CN109596589A - 一种基于led光源的荧光固相生物芯片检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于LED光源的荧光固相生物芯片检测方法,包括以下步骤:将待测物的抗原或抗体或受体或适配体在PBS缓冲溶液中混合,点样于载体片基的反应区内,再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团;在生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液,在剩余反应孔内分别加入待测物溶液,继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的荧光材料标记的单克隆抗体或适配体反应,洗涤液洗涤;最后用LED光源的荧光分析仪扫描图像并定量计算待测物溶液中检测目标物的含量。本申请检测方法可以大大降低检测成本,适合在基层检测领域推广应用,可满足对临床样品、食品和环境样本中多指标同时进行快速定量检测的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物芯片检测方法,尤其涉及一种低成本基于LED光源的荧光法检测待测样品中多指标残留的固相生物芯片检测方法。
背景技术
现有的生物芯片是指包被在固定载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微阵列,利用生物大分子具有特异相互识别的能力而将他们有序的排列在固相载体基片(孔板、膜、玻璃片,高聚物载体等)上,与检测样品和标记的生物分子同时反应或杂交,经过自动阅读设备可获得大量有用的生物信息。目前生物芯片检测方法主要有荧光法、化学发光法、催化显色法等。由于化学发光法和催化显色法等都需要催化底物反应进行检测,干扰因素较多,而且化学发光法需要冷CCD进行高灵敏检测,因此仪器价格昂贵,不利于在基层检测领域推广。传统的荧光法需要激光作为光源,激光光源虽然具有单色性好,方向性强,光亮度高等优点,但仪器成本同样昂贵,也不利于在基层检测领域推广。LED(LightEmitting Diode),发光二极管,是一种能够直接将电转化为光的固态半导体器件,具有光效高、耗电少,寿命长、易控制、免维护、安全环保,是新一代固体冷光源。
目前有将LED作为光源进行检测应用在液相芯片上,但是其主要检测目的在于检测溶液中总的荧光强度。在固相芯片中,检测的是固相载体上微阵列点的荧光强度,其强度大小远远小于溶液中的荧光强度。对于固相生物芯片,如果采用LED作为光源进行检测,对荧光材料的荧光强度要求高,目前常用的荧光材料的强度太低,均达不到检测灵敏度的要求。如何将LED作为光源进行检测应用到固相芯片,并且可以确保检测效果,是该领域技术人员一直探究的问题。
发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的上述技术问题,本申请提供了一种在确保检测效果的基础上能够降低检测成本的基于LED光源的荧光固相生物芯片检测方法。
技术方案:本申请所述的一种基于LED光源的荧光固相生物芯片检测方法,包括以下步骤:
(1)制作生物芯片:将待测物的抗原或抗体或受体或适配体在PBS缓冲溶液中混合,点样于载体片基的反应区内,再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团;
(2)在上述生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液,在剩余反应孔内分别加入待测样本溶液,继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的荧光材料标记的单克隆抗体或适配体,于20~37℃中反应10~20min,洗涤液洗涤;
(3)用LED光源的荧光分析仪扫描图像,根据检测目标物的荧光强度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线,采用外标曲线法定量,分别计算待测物溶液中检测目标物的含量。
步骤(1)中,所述待测物为病毒、蛋白、基因、毒素、兽药残留、农药残留或重金属。
步骤(1)中,所述载体片基为透明的多孔板、高聚物片基、膜或玻片。
其中,所述的多孔板为24孔板、48孔板、96孔板或384孔板。
步骤(1)中,所述PBS缓冲液的配制:用137mmol/L氯化钠、2.7mmol/L氯化钾、10mmol/L磷酸二氢钠、2mmol/L磷酸二氢钾配制pH 7.4的PBS缓冲液。
步骤(1)中,所述洗涤液为盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。
步骤(2)中,所述荧光材料为无机荧光材料和/或有机荧光材料,其中,所述无机荧光材料选自稀土元素、碱土金属的硫化物和铝酸盐中的一种或多种,有机荧光材料选自有机小分子荧光材料和/或有机高分子荧光材料。
所述荧光材料还可以为聚合量子点、荧光微球或者荧光纳米材料。
优选的,所述荧光纳米材料为荧光材料修饰的纳米金、纳米银、以核酸杂交聚合后的纳米粒子或修饰的纳米粒子为核,利用各种显色剂包裹形成的纳米粒子聚合体。所述荧光微球为包裹荧光的各种微球。
作为一种优选的技术方案,在采用荧光材料修饰的纳米金、纳米银、以核酸杂交聚合后的纳米粒子或修饰的纳米粒子作为荧光材料的情况下,步骤(2)用洗涤液洗涤后,加入显色剂,形成纳米粒子聚合体,然后进行步骤(3)的扫描检测。
优选的,其中所述显色剂为氯金酸/单宁酸体系、氯金酸/氢醌体系、硝酸银/氢醌体系。
步骤(2)中,所述待测样本溶液为临床样品、食品、环境样本,包括血样、尿液、唾液、头发、组织、乳制品、饲料、动物组织、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋、水产品、蔬菜、土壤、水体。
进一步的,所述待测样品溶液的制备方法为:当待测样品为液体时,取50μL~1mL于10mL EP管中,用缓冲液稀释10~100倍即得待测样品溶液;当待测样品为固体时,取粉碎样品5g,加入8mL缓冲液,混合2~5min,置50℃水浴下放置10~30min,离心5~10min,取50μL上清液,加入450μL缓冲液混匀,取50μL~500μL即得待测样品溶液。
