JP2005509858A - 体液サンプル由来の混合被検体の多重フロー・サイトメトリー分析方法および装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、試験サンプル、特に体液中の複数被検体を同時に自動的に分析するための反応混合液、方法および装置に関する。本発明は、特に、一般的な臨床化学の分野に関するが、他の利用分野でも用途があるかもしれない。

Description

本発明は、試験サンプル中の複数被検体を同時に自動的に解析するための被検体試薬の混合物と、方法および装置とに関する。本発明は特に、一般的な臨床化学の分野に関するが、他の分野にも用途があるかもしれない。

一般に患者の病状は身体の化学的状態に反映する。したがって、診断医学は、疾患の状態または異常の指標として役立つ多数の試験物質の存在および／または濃度を測定するためのさまざまな分析技術を開発してきた。生命が非常に複雑であること、そして、検出および／または定量的な測定によって、想定される疾患状態または病状を識別または除外するうえで役立つ場合がある物質は、数多く多様であることから、多数の異なる試験を行う必要があるのが一般的である。しかし、多数の異なる試験を行う必要性は、意味のある試験結果を得るために要する時間および努力と、これに伴う分析試験の費用とを増やす。さらに、複数の分析試験を行う需要は、試験を行う者に大量の試験サンプルまたは複数のサンプルを得ることを要求するが、これは困難あるいは不可能な場合がある。

試験の手順の高度複雑化および試験結果の重要性のために、一般に、かかるアッセイを実施するためには非常に熟練した人材を用いる必要があるが、これもかかる試験のコストを上昇させる。そのような場合であっても、不正確な試験結果につながる人間の誤りの可能性は完全には除外できない。

自動分析システムの開発は従来から試みられてきた。従来の一般的な化学システムはバルク溶液（ｂｕｌｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で１度に１つの被検体をアッセイする。このタイプの単一試験・単一アッセイ型のデザインの結果、試験サンプルの数（システムのスループット）と試験される被検体の数（システムのメニュー）とが増大するにつれて、システムの複雑さは増大する。別々の試薬がそれぞれの試験ごとに必要なのが典型的であるため、多数の異なる試薬の在庫を維持する必要があり、別々の試薬を添加するステップ（例えば、ピペット処理のステップ）がそれぞれの試験のシリーズごとに必要である。複数アッセイを逐次的に実行することはサンプル処理時間を長くする。

最近、単一の試験サンプル中の複数の被検体を同時に分析するシステムが示唆されてきた。例えば、ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｎｇｈらの以下の特許文献１を参照せよ。特許文献１は、前記サンプル中のそれぞれの被検体の濃度に応じて変化する光学特性を有する異なるタイプのレポータービーズを試験サンプルと混合すること、および、前記レポータービーズの光学特性をフロー・サイトメーターで測定することを提唱する。蛍光および吸光度が、測定される光学特性として言及されている。被検体のメニューは限られていて、尿、クレアチニンその他多数の重要な臨床的に関係のある被検体について如何にアッセイするのかの詳細は提供されていない。したがって、このシステムは完全な化学的分析を行うことを考慮に入れていない。
米国特許第５，７４７，３４９号明細書

別の多重システムが、「臨床検体の多重分析 装置と方法」と題するＣｈａｎｄｌｅｒらの以下の特許文献２に説明されている。この文書は、試験サンプルに曝されたビーズのセットのフロー・サイトメトリー分析を提唱している。前記ビーズのセットの各メンバーは、該セットの他のメンバーと個々に区別可能なように、そして、関心のある特定の被検体に反応するように設計されることが意図されており、前記関心のある特定の被検体とは、抗原、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸配列および／または酵素の場合がある。このシステムにおいては、前記サンプル中のそれぞれの関心のある被検体の識別および定量は、前記粒子の分類に関するデータを実質的に同時に収集すること、前記粒子と、該粒子に特異的な被検体との複合体形成または反応に関するデータを収集すること、前記粒子を分類すること、および、各粒子に結合した被検体の量を実時間で定量することによって決定される。このアプローチは理論的には原則として期待が持てるものであるが、実現が困難で、実質的に同時に実時間で分析および定量をすることは、異常な極端な測定値を除くための測定値の分布の統計的な分析を排除することになるので、不正確になることを免れない。さらに、被検体の選択範囲（ａｎａｌｙｔｅ ｐａｌｅｔｔｅ）が限られていて、多くの症例で重要な、アルカリ金属イオンのような電解質や、グルコースのような低分子代謝物（ｓｍａｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）分子の分析のための配慮がされていない。その結果、この先行技術の大変な努力にもかかわらず、複数の試験を、しばしば複数の試験サンプルで実施する必要性がまだあり、単一のサンプル中の医学的および／または生物学的に関心のある広範囲の被検体を確実に分析することができる、実用的で自動化されたシステムの必要性がまだ存在する。
米国特許第５，９８１，１８０号明細書

発明の概要
単一の試験の手順において複数の被検体の同時測定を可能にする、アッセイ方法、アッセイ装置およびアッセイ試薬を含むアッセイシステムを提供することが本発明の利点である。

本発明の別の利点は、体液サンプル中の電解質および／または低分子代謝物を含む複数の日常的で一般的な化学的被検体の分析を行うために特に適する多重アッセイシステムを提供することである。

本発明の別の利点は、ミニチュア化に向いていて、非常に少量の試験サンプルの分析を促進するアッセイシステムを提供することである。

先行技術のシステムより簡便でメンテナンス作業を要しないアッセイシステムを提供することが本発明の利点である。

本発明の別の利点は、試験サンプルの完全な分析を行うために検査室が在庫しておかなければならない試薬の数を最小にとどめるアッセイシステムを提供することである。

本発明のまた別の利点は、対費用効果のあるやり方で試験サンプルの完全な分析を提供することができるアッセイシステムを提供することである。

本発明の別の利点は、先行技術の自動化システムよりも短時間に低コストで臨床サンプルの完全な化学分析を実行することができるアッセイシステムを提供することである。

本発明の別の利点は、臨床サンプル中の複数の被検体を感染にアッセイするために、１回のサンプル移送（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ステップと１回の試薬移送ステップだけしか必要としないアッセイシステムを提供することである。

これらおよびその他の本発明の利点は、以下に説明され、請求の範囲に記載される、方法、装置および試薬の混合物によって達成される。

本発明は、特定の被検体を定量的に検出するように仕立てられた異なるクラスの粒子または「ビーズ（ｂｅａｄ）」を含む、試薬の混合物または「カクテル」を用いる。この試薬粒子の混合物は、試験サンプルと十分な時間インキュベーションされて、該サンプル中に関心のある被検体が存在する場合には、前記粒子が該被検体のそれぞれと複合体形成または反応することを可能にする。その後、前記試薬粒子の混合物は、各タイプの粒子の数と、関心のある特定の被検体と複合体形成または反応した各タイプの粒子の割合とを定性的および／または定量的に測定するために、フロー・サイトメトリーまたはこれに類する個々の粒子の特性を測定する技術に供される。

前記粒子またはビーズそのものは、関心のある被検体に対する結合剤または反応剤と、前記関心のある被検体との結合または反応の有無を指示するための指示薬または信号試薬（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）との結合を可能にするように官能基化された、商業的に入手可能なポリスチレンラテックス粒子であってもよい。懸濁または分散重合法により作出された、アクリル酸またはメタクリル酸誘導体粒子であってもよい。その他の考えられるビーズまたは粒子の出所は、ヒドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）ポリマー粒子と、重合ミセル粒子と、キャストフィルムの粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｔ ｆｉｌｍｓ）により製造された粒子と、水性乳剤の光重合により製造された粒子と、米国特許第４，３０２，１６６号および第４，１６２，２８２号明細書に説明されたソルベントキャスト法（ｓｏｌｖｅｎｔ ｃａｓｔｉｎｇ）により製造された粒子とを含む。ビーズのサイズは、典型的には、約０．１μｍから約５０μｍまでの範囲であるが、約１μｍから約２０μｍまでの範囲であることが好ましい。ビーズの密度は、０．５から２．０ｇ／ｍＬまでの範囲であることが典型的である。このサイズおよび密度の組み合わせは、センサービーズの水性懸濁液を、ピペット、ポンプ、バルブ等のような液体移送器具によって運搬可能な単純な液体として取り扱うことを可能にする。したがって、前記粒子は従来の液体移送技術によって水性懸濁液状態で自由に輸送可能である。

