASSAY OF AGGREGATED PROTEINS BY PHOTOOXIDATION-INDUCED AMPLIFICATION}
본 발명은 체액기반의 퇴행성 신경질환 진단법에 관한 것으로, 상세하게는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질이 선택적으로 결합된 항체 표지 효소와 기질의 반응 후 광 산화 증폭을 이용하여 응집 단백질을 고감도로 검출함으로써, 체액 내에 미량으로 존재하는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질의 함량을 정량 분석하고, 정상 또는 비정상적인 단백질 응집양을 측정함으로써 퇴행성 신경질환을 정확하게 진단할 수 있도록 한 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 퇴행성 신경질환의 진단 방법에 관한 것이다.
신경세포 기능장애 및 손상은 독성의 응집되기 쉬운 단백질에 의해 유발될 수 있고, 다수의 신경계 질환은 그러한 용태를 특징으로 한다. 이들은 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨 병, 프리온 질병, 폴리글루타민 확장증, 척수소뇌성 실조증, 척수 및 연수 근육위축, 해면 뇌병증, 타우증(tauopathy), 헌팅톤 병, 또는 근육긴장 이상과 같은 질환을 포함한다.
이에, 효소 면역 분석법(ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay)을 통해 체액 내에 존재하는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질을 면역 분석하는 방법들이 보고되고 있다. 여기서, 효소 면역 분석법은 효소 표지 항체를 이용한 면역 측정법의 하나로서 항원 또는 항체의 정량 측정법이라고 할 수 있다. 보통은 마이크로 플레이트의 웰 안에서 반응이 완결하므로, 플레이트 리더기 등을 이용하여 효소-기질 반응을 광학적으로 측정하고 이를 기준치와 비교하여 항원 또는 항체의 양을 정량화하기도 한다.
하지만, 종래에 효소 면역 분석법을 통한 응집 단백질의 면역 분석 방법은 체액 내의 응집 단백질이 미량으로 존재하기 때문에 정확하게 정량화하기 어려운 문제가 있었다. 다시 말해, 종래의 효소 면역 분석법을 통한 응집 단백질의 면역 분석 방법은 응집 단백질의 양이 미량이거나 기준치 이하의 저농도인 경우 항체에 표지된 효소의 작용에 의한 기질의 발색 또는 발광 검출이 불가능하거나, 가능하더라도 극소의 검출량으로는 응집 단백질의 정량이 불가능하여 정상 또는 비정상적인 단백질 응집에 따른 퇴행성 신경질환을 정확하게 진단하는데 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질이 선택적으로 결합된 항체 표지 효소와 기질의 반응 후 광 산화 증폭을 이용하여 응집 단백질을 고감도로 검출함으로써, 체액 내에 미량으로 존재하는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질의 함량을 정량 분석하고, 정상 또는 비정상적인 단백질 응집에 따른 퇴행성 신경질환을 정확하게 진단할 수 있도록 한 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 퇴행성 신경질환 진단 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 실시 예에 따른 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 퇴행성 신경질환 진단 방법은 체액 샘플을 준비하는 단계, 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소를 포함하는 체액 샘플과 응집 단백질이 결합되지 않은 항체 표지 효소를 포함하는 기준 샘플로 나누어 준비하는 단계; 체액 샘플과 기준 샘플에 효소-기질 반응을 수행하는 단계, 효소-기질 반응 이후에 체액 샘플과 기준 샘플에 지속적으로 광을 노출하여 광 산화 증폭 과정을 수행하는 단계, 광 산화 증폭 과정에서 생성물의 발광량을 광학적으로 검출하고 시간에 따른 광 산화 증폭 양상을 지표화하는 단계, 및 체액 샘플의 광 산화 증폭 양상 지표를 기준 샘플과 비교하여 체액 내 응집 단백질의 함량 분석을 통해 퇴행성 신경계 질환을 진단하는 단계를 포함한다.
