CN111579767A - 一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒 - Google Patents

一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒，属于医药试剂技术领域。该方法先将CDI溶液滴加到胶乳微球溶液，震荡混匀，得到活化的胶乳微球；向活化的胶乳微球中加入偶联缓冲液调节pH；将抗体加入到调节pH后的溶液中，震荡混匀，得到偶联后的溶液；将牛血清白蛋白母液加入到偶联后的溶液中，震荡混匀，得到致敏胶乳。本发明还提供上述制备方法得到的致敏胶乳。本发明还提供一种含上述致敏胶乳的试剂盒。本发明的方法偶联效率高、成本低，得到的试剂盒性能优异。

Description

一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒
技术领域
本发明属于医药试剂技术领域，具体涉及一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒。
背景技术
体外诊断目前主要的方法有酶联免疫法、胶乳比浊法、化学发光法及分子诊断等方法。胶乳比浊法和化学发光法中涉及用到微球标记蛋白。微球标记蛋白(抗原或抗体或亲和素)的方法主要是吸附法和共价偶联法，目的是将待测物质相对应的抗体或抗原包被在微球上，通过待测物质与包被了相应抗原抗体的微球反应后的特性进行检测提高试验的敏感性。共价偶联法中常用的微球表面偶联有功能基团-羧基。
胶乳增强免疫比法(Latex particle-enhanced turbidimetric immunoassay,LETIA)是一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。其原理通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆抗体，当抗原与交联有抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，改变反应溶液的吸光度。而且，反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测抗原的浓度。
LETIA法需要采用物理或者化学的方法将抗体偶联在微球表面，物理吸附法，是由于蛋白质和胶乳颗粒之间是以静电相互作用或者是疏水相互作用结合在一起的，是一种弱的作用力，所以蛋白很容易从胶乳微球上解离下来，造成试剂的不稳定、偶联效率低，在实际应用上受到一定的限制。化学偶联法，是通过胶乳微球表面的功能基团与免疫活性分子上的氨基以共价键的形式结合在一起，增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。所以目前国内的研发，大部分采用化学偶联法；目前羧基微球偶联氨基的通用方法有两种：一是以碳二亚胺(EDC)为交联剂的一步法，二是以碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为交联剂的两步法。
在实际应用中EDC对pH值敏感，活化羧基的最适pH值在3.5-4.5，但是活化羧基后形成的中间产物与氨基偶联的最适pH在4.5-7.5，在实际应用过程中，这种操作比较繁琐，影响反应效率。另外EDC可与磷酸基团发生反应，所以在EDC参与的反应过程中不能使用磷酸缓冲液，但是磷酸缓冲液是在本领域内常用的、易配制且价廉的缓冲液。因此，现有技术中的一步法和二步法均由于使用EDC作为交联剂，导致反应条件受到诸多限制，操作条件的苛刻与操作步骤的繁琐进一步导致了目前的羧基微球偶联氨基方法成本高、偶联效率低。
N,N’-羰基二咪唑(CDI)是一种在溶液或者固相肽合成中活化羧酸的试剂，但至今未见其应用于羧基微球标记蛋白领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒，该方法偶联效率高、成本低。
本发明首先提供一种羧基微球偶联氨基的方法，包括以下步骤：
步骤一：将CDI溶液滴加到胶乳微球溶液，震荡混匀，10-37℃震荡活化20-30min，震荡速度为50-200rpm/min，得到活化的胶乳微球；
步骤二：向步骤一的活化的胶乳微球中加入偶联缓冲液调节pH至7-9；
步骤三：将抗体加入到调节pH后的溶液中，震荡混匀，10-37℃震荡偶联2-3h，震荡速度为50-200rpm/min，得到偶联后的溶液；
步骤四：将牛血清白蛋白母液加入到偶联后的溶液中，震荡混匀，10-37℃震荡封闭1-2h，震荡速度为50-200rpm/min，然后将溶液清洗换液，得到致敏胶乳。
优选的是，所述步骤一中CDI溶液是将CDI用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解后得到的，CDI的浓度为0.01g/mL。
优选的是，所述步骤一中胶乳微球溶液用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸稀释后得到的，胶乳微球的浓度为1-3％w/v。
