CN103525815A - 适配体修饰的纳米银探针及其试剂盒与在检测pdgf-bb中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适配体修饰的纳米银探针，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链。本发明还公开了包含上述探针的试剂盒及其在检测PDGF-BB中的应用。本发明的纳米银探针与显色剂联用能提高显色可视化检测的灵敏度，检测PDGF-BB的线性范围为1.56ng/mL-100ng/mL，检测限低，特异性好。此种纳米银探针的合成及修饰方法成熟，显色剂检测性能优良，两者的联合可以使检测PDGF-BB的灵敏度大大提高，检测过程大大简化。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种适配体修饰的纳米银探针及其试剂盒在检测PDGF-BB中的应用。
背景技术
血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一种强效的丝裂原和重要的促肿瘤血管生成生长因子，可由多种血细胞、组织细胞和一些肿瘤细胞产生。目前对肿瘤细胞中PDGF表达与检测的研究已成为生物医学研究领域的热点之一。适配体是具有三维空间结构能特异性识别目标蛋白质的DNA或RNA分子，合成容易，易于修饰且稳定。我们利用适配体功能化的纳米银可以实现对血小板衍生生长因子-BB(即PDGF-BB)的特异识别。
纳米银具有优良的表面催化特性，当金属离子和还原剂分子吸附到其表面时，纳米银催化氧化还原反应并在其表面产生一层金属膜。基于此原理，我们合成了适配体修饰的纳米银探针，通过其催化金属沉积实现对PDGF-BB的高灵敏，特异性可视化分析检测。
发明内容
本发明还要解决的技术问题，是提供包含上述纳米银材料的试剂盒，用于PDGF-BB的检测。
本发明最后要解决的技术问题，是提供上述试剂盒在检测PDGF-BB中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种适配体修饰的纳米银探针，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链；
所述的适配体链，其核苷酸序列为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG。
所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为：5’SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。
上述适配体修饰的纳米银探针的制备方法，它包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为1：3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；
(2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比(1～9):(1～99)加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置10～24小时，适配体链和寡核苷酸的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1；
所述的适配体链，其核苷酸序列为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG，其5’端由巯基修饰；
所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为：5’SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’，其5’端由巯基修饰；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1×PBS，静置3～10小时；
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入1～5mol/L氯化钠溶液，静置2～4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1～4次，使得氯化钠的终浓度为0.1～0.3mol/L；
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24～72小时；
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍；最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。
步骤(2)中，适配体链和寡核苷酸链摩尔比优选为(1～10):(1～1:10)，最优选为1:1；静置时间优选为15～20h，最优选为18h。
步骤(3)中，PBS缓冲溶液优选为1×PBS，即包含如下物质的水溶液：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4·12H2O，2mM KH2PO4；静置时间优选为6h。
步骤(4)中，氯化钠溶液的浓度优选为2mol/L；氯化钠的终浓度优选为0.2mol/L；静置时间优选为3h。
步骤(5)中，静置时间优选为48h。
步骤(6)中，所述的离心条件为10000～20000rpm条件下离心10～30分钟，优选15000条件下离心15分钟。所述的1×PBSM配方为1×PBS和1mmol/L MgCl2。
上述适配体修饰的纳米银探针在制备检测PDGF-BB的试剂中的应用。
一种用于检测PDGF-BB的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂：适配体修饰的纳米银探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20、anti-PDGF-BB抗体、PDGF-BB、氯金酸、氢醌、牛血清白蛋白、醛基片基。
上述用于检测PDGF-BB的试剂盒在检测PDGF-BB中的应用。
利用上述检测PDGF-BB的试剂盒检测PDGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤：
(1)配制溶液：
稀释液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS；
洗涤液：1×PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；
阴性对照：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中，得1mg/mL BSA溶液；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液；