他の粒子状センサーとの相互作用を効果的に阻止する（類似の荷電状態とか界面活性剤の存在のような）手段を含むことは前記ビーズまたは粒子にとって都合がよい。これは、装置を詰まらせる粒子の凝集塊（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅ）の形成と、異なるタイプの粒子の間での干渉との両方の阻止を含む。

前記粒子は、適当な数（すなわち１０，０００個未満）の測定をするとアッセイ結果の偏差が臨床的に受け入れられる範囲に収まる程度に特性が均質でなければならない。

ここで用いられるところのビーズまたは粒子の「タイプ」とは、特定の被検体と同じやり方で相互作用する全ての粒子を指す。もちろん、試薬の混合物が、異なるやり方で同じ被検体と相互作用する、２または３以上の異なるタイプの粒子を含む場合がある。それぞれのタイプの粒子は、該粒子タイプを固有に識別することができるコード化指標（ｃｏｄｉｎｇ ｉｎｄｉｃｉａ）を取り込んでおり、その結果、前記分析システムが前記粒子由来の測定信号を前記ビーズが相互作用する特定の被検体に割り当てることを可能にする。粒子の標識化またはコード化は、前記粒子に結合した蛍光色素由来の蛍光強度と、前記粒子に結合した複数の蛍光色素由来の蛍光強度の比と、前記粒子に結合した１または２以上の蛍光色素の蛍光波長と、前記粒子のサイズと、前記粒子の相対的な数と、上記の特性のいずれかの組み合わせとのような、検出可能な粒子の特性を変えることによって達成されることがある。もちろん、「検出可能な信号」は光がないことであってもよい、すなわち、蛍光原子団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）が消光して、光を発生しない場合がある。磁性材料のような他の検出可能な特性を有する材料を添加することによって前記粒子をコード化することも可能である。有用なコード化計画についての追加情報は、Ｆｕｌｗｙｌｅｒの米国特許第４，４９９，０５２号明細書と、コールター・エレクトロニクスの英国特許第１，５６１，０４２号明細書と、Ｔｒｉｐａｔｚｉｓの欧州特許第１２６４５０号明細書とに記載されている。

第１のクラスのビーズまたは粒子は、電解質、すなわち、試験サンプル中に存在するイオンを測定するように設計される。第１のクラスの粒子は、イオノフォアその他の成分を取り込んで、特定のイオンが結合すると信号を発生する「光化学センサー（ｏｐｔｏｄｅ）」を生成する、アルキル化アクリル酸、塩化ポリビニルまたはポリスチレンのビーズでできている。軟質塩化ポリビニル（ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｄ ＰＶＣ）のビーズは特に適することが証明されている。前記「光化学センサー」粒子によって特異的に標的にされることがある生物学的に関連するイオンは、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、塩素および二酸化炭素（炭酸）を含む。粒子のサイズのような標識か、１または２以上の蛍光マーカーか、粒子のタイプを識別する、粒子のサイズと蛍光マーカーとの組み合わせかに加えて、前記ビーズは、該ビーズ上またはビーズ内のイオノフォア分子が関心のある被検体と複合体を形成するとき、蛍光波長または強度の変位を生じる蛍光指示薬または信号試薬を結合しているか含んでいる。前記光化学センサーは、デテクタ・イオノフォアと、レポーター・イオノフォアと、イオン部位（ｉｏｎｉｃ ｓｉｔｅ）とを含む、疎水性のバルク相である。水性のサンプル由来のイオンは有機相に拡散して前記イオノフォアと複合体を形成し、該イオノフォアはかわりにプロトンその他のイオンを転送して、荷電の中性状態を保ち、検出可能な蛍光信号を発生する。有用なイオノフォア材料を含む光化学センサー粒子は、「ピペット処理可能な（ｐｉｐｅｔｔｅａｂｌｅ）イオン検出器および方法」という名称の米国特許第６，１６５，７９６号明細書に開示されており、この開示内容は引用によりここに取り込まれる。例えばカリウムイオン用には、イオノフォアはバリノマイシン（ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）の場合があるが、これは既知の脂溶性でカリウム選択的なイオノフォアである。アンモニア用に適当なイオノフォアは、モナクチン（ｍｏｎａｃｔｉｎ）で、ナトリウム用にはＮ，Ｎ，Ｎ＝，Ｎ＝−テトラシクロヘキシル−１，２−フェニレンジオキシジアセトアミド（ＥＴＨ２１２０）であり、カルシウム用にはＥＴＨ１００１で、塩素用にはクロロ（オクタエチルポルフィリナート）インジウムである。蛍光波長または強度を検出するためにフロー・サイトメーターを用いることにより、前記粒子が標的イオンと複合体を形成しているか否かを決定することができ、試験サンプル中に存在するかかるイオンの量を決定することができる。イオノフォアおよび指示薬が単一分子の一部である場合（１成分システム）もあれば、イオノフォアと指示薬とが前記粒子上または粒子内に分布する別々の分子である場合（２成分システム）もある。

第２のクラスの粒子は、低分子代謝物分子、例えばグルコース、果糖、乳糖またはガラクトースのような糖質を測定するために設計される。他の関心のある低分子代謝物分子は、例えば、アンモニア、尿素、尿酸、コレステロール、鶏グリセリド、エタノール、乳酸、サリチル酸塩、アセトアミノフェン、ビリルビンおよびクレアチニンを含む。第１のクラスの粒子と同様に、この第２のクラスの粒子のそれぞれは、粒子の特定のタイプを固有に識別する識別標識を有する。さらに、第２の粒子は、関心のある被検体に特異的に結合して、該被検体、例えば、グルコースに結合するとき蛍光を生じる発信リガンド（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）分子を表面に固定化している。このタイプの発信リガンドの例は、米国特許第５，５０３，７７０号および第５，７６３，２３８号明細書に開示されている。さらなる例は、光誘導電子転移蛍光センサー分子という名称の本願と出願承継人が共通の同時係属の米国特許出願に開示されている。水相のリガンドは疎水性粒子の表面に結合するか、親水性粒子の内部に分布することがある。有機相を要求するリガンドは、疎水性粒子の内部に分布することができる。グルコースのような糖質用に特に好ましい発信リガンド分子は、２つの４級アミン基を介する非蛍光性のスペーサリンカー（ｓｐａｃｉｎｇ ｌｉｎｋｅｒ）領域によって連結された２重のフェニルボロン酸構造（ｄｕａｌ ｐｈｅｎｙｌ ｂｏｒｏｎａｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を含む。前記４級アミン基のうちの一方は、糖質分子が前記ボロン酸基と複合体を形成するとき、例えば蛍光性になるように蛍光特性を変化させて、近赤外領域の光による励起に応答する構造の原子団を結合するのにも用いられる。前記ボロン酸基が前記糖質のシスのジオールに結合するとき、その結果前記ボロン酸基の酸性増大してが蛍光原子団から荷電を引き去り、それにより蛍光を増大させる。このようにして、蛍光信号発生が被検体の結合と結びつけられる。もう一方のアミノ基は、前記発信リガンド分子を前記粒子上に固定するアンカー原子団に結合するために用いられる。異なる被検体に対する前記発信リガンドの特異性は、前記スペーサリンカーのサイズおよび／または立体配置を調整して、前記ボロン酸基の間隔および方向を前記関心のある被検体に適合するように適応させることによって、変えることができる。

低分子代謝物分子の分析用の代替的なセンサー粒子は、非発信リガンド（ｎｏｎ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）と代謝物の標識類似体とを競合結合アッセイの形式で使用する。前記非発信リガンドは、前記発信リガンドと非常に類似するが、蛍光原子団がない。これらのリガンドは、被検体か、標識類似体かのいずれかに、反応混合液中の相対濃度に比例して結合する。したがって、粒子に結合した標識の量は、反応混合液中のサンプルの量に反比例する。粒子状センサーは直径が０．１μｍから５０μｍまでの範囲であり、好ましくは、１μｍから２０μｍまでの範囲である。前記センサーの密度は０．５から２．０ｇ／ｍＬまでの範囲内である。この範囲は、センサーをポリスチレンまたは塩化ポリビニルのようなプラスチックで作ることによって容易に達成できる。このサイズと密度との組み合わせが、ピペット、ポンプおよびある種のバルブのようなたいていの液体移送器具によって、単純な液体として懸濁されたセンサーを取り扱うことを可能にする。