优选的是，所述的胶乳微球溶液中胶乳微球的粒径为60-300nm的聚苯乙烯胶乳微球。
优选的是，所述步骤一胶乳微球溶液中胶乳微球的质量mg：CDI溶液的体积μL为1：(10-100)。
优选的是，所述步骤二偶联缓冲液为50-200mM/L磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种，pH在6-10之间。
优选的是，所述步骤三中的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种。
优选的是，所述步骤三中，以胶乳微球的重量为计，胶乳微球：抗体＝0.1-0.5％：1。
本发明还提供上述制备方法得到的致敏胶乳。
本发明还提供一种试剂盒，包括R1和R2试剂，其中R1包括缓冲液、一价或二价盐、表面活性剂、PEG6000和PC300；R2为含有10％-20％的上述致敏胶乳。
本发明的有益效果
(1)本发明使用N,N’-羰基二咪唑(CDI)作为交联剂，可实现羧基微球与氨基的高效偶联，克服了现有技术的一步法和两步法操作繁琐的缺点，操作简便。
(2)本发明的方法反应条件温和，可采用磷酸盐缓冲液，且对其pH值要求宽泛，磷酸盐缓冲液pH值4.5-9.0均可实现高效偶联，克服了现有技术中不能使用磷酸盐缓冲液、且对缓冲液的pH值要求范围过窄的不足。
(3)本发明的试剂盒与现有商品化试剂盒相比相关性较好，测值一致，具有很好的精确度。
具体实施方式
本发明首先提供一种羧基微球偶联氨基的方法，包括以下步骤：
步骤一：将CDI溶液滴加到胶乳微球溶液，震荡混匀，10-37℃震荡活化20-30min，震荡速度为50-200rpm/min，得到活化的胶乳微球；
所述的CDI溶液是将CDI用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解后得到的，CDI的浓度优选为0.01g/mL；胶乳微球溶液用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸稀释后得到的，胶乳微球的浓度为1-3％w/v，所述的胶乳微球溶液中胶乳微球的粒径优选为60-300nm的聚苯乙烯胶乳微球。
所述的胶乳微球溶液中胶乳微球的质量mg：CDI溶液的体积μL优选为1：(10-100)，更优选为1：(50-80)；
步骤二：向步骤一的活化的胶乳微球中加入偶联缓冲液调节pH至7-9；所述偶联缓冲液优选为50-200mM/L磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种，pH在6-10之间；
步骤三：将抗体加入到调节pH后的溶液中，震荡混匀，10-37℃震荡偶联2-3h，震荡速度为50-200rpm/min，得到偶联后的溶液；所述的抗体优选为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种；以胶乳微球的重量为计，胶乳微球：抗体＝0.1-0.5％：1；
步骤四：将牛血清白蛋白母液加入到偶联后的溶液中，震荡混匀，10-37℃震荡封闭1-2h，震荡速度为50-200rpm/min，然后将溶液清洗换液，得到致敏胶乳；所述的牛血清白蛋白母液浓度为5％；所述的清洗换液优选为：离心、去上清，加入储存缓冲液将沉淀重悬，超声打散即得到致敏胶乳；
所述的储存缓冲液优选为20-100mM/L磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种，pH在6-10之间；
为了提高试剂的稳定性，一般在储存液中加入稳定剂，所述的稳定剂优选为1-5％的甘油、蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或者多种。
本发明还提供上述制备方法得到的致敏胶乳。
本发明还提供一种试剂盒，包括R1和R2试剂，其中R1包括缓冲液、一价或二价盐、表面活性剂、PEG6000和PC300；R2为含有10％-20％的上述致敏胶乳。
按照本发明，所述的的缓冲液优选为Tris、磷酸盐、碳酸盐缓冲液中的一种，浓度为20-500mM/L。
按照本发明，所述的一价或二价盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁中的一种或多种组成，浓度为0.1-15g/L。
按照本发明，所述的表面活性剂为吐温系列、曲拉通系列中的一种，浓度为1-10mL/L。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
根据本发明的优选方案制备的抗链球菌溶血素“O”试剂盒，其步骤是：
(1)准备：准备155nm的聚苯乙烯胶乳微球，胶乳微球用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸稀释至终浓度为1.5％w/v得到胶乳微球溶液；N,N’-羰基二咪唑(CDI)用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解，得到浓度为0.01g/mL的CDI溶液；