상기와 같은 기술 특징을 갖는 본 발명의 실시 예에 따른 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 퇴행성 신경질환 진단 방법으로 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질이 선택적으로 결합된 항체 표지 효소와 기질의 반응 후 광 산화 증폭을 이용하여 응집 단백질을 고감도로 검출함으로써, 체액 내에 미량으로 존재하는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질의 함량을 정량 분석하여 정상 또는 비정상적인 단백질 응집에 따른 퇴행성 신경질환을 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시 예에 따른 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소가 포함되어 있는 체액 샘플의 준비 단계를 설명하기 위한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시 예에 따른 고감도 면역 분석 방법에서 효소-기질 반응을 설명하기 위한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시 예에 따른 자체 촉매 반응에 의한 광 산화 증폭 과정을 설명하기 위한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 실시 예에 따른 효소의 농도별 광 산화 증폭 결과 및 지표 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 올리고머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 정상 및 알츠하이머병 환자의 구분 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 올리고머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 정상 및 알츠하이머병 환자의 구분 결과를 나타낸 다른 그래프이다.
도 7은 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 올리고머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 정상 및 알츠하이머병 환자의 구분 결과를 ROC 커브의 그래프로 나타낸 도면이다.
도 8은 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 모노머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 정상 및 알츠하이머병 환자의 구분 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서는 체액 내에 미량으로 존재하는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질을 고감도로 면역 분석하기 위해, 응집 단백질과 결합된 항체 표지 효소와 기질의 반응 후 생성물의 광 산화 증폭을 이용하여 미량의 응집 단백질을 고감도로 검출하게 된다. 이때, 응집 단백질의 N-terminus 또는 C-terminus를 인지하는 두 종류의 항체를 이용하여 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질을 선택적으로 검출할 수 있다. 이와 같이, 체액 내에 미량으로 존재하는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질을 고감도로 정량화하고 비교 분석하면 정상 또는 비정상적인 단백질 응집 따른 퇴행성 신경질환을 정확하게 진단할 수 있게 된다.
이하, 본 발명의 실시 예를 첨부한 도면들을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시 예에 따른 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소가 포함되어 있는 체액 샘플의 준비 단계를 설명하기 위한 모식도이다.
구체적으로, 도 1의 (a)는 올리고머 형태의 응집 단백질이 포함된 체액 샘플의 일 예를 나타내며, 도 1의 (b)는 모노머 형태의 응집 단백질이 포함된 체액 샘플의 일 예를 나타낸다.
체액 샘플 및 기준 샘플로는 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소가 포함되어 있는 체액 샘플과 응집 단백질이 결합되지 않은 항체 표지 효소가 포함되어 있는 기준 샘플로 나누어 준비한다. 특히, 도 1(a) 및 도 1(b)에 도시된 바와 같이, 체액 샘플 준비 시에는 올리고머나 모노머 형태의 응집 단백질이 선택적으로 결합된 항체 표지 효소를 포함하는 체액 샘플을 준비한다.
예를 들면, 체액 샘플 준비 시에는 응집 단백질의 N-terminus를 인지하는 일차 항체(101)가 결합되어 있는 기판 또는 자성 비드를 준비한 후, 일차 항체(101)가 결합되어 있는 기판 또는 자성 비드에 체액 샘플을 첨가하여 미리 설정된 일정 시간(예를 들어, 15분) 동안 인큐베이션하고 버퍼 용액에서 세척한다.
이때, 올리고머 형태의 응집 단백질(150)은 응집 단백질의 N-terminus를 인지하는 이차 항체(202)를 미리 설정된 일정 시간(예를 들어 15분) 동안 인큐베이션하고 버퍼 용액에서 세척한다.
반면, 모노머 형태의 응집 단백질(160)은 응집 단백질의 C-terminus를 인지하는 이차 항체(203)를 미리 설정된 일정 시간(예를 들어, 15분) 동안 인큐베이션하고 버퍼 용액에서 세척한다.
이와 같이 응집 단백질이 포함된 체액 샘플을 준비할 때는 올리고머 또는 모노머에 효소의 종류별로 서로 다르게 농도 변화를 주어 농도가 상이하게 다양한 체약 샘플을 준비하는 것도 바람직하다.
다음으로, 이차 항체(202,203)에 기질과 반응할 수 있는 효소(예를 들어 페르옥시다아제, 300)를 표지하고 버퍼 용액에서 세척한다. 한편, 여기서는 효소(300)가 이미 결합되어 있는 이차 항체(202,203)를 바로 이용할 수 있으며, 이때 추가적인 효소 표지 과정은 생략할 수도 있다.
도 2는 본 발명의 실시 예에 따른 고감도 면역 분석 방법에서 효소-기질 반응을 설명하기 위한 모식도이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소를 포함하는 체액 샘플과 응집 단백질이 결합되지 않은 항체 표지 효소를 포함하는 기준 샘플이 준비되면, 상기 체액 샘플 및 기준 샘플에 기질 용액을 혼합하여 효소-기질 반응이 일어나도록 한다.
