JP6653433B2 - 核酸アプタマー/ナノ銀プローブとexo i酵素に基づく電気化学的バイオセンサ。 - Google Patents
核酸アプタマー/ナノ銀プローブとexo i酵素に基づく電気化学的バイオセンサ。 Download PDFInfo
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Description
ナノ銀とナノ銀の表面に接続された複数のプローブ本体とを備え、前記プローブ本体はターゲット物質に対して特異的認識機能を有する核酸アプタマー断片(以下、ターゲットアプタマーと呼ばれることがない)と該核酸アプタマー断片と部分相補的な塩基配列を構成する核酸断片(以下、捕捉プローブDNAと呼ばれることがある)とを含み、前記核酸アプタマー断片は前記核酸断片とハイブリダイゼーションして前記プローブ本体を形成し、前記核酸断片の3’末端がチオール化されており、
前記核酸断片の前記核酸アプタマー断片に対する競合ハイブリダイゼーション能力が前記ターゲット物質の核酸アプタマー断片に対するハイブリダイゼーション能力より低いバイオプローブを提供することを第一目的とする。
前記ターゲット生体分子を検出するバイオプローブはターゲット物質により開始されて、競合反応を行って、前記核酸アプタマー断片を前記プローブ本体から離脱させてターゲット物質と特異的に結合するステップと、
EXO I酵素を加えて、EXO I酵素で前記一本鎖形態として存在する核酸アプタマー断片を加水分解し、ターゲット物質が遊離して前記プローブ本体中の核酸アプタマー断片と特異的に結合し続けて、加水分解と特異的結合に対応したターゲット信号の増幅サイクル反応を形成し、最終的に前記核酸断片(捕捉プローブDNA)に接続されたナノ銀を得るステップと、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続されて前記核酸断片の塩基と相補的であり、3’末端がチオール化された核酸断片(以下、相補的プローブDNAと呼ばれることがある)とを含む、相補的プローブ(以下、バイオ相補的プローブと呼ばれることがある)を加えるステップと、
塩基相補的対合の原理を利用して、得られた前記相補的プローブの塩基と相補的であるナノ銀が前記相補的プローブDNAを修飾した金電極の表面に集まり、金電極すなわち電気化学的バイオセンサを得るステップとを含む方法によって製造される電気化学的バイオセンサを提供することを第二目的とする。
(1)バイオ捕捉プローブの製造
ジスルフィド結合を開裂した捕捉プローブDNAとターゲットアプタマーとを相補的に対合して、プローブ本体溶液(二本鎖DNA溶液)を形成し、前記プローブ本体溶液とナノ銀コロイドを混合して反応させて、3’末端がチオール化されたバイオ捕捉プローブを得る。
(2)バイオ相補的プローブの製造
ジスルフィド結合を開裂したステップ(1)の前記捕捉プローブDNAの塩基相補的プローブDNAとナノ銀コロイドを混合して反応させ、DNAの3’末端がチオール化されたバイオ相補的プローブを得る。
(3)バイオ捕捉プローブの認識及び酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
ステップ(1)で得られたバイオ捕捉プローブ、ターゲット物質及びEXOIエキソヌクレアーゼを混合して反応させる。
(4)電気化学的バイオセンサの製造
ステップ(3)で得られた溶液をステップ(2)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に前記相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、電気化学的バイオセンサを得る。
標準濃度を有する各ターゲット物質の電気化学的バイオセンサについてLSV検出を行って、異なる標準濃度を有するターゲット物質のLSVピーク電流を取得する、電気化学的検出をするステップ(1)と、
ステップ(1)のLSVピーク電流についてターゲット物質の濃度の対数に対して線形回帰方程を作成して、該方法の検量線を得る、検量線を作成するステップ(2)と、
実際サンプルの電気化学センサを用いて電気化学的検出を行って、対応したLSVピーク電流を得て、LSVピーク電流をステップ(2)の検量線に代入して、実際サンプルにおけるターゲット物質の濃度を得る、実際サンプルを検出するステップ(3)とを含む。
(1)本発明に係る核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブとEXO I酵素のターゲット策略とに基づく電気化学的バイオセンサは、新規なラベルフリー電気化学的バイオセンサであり、ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備える核酸アプタマーで修飾された銀ナノ粒子をターゲット生体分子を検出するバイオプローブとして、ターゲット物質により開始されて、相補的プローブとEXO I酵素によるサイクル切断増幅を補助として、DNAの相補的対合原理を利用して、該プローブは金電極の表面に集まり、ターゲット生体分子の濃度が大きいほど、誘導された核酸アプタマー/ナノ銀プローブの凝集程度が高くなり、さらに、ターゲット物質の認識過程にEXO Iエキソヌクレアーゼのターゲットサイクル増幅メカニズムを導入することで、該電気化学的バイオセンサはターゲット生体物質を高感度で効率よく検出できる。