(2)活化：以胶乳微球的重量为计，每mg微球按50μL CDI溶液的比例滴加到胶乳微球溶液中，震荡混匀，25℃震荡活化25min，震荡速度为200rpm/min，得到活化的胶乳微球；
(3)加入50mM/L磷酸盐缓冲液调节pH至8.0；
(4)偶联：以胶乳微球的重量为计，按胶乳微球：抗体＝0.25％的比例将多克隆抗体加入到溶液中，震荡混匀，25℃震荡偶联2h，震荡速度为200rpm/min；
(5)封闭：按溶液的终体积为1％的比例将5％牛血清白蛋白母液加入到溶液(4)中，震荡混匀，25℃震荡封闭1h，震荡速度为200rpm/min；
(6)清洗换液：离心，去上清，加入50mM/LTris缓冲液，pH为7.5的储存缓冲液(加入稳定剂为2％的甘油和1％的蔗糖)将沉淀重悬，超声打散即得到致敏胶乳。
实施例2
根据本发明的优选方案制备的C反应蛋白试剂盒，其步骤是：
(1)准备：准备107nm的聚苯乙烯胶乳微球，胶乳微球用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸稀释至终浓度为3％w/v得到胶乳微球溶液；N,N’-羰基二咪唑(CDI)用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解，得到浓度为0.01g/mL的CDI溶液；
(2)活化：以胶乳微球的重量为计，每mg微球按80μL CDI溶液的比例滴加到胶乳微球溶液中，震荡混匀，30℃震荡活化30min，震荡速度为100rpm/min，得到活化的胶乳微球；
(3)加入50mM/L硼酸盐缓冲液调节pH至7.5；
(4)偶联：以胶乳微球的重量为计，按胶乳微球：抗体＝0.5％的比例将单克隆抗体加入到溶液中，震荡混匀，30℃震荡偶联3h，震荡速度为100rpm/min；
(5)封闭：按溶液的终体积为0.5％的比例将5％牛血清白蛋白母液加入到溶液
(4)中，震荡混匀，30℃震荡封闭1.5h，震荡速度为100rpm/min；
(6)清洗换液：离心，去上清，加入20mM/L磷酸盐缓冲液，pH为7.5的储存缓冲液(加入稳定剂为3％的蔗糖)将沉淀重悬，超声打散即得到致敏胶乳。
实施例3
根据本发明的优选方案制备的β2微球蛋白试剂盒，其步骤是：
(1)准备：准备123nm的聚苯乙烯胶乳微球，胶乳微球用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸稀释至终浓度为1.8％w/v得到胶乳微球溶液；N,N’-羰基二咪唑(CDI)用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解，得到浓度为0.01g/mL的CDI溶液；
(2)活化：以胶乳微球的重量为计，每mg微球按60μL CDI溶液的比例滴加到胶乳微球溶液中，震荡混匀，37℃震荡活化20min，震荡速度为200rpm/min，得到活化的胶乳微球；
(3)加入50mM/L硼酸盐缓冲液调节pH至7.5；
(4)偶联：以胶乳微球的重量为计，按胶乳微球：抗体＝0.2％的比例将多克隆抗体加入到溶液中，震荡混匀，37℃震荡偶联2h，震荡速度为200rpm/min；
(5)封闭：按溶液的终体积为1％的比例将5％牛血清白蛋白母液加入到溶液(4)中，震荡混匀，37℃震荡封闭1h，震荡速度为200rpm/min；
(6)清洗换液：离心，去上清，加入100mM/L HEPES缓冲液，pH为8.0的储存缓冲液(加入稳定剂为1％甘露醇和1％海藻糖)将沉淀重悬，超声打散即得到致敏胶乳。
实施例4一种检测试剂盒，包括R1和R2试剂，其中R1包括缓冲液、一价或二价盐、表面活性剂、PEG6000和PC300；R2为含有10％的实施例1制备的致敏胶乳。
所述的缓冲液为Tris缓冲液，浓度为100mM/L。
所述的一价或二价盐为氯化钠和氯化镁，浓度分别为9g/L、5g/L。
所述的表面活性剂为曲拉通系列，浓度为3mL/L。
配制R1的具体操作为：量取975mL纯化水于烧杯中，分别加入12.114g Tris、9g氯化钠、5g氯化镁、15g PEG6000、10g蔗糖，搅拌溶解；在加入2mL PC300、3mL曲拉通X-100、20mL甘油，搅拌混匀，即得到R1试剂。
试剂盒在生化仪上的应用
测试试剂盒：实施例4的试剂盒、对比例1的抗链球菌溶血素“O”试剂盒(由北京百尚利德生物有限公司生产)
测试仪器：日立7100生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：570nm；副波长：750nm；测光点：18-34；样本量：2uL；试剂量R1:R2＝160:40；校准方法：spline标准曲线的设定：分别将已知浓度的标准品，即0、100、200、400、800IU/mL放在校准盘里，设置校准品位置及浓度，得到以下数据，实施例4数据如表1，对比例1数据如表2；
表1
Figure BDA0002512725580000071
表2
Figure BDA0002512725580000072
取30例不同浓度的临床样本与对比例平行进行检测，得到以下数据如表3：
表3
血清编号 实施例4(IU/mL) 对比例1(IU/mL) 绝对偏差 相对偏差 血清相关性
血清1 28 27 1.00 3.7％ 0.997473519