粒子状センサーは、関心のある被検体に応答して、該被検体と可逆的に結合することにより信号を発生する。前記被検体の標識類似体は、該被検体と有限の結合部位をめぐって競合する。結合した検出可能な標識類似体の量は、反応混合液中の被検体濃度に反比例する。この手順は、以下のグルコース検知粒子に関する実施例において示される。

第３のクラスの粒子は、酵素、すなわち、レセプター分子に結合して生物活性を媒介するタンパク質を測定するために設計される。測定可能な酵素の例示は、アルカリフォスファターゼ、アラニン・アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチンキナーゼ、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびリパーゼを含む。この第３のクラスの粒子に適する材料は、「ラテックス」粒子またはポリスチレンビーズを含むが、限定されない。上記のとおり粒子の特定のタイプを固有に識別する粒子の標識に加えて、前記粒子は、標的酵素の活性に応答して信号を発生する蛍光性の基質を表面に固定している。前記蛍光性基質は、関心のある被検体に対する特異的な結合部位を含み、タンパク質に結合するときに蛍光特性が変位する分子であるかもしれず、あるいは、前記基質は、酵素の作用を受けるとき、蛍光特性の変位が起こる物質であるかもしれない。例えば、血清酵素アルカリフォスファターゼは、４−メチルウンビリフェロンリン酸（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｉｌｌｉｆｅｒｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を指示薬または信号試薬として取り込んだビーズを用いて、測定する場合がある。はじめは非蛍光性であったこの材料がアルカリフォスファターゼによって脱リン酸化されるときに起こる電荷の転移によって、生成した分子は蛍光性になる。別の例は、アルファ−アミラーゼという酵素で、これは、３−（２−ヒドロキシエチル）インドールと、５−（２−アミノエチルアミノ）−１−ナフタレンスルホン酸との蛍光性構造がＰａｙｒｅら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３４巻、（１１号）：１２３９−４１頁（１９９５年）に説明されるとおりに両端に結合された、マルトペンタオースを含む指示薬基質を用いて検出される場合がある。この基質は、糖質の非還元末端でラテックス粒子に連結される場合がある。前記アミラーゼ酵素による糖鎖の切断は、色素原子団の間での共鳴エネルギーの転移を妨げ、蛍光の著しい低下をもたらす。他のクラスの粒子と同様に、特定の粒子の識別と、関心のある被検体酵素に結合した粒子がある場合には、その割合とは、フロー・サイトメトリーまたはこれに類する個々の粒子の特性を測定する技術によって決定することができる。

第４のクラスの粒子は、抗体または抗原を測定するために設計される。他のクラスの粒子と同様に、これらの粒子は、サイズか、１または２以上の蛍光色素か、その両方かによって独自に標識されているので、粒子のタイプはフロー・サイトメトリーによって識別できる。さらに前記粒子は、試験サンプル中の関心のある抗原の存在を測定することを望む場合には、表面に特異的な抗体が固定され、サンプル中の抗体の存在を測定することを望む場合には、関心のある抗体が特異的に結合する抗原が表面に固定される。検出される場合がある抗原の例は、ミオグロビン、トロポニンＩおよびＣＫ−ＭＢを含む。蛍光標識で標識された測定されるべき抗原または抗体の類似体がシステムに加えられることもあり、抗原または抗体アッセイは、競合結合アッセイとして実行されることがある。代替的には、前記抗原または抗体の異なるエピトープに結合し、蛍光標識で標識された、２次抗体がシステムに加えられることもあり、アッセイがサンドイッチアッセイとして実行されることもある。前記競合型免疫アッセイのアプローチは低分子には好ましいが、その理由は、サンドイッチアッセイのアプローチは分子上に２つの結合部位が存在する必要があるが、これは低分子では存在しないか、あるいは、立体的障害を起こす場合があるからである。有用な抗体／抗原ビーズの例は、Ｓａｕｎｄｅｒｓの米国特許第４，６６５，０２０号明細書と、Ｆｅｒｔらの同時係属中の米国特許出願第０９／１５４，２４８号明細書に開示されている。

反応混合液中に存在する場合がある第５のクラスの粒子は、例えば遺伝子またはメッセンジャーＲＮＡのような、関心のある特異的なポリヌクレオチド配列を検出および／または測定するために設計される。かかる粒子は、ＨＩＶのようなウイルスの存在の試験や、嚢胞性繊維症の原因となる突然変異の１つのような遺伝的突然変異の試験に有用かもしれない。これらの粒子は、各粒子のタイプが反応混合液中に存在する他のタイプの粒子から区別できるように標識されている以外に、関心のあるポリヌクレオチド配列に相補的で、結果的に適当なハイブリダイゼーション条件下で雑種形成をすることができるポリヌクレオチド配列を表面に固定している。前記システムは、２本鎖ＤＮＡには結合するが１本鎖ＤＮＡには結合しないので、フロー・サイトメーターが、雑種形成をしたＤＮＡ配列を有するビーズと、前記固定された１本鎖ポリヌクレオチドだけを有する未反応のビーズとを区別することができる、蛍光標識タグを含む。代替的には、蛍光標識で標識された関心のあるポリヌクレオチド配列の類似体が前記システムに追加され、アッセイが競合結合アッセイとして実行される場合がある。ＤＮＡ配列の分析に特に適応した粒子の例は、Ｆｕｌｔｏｎの米国特許第５，７３６，３３０号および第６，０５７，１０７号明細書に開示されている。

本発明の反応混合液は、上記の一般的なクラスのうち２以上のタイプの粒子を含む場合がある。例えば前記反応混合液は、サンプル中のカリウムイオンの存在を定量的に測定するように設計されたビーズを、カルシウムイオンを定量的に測定するように設計された他の粒子とともに含む場合があり、あるいは、前記反応混合液は、サンプル中のグルコース量を測定するように設計されたビーズを、尿素を測定する他の粒子とともに含む場合がある。

本発明は、本発明の反応混合液が上記の最初の２つのクラスのそれぞれのビーズを含むことを意図する。一般に、電解質および代謝物のアッセイの重要性のため、本発明の反応混合液はこれらのクラスのそれぞれから選択されたビーズの少なくとも１つのタイプを含むであろう。酵素、抗体または抗原、および／またはＤＮＡ配列の測定に向けられたクラスのそれぞれから少なくとも１つのビーズが含まれるべきである。共通に関心のある全ての被検体を測定するように設計されたビーズを含む反応混合液を提供して、たった１つの反応混合液を用いる単一の試験を全ての被検体について使うことができ、複数の試験を実施したり、異なる反応混合液の別々の補充備蓄を維持したり、フロー・サイトメーターに使用する試薬溶液を交換したりする必要をなくすようにすることが本発明の意図であることは理解されるべきである。好ましい実施態様では、本発明の反応混合液は上記の５つのクラスのビーズの全てを含む。

既知の蛍光色素が、フロー・サイトメーターで識別するための個々のタイプのビーズを標識するために、用いられることがある。疎水性で、安定で、この目的に使用可能な適当な蛍光色素の例は、ＩＲ７９２（［２−［２−［３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−インドール−２−イリジン）エチリジン］−２−（フェニルチオ）−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルインドーリウム過塩素酸］）、ＩＲ７６８（［２−［２−［３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−インドール−２−イリジン）エチリジン］−２−フェノキシ−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルインドーリウム過塩素酸］）、ＹＬ２２（ヨード［２−［２−［３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリジン）エチリジン］−２−（フェニルチオ）−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルベンゾインドーリウム］）、ＩＲ７８０（［２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−インドール−２−イリジン）エチリジン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルインドーリウム過塩素酸］）、ＪＭ５４８８−４８（ヨード［２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−デカニル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリジン）エチリジン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−デｋニルベンゾインドーリウム］）、ＪＭ５４８８−７２（ヨード［２−［２−［−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−デカニル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリジン）エチリジン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−デカニルベンゾインドーリウム］）、ＩＲ１４０およびＩＲ１４３の命名表記により知られたものと、これらの誘導体とを含む。個々の色素か、異なる量または割合の色素の組み合わせかが、粒子サイズ特性と任意的に組み合わせて、前記ビーズ混合物中の各タイプの粒子の固有識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）を提供するために用いられる場合がある。これは、本願と出願承継人が共通するＢｅｌｌらによる「被検体検出システム」という名称の同時係属の出願（代理人Ｓｈｅｌｄｏｎ ＆ Ｍａｋ事務所管理番号１３５９９、出願日＿＿＿＿＿、出願番号＿＿＿＿）にさらに詳細に説明され、引用によりここに取り込まれる。