(2)他の操作に比べて、本発明は、初めて電気化学的バイオセンサに認識と信号発生の2種の機能を備える核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブを適用することによって、従来のラベルフリー検出方法に使用される信号基質を省略して、該バイオセンサの操作を簡便にして、安定性を高め、検出限界を低下させて、感度を高め、選択性を向上させる。
(3)本発明では、電気化学的検出方法の使用により、操作を簡便にして、コストを削減させ、検出速度及び効率を高め、容易に小型化できる等の利点を付与し、現場でリアルタイムに迅速に検出できる。このため、核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブに基づく電気化学的バイオセンサは生体分子を検出するための新規な高感度方法を提供する。
(1)装置
CHI650電気化学ワークステーション(上海辰華装置有限公司製);飽和カロメル電極(SCE)を参照電極、白金線電極を対電極とする。
(2)試薬
リゾチームアプタマー、γインターフェロンアプタマー及びレポートプローブ(上海生工生物工程股▲ふん▼有限公司製)
ほかの試薬はすべて分析的に純粋なものであり、実験用水は二次蒸留水である。
(1)ナノ銀の製造
氷水浴において0.003M水素化ホウ素ナトリウム100mlを250ml三つ口丸底フラスコに投入して、前後にある2つの開口をシールして、激しく撹拌した。ピペットガンを用いて、1回に1ミリリットル滴下するように0.002M硝酸銀50mLを、10ml添加する毎に2分間を空けるように緩慢に水素化ホウ素ナトリウムに加え、硝酸銀の添加が終了した後、5min連続して激しく撹拌した。丸底フラスコを沸騰水浴に入れて、3〜5分間加熱した直後、迅速に0.003M水素化ホウ素ナトリウム溶液を10ml加えた。フラスコを温水浴から取り出して、続けて激しく撹拌して室温まで冷却させた。製造されたナノ銀コロイドを王水で浸漬された茶色瓶に移して、遮光下、4℃で保存した。
(2)捕捉プローブの製造
捕捉プローブDNA(5’−A CTC TTT AGC CCT GAT−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:1)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にリゾチームアプタマー(5’− ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG−3’;配列 SEQID NO:2)10μLを加えて水浴鍋に入れて37℃で2時間反応させて、二本鎖を形成した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加えて、次に二本鎖DNAを加えてシールして、遮光下で5〜6時間かけて緩やかに撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(3)相補的プローブの製造
相補的プローブDNA(5’−ATC AGG GCT AAA GAG T−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:3)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNA 10μLを加えて、密封遮光下、5〜6時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(4)標準濃度を有するリゾチーム溶液の調製
超純水を用いて100uM母液を調製して、0.1M PBS緩衝溶液で母液を希釈して0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nMの濃度勾配を有するリゾチーム溶液を調製した。
(5)捕捉プローブの認識と酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
2mL遠心分離管に捕捉プローブ100μLと勾配濃度を有するリゾチーム100uLとを加え、次に20 U EXO I エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において37℃で1時間放置した。
(6)相補的プローブDNAを修飾した金電極の製造
金電極の研磨処理
金電極をウォッシュレザーにおいて0.3umと0.05umのAl2O3で順次研磨して鏡面に仕上げて、順次エタノール、再蒸留水で超音波洗浄を20−25秒間行い、次に0.5M硫酸溶液において、掃引速度を0.1V/sとしてサイクリックボルタンメトリーを行って、安定的になると、蒸留水できれいに洗浄して、窒素ガスで吹き干した。
前記相補的プローブDNAをTCEPで2時間反応させてジスルフィド結合を開裂して、ここで、相補的プローブDNAのジスルフィド結合を開裂した反応系において、DNAの濃度を1μM、TCEPの濃度を0.01M、PBの濃度を0.01M、NaClの濃度を0.1Mにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNAを研磨処理済みの金電極に24時間浸入して、前記相補的プローブDNAを修飾した金電極を得た。