血清2 29 28 1.00 3.6％
血清3 34 32 2.00 6.3％
血清4 33 36 -3.00 -8.3％
血清5 34 37 -3.00 -8.1％
血清6 44 42 2.00 4.8％
血清7 45 43 2.00 4.7％
血清8 44 44 0.00 0.0％
血清9 46 46 0.00 0.0％
血清10 42 46 -4.00 -8.7％
血清11 51 52 -1.00 -1.9％
血清12 52 55 -3.00 -5.5％
血清13 54 56 -2.00 -3.6％
血清14 57 56 1.00 1.8％
血清15 61 56 5.00 8.9％
血清16 56 56 0.00 0.0％
血清17 66 62 4.00 6.5％
血清18 76 70 6.00 8.6％
血清19 75 74 1.00 1.4％
血清20 75 80 -5.00 -6.3％
血清21 84 89 -5.00 -5.6％
血清22 96 96 0.00 0.0％
血清23 116 115 1.00 0.9％
血清24 128 122 6.00 4.9％
血清25 134 128 6.00 4.7％
血清26 145 141 4.00 2.8％
血清27 164 153 11.00 7.2％
血清28 153 163 -10.00 -6.1％
血清29 212 198 14.00 7.1％
血清30 308 303 5.00 1.7％
表3的结果表明，本发明制备的试剂盒与对比例1相关性较好，测值一致。
校准通过后，测定同一血清样本，测10次，通过检测10次的浓度结果求得平均值、SD值、计算出CV值。结果见表4：
表4
Figure BDA0002512725580000081
Figure BDA0002512725580000091
从表4数据可以看出，实施例4对同一样本的测定结果，重复性和对比例1相差不多，说明本试剂测定样本具有很好的精确度。
测定自配试剂的线性样本，将800IU/mL的抗链球菌溶血素“O”抗原稀释为5个浓度，每个浓度测定结果见表5：
表5
Figure BDA0002512725580000092
实施例5本发明含有上述致敏胶乳的检测试剂盒，包括R1和R2试剂，其中R1包括缓冲液、一价或二价盐、表面活性剂、PEG6000和PC300；R2为含有15％的实施例2制备得到的致敏胶乳。
所述的缓冲液为磷酸盐，浓度为50mM/L。
所述的一价或二价盐为氯化钠，浓度为12g/L。
所述的表面活性剂为吐温系列，浓度为2mL/L。
配制R1的具体操作为：量取1L纯化水于烧杯中，分别加入5.9623g磷酸氢二钠、1.248g磷酸二氢钠、12g氯化钠、20g PEG6000、30g蔗糖，搅拌溶解；在加入2mL PC300、2mL吐温20，搅拌混匀，即得到R1试剂。
试剂盒在生化仪上的应用
测试试剂盒：实施例5的试剂盒、对比例2的C反应蛋白试剂盒(由北京利德曼生物有限公司生产)
测试仪器：日立7100生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：570nm；副波长：700nm；测光点：18-34；样本量：2uL；试剂量R1:R2＝140:140；校准方法：spline
标准曲线的设定：分别将已知浓度的标准品，即0、10、20、40、80、160mg/mL放在校准盘里，设置校准品位置及浓度，得到以下数据，实施例5数据如表6，对比例2数据如表7；：
表6
Figure BDA0002512725580000101
表7
Figure BDA0002512725580000102
取30例不同浓度的临床样本与对比例平行进行检测，得到以下数据如表8，
表8
Figure BDA0002512725580000103
Figure BDA0002512725580000111
表8的结果表明，本发明制备的试剂盒与对比例2相关性较好，测值一致。
校准通过后，测定同一血清样本，测10次，通过检测10次的浓度结果求得平均值、SD值、计算出CV值。结果见表9：
表9
Figure BDA0002512725580000112
从表9数据可以看出，实施例5对同一样本的测定结果，重复性和对比例2相差不多，说明本试剂测定样本具有很好的精确度。
测定自配试剂的线性样本，将160mg/mL的C反应蛋白抗原稀释为5个浓度，每个浓度测定结果见表10：
表10
Figure BDA0002512725580000121
实施例6本发明含有上述致敏胶乳的检测试剂盒，包括R1和R2试剂，其中R1包括缓冲液、一价或二价盐、表面活性剂、PEG6000和PC300；R2为含有17％的实施例3制备得到的致敏胶乳。
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为20mM/L。
所述的一价或二价盐为氯化钠、氯化镁，浓度分别为9g/L、3g/L。
所述的表面活性剂为曲拉通系列，浓度为2mL/L。
配制R1的具体操作为：量取1L纯化水于烧杯中，分别加入2.3849g磷酸氢二钠、0.4992g磷酸二氢钠、9g氯化钠、3g氯化镁、10g PEG6000、10g/L甘露醇、10g/L海藻糖，搅拌溶解；在加入2mL PC300、2mL曲拉通X-100，搅拌混匀，即得到R1试剂。