구체적으로, 체액 샘플 및 기준 샘플에 효소와 반응할 수 있는 기질 용액을 첨가하고 미리 설정된 일정 시간(예를 들어, 15분 내지 30분) 동안 효소-기질 반응 수행한다. 이때, 기질 용액으로는 예를 들어 ADHP(Amplex Red; 10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)를 이용할 수 있다. 여기서, 이때, 샘플들의 효소-기질 반응 후 중지 용액을 첨가하여 효소-기질 반응을 중지시킴이 바람직하나, 효소-기질 반응을 중지하지 않고 일정 시간 이후 다음의 광 산화 증폭 과정을 수행하는 것도 가능하다.
상기와 같이 효소-기질 반응 시에는 무색 및 무형광인 기질(Amplex Red)이 효소(페르옥시다아제,300)의 작용으로 색 및 형광을 나타내는 생성물(Resorufin)로 바뀌게 되는데, 효소-기질 반응을 이용하여 올리고머나 모노머 형태의 응집 단백질 반응을 면역 분석할 수 있다. 즉, 올리고머나 모노머 형태의 응집 단백질이 선택적으로 결합된 항체에 효소(페르옥시다아제, 300)를 결합시켜 놓고 효소-기질 반응 정도를 측정하여 올리고머나 모노머 형태별 응집 단백질의 양을 정량화할 수 있다.
하지만 종래의 효소 면역 분석시에는 응집 단백질의 양이 미량이거나 기준치 이하의 저농도인 경우, 항체에 표지된 효소의 작용에 의한 생성물의 발색 또는 발광 검출이 불가능하거나, 가능하더라도 극소의 검출량으로는 응집 단백질의 정확한 정량이 불가능한 문제점이 있었다.
이를 해결하기 위해, 본 발명에서는 효소-기질 반응시 생성되는 발색 또는 발광 물질을 광 산화 증폭 과정을 이용하여 검출 가능한 양으로 증폭하고 그 증폭 양상을 지표화하여 저농도 또는 미량 샘플의 면역 반응을 정량화함으로써 저농도 또는 미량 샘플의 면역 반응을 보다 정확하게 세부적으로 분석할 수 있도록 한다.
도 3은 본 발명의 실시 예에 따른 자체 촉매 반응에 의한 광 산화 증폭 과정을 설명하기 위한 모식도이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 각 샘플들의 효소-기질 반응 중지 후 또는 일정 시간 후에는 광 산화 증폭 과정을 수행함과 아울러, 광 산화 증폭 과정에서의 생성물의 발광량을 광학적으로 검출하고 이의 시간에 따른 변화 양상을 지표화하여 응집 단백질의 농도를 정량화할 수 있다.
다시 말해, 효소-기질 반응이 이루어진 샘플들을 광 산화 증폭시키면 자체 촉매(autocatalysis) 반응이 일어난다. 즉, 효소-기질 반응이 이루어진 샘플들에 광을 노출시키게 되면, 하기 수학식 1로 도시된 바와 같이 자체 촉매 반응에 의해 발광 물질(Resorufin)의 양이 증폭된다. 이에, 발광 물질의 양에 따른 형광 밝기를 시간별로 측정하게 되면 광 산화 증폭 양상을 도시할 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112016038004848-pat00001
광 산화 증폭 과정에서 생성물의 발색 또는 발광량을 광학적으로 검출하는 과정에서는 체액 샘플 및 기준 샘플에 지속적으로 광을 노출시키면서 노출 시간별 자체 촉매 반응에 의한 생성물의 발색 및 발광량을 연속적으로 측정하게 된다. 이때는 광을 지속적으로 노출시킴으로써 광 노출을 통한 동영상을 측정하고, 짧은 시간 간격으로 간헐적 노출을 통해 시간대별로 측정할 수도 있다.
도 4는 본 발명의 실시 예에 따른 효소의 농도별 광 산화 증폭 결과 및 지표 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 효소-기질 반응 생성물의 광 산화 증폭 양상 분석시, 측정된 밝기 값들은 예를 들어 X축을 시간으로 하고, Y축을 상대적인 형광 밝기 값으로 하는 그래프 상에 표시할 수 있다.