関心のある被検体との複合体形成または反応を指示するために用いられることがある好ましい色素の構造は、Ｃｙ５、ジベンゾＣｙ５、Ｃｙ７およびジベンゾＣｙ７という表記で知られるシアニン色素と、ＥＴＨ５２９４のようなナイル・ブルーの誘導体とを含む。これらの色素が反応混合液中の各タイプのビーズに特有である必要はない。むしろ、異なるタイプのビーズはそれら自体がそれぞれ識別のために固有の標識を施されているのであるから、そのビーズは関心のあるそれぞれの被検体と複合体を形成しているのか、あるいは、反応したのかどうかを表示するために、同一の色素が複数の異なるタイプのビーズに使用されることもある。

個々のタイプのビーズを標識し、あるいは、関心のある被検体との複合体形成または反応を表示するために有用な蛍光色素のさらなる例は、当業者に知られている。例えば、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、蛍光プローブおよび研究用試薬のハンドブック第５版（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，５^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、１９９２年を参照せよ。

使用の際に、試薬の混合物は水性懸濁液に懸濁される。かかる懸濁液は、ピペット処理により容易に取り扱うことができる。安定な試験条件を確保するために、試薬ビーズ混合液にバッファーを添加することが望ましい。この点で、電解質および／または低分子代謝物分子の分析と干渉するナトリウム、リン酸または尿素を含まない、ＨＥＰＥＳバッファーのようなバッファーを用いることが好ましい。

好ましい本発明のアッセイの読みとり技術はフロー・サイトメトリーで、粒子は、読みとり装置を通過して流れる際に、個別に読みとられる。読みとるとき、前記粒子は、コード化指標による識別と、それぞれの被検体との相互作用の測定とが両方とも行われる。したがって、測定結果を関係する被検体に適切に割り当てることができる。これは、異なる被検体に対する試薬粒子を単一の反応混合液で混合することおよび単一の試験サンプル中で複数の被検体を同時に分析することを可能にする。

フロー・サイトメトリーは、試験液中に懸濁された試薬ビーズと、該試験液の他の成分とを容易に区別できるので、本発明のアッセイ手順を実行するために用いられるフロー・サイトメーターは、試験ビーズに結合した蛍光構造と、試験培地に未結合型で存在する同一または類似の構造とを弁別できる。その結果、試験サンプルとのインキュベーションの後、フロー・サイトメーターを通す前に、ビーズを洗浄することは必須ではない。これは、分析をする前に過剰の試薬を除去するために基質の洗浄を必要とする先行技術の手順と比べて、本発明のアッセイは貴重な簡便化が図られていることを意味する。

本発明を実施するために用いられる装置は、分析される試験サンプルを導入するための既知の手段、すなわち、関心のある被検体のそれぞれを測定するように設計されたビーズを含む、試薬ビーズ混合物を導入する手段と、前記サンプルと反応混合液との反応を可能にするインキュベーション・チャンバーまたは容器と、通過する各ビーズのビーズ標識を読みとってビーズのタイプおよび関心のある被検体を識別するため、および、各ビーズに結合した蛍光指示薬を読みとって該ビーズがどの程度それぞれの関心のある被検体と複合体形成または反応をしたかを決定するためのフロー・サイトメーター読みとりセルとを含む。任意的に前記装置は、試験サンプルのインキュベーションと読みとりセルの通過との間にビーズを洗浄するための洗浄装置を含む場合もあるが、上記のとおり、これは必須ではない。前記読みとりセルは、ビーズのタイプおよび関心のある被検体を決定するためにビーズの標識またはコードを読みとる、第１のレーザまたはコード化レーザと、第１のデテクタとを含み、各ビーズに結合する蛍光指示薬を読みとる第２のレーザまたはアッセイレーザと、第２のデテクタとを含む場合もある。代替的には、単一のレーザが両方の機能を果たす場合もある。追加のデテクタがそれぞれのレーザに付属する場合もある。かかる追加のデテクタは、異なる蛍光色素由来の信号が区別されるように、限られた範囲内の波長の光に敏感なこともある。例えば、約６３５ｎｍの波長の光を発生する１５ｍＷのダイオードレーザが、第２のレーザとして効果的に使用できる。有利な第１のレーザは、例えば、約７８５ｎｍの波長の光を発生する３０ｍＷのダイオードレーザの場合がある。これらの波長は、近赤外波長の範囲内に該当し、通常フロー・サイトメトリーに用いられる波長より少し長いが、血清その他の生物学的なサンプルに天然に存在する物質によって生じる可視光の範囲での干渉のおそれを回避するので、本発明には特に有用である。近赤外波長の範囲での作業は、従来のガスレーザよりも著しく安価なレーザダイオードの使用を促進する。デテクタは光電子増倍管またはフォトダイオードの場合がある。フォトダイオードは、固体であるという性質がミニチュア化および動作の信頼性を促進するためと、近赤外範囲の長波長でよりうまく動作するためとの両方の理由で好ましい。

フロー・サイトメトリーで知られているとおり、粒子サイズを決定するために、前方散乱信号と側方散乱信号とは、単独で用いられるか、あるいは、併用される場合がある。

本発明の反応混合液を用いて本発明の方法および装置によって分析される場合がある、試験サンプルの例は、全血液、血清、血漿、リンパ液、脊髄液、涙、粘液、唾液、精液、尿その他の体液を含む。

本発明の方法は、一般に以下のステップを含む。
測定される複数の被検体を含む試験サンプルを、複数のタイプのセンサー粒子と測定基質とを含む反応混合液と混合するステップであって、該センサー粒子の各タイプは、そのタイプの粒子の光学特性を固有に識別することを可能にするコード化指標を含み、前記測定基質は関心のある被検体と特異的に相互作用する、ステップ。前記反応混合液は、以下の被検体のそれぞれと特異的に相互作用する粒子を含む。
（Ａ）アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウム、ハロゲン化物イオン、酸素、ｐＨ、二酸化炭素からなるグループから選択される少なくとも１つの被検体。
（Ｂ）糖質、アンモニア、尿素、尿酸、コレステロール、トリグリセリド、エタノール、乳酸、サリチル酸塩、アセトアミノフェン、ビリルビンおよびクレアチニンからなるグループから選択される少なくとも１つの被検体。
（Ｃ）酵素、抗体、抗原およびポリヌクレオチド配列からなるグループから選択される少なくとも１つの被検体。
各タイプのセンサー粒子が、該センサー粒子の測定光学特性に影響を与えるように向けられた被検体と相互作用するのに十分な時間、前記反応混合液をインキュベーションさせるステップ。
前記混合液を読みとり装置に移送して、各センサー粒子のコード化光学特性と、測定光学特性との両方を個別に読みとるステップ。
前記粒子から読みとられたコード化光学特性に従って各センサー粒子タイプの測定光学特性を保存するステップ。
各タイプのセンサー粒子に結合した被検体についてのアッセイ結果を得るために、各センサー粒子のタイプについての保存された測定値を処理するステップ。
これにより、試験サンプルの完全な化学的分析が得られる。

前記アルカリ金属イオンは、ナトリウムおよびカリウムのイオンからなるグループから選択されることが好ましく、前記アルカリ土類金属イオンは、カルシウムおよびマグネシウムのイオンからなるグループから選択され、前記ハロゲン化物は塩素イオンである。前記糖質は、グルコース、果糖、乳糖およびガラクトースからなるグループから選択される。

前記酵素は、アルカリフォスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチンキナーゼ、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびリパーゼからなるグループから選択される。

最も好ましい被検体は、ナトリウム、カリウム、塩素、グルコース、尿素、クレアチニン、アルブミン、クレアチンキナーゼＩ、トロポニンＩおよびミオグロビンである。

本発明の方法および装置は、装置をミニチュア化して空間および重量を削減することができるという利点がある。本発明のシステムは、他のタイプのアッセイシステムに比べて比較的単純であり、このことが信頼性を増大させ、維持コストを低減させる。しかも、本方法および装置の感度が高いために、先行技術のシステムに要する試薬量より少ない試薬で完全なサンプルのアッセイを実行することができる。