底物：用1mg/mL BSA配制所需浓度的anti-PDGF-BB标准样品溶液；
显色剂：10mmol/L氯金酸和2mmol/L氢醌等体积混合；
探针：用（1×PBSM）溶液配制1.03nmol/L的适配体修饰的纳米银探针；其中，1×PBSM配方为1×PBS和1mmol/L MgCl2。
(2)将不同浓度的anti-PDGF-BB溶液、待测样品和阴性对照在醛基片上点样，37℃条件下固定2h；
(3)每孔加入10～50μL封闭液，在37℃条件下封闭1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；
(4)在不同的孔中加入不同浓度的PDGF-BB标准样品溶液30μL，在其余的孔中加入30μL样品溶液，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；
(5)每孔加入1.03nmol/L适配体修饰的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；
(6)每孔加入30μL显色剂，避光反应1～8min，去离子水冲洗3～4次，拍干；
(7)用扫描仪（Scanmaker i900）扫描，LuxScan3.0芯片图像分析软件对图像进行处理，不同浓度的PDGF-BB标准样品溶液对应不同的灰度值，得到PDGF-BB标准曲线，由标准曲线计算得到样品中PDGF-BB的浓度。
有益效果：本发明的纳米银探针耦合显色剂的方法能大大提高显色检测的灵敏度，只需要通过普通的扫描仪采集信号，普适性和实用性高。此种探针的合成及修饰方法成熟，显色剂显色性能好，为蛋白质的显色分析检测提供了一种极好的方法。
本发明利用适配体分子对蛋白质的特异性识别作用实现对PDGF-BB的高灵敏特异性检测，对PDG-BB的分析范围为1.56ng/mL-100ng/mL,且特异性好，人免疫球蛋白IgG、人血清蛋白HSA、血清serum没有干扰。本发明试剂盒中所采用的显色剂，与商品化的银增强试剂比较，所需显色时间短，在检测低浓度的蛋白质含量时具有明显的优势。
附图说明
图1纳米银探针的紫外-可见吸收光谱图。其中，1-纳米银（AgNPs，2.6nmol/L），2-适配体修饰的纳米银探针（Ag-apt），3-离心后适配体修饰的纳米银探针（Ag-apt,1.03nmol/L）。
图2检测PDGF-BB浓度的信号相关性曲线及扫描图。
图3显色后芯片表面的扫描电子显微镜图
图4检测PDGF-BB的特异性曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：纳米银探针的制备。
(1)在冰浴的条件下，将2mmol/L的硝酸银以一定的速度滴加至3mmol/L的硼氢化钠溶液中（两者反应摩尔比为1:3），不断搅拌至反应完全，反应完成后补加7%摩尔量的硼氢化钠溶液并加热得到黄色溶液，纳米银的浓度为2.6nM。
(2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比3:1加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置18小时。适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为288。
所述的适配体链，其核苷酸序列为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG，其5’端由巯基修饰；
所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为：5’SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’，其5’端由巯基修饰；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS（137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM,Na2HPO4·12H2O,2mM KH2PO4）溶液，使PBS的浓度为0.1×，静置6小时。
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液，每隔3小时加一次氯化钠，静置，使氯化钠的终浓度为0.2mol/L。
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置48小时。
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，沉淀加入1×PBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤3次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的1倍；最后离心得到的沉淀经1×PBSM重悬即得适配体修饰的纳米银探针。图1为纳米银探针的紫外-可见吸收光谱图。
实施例2：纳米银探针的制备。
(1)在冰浴的条件下，将20mmol/L的硝酸银以一定的速度滴加至30mmol/L的硼氢化钠溶液中（两者反应摩尔比为1:3），不断搅拌至反应完全，反应完成后补加7%摩尔量的硼氢化钠溶液并加热得到黄色溶液，纳米银的浓度为2.6nmol/L。
(2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比1:1加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置10小时。适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为100。
所述的适配体链，其核苷酸序列为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG，其5’端由巯基修饰，且末端为碱基A；
所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为：5’SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’，其5’端由巯基修饰；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS（137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM,Na2HPO4·12H2O,2mM KH2PO4）溶液，使PBS的浓度为0.1M，静置3小时。
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入1mol/L氯化钠溶液，静置2小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1次，使氯化钠的终浓度为0.1mol/L。