광 산화 증폭 과정은 자체 촉매 반응의 일종이므로 S-자 커브 형태인 상기의 수학식 1 또는 하기의 수학식 2의 광 산화 증폭 모델식으로 변환 또는 재배치할 수 있다.
[수학식 2]
Figure 112016038004848-pat00002
여기서, 모델 변환 또는 재배치 식을 이용하여 각 샘플의 광 산화 증폭 양상을 대변할 수 있는 지표 예를 들어, 중간값 시간(T50), 초기값 시간(T10), 종기값 시간(T90), 증폭률(K) 등을 산출하여 개별적으로 또는 복합적으로 이용 가능하다. 예를 들면, 광 산화 증폭 양상 대변 지표, characteristic time length(CTL)는 T50 또는 T50+T10+T90 또는 K/(0.5/T50)*T50 또는 K/(0.5/T50)*(T50+T10+T90) 등을 이용할 수 있다.
다시 말해, 응집 단백질의 농도를 분석할 때는 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소와 기질의 반응 후 광 산화 증폭 과정을 시간에 따른 생성물의 발색 및 발광량 변화 값을 그래프 상에 변환 또는 재배치하고, 광 산화 증폭 양상을 대변하는 지표를 추출하여 응집 단백질을 포함하는 체액 샘플을 정량화할 수 있도록 한다. 그리고 광 산화 증폭 양상을 대변하는 지표로 중간값 시간(T50), 초기값 시간(T10), 종기값 시간(T90), 증폭률(K) 중 적어도 하나를 개별적으로 또는 복합적으로 계산하는 지표를 포함하여 이용할 수 있다.
결과적으로는 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소의 농도가 높을수록 초기 레조루핀의 생성량이 많기 때문에 자체 촉매 반응의 속도 또한 빠르고 광 산화 증폭이 빠르게 진행되어 형광 밝기 값이 빠르게 변화된다. 반면, 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소의 농도가 낮을수록 초기 레조루핀의 생성량이 적기 때문에 자체 촉매 반응의 속도가 느리고 광 산화 증폭이 느리게 진행되어 형광 밝기 값이 느리게 변화된다.
따라서, 형광 밝기 값이 변화되는 상대적인 시간 비교를 통해 항체가 결합된 효소의 농도를 확인할 수 있으며, 저농도 및 극미량의 샘플로도 면역 반응을 보다 정확하게 세부적으로 분석할 수 있게 된다.
광 산화 증폭 과정은 초기 레조루핀의 양에 따라 좌우되므로 광 산화 증폭 대변 지표를 산출하여 기준 값과 비교하면 체액 샘플에 존재하는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질의 함량을 정량 비교할 수 있다. 이때, 기준 값은 응집 단백질을 포함하지 않은 기준 샘플의 광 산화 증폭 양상 대변 지표 값으로 할 수 있다.
도 5는 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 올리고머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 정상 및 알츠하이머병 환자의 구분 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5에 도시된 바와 같이, 체액 샘플로 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 올리고머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통해서 정상 및 알츠하이머병 환자를 구분할 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면, 체액 샘플로 정상 및 알츠하이머병 환자의 혈장 내 신경유래 엑소좀 샘플을 준비하여 앞서 설명한 방법으로 수행할 수 있다. 이때, 자성 비드에 결합되어 있는 6E10 일차 항체와 이차 항체로 페르옥시다아제가 표지되어 있는 6E10을 이용하여 올리고머 형태의 베타 아밀로이드를 선택적으로 검출하여 효소-기질 반응을 수행한다.
96-웰플레이트에서 형광 현미경을 이용하여 광 산화 증폭 과정을 수행할 수 있는데, 광 산화 증폭 양상 대변 지표로 CTL=K/(0.5/T50)*T50 등을 이용할 수 있다.
도 6은 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 올리고머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 정상 및 알츠하이머병 환자의 구분 결과를 나타낸 다른 그래프이다. 그리고, 도 7은 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 올리고머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 정상 및 알츠하이머병 환자의 구분 결과를 ROC 커브의 그래프로 나타낸 도면이다.
도 6 및 도 7을 참조하면, 광 산화 증폭 과정 수행 이후에는 정상 및 알츠하이머병 환자 샘플의 광 산화 증폭 양상 지표인 CTL 값을 베타 아밀로이드가 포함되지 않은 기준 샘플의 CTL 값의 상대적인 값으로 비교하여 정상 및 환자를 96% 이상의 민감도 및 96% 이상의 선택도로 구분할 수 있게 된다.