(7)電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ(5)で得られた各溶液をステップ(3)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。
捕捉プローブDNA(5’−A CTC TTT AGC CCT GAT−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:1)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にリゾチームアプタマー(5’− ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG−3’;配列 SEQID NO:2)10μLを加えて水浴鍋において37℃で1.5時間反応させて、二本鎖を形成した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加えて、次に二本鎖DNAを加えてシールして、遮光下で5〜6時間かけて低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、5℃で13時間反応させた。13時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(2)相補的プローブの製造
相補的プローブDNA(5’−ATC AGG GCT AAA GAG T−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:3)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNA 10μLを加えて、密封遮光下、5〜6時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、5℃で13時間反応させた。13時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(3)標準濃度を有するリゾチーム溶液の調製
超純水を用いて100uM母液を調製して、0.1M PBS緩衝溶液で母液を希釈して0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nMの濃度勾配を有するリゾチーム溶液を調製した。
(4)捕捉プローブの認識及び酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
2mL遠心分離管に捕捉プローブ100μLと勾配濃度を有するリゾチーム100uLとを加え、次に20 U EXO I エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において35℃で1.5時間放置した。
(5)電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ(4)で得られた各溶液をステップ(2)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に実施例1のステップ(6)の相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、修飾された電極を取り出しいて、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。
(1)電気化学的検出
実施例1で得られた各電極を取り出した後、0.01M PBで2−3回洗浄して、電極を0.2M PBSの検出液に浸入して、カロメル参照電極と白金線コントラスト電極とともに三電極システムを構成して、LSV検出を行った。
(2)検量線の作成
標準濃度を有するリゾチームが認識されたLSVピーク電流について、リゾチーム濃度の対数に対して線形回帰方程を作成して、該方法の検量線を得た。図2に示すように、該線形回帰方程はI=0.5068lgC+0.67798、R2=0.997、線形範囲は1.5pM−10nM、検出限界は290fM(S/N=3)であった。
(3)実際サンプルの検出
実際サンプルについて実施例1の方法によって操作を行って、得られたピーク電流を検量線に代入して、実際サンプルにおけるリゾチームの濃度を得た。
リゾチームの検出結果から明らかなように、異なる濃度のリゾチームは、ピーク電流の曲線が顕著に変化しており、リゾチームは、1.5pM−10nMの濃度範囲で良好な線形関係を示し、本発明に係る電気化学的バイオセンサによるリゾチームの検出限界は290fMと低くなる。
(1)ナノ銀の製造
実施例1のナノ銀の製造ステップと同様であった。
(2)捕捉プローブの製造
捕捉プローブDNA(5´− CC AAC ACA ACC AAC CCC−C6−SH−3´;配列 SEQID NO:4)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にγインターフェロンアプタマー(5´−GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGT TGT GTC CAA CCC C−3´;配列 SEQID NO:5)10μLを加えて水浴鍋において37℃で2時間反応させて、二本鎖を形成した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加えて、次に二本鎖DNAを加えてシールして、遮光下で5〜6時間かけて低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(3)相補的プローブの製造