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24小时。
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，沉淀加入1×PBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1倍；最后离心得到的沉淀经1×PBSM重悬即得适配体修饰的纳米银探针。
实施例3：纳米银探针的制备。
(1)在冰浴的条件下，将10mmol/L的硝酸银以一定的速度滴加至20mmol/L的硼氢化钠溶液中（两者反应摩尔比为1:3），不断搅拌至反应完全，反应完成后补加7%摩尔量的硼氢化钠溶液并加热得到黄色溶液，纳米银的浓度为2.6nmol/L。
(2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比9:99加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置24小时。适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为1000。
所述的适配体链，其核苷酸序列为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG，其5’端由巯基修饰，且末端为碱基A；
所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为：5’SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’，其5’端由巯基修饰；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS（137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM,Na2HPO4·12H2O,2mM KH2PO4）溶液，使PBS的浓度为0.1×，静置10小时。
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入5mol/L氯化钠溶液，静置4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤4次，使氯化钠的终浓度为0.3mol/L。
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置72小时。
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，沉淀加入1×PBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍；最后离心得到的沉淀经1×PBSM重悬即得适配体修饰的纳米银探针。
实施例4：用于检测PDGF-BB的试剂盒。
适配体修饰的纳米银探针实施例1～3的方法合成；
PBS（购自上海生工生物工程有限公司）及Tween-20（购自天津科美有限公司）用于配制洗涤液；
牛血清白蛋白购自北京博奥森生物技术有限公司；
anti-PDGF-BB购自Abcam,USA；
PDGF-BB蛋白购自于R&D Systems,Minneapolis,USA；
氯金酸购自于（上海试剂一厂）；
氢醌购自于（南京试剂有限公司）；
醛基片基购自于（上海百傲科技有限公司）。
所有溶液均用高纯水配制（除有特殊说明）。
实施例5：检测PDGF-BB含量的方法。
利用实施例4的试剂盒检测PDGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤：
(1)配制溶液：
稀释液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS；
洗涤液：1×PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；
阴性对照：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中，得1mg/mL BSA溶液；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液；
底物：用1mg/mL BSA配制所需浓度的anti-PDGF-BB标准样品溶液；
显色剂：10mmol/L氯金酸和2mmol/L氢醌等体积混合；
探针：用1×PBSM溶液配制1.03nmol/L的适配体修饰的纳米银探针；
(2)将anti-PDGF-BB和阴性对照物BSA在醛基片上点样，37℃条件下固定2h；
(3)每孔加入30μL封闭液，在37℃条件下封闭1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(4)在不同的孔中加入16ng/mL-10μg/mL的PDGF-BB标准样品溶液30μL，在其余的孔中加入30μL样品溶液，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；
(5)每孔加入1.03nmol/L适配体修饰的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(6)每孔加入30μL显色剂，避光反应4min，去离子水冲洗3次，拍干；
(7)用扫描仪（Scanmaker i900）扫描，LuxScan3.0芯片图像分析软件对图像进行处理，不同浓度的PDGF-BB标准样品溶液对应不同的灰度值，得到PDGF-BB标准曲线，由标准曲线计算得到样品中PDGF-BB的浓度，结果见图2。图3为显色后的扫描电子显微镜图。
实施例6：PDGF-BB的特异性。
试验方法：
(1)配制溶液：
稀释液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS；
洗涤液：1×PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；
阴性对照：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中，得1mg/mL BSA溶液；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液；
底物：用1mg/mL BSA配制所需浓度的anti-PDGF-BB标准样品溶液；
显色剂：10mmol/L氯金酸和2mmol/L氢醌等体积混合；
探针：用1×PBS溶液配制1.03nmol/L的适配体修饰的纳米银探针；
(2)将anti-PDGF-BB和阴性对照物BSA在醛基片上点样，37℃条件下固定2h；