도 8은 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 모노머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 정상 및 알츠하이머병 환자의 구분 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8과 같이, 혈액 샘플로 혈장 내 신경유래 엑소좀에서 추출된 모노머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 정상 및 알츠하이머병 환자를 구분할 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면, 혈액 샘플로 정상 및 알츠하이머병 환자의 혈장 내 신경유래 엑소좀 샘플을 준비하여 앞서 설명한 방법으로 수행할 수 있는데, 먼저 자성 비드에 결합되어 있는 6E10 일차 항체와 이차 항체로 페르옥시다아제가 표지되어 있는 12F4를 이용하여 모노머 형태의 베타 아밀로이드를 선택적으로 검출하여 효소-기질 반응을 수행할 수 있다.
96-웰플레이트에서 형광 현미경을 이용하여 광산화 증폭 과정을 수행할 수 있는데, 광 산화 증폭 양상 대변 지표로 CTL=K/(0.5/T50)*T50 등을 이용할 수 있다.
이후에는 정상 및 알츠하이머병 환자 체액 샘플의 CTL 값을 베타 아밀로이드가 포함되지 않은 기준 샘플의 CTL 값의 상대적인 값으로 비교하여 정상 및 환자를 구분할 수 있게 된다.
도 6에 따른 측정 결과와 도 8의 측정 결과를 비교해보면, 모노머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통해서도 정상 및 알츠하이머병 환자의 CTL 값 차이를 확인할 수 있으나, 도 6에 따른 예에서처럼 올리고머 형태의 베타 아밀로이드 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통하여 좀 더 정확하게 정상 및 알츠하이머병 환자를 구분할 수 있음을 알 수 있다.
이상 상술한 바에 따른 본 발명의 응집 단백질의 고감도 광산화 증폭 면역 분석을 통한 퇴행성 신경계 질환 진단 방법으로는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질이 선택적으로 결합된 항체 표지 효소와 기질의 반응 후 광 산화 증폭을 이용하여 응집 단백질을 고감도로 검출함으로써, 체액 내에 미량으로 존재하는 올리고머 또는 모노머 형태의 응집 단백질의 함량을 정량 분석하여 정상 또는 비정상적인 단백질 응집에 따른 퇴행성 신경계 질환을 정확하게 진단할 수 있게 된다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시 예에 대하여 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당 업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허 청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (16)

  1. 체액 샘플을 준비하는 단계;
    응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소를 포함하는 체액 샘플과 응집 단백질이 결합되지 않은 항체 표지 효소를 포함하는 기준 샘플로 나누어 준비하는 단계;
    상기 체액 샘플과 기준 샘플에 효소-기질 반응을 수행하는 단계;
    효소-기질 반응 이후에 상기 체액 샘플과 기준 샘플에 지속적으로 광을 노출하여 광 산화 증폭 과정을 수행하는 단계;
    상기 광 산화 증폭 과정에서 생성물의 발광량을 광학적으로 검출하고 시간에 따른 광 산화 증폭 양상을 지표화하는 단계; 및
    상기 체액 샘플의 광 산화 증폭 양상 지표를 기준 샘플과 비교하여 체액 내 응집 단백질의 함량 분석을 통해 퇴행성 신경계 질환을 진단하는 단계;를 포함하고,
    상기 효소-기질 반응은 효소로서 페르옥시다아제 효소를 이용하고, 기질로서 ADHP(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)를 이용하는, 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 체액 샘플은
    혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 눈물, 콧물 중 적어도 하나를 포함하는 체액의 샘플인 것을 특징으로 하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 체액 샘플을 준비하는 단계는
    신경유래 엑소좀(Neuronal Exosome) 분석 방식으로 상기 체액에서 엑소좀을 추출하거나 추출한 엑소좀으로부터 신경유래 엑소좀을 분리하여 분석 샘플을 준비하거나 상기 엑소좀을 분해(lysis)하는 단계를 더 포함하는 비정상적인 응집 단백질의 올리고머 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 체액 샘플을 준비하는 단계는
    베타 아밀로이드(Amyloid β), Tau, Alpha-synuclein, PrPsc, Huntingtin 중 적어도 하나의 응집 단백질이 선택적으로 결합된 항체 표지 효소를 포함하는 체액 샘플을 준비하는 것을 특징으로 하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 체액 샘플을 준비하는 단계는