有益效果:相比较于现有技术,本申请检测方法结合聚合量子点、荧光纳米材料或者荧光微球标记的高荧光强度材料,利用LED光源的荧光检测仪测得荧光强度值,通过计算荧光强度值得出样品中待测组分的含量,可以大大降低检测成本,适合在基层检测领域推广应用,可满足对临床样品、食品和环境样本中多指标同时进行快速定量检测的要求。
附图说明
图1为显色剂包裹形成的纳米粒子聚合体在芯片表面的扫描电子显微镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
适配体和荧光材料标记的寡核苷酸链修饰的纳米银探针的制备方法:
(1)在冰浴条件下,将10mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至30mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(2)将不同的适配体链和荧光材料标记的寡核苷酸链按摩尔比1:1加入步骤(1)得到的纳米银溶液中,静置24小时,适配体链和荧光材料标记的寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为100:1;
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1×PBS,静置6小时;
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入5mol/L氯化钠溶液,静置2小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤3次,使得氯化钠的终浓度为0.3mol/L;
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置72小时;
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤3次,1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的2倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶重悬即得备用探针。
实施例2
一种基于LED光源的荧光固相生物芯片检测方法,包括以下步骤:
(1)制作生物芯片:将待测物的抗原在PBS缓冲溶液中混合,点样于载体片基的反应区内,再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团;
(2)在上述生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液,在剩余反应孔内分别加入待测样本溶液,继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的实施例1制备的适配体和荧光材料标记的寡核苷酸链修饰的纳米银探针,于37℃中反应20min,洗涤液洗涤;再用显色液10mmol/L氯金酸和2mmol/L氢醌等体积混合进行显色,使纳米银探针形成纳米粒子聚合体;
(3)用LED光源的荧光分析仪扫描图像,根据检测目标物的荧光强度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线,采用外标曲线法定量,分别计算待测物溶液中检测目标物的含量。
实施例3
相比较于实施例2,本实施例将步骤(2)的显色剂换成:10mmol/L氯金酸和10mmol/L单宁酸等体积混合进行显色,使纳米银探针形成纳米粒子聚合体。其余操作同实施例2。
实施例4
相比较于实施例2,本实施例将步骤(2)的显色剂换成:10mmol/L硝酸银和20mmol/L氢醌等体积混合进行显色,使纳米银探针形成纳米粒子聚合体。其余操作同实施例2。
用实施例2-4的方法对人IgE和PDGF-BB进行分析检测
实施例2方法检测结果:当人IgE的浓度在50ng/mL-5000ng/mL和PDGF-BB的浓度在15.6ng/mL-1000ng/mL,信号强度与浓度具有很好的相关性,相关系数分别为0.9813和0.9861。由此可见,纳米银探针与显色剂联合使用能显著增强荧光信号,实施例2显色剂包裹形成的纳米粒子聚合体在芯片表面的扫描电子显微镜图,如图1所示。
实施例3方法检测结果:当人IgE的浓度在80ng/mL-8000ng/mL和PDGF-BB的浓度在40ng/mL-2000ng/mL,信号强度与浓度具有很好的相关性,相关系数分别为0.9716和0.9768。
实施例4方法检测结果:当人IgE的浓度在60ng/mL-6000ng/mL和PDGF-BB的浓度在20ng/mL-1000ng/mL,信号强度与浓度具有很好的相关性,相关系数分别为0.9815和0.9871。
对比例1
一种基于LED光源的荧光固相生物芯片检测方法,包括以下步骤:
(1)制作生物芯片:将待测物的抗原在PBS缓冲溶液中混合,点样于载体片基的反应区内,再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团;
(2)在上述生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液,在剩余反应孔内分别加入待测样本溶液,继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的实施例1制备的适配体和荧光材料标记的寡核苷酸链修饰的纳米银探针,于37℃中反应20min,洗涤液洗涤;
(3)用LED光源的荧光分析仪扫描图像,根据检测目标物的荧光强度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线,采用外标曲线法定量,分别计算待测物溶液中检测目标物的含量。
用上述方法对人IgE和PDGF-BB进行分析检测,当人IgE的浓度在500ng/mL-50μg/mL和PDGF-BB的浓度在200ng/mL-20μg/mL,信号强度与浓度具有很好的相关性,相关系数分别为0.9713和0.9661。
本方法与实施例2相比,没有加显色液,不能使纳米银探针形成纳米粒子聚合体。因此,方法检测的浓度明显的提高,而方法灵敏度降低了近10倍。
实施例5