本発明のその他の目的、利点および新規な特徴は、添付する図面とともに考慮するとき、以下の発明の詳細な説明から明らかになるであろう。

発明の詳細な説明
本発明の好ましい実施態様は以下の実施例を参照することにより最もよく理解される。

本実施例では、試験サンプルは以下の「メニュー」に列挙された被検体の混合物を用いて調製される。
メニュー：ナトリウム、カリウム、グルコース、α−アミラーゼ、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）。

手順は以下のステップを含む。
各センサー粒子タイプおよび各補助試薬（ｓｕｐｐｏｒｔ ｒｅａｇｅｎｔ）を個別に調製するステップ。
成分のアリコートを混合して組み合わせ試薬を形成するステップ。
前記組み合わせ試薬のアリコートを較正試薬（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）および試験サンプルと混合するステップ。
反応結果を測定するステップ。
測定された結果を組み合わせて前記試験サンプル中の被検体濃度を決定するステップ。

検知粒子の調製
ナトリウムイオン検知粒子
米国特許第４，３０２，１６６号および第４，１６２，２８２号明細書に説明されたソルベントキャスト法によりナトリウムイオン検知粒子を調製する。
混合
１５ｍｇ ナトリウムイオノフォアＸ（４−第３ブチルカリクス［４］アーレン−テトラ酢酸テトラエチル エステル）、
１．７５ｍｇ ＥＴＨ５２９４（９−（ジエチルアミノ）−５−（オクタデカノイルイミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン）、
４．１ｍｇ テトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ホウ酸ナトリウム、
５０ｍｇ 高分子塩化ポリビニル、および
１００ｍｇ ビス（２−エチルへキシル）セバシン酸を混合する。
上記の材料はウィスコンシン州ミルウオーキーのフルカ・ケミカル社（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）から入手可能である。
５ｍＬ シクロヘキサノンに溶解する。
上記の溶液を１ｍＬ キシレンおよび２００ｍＬ ジクロロメタンで希釈する。

コアの流速毎分０．５ｍＬで０．００１５”の直径のオリフィスを通して、流速毎分５４ｍＬの脱イオン水のシースとともに、ポリエチレングリコール（ＭＷ６００，ポリサイエンス社、ペンシルバニア州、ワリントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ））の３％溶液が毎分２０μＬの速度で滴下している２Ｌの容器に、パルス速度１７，５００Ｈｚで流し込んで粒子を成形する。オーバーフローを２０Ｌの容器で受けて粒子を２４時間かけて沈殿させる。液体の大半をデカンテーションにより除去して、前記粒子を４ｍＭ トリス、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４に再懸濁する。

カリウムイオン検知粒子
米国特許第４，３０２，１６６号および第４，１６２，２８２号明細書に説明されたソルベントキャスト法によりカリウムイオン検知粒子を調製する。
混合
９ｍｇ ＢＭＥ−４４（２−ドデシル−２−メチル−１，３−プロパンジイル ビス［Ｎ−［５＝−ニトロ（ベンゾ−１５−クラウン−５）−４＝−イル］カルバメート］）、
６ｍｇ ＥＴＨ５２９４（９−（ジエチルアミノ）−５−（オクタデカノイルイミノ）−５Ｈ−ベンゾフェノキサジン）、
７．５ｍｇ テトラキス［３，５−ビス （トリフルオロメチル）フェニル］ホウ酸ナトリウム、
６０ ｍｇ 高分子塩化ポリビニル、および
１２０ ｍｇビス（２−エチルへキシル）セバシン酸を混合する。
上記の材料はウィスコンシン州ミルウオーキーのフルカ・ケミカル社（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）から入手可能である。
５ｍＬ シクロヘキサノンに溶解する。
上記の溶液を１ｍＬ キシレンおよび２００ｍＬ ジクロロメタンで希釈する。

コアの流速毎分０．２ｍＬで０．００１５”の直径のオリフィスを通して、流速毎分７０ｍＬの脱イオン水のシースとともに、ポリエチレングリコール（ＭＷ６００，ポリサイエンス社、ペンシルバニア州、ワリントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ））の３％溶液が毎分２０μＬの速度で滴下している２Ｌの容器に、パルス速度２５，０００Ｈｚで流し込んで粒子を成形する。オーバーフローを２０Ｌの容器で受けて粒子を２４時間かけて沈殿させる。液体の大半をデカンテーションにより除去して、前記粒子を４ｍＭ トリス、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４に再懸濁する。

グルコース検知粒子
カルボキシル化ラテックス粒子の表面で発信リガンドを合成することにより、グルコース検知粒子を製造する。このリガンドは、グルコースに対する選択性が高く、グルコースの結合に応答してその蛍光を変化させる。合成は以下に説明されるが、（５）に示されるポリマーは、直径３．２μｍのポリ（スチレン／５．５％ジビニルベンゼン／５％メタクリル酸）ビーズの形状をしており、インジアナ州フィッシャーズ（Ｆｉｓｈｅｒｓ）のＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．から入手可能である。

ポリマー２の調製
架橋カルボン酸修飾ポリマービーズ（２００ｍｇ）と、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）（１７０ｍｇ）と、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（２００ｍｇ，）と、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（８ｍｇ）とのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍｌ）中の懸濁液を、窒素雰囲気下のアイス・バス上で３０分間撹拌する。ビス（ヘキサメチレン）トリアミン（１．０ｇ）を上記の溶液に添加し、室温で１日撹拌する。この反応混合液をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に注ぎ、室温で１時間撹拌する。ビーズを沈殿させるために遠心し、上清をデカンテーションして、メタノール中に再懸濁する。遠心とデカンテーションとを繰り返した後、メタノール中に再懸濁する。

ポリマー３の調製
ＴＨＦおよびメタノール（各７ｍＬ）中のポリマー２（２００ｍｇ）と１−ピレンカルボキシアルデヒド（１１６ｍｇ、０．５０ミリモル）の懸濁液を室温で５時間撹拌する。水素化ホウ素ナトリウム（５７ｍｇ）を上記反応に添加して、室温で１時間撹拌する。減圧下で溶媒を除去して残渣をクロロホルムに懸濁する。水で洗浄し、硫酸マグネシウムの上で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去する。遠心、デカンテーションおよび再懸濁により、残渣を２回メタノールで洗浄する。

ポリマー１の調製
ポリマー３（９５ｍｇ）、炭酸カリウム（１１６ｍｇ）および２−（２−ブロモベンジル）−１，３−ジオキサ−２−ボリナン（９３ｍｇ）のＴＨＦ（５ｍＬ）およびアセトニトリル（３ｍＬ）中の懸濁液を還流条件下で７時間加熱する。室温まで冷却し、減圧下で除去する。クロロホルム中に残渣を懸濁し、水で洗浄する。硫酸マグネシウムの上で乾燥し、溶媒を減圧下で除去する。残渣をクロロホルムおよびｎ−ヘキサンに再懸濁して、遠心およびデカンテーションによって洗浄する。洗浄されたビーズを、ｐＨ７．２に調整された５０ｍＭ トリスバッファー中に再懸濁する。

アミラーゼ検知粒子
ヒト血清ａ−アミラーゼは、修飾マルトペンタオース基質を高い特異性で切断する。マルトペンタオースは、オリゴ糖の一端を蛍光受容体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ）分子で、反対側の端を蛍光供与体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｃｅ ｄｏｎｏｒ）分子で標識されることがある。このようにして調製されたα−アミラーゼ酵素の基質は、酵素が基質を消化する際に、蛍光強度の変化を示す。Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｐａｙｒｅ、Ｓｙｌｖａｉｎ ＣｏｔｔａｚおよびＨｕｇｕｅｓ Ｄｒｉｇｕｅｚは、５−（２−アミノエチルアミノ）−１−ナフタレン−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を受容体とし、３−（２−ヒドロキシエチル）インドールを供与体として用いた。これは、前記供与体が前記受容体からａ−アミラーゼによって切断された際に蛍光の減少を起こした（Ａｎｇｖ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９５ ３４（Ｎｏ．１１））。さらに、Ｅｄｍｕｎｄ Ｄ．Ｍａｔａｙｏｓｈｉ、Ｇａｒｙ Ｔ．Ｗａｎｇ、Ｇｒａｎｔ Ａ．ＫｒａｆｅｔおよびＪｏｈｎ Ｅｒｉｃｋｓｏｎは、蛍光吸収受容体であるＤＡＢＣＹＬ（４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）と、蛍光供与体であるＥＤＡＮＳとで両端をそれぞれ標識したオクタペプチド、すなわち、ＤＡＢＣＹＬ−ＳｅｒＧｌｎＡｓｎＴｙｒＰｒｏＩｌｅＶａｌＧｌｎ−ＥＤＡＮＳを示した。この消光した蛍光基質は、プロテアーゼ酵素が前記オクタペプチドを切断した際に蛍光の増大を示した（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻、９５４頁（１９９０年）。かかる信号の増大は、感度および精度を向上させるうえで望ましい。

Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．ＦａｉｒｃｌｏｕｇｈとＣｈａｒｌｅｓ Ｒ．Ｃａｎｔｏｒとは、同様の方法に適するかもしれない分子内エネルギー転移対を多数列挙している（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４８巻、３４７頁（１９７８年））。

この好ましい信号の変化方向を有するα−アミラーゼ検知粒子を作成するために、ＥＤＡＮＳが蛍光供与体原子団として選択され、ＤＡＢＣＹＬが蛍光消光受容体原子団として選択された。これらは、α―アミラーゼ基質のペンタオースに共有結合で結合され、蛍光エネルギー転移を促進するために１００オングストローム未満の距離をおいて空間的に配置された。この基質を、「消光した蛍光酵素基質」という。前記消光した蛍光酵素基質は、ラテックス粒子に、該ラテックス粒子のカルボキシル基と、蛍光酵素基質分子の脂肪族側鎖原子団（ｐｅｎｄａｎｔ ｇｒｏｕｐ）のアミノ末端との間のアミド結合形成を介して結合する。前記基質分子の結合点（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）を選択するについては注意しなければならない。蛍光原子団を固相に結合すべきである。したがって、前記オリゴ糖の酵素切断の際、供与体／受容体の対の「蛍光消光剤」メンバーがバルク溶液中に遊離され、残った「裸の」蛍光原子団は固相で蛍光を発する。フロー・サイトメーターがこのような粒子の数を算定し、蛍光強度を定量して前記α―アミラーゼ活性と関係づけることができる。

α―アミラーゼの消光した蛍光酵素基質の代表的な化合物としてのＤＡＢＣＹＬ−オリゴ糖−ＥＤＡＮＳ。この基質は、カルボキシル表面官能基でポリマー粒子に結合する。鍵となる中間体は「３重機能性コンジュゲートを用いる被検体アッセイ」という名称の米国特許第５，８５１，７７８号明細書の方法によって得られる。この合成の詳細は以下のとおりである。

１．ヒドロキシメチル−ＥＤＡＮＳ（化合物Ｉ）の調製
ＤＭＦ中のカルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）またはジシクロヘキシルカルボジイミダゾール（ＤＤＣＩ）を用いて、カルボベンゾキシ基で保護されたセリンを活性化して、５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）と反応させる。臭化水素酸処理または接触水素化によりカルボベンゾキシ保護基を除去して、アミノ末端を有する化合物を得る。無水コハク酸で処理することにより、このアミノ基をカルボキシ末端に変換して、化合物Ｉを得る。

２．３糖−ＥＤＡＮＳ（化合物ＩＩ）
Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｐａｙｒｅ、Ｓｙｌｖａｉｎ ＣｏｔｔａｚおよびＨｕｇｕｅｓ Ｄｒｉｇｕｅｚ、Ａｎｇｖ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９５、３４（Ｎｏ．１１）に説明されるとおり、トルエン／ニトロメタン中のシアン化水銀（ＩＩ）および臭化水銀（Ｉ）を用いてヒドロキシメチル−ＥＤＡＮＳ（Ｉ）をブロモ化３糖と反応させる。メタノール中のナトリウムメトキシドで生成物を脱アセチル化して、化合物ＩＩを得る。

３．５糖−ＥＤＡＮＳ（化合物ＩＩＩ）
Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｐａｙｒｅ、Ｓｙｌｖａｉｎ ＣｏｔｔａｚおよびＨｕｇｕｅｓ Ｄｒｉｇｕｅｚ、Ａｎｇｖ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９５、３４（Ｎｏ．１１）に説明されるとおり、メタノール／リン酸バッファー中のα−アミラーゼを用いて、３糖−ＥＤＡＮＳ（ＩＩ）を蛍光性２糖に結合させて、化合物ＩＩＩを得る。

４．Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｐａｙｒｅ、Ｓｙｌｖａｉｎ ＣｏｔｔａｚおよびＨｕｇｕｅｓ Ｄｒｉｇｕｅｚ、Ａｎｇｖ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９５、３４（Ｎｏ．１１）に従って、３７°Ｃのリン酸バッファー中でガラクトースオキシダーゼおよびカタラーゼによって末端の糖の５−ヒドロキシメチル基を酵素的に酸化させて、アルデヒド体（化合物ＩＶ）を得る。

５．前記化合物ＩＶのアルデヒド基を１，６−ヘキサンジアミンと反応させ、次のシッフ塩基を水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元して、アミノ−５糖−ＥＤＡＮＳ（化合物Ｖ）を得る。

６．４−［（４−ジメチルアミノ）−フェニルアゾ］安息香酸のカルボキシル基をＣＤＩまたはＤＣＣＩで活性化して、上記化合物Ｖの１級アミノ基と反応させて、生成物ＶＩを得る。

７．化合物ＶＩのラテックス粒子表面への結合は、該粒子をＥＤＡＸで活性化し、１，６ヘキサンジアミンのスペーサを前記粒子に結合させ、化合物ＶＩをＣＤＩで活性化し、活性型の化合物ＶＩを前記スペーサの遠位端に結合することによって行われる。

７．１ ラテックスの活性化
１０ｍｇの直径４．４μｍのカルボン酸修飾ポリスチレンラテックス粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インジアナ州、インジアナポリス）を１ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．１中で洗浄する。１０ｍｇのＥＤＡＣを添加して、２０°Ｃ１５分間連続撹拌しながら反応させる。活性化された前記粒子をｐＨ７．８に調整された５０ｍＭ ＭＥＳバッファー中で２回洗浄する。０．５ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ７．８中で超音波処理することにより再懸濁する。

７．２ スペーサ結合
５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ７．８中の１ｍＭ １，６−ヘキサンジアミン０．５ｍＬを添加して３時間連続撹拌する。洗浄し、５０ｍＭＭＥＳバッファー中の０．０３％グリシン１ｍＬに再懸濁して、３０分間ゆっくりと撹拌する。前記粒子をｐＨ７．８に調整された５０ｍＭ ＭＥＳバッファー中で２回洗浄して、残存するアミンを除去する。超音波処理により５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ７．８の０．５ｍＬ中に再懸濁する。

７．３ 化合物ＶＩの活性化
化合物ＶＩのカルボキシル基をＤＭＦ中のＣＤＩを用いて活性化し、前記ラテックス懸濁液に添加して３時間連続撹拌する。洗浄して、５０ｍＭ ＭＥＳバッファー中の０．０３％グリシン１ｍＬに再懸濁して３０分間ゆっくりと撹拌する。前記粒子をｐＨ７．２に調整された５０ｍＭ トリスバッファー中で２回洗浄する。洗浄されたビーズを、ｐＨ７．２に調整された５０ｍＭ トリスバッファー中で超音波処理することによって再懸濁する。

ＴＳＨ捕捉粒子
直径５．６μｍのカルボン酸修飾ポリスチレンラテックス粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０ｍｇを５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．１の１ｍＬ中で洗浄する。洗浄と、１ｍＬのＭＥＳバッファー中での超音波処理による再懸濁とを繰り返す。１０ｍｇのＥＤＡＣ（塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）を添加して、２０°Ｃ１５分間連続撹拌しながら反応させる。活性化された粒子を、ｐＨ７．８に調整された５０ｍＭＭＥＳバッファー中で２回洗浄する。０．５ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ７．８中で超音波処理して再懸濁する。１．８ｍｇのマウスモノクローナル抗ヒトＴＳＨ抗体（ＢｉｏＣｈｅｃｋ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を０．５ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ７．８中に添加して、３時間連続撹拌しながら反応させる。洗浄して５０ｍＭ ＭＥＳバッファー中の０．０３％ グリシンの１ｍＬに再懸濁して３０分間ゆっくりと撹拌する。洗浄して、４ｍＭ トリスバッファー、ｐＨ７．４中の１％ウシ血清アルブミンに再懸濁する。