    올리고머, 모노머 중 적어도 하나의 형태의 응집 단백질이 선택적으로 결합된 항체 표지 효소를 포함하는 체액 샘플을 준비하는 것을 특징으로 하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 항체 표지 효소로는
    페르옥시다아제 효소가 적용되는 것을 특징으로 하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 체액 샘플을 준비하는 단계는
    상기 응집 단백질의 N-terminus를 인지하는 일차 항체가 결합되어 있는 기판 또는 자성 비드를 준비하는 단계 및
    상기 일차 항체가 결합되어 있는 기판 또는 자성 비드에 샘플을 첨가하여 미리 설정된 시간동안 인큐베이션하고 버퍼 용액에서 세척하는 단계를 포함하며
    올리고머 형태의 상기 응집 단백질은 N-terminus를 인지하는 이차 항체를 미리 설정된 시간동안 인큐베이션하고 버퍼 용액에서 세척하는 단계;
    모노머 형태의 상기 응집 단백질은 C-terminus를 인지하는 이차 항체를 미리 설정된 시간동안 인큐베이션하고 버퍼 용액에서 세척하는 단계; 및
    상기 각 이차 항체에 기질과 반응할 수 있는 효소를 표지하고 버퍼 용액에서 세척하는 단계;
    를 포함하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 체액 샘플의 효소-기질 반응을 수행하기 위한 기질로 ADHP(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine, Amplex Red)를 포함하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 샘플의 효소-기질 반응을 수행하는 단계는
    상기 올리고머 및 모노머 형태의 응집 단백질이 결합된 항체 표지 효소를 포함하는 체액 샘플 및 기준 샘플에 기질 용액을 혼합하여 효소-기질 반응이 일어나도록 하는 단계를 포함하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 광 산화 증폭 과정 수행 단계는
    효소-기질 반응이 이루어진 상기 체액 샘플 및 기준 샘플에 지속적으로 광을 노출시켜 하기 수학식 1에 따른 자체 촉매 반응에 생성물의 발색 또는 발광량이 변화되도록 하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
    [수학식 1]
    Figure 112018053022522-pat00003

  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 광 산화 증폭 과정에서 생성물의 발색 또는 발광량을 광학적으로 검출하는 단계는
    상기 체액 샘플 및 기준 샘플에 지속적으로 광을 노출시키면서 노출 시간별 자체 촉매 반응에 의한 생성물의 발색 및 발광량을 연속적으로 측정하는 단계를 포함하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 광 산화 증폭 과정에서의 광을 지속적으로 노출시키는 방법으로 계속적인 광 노출을 통한 동영상 측정 및 짧은 시간 간격의 간헐적 노출을 통한 시간별 측정 과정을 포함하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 광 산화 증폭 양상을 지표화하는 단계는
    검출된 생성물의 발색 또는 발광량 변화 양상을 시간에 따른 그래프로 재배치하여 지표화하되, 상기 검출된 생성물의 발색 또는 발광량 값을 바탕으로 X축을 시간으로 하고 Y축을 생성물의 발색 또는 발광량 값으로 하는 그래프 상에 표시하는 것을 특징으로 하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 광 산화 증폭 과정을 시간에 따른 그래프로 재배치하는 단계에서
    하기 수학식 2에 따라 광 산화 증폭 모델식으로 변환 또는 재배치하여 그래프로 표시하는 단계를 포함하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    [수학식 2]
    Figure 112018053022522-pat00004
    .
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 체액 샘플의 광 산화 증폭 양상 지표를 기준 샘플과 비교하여 체액 내 응집 단백질의 함량 분석 및 진단하는 단계는
    상기 응집 단백질의 면역 반응을 분석할 수 있도록 광 산화 증폭 과정을 시간에 따른 생성물의 발색 및 발광량 변화 값을 그래프 상에 변환 또는 재배치하고,
    광 산화 증폭 양상을 대변하는 지표를 추출하여 상기 체액 샘플의 광 산화 증폭 양상 지표를 기준 샘플의 광 산화 증폭 양상 지표와 비교하여 응집 단백질의 양을 정량화하고 진단하는 단계를 포함하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 광 산화 증폭 양상을 대변하는 지표로
    중간값 시간(T50), 초기값 시간(T10), 종기값 시간(T90), 증폭률(K) 중 적어도 하나를 포함하고, 이를 개별적으로 또는 복합적으로 계산하는 지표를 포함하는 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액 기반의 퇴행성 신경질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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