试剂盒在生化仪上的应用
测试试剂盒：实施例6的试剂盒、对比例3的β2微球蛋白试剂盒(由北京利德曼生物有限公司生产)
测试仪器：日立7100生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：546nm；副波长：750nm；测光点：18-34；样本量：2uL；试剂量R1:R2＝160:40；校准方法：spline
标准曲线的设定：分别将已知浓度的标准品，即0、2.5、5、10、20mg/mL放在校准盘里，设置校准品位置及浓度，得到以下数据，实施例6数据如表11，对比例3数据如表12；
表11
Figure BDA0002512725580000131
表12
Figure BDA0002512725580000132
取30例不同浓度的临床样本与对比例平行进行检测，得到以下数据如表13；
表13
Figure BDA0002512725580000133
Figure BDA0002512725580000141
表13的结果表明，本发明制备的试剂盒与对比例3相关性较好，测值一致。
校准通过后，测定同一血清样本，测10次，通过检测10次的浓度结果求得平均值、SD值、计算出CV值。结果见表14：
表14
Figure BDA0002512725580000142
从表14数据可以看出，实施例6对同一样本的测定结果，重复性和对比例3相差不多，说明本试剂测定样本具有很好的精确度。
测定自配试剂的线性样本，将20mg/mL的β2微球蛋白抗原稀释为5个浓度，每个浓度测定结果见表15，
表15
Figure BDA0002512725580000143
Figure BDA0002512725580000151

Claims (10)

1.一种羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将CDI溶液滴加到胶乳微球溶液，震荡混匀，10-37℃震荡活化20-30min，震荡速度为50-200rpm/min，得到活化的胶乳微球；
步骤二：向步骤一的活化的胶乳微球中加入偶联缓冲液调节pH至7-9；
步骤三：将抗体加入到调节pH后的溶液中，震荡混匀，10-37℃震荡偶联2-3h，震荡速度为50-200rpm/min，得到偶联后的溶液；
步骤四：将牛血清白蛋白母液加入到偶联后的溶液中，震荡混匀，10-37℃震荡封闭1-2h，震荡速度为50-200rpm/min，然后将溶液清洗换液，得到致敏胶乳。
2.根据权利要求1所述的一种羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，所述步骤一中CDI溶液是将CDI用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解后得到的，CDI的浓度为0.01g/mL。
3.根据权利要求1所述的一种羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，所述步骤一中胶乳微球溶液用pH6.0的50mM/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸稀释后得到的，胶乳微球的浓度为1-3％w/v。
4.根据权利要求1所述的一种羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，所述的胶乳微球溶液中胶乳微球的粒径为60-300nm的聚苯乙烯胶乳微球。
5.根据权利要求1所述的一种羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，所述步骤一胶乳微球溶液中胶乳微球的质量mg：CDI溶液的体积μL为1：(10-100)。
6.根据权利要求1所述的一种羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，所述步骤二偶联缓冲液为50-200mM/L磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种，pH在6-10之间。
7.根据权利要求1所述的一种羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，所述步骤三中的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，所述步骤三中，以胶乳微球的重量为计，胶乳微球：抗体＝0.1-0.5％：1。
9.权利要求1-8任何一项所述的制备方法得到的致敏胶乳。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括R1和R2试剂，其中R1包括缓冲液、一价或二价盐、表面活性剂、PEG6000和PC300；R2为含有10％-20％的权利要求9所述的致敏胶乳。
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