補助試薬（ｓｕｐｐｏｒｔ ｒｅａｇｅｎｔｓ）
ＴＳＨレポーター抗体
１ｍｇのアフィニティ精製ヤギ抗ヒトＴＳＨ抗体（ＢｉｏＣｈｅｃｋ， Ｉｎｃ．）をＣｙ５色素（Ｆｌｕｏｒｏｌｉｎｋ Ｃｙ５、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社、ニュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）に色素の製造者の指示に従って結合して、コンジュゲートにする。標識抗体を（ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製後）１０ｍＬ トリスバッファー、ｐＨ７．４中に懸濁する。

組み合わせ試薬
各粒子タイプの希釈アリコートを以下に説明するフロー・サイトメーターで測定して、前方および側方散乱の固有値（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｖａｌｕｅ）を確立する。各タイプの被検体ビーズを同数混合して、ｐＨ７．４に調整された０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０入り５ｍＭ トリスバッファーにビーズ総濃度２５０，０００個／ｍＬになるように組み合わせ試薬を作成する。ＴＳＨレポーター抗体を、最終濃度が１２μｇ／ｍｌになるように添加する。

組み合わせ試薬を反応させる
各被検体について、参照用臨床濃度間隔の最小濃度の半分から最大濃度の２倍までの範囲にわたる、メニュー被検体を添加することによって、６つの較正溶液を調製する。別々の反応容器に入った前記組み合わせ試薬の２０μＬのアリコートに各較正溶液および試験サンプルのいずれかの２０μＬを混合する。各反応容器にｐＨ７．４のトリスバッファー１６０μＬを添加する。温度を３７°Ｃで０．２°Ｃ以内に維持する。結果を測定する前、３０分間ゆっくりと撹拌する。

反応結果の測定
６３３ｎｍおよび３４０ｎｍの共焦点励起でフロー・サイトメーターを用いて粒子の信号を測定する。６３３ｎｍ光源からの前方散乱と側方散乱とを検出する。４５０から５２０ｎｍまでの波長感度の第１の蛍光検出チャンネルと、６５０から７２０ｎｍまでの第２の蛍光検出チャンネルとの２チャンネルで蛍光を検出する。前方散乱の信号でデータ収集を始動（ｔｒｉｇｇｅｒ）する。検出された粒子を同様の前方および側方散乱のクラスターにグループ分けする。これが、サイズの異なる粒子タイプを区別する。

測定結果を組み合わせる
被検体を組み合わせる前に行われた散乱の測定を参照することにより、同様の前方および側方散乱が測定されたクラスターを、被検体の特異性に関連させる。各反応について、各被検体と関連したクラスとについて、その被検体の信号に関連した蛍光検出チャンネル由来の蛍光のメジアンに等しい値を計算する。α−アミラーゼ活性については、適当な信号は第１の蛍光検出チャンネル由来のものである。その他の全ての被検体については、適当な信号は第２の蛍光チャンネル由来のものである。これは各反応について５つの値を作成する。それぞれの値は、試験メニューの５つの被検体のうちの１つに関連する。較正溶液の反応由来の値に基づいて当て嵌められた曲線を用いて、前記値と各被検体の濃度との間の関係を決定する。それぞれの値と被検体濃度との対を４パラメーター・ロジスティック結合曲線に当て嵌めて、曲線のパラメーターを決定する。試験サンプルのそれぞれから測定された値と、当て嵌めた曲線から決定されたパラメーターとを用いて、各試験サンプルから各被検体の濃度を計算する。

図１を参照して、本発明の方法を実施する装置は、全体として符号１０で示され、分析されるべき試験サンプルの取り込み口１２と、複数のタイプのセンサー粒子を含む反応混合液の取り込み口１４と、インキュベーションチャンバーまたは容器１６と、通過する各センサー粒子上のコード化指標を読みとるように適応して、センサー粒子のタイプと、該粒子が相互作用する関心のある被検体とを識別し、前記センサー粒子がそれぞれの関心のある被検体と相互作用下かどうかを示す測定値を得るために関連する蛍光指示薬を読みとるフロー・サイトメーター読みとりセル１８と、コントローラ２０とを含み、前記センサー粒子の各タイプは、関心のある被検体と特異的に相互作用して結合した蛍光指示薬の光学特性を変化させるように設計されており、インキュベーションチャンバーまたは容器１６は、前記サンプルおよび反応混合液が相互作用することを可能にし、フロー・サイトメーター読みとりセル１８は、通過する各センサー粒子上のコード化指標を読みとるように適応されており、センサー粒子のタイプと、該粒子が相互作用する関心のある被検体とを識別し、前記センサー粒子がそれぞれの関心のある被検体と相互作用下かどうかを示す測定値を得るために関連する蛍光指示薬を読みとり、コントローラ２０は、センサー粒子のタイプと該センサー粒子のタイプが相互作用する特定の被検体とに従って、各センサー粒子について読みとられた測定値を記憶して、各センサー粒子タイプについての記憶された前記測定値を処理して、各タイプのセンサー粒子に関連する被検体についてのアッセイ結果を得る。

フロー・サイトメーター読みとりセル１８は、フローセル２２と、適当なダイオードレーザ２４と、光デテクタ２６とを含み、ダイオードレーザ２４は、各ビーズの標識および蛍光指示薬を励起し、光デテクタ２６は生じた信号を検出しコントローラ２０に伝達する。好ましくは、前記ダイオードレーザおよび光デテクタは、各ビーズのビーズ標識を励起して、識別用蛍光信号を発光させる第１のダイオードレーザと、前記識別用蛍光信号を検出する第１の光デテクタと、各ビーズに結合する蛍光指示薬を励起して測定信号を発光する第２のレーザダイオードと、前記測定信号を検出する第２の光デテクタとを含む。前記測定信号は、近赤外波長の範囲であることが好ましい。

本明細書に言及された全ての特許その他の刊行物は、引用によりここにその全体が取り込まれる。

以上の説明および実施例は、本発明を例示するために示されたに過ぎず、限定することを意図するものではない。本発明の趣旨および実質を取り込んで開示された実施態様を改変することは当業者に想到できる場合があり、本発明は、添付する請求の範囲およびその均等の範囲の内に該当する全ての変更を広く含むように解釈されるべきである。

本発明の装置の模式図。

符号の説明

１０ 本発明の装置
１２ 試験サンプルの取り込み口
１４ 反応混合液の取り込み口
１６ インキュベーションチャンバー
１８ フロー・サイトメーター読みとりセル
２０ コントローラ
２２ フローセル
２４ ダイオードレーザ
２６ 光デテクタ

Claims (21)