一种基于LED光源的荧光固相生物芯片检测方法,包括以下步骤:
(1)制作生物芯片:将待测物的抗原在PBS缓冲溶液中混合,点样于载体片基的反应区内,再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团;
(2)在上述生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液,在剩余反应孔内分别加入待测样本溶液,继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的包裹有罗丹明B的二氧化硅荧光微球标记的抗体,于37℃中反应20min,洗涤液洗涤;
(3)用LED光源的荧光分析仪扫描图像,根据检测目标物的荧光强度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线,采用外标曲线法定量,分别计算待测物溶液中检测目标物的含量。
用上述方法对乳铁蛋白进行分析检测,当乳铁蛋白的浓度在500ng/mL-50μg/mL时,信号强度与浓度具有很好的相关性,相关系数为0.9623。
实施例6
一种基于LED光源的荧光固相生物芯片检测方法,包括以下步骤:
(1)制作生物芯片:将待测物的抗原在PBS缓冲溶液中混合,点样于载体片基的反应区内,再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团;
(2)在上述生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液,在剩余反应孔内分别加入待测样本溶液,继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的聚合Cd量子点标记的抗体,于37℃中反应20min,洗涤液洗涤;
(3)用LED光源的荧光分析仪扫描图像,根据检测目标物的荧光强度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线,采用外标曲线法定量,分别计算待测物溶液中检测目标物的含量。
用上述方法对氟苯尼考进行分析检测,当氟苯尼考的浓度在100ng/mL-5μg/mL时,信号强度与浓度具有很好的相关性,相关系数为0.9801。
Claims (10)
1.一种基于LED光源的荧光固相生物芯片检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制作生物芯片:将待测物的抗原或抗体或受体或适配体在PBS缓冲溶液中混合,点样于载体片基的反应区内,再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团;
(2)在上述生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液,在剩余反应孔内分别加入待测样本溶液,继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的荧光材料标记的单克隆抗体或适配体,于20~37℃中反应10~20min,洗涤液洗涤;
(3)用LED光源的荧光分析仪扫描图像,根据检测目标物的荧光强度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线,采用外标曲线法定量,分别计算待测物溶液中检测目标物的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(2)中,所述荧光材料为无机荧光材料和/或有机荧光材料,其中,所述无机荧光材料选自稀土元素、碱土金属的硫化物和铝酸盐中的一种或多种,有机荧光材料选自有机小分子荧光材料和/或有机高分子荧光材料。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述荧光材料为聚合量子点、荧光微球或者荧光纳米材料。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于,所述荧光纳米材料为荧光材料修饰的纳米金、纳米银、以核酸杂交聚合后的纳米粒子或修饰的纳米粒子为核,利用各种显色剂包裹形成的纳米粒子聚合体。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述显色剂选自氯金酸/单宁酸体系、氯金酸/氢醌体系、硝酸银/氢醌体系。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述待测物为病毒、蛋白、基因、毒素、兽药残留、农药残留或重金属。
7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述PBS缓冲液的配制:用137mmol/L氯化钠、2.7mmol/L氯化钾、10mmol/L磷酸二氢钠、2mmol/L磷酸二氢钾配制pH7.4的PBS缓冲液。
8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述洗涤液为盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。
9.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(2)中,所述待测样本溶液为临床样品、食品、环境样本,包括血样、尿液、唾液、头发、组织、乳制品、饲料、动物组织、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋、水产品、蔬菜、土壤、水体。
10.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述待测样品溶液的制备方法为:当待测样品为液体时,取50μL~1mL于10mL EP管中,用缓冲液稀释10~100倍即得待测样品溶液;当待测样品为固体时,取粉碎样品5g,加入8mL缓冲液,混合2~5min,置50℃水浴下放置10~30min,离心5~10min,取50μL上清液,加入450μL缓冲液混匀,取50μL~500μL即得待测样品溶液。
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