(3)每孔加入30μL BSA（10mg/mL），在37℃条件下封闭1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(4)在不同的孔中分别加入10%serum+PDGF-BB(50ng/mL)、50ng/mL PDGF-BB、10%serum、50μg/mL人血清白蛋白（HSA）、50μg/mL人免疫球蛋白IgG、1mg/mLBSA各30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(4)每孔加入1.03nmol/L适配体修饰的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(5)每孔加入30μL显色剂，避光反应4min，另外留一些孔不加任何试剂作为对照，去离子水冲洗3次，拍干；
(6)用扫描仪（Scanmaker i900）扫描，得到PDGF-BB特异性的数据,结果见图4。
本发明将纳米银探针应用于PDGF-BB的分析检测中，当PDGF-BB的浓度在1.56ng/mL-100ng/mL，荧光信号强度与浓度具有很好的相关性，相关系数为0.9861。纳米银探针与我们自制的显色剂耦合能显著增强显色信号。在同等的条件下，我们将商品化的银增强试剂与纳米银探针联用，其线性范围为12.50ng/mL-100ng/mL，表明本发明中试剂盒所用显色剂在低浓度区域有显著的优势，线性范围更宽，检测限低于1.56ng/mL。而且此显色体系具有很好的特异性，能特异性识别PDGF-BB，不受复杂体系（如人血清）中其它因素的干扰。
Claims (7)
1.一种适配体修饰的纳米银探针，其特征在于，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链；
其中，所述的适配体链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG；
其中，所述的寡核苷酸链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。
2.权利要求1所述的适配体修饰的纳米银探针的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为1：3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；
(2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比(1～9):(1～99)加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置10～24小时，适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1；
其中，所述的适配体链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG；
其中，所述的寡核苷酸链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1×PBS，静置3～10小时；
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入1～5mol/L氯化钠溶液，静置2～4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1～4次，使得氯化钠的终浓度为0.1～0.3mol/L；
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24～72小时；
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍；最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。
3.根据权利要求2所述的适配体修饰的纳米银探针的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的离心条件为10000～20000rpm条件下离心10～30分钟。
4.权利要求1所述的适配体修饰的纳米银探针在制备检测PDGF-BB的试剂中的应用。
5.一种用于检测PDGF-BB的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下试剂：适配体修饰的纳米银探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20、anti-PDGF-BB抗体、PDGF-BB蛋白、氯金酸、氢醌、牛血清白蛋白、醛基片基。
6.权利要求5所述的用于检测PDGF-BB的试剂盒在检测PDGF-BB蛋白中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用检测PDGF-BB的试剂盒检测PDGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤：
(1)配制溶液：
稀释液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS；
洗涤液：1×PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；
阴性对照：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中，得1mg/mL BSA溶液；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液；
底物：用1mg/mL BSA配制所需浓度的anti-PDGF-BB标准样品溶液；
显色剂：10mmol/L氯金酸和2mmol/L氢醌等体积混合；
探针：用1×PBSM溶液配制1.03nmol/L（原液）的适配体修饰的纳米银探针；
(2)将不同浓度的anti-PDGF-BB抗体溶液、待测样品和阴性对照在醛基片上点样，37℃固定2h；
(3)每孔加入10～50μL封闭液，在37℃条件下封闭1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；
(4)在不同的孔中加入不同浓度的PDGF-BB标准样品溶液30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；在其余的孔中加入30μL样品溶液，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；
(5)每孔加入1.03nmol/L适配体修饰的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；
(6)每孔加入30μL显色剂溶液，避光反应1～8min，去离子水冲洗3～4遍，拍干；
(7)用扫描仪扫描，LuxScan3.0芯片图像分析软件对图像进行处理，不同浓度的PDGF-BB标准样品溶液对应不同的灰度值，得到PDGF-BB标准曲线，由标准曲线计算得到样品中PDGF-BB的浓度。
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