相補的プローブDNA(5´−GGG GTT GGT TGT GTT GG−C6−SH −3´;配列 SEQID NO:6)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNA 10μLを加えて、密封遮光下、5〜6時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(4)標準濃度を有するγインターフェロン溶液の調製
超純水を用いて100uM母液を調製して、0.1M PBSの緩衝溶液で母液を希釈して0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nMの濃度勾配を有するγインターフェロン溶液を調製した。
(5)捕捉プローブの認識と酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
2mL遠心分離管に捕捉プローブ100μLと勾配濃度を有するγインターフェロン100uLとを加え、次に20 U EXO I エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において37℃で1時間放置した。
(6)相補的プローブDNAを修飾した金電極の製造
金電極の研磨処理
金電極をウォッシュレザーにおいて0.3umと0.05umのAl2O3で順次研磨して鏡面に仕上げて、順次エタノール、再蒸留水で超音波洗浄を20−25秒間行い、次に0.5M硫酸溶液において、掃引速度を0.1V/sとしてサイクリックボルタンメトリーを行って、安定的になると、再蒸留水できれいに洗浄して、窒素ガスで吹き干した。
前記相補的プローブDNAをTCEPで2時間反応させてジスルフィド結合を開裂して、ここで、相補的プローブDNAのジスルフィド結合を開裂した反応系において、DNAの濃度を1μM、TCEPの濃度を0.01M、PBの濃度を0.01M、NaClの濃度を0.1Mにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNAを研磨処理済みの金電極に24時間浸入して、前記相補的プローブDNAを修飾した金電極を得た。
(7)電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ(5)で得られた各溶液をステップ(3)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。
Claims (3)
- ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備えてターゲット生体分子を検出するバイオプローブであって、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続された複数のプローブ本体とを備え、前記プローブ本体はターゲット物質に対して特異的認識機能を有する核酸アプタマー断片と該核酸アプタマー断片と部分相補的な塩基配列を構成する核酸断片とを含み、前記核酸アプタマー断片は前記核酸断片とハイブリダイゼーションして前記プローブ本体を形成し、前記核酸断片の3’末端がチオール化されており、
前記核酸断片の前記核酸アプタマー断片に対する競合ハイブリダイゼーション能力が前記ターゲット物質の核酸アプタマー断片に対するハイブリダイゼーション能力より低いことを特徴とするバイオプローブ。 - 請求項1に記載のバイオプローブの製造方法であって、
ジスルフィド結合を開裂した前記核酸断片と核酸アプタマー断片を相補的に対合して、プローブ本体溶液を形成するステップと、
前記プローブ本体溶液とナノ銀コロイドを混合して反応させ、ターゲット生体分子を検出するバイオプローブを得るステップとを含む
ことを特徴とするバイオプローブの製造方法。 - ジスルフィド結合を開裂した前記核酸断片は、
前記核酸断片とトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンを含有する溶液とを反応させてジスルフィド結合を開裂して、ジスルフィド結合を開裂した前記核酸断片を得る方法によって製造されるものであり、
前記プローブ本体溶液の反応ステップでは、35〜40℃で1.5〜2.5時間反応させ、
前記混合反応の条件としては、密封遮光下、35〜40℃で撹拌しながら5〜6h反応させ、2〜6℃で10〜14h反応させ、
2〜6℃で10〜14h反応させた後、撹拌しながら反応物にPBS緩衝液を加えてpHを調整し、次にNaCl溶液を加え、密封遮光下、2〜4h撹拌し、密封遮光下、2〜6℃で10〜24h反応させた後、PBSで遠心洗浄して、ターゲット生体分子を検出するバイオプローブを得る
請求項2に記載の製造方法。
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