1. （ａ）イオンセンサーおよび（ｂ）代謝物センサーのクラスのそれぞれから選択される被検体センサー粒子の少なくとも１のタイプと、（ｃ）酵素センサー、（ｄ）抗原センサーまたは抗体センサーおよび（ｅ）核酸配列センサーのクラスから選択される被検体センサー粒子の少なくとも１のタイプとを含む、試験サンプル中の標的被検体を測定するための試薬であって、
   （ａ）イオンセンサーは、前記サンプル中の標的イオンと相互作用をするように適応した標的イオノフォアと、前記標的イオノフォアと標的イオンとの相互作用に従って蛍光を発する第１の蛍光信号とを結合した、複数のサンプル不溶性粒子を含み、
   （ｂ）代謝物センサーは、前記サンプル中の標的代謝物と相互作用をして、該標的代謝物との相互作用に従って第２の蛍光信号を発生するように適応したリガンドを結合した、複数のサンプル不溶性粒子を含み、
   （ｃ）酵素センサーは、前記サンプル中の標的酵素と相互作用をして、第３の蛍光信号を発生するように適応した蛍光性基質を結合した、複数のサンプル不溶性粒子を含み、
   （ｄ）抗原センサーまたは抗体センサーは、相補的な標的抗原または相補的な抗体と相互作用をして複合体を形成すること、および、前記相補的な標的抗原または相補的な抗体との相互作用に従って第４の蛍光信号を発生することに適応した固定化された対のメンバーを結合した、複数のサンプル不溶性粒子を含み、
   （ｅ）核酸配列センサーは、標的ヌクレオチド配列に相補的で、かつ、雑種形成をする条件下で該標的ヌクレオチド配列と雑種形成をすることができるポリヌクレオチド分子と、前記相補的なポリヌクレオチド分子と標的ヌクレオチド配列との雑種形成の際に第５の蛍光信号を発生する蛍光信号材料とを結合した、複数のサンプル不溶性粒子を含み、
   前記反応混合液は、
   （Ａ）アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウム、ハロゲン化物イオン、酸素、ｐＨ、二酸化炭素からなるグループから選択される、少なくとも１の被検体と、
   （Ｂ）糖質、アンモニア、尿素、尿酸、コレステロール、トリグリセリド、エタノール、乳酸、サリチル酸塩、アセトアミノフェン、ビリルビンおよびクレアチニン、酵素、抗体、抗原およびポリヌクレオチド配列からなるグループから選択される、少なくとも１の被検体と
   のそれぞれに特異的に相互作用するセンサー粒子を含む、試験サンプル中の標的被検体を測定するための試薬。
2. 前記アルカリ金属イオンは、ナトリウムおよびカリウムのイオンからなるグループから選択され、前記アルカリ土類金属イオンは、カルシウムおよびマグネシウムのイオンからなるグループから選択され、前記ハロゲン化物イオンは、塩素イオンである、請求項１に記載の試薬。
3. 前記糖質は、グルコース、果糖、乳糖およびガラクトースからなるグループから選択される、請求項１に記載の試薬。
4. 前記酵素は、アルカリフォスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチンキナーゼ、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびリパーゼからなるグループから選択される、請求項１に記載の試薬。
5. 前記センサー粒子は約０．１μｍから約５０μｍまでの範囲のサイズを有する、請求項１に記載の試薬。
6. 前記クラス（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のそれぞれから選択される少なくとも１のタイプの被検体センサー粒子を含む、請求項１に記載の試薬。
7. 前記クラス（ａ）、（ｂ）および（ｄ）のそれぞれから選択される少なくとも１のタイプの被検体センサー粒子を含む、請求項１に記載の試薬。
8. 前記クラス（ａ）、（ｂ）および（ｅ）のそれぞれから選択される少なくとも１のタイプの被検体センサー粒子を含む、請求項１に記載の試薬。
9. 前記クラス（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のそれぞれから選択される少なくとも１のタイプの被検体センサー粒子を含む、請求項１に記載の試薬。
10. 前記クラス（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）のそれぞれから選択される少なくとも１のタイプの被検体センサー粒子を含む、請求項１に記載の試薬。
11. 前記クラス（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）のそれぞれから選択される少なくとも１のタイプの被検体センサー粒子を含む、請求項１に記載の試薬。
12. 前記クラス（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のそれぞれから選択される少なくとも１のタイプの被検体センサー粒子を含む、請求項１に記載の試薬。
13. 試験サンプル中の複数の被検体をアッセイする方法であって、
    （１）測定されるべき複数の被検体を含む試験サンプルを複数のタイプのセンサー粒子を含む反応混合液と混合するステップであって、
    前記センサー粒子の各タイプは、該タイプの粒子の光学特性を一義的に同定することを可能にするコード化指標と、関心のある被検体と特異的に相互作用して測定光学特性が変化する測定基質とを含み、
    前記反応混合液は、
    （Ａ）アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウム、ハロゲン化物イオン、酸素、ｐＨ、二酸化炭素からなるグループから選択される、少なくとも１の被検体と、
    （Ｂ）糖質、アンモニア、尿素、尿酸、コレステロール、トリグリセリド、エタノール、乳酸、サリチル酸塩、アセトアミノフェン、ビリルビンおよびクレアチニンからなるグループから選択される、少なくとも１の被検体と、
    （Ｃ）酵素、抗体、抗原およびポリヌクレオチド配列とからなるグループから選択される、少なくとも１の被検体と
    のそれぞれと特異的に相互作用する粒子を含む、複数の被検体を含む試験サンプルを複数のタイプのセンサー粒子を含む反応混合液と混合するステップと、
    （２）各タイプのセンサー粒子が、被検体と特異的相互作用をして、前記センサー粒子の測定光学特性を変化させるのに十分な時間、得られた混合物をインキュベーションするステップと、
    （３）前記混合物を読みとり装置に移送して、各センサー粒子のコード化光学特性と測定光学特性の両方を個別に読みとるステップと、
    （４）前記粒子から読みとられたコード化光学特性に従って各センサー粒子のタイプの測定光学特性の記憶をするステップと、
    （５）各センサー粒子のタイプについての前記記憶がされた測定値を処理して、各タイプのセンサー粒子に関連する前記被検体についてのアッセイ結果を得るステップとを含み、
    前記試験サンプルの完全な化学的分析結果が得られる、試験サンプル中の複数の被検体をアッセイする方法。
14. 前記アルカリ金属イオンは、ナトリウムおよびカリウムのイオンからなるグループから選択され、前記アルカリ土類金属イオンは、カルシウムおよびマグネシウムのイオンからなるグループから選択され、前記ハロゲン化物イオンは塩素イオンである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記糖質は、グルコース、果糖、乳糖およびガラクトースからなるグループから選択される、請求項１３に記載の方法。
16. 前記酵素はアルカリフォスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチンキナーゼ、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびリパーゼからなるグループから選択される、請求項１３に記載の方法。
17. 前記読みとり装置はフロー・サイトメーターで、前記粒子の測定光学特性は蛍光で、前記読みとるステップは、各タイプのセンサー粒子の蛍光を測定することによって実行される、請求項１３に記載の方法。
18. 試験サンプル中の複数の被検体をアッセイするための装置と、請求項１３に記載の方法を説明する該装置の使用指示書とを含む、キット。
19. 試験サンプル中の複数被検体をアッセイする装置であって、
    （Ａ）分析されるべき試験サンプルの取り込み口と、
    （Ｂ）それぞれが関心のある被検体と特異的に相互作用して結合した蛍光指示薬の光学特性を変化させるように設計されたセンサー粒子の複数のタイプを含む反応混合液の取り込み口と、
    （Ｃ）前記サンプルおよび反応混合液が相互作用することを可能にするインキュベーションチャンバーまたは容器と、
    （Ｄ）通過する各センサー粒子上のコード化指標を読みとって、センサー粒子のタイプと、該粒子が相互作用する関心のある被検体とを同定すること、および、結合した蛍光指示薬を読みとって前記センサー粒子がそれぞれの関心のある被検体と相互作用しているかどうかを示す測定値を得ることに適応した、フロー・サイトメーター読みとりセルと、
    （Ｅ）センサー粒子のタイプと、該センサー粒子のタイプが相互作用する特異的な被検体とに従って、各センサー粒子について読みとられた測定値を記憶すること、および、各センサー粒子のタイプについて記憶された前記測定値を処理して、各タイプのセンサー粒子に関連する前記被検体についてアッセイ結果を得ることに適応した、コントローラとを含む、試験サンプル中の複数被検体をアッセイする装置。
20. 前記フロー・サイトメーターの読みとりセルは、
    （Ａ）各ビーズのビーズ標識を励起して同定用の蛍光信号を発光させるための第１のダイオードレーザと、前記同定用の蛍光信号を検出するための第１の光デテクタと、
    （Ｂ）各ビーズに結合した前記蛍光指示薬を励起して、測定信号を発光させるための第２のレーザダイオードと、前記測定信号を検出するための第２の光デテクタとを含む、請求項１９に記載の装置。
21. 試験サンプル中の複数の被検体をアッセイするための装置であって、
    （Ａ）分析されるべき試験サンプルを導入する手段と、
    （Ｂ）それぞれのタイプのセンサー粒子が、関心のある被検体と特異的に相互作用して、結合した蛍光指示薬の光学特性を変化させるように設計された、複数のタイプのセンサー粒子を含む反応混合液を導入するするための手段と、
    （Ｃ）前記サンプルおよび反応混合液が相互作用することを可能にする、インキュベーションチャンバーまたは容器と、
    （Ｄ）通過する各センサー粒子上のコード化指標を読みとって、前記センサー粒子のタイプと、該粒子が相互作用する関心のある前記被検体とを同定すること、および、結合した蛍光指示薬を読みとって、前記センサー粒子がそれぞれの関心のある前記被検体と相互作用したかどうかを示す測定値を得ることに適応した、フロー・サイトメーター読みとりセルと、
    （Ｅ）センサー粒子のタイプと該タイプのセンサー粒子が相互作用する特異的な被検体とに従って、各センサー粒子について読みとられた測定値を記憶すること、および、各センサー粒子のタイプについて記憶された前記測定値を処理して、各タイプのセンサー粒子に関連する被検体についてアッセイ結果を得ることに適応した、コントローラとを含む、試験サンプル中の複数の被検体をアッセイするための装置。
    
    

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