KR101376363B1 - 효소 검출 기법 - Google Patents

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킴벌리-클라크 월드와이드, 인크.
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Abstract

효소 또는 효소 억제제의 존재 또는 양을 검출하기 위한 진단용 시험 키트를 제공한다. 진단용 키트는 기질 접합체를 이용하여 기질 및/또는 기질의 효소-촉매화 반응에서 형성된 생성물의 직접 검출을 통해 효소 또는 효소 억제제의 검출을 용이하게 한다. 기질 접합체는 리포터에 연결된(예를 들어, 공유 결합, 물리적 흡착 등으로) 기질을 포함한다. 한 실시양태에서는, 예를 들어, 펩티드, 단백질, 또는 당단백질 기질이 리포터(예를 들어, 착색한 라텍스 입자)에 연결된다. 이 실시양태에서는, 기질은 효소의 절단 표적을 제공한다. 구체적으로, 기질 접합체에 접촉시, 효소는 기질과의 반응을 촉매화하고, 리포터에 연결된 효소 촉매화 반응의 생성물을 포함하는 생성물 접합체를 형성한다. 이어서, 리포터에 의해 나타나는 신호를 사용하여 시험 시료 내의 효소 또는 효소 억제제의 존재 또는 양을 나타낼 수 있다.
진단용 시험 키트, 효소 또는 효소 억제제, 기질 접합체, 생성물 접합체

Description

효소 검출 기법 {ENZYMATIC DETECTION TECHNIQUES}
시험 시료 내의 특정 효소의 존재 또는 양을 결정하는 것이 종종 바람직할 때가 있다. 일부 경우에서는, 효소의 존재만으로도, 예를 들어, 조직 또는 장기 손상의 존재를 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 비정상 효소 농도도 또한 다른 상태, 예컨대 박테리아 또는 바이러스 감염을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 프로테아제(예를 들어, 아스파르트산 프로테아제) 및 메탈로펩티다아제는 칸디다 질염("효모 감염")의 원인이 될 수 있는 미생물인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 병원성을 증가시키는 것으로 여겨진다. 시험 시료 내 효소의 존재 또는 농도는 일부 종류의 암 및 다른 상태에 대한 진단용 마커(marker)의 역할을 할 수도 있다. 예를 들어, 전립선-특이적 항원(PSA)은 전립선암에 있어 잘 알려진 마커이다. 진단용 마커의 다른 예에는 카텝신 B(암), 카텝신 G(폐기종, 류마티스성 관절염, 염증), 플라스미노겐 활성제(혈전증, 만성 염증, 암), 및 유로키나아제(암)이 포함된다.
효소의 존재를 검출하기 위한 한 통상적인 기법이 브라아크-막스비티스(Braach-Maksvytis) 등에 허여된 미국 특허 제6,348,319호에 기재되어 있다. 브라아크-막스비티스 등은 효소에 의한 기질의 소화를 감지함으로써 기능한다. 예를 들어, 브라아크-막스비티스 등의 도 1은 제1 구역(11) 및 제2 구역(12)을 포함하는 장치(10)를 예시한다. 제1 구역(11)에는 프로테아제(16)에 의해 절단가능한 펩티드 연결기(15)를 통해 스트렙타비딘(14)(리포터(reporter))에 연결된 중합체 비드(13)(담체)가 마련되어 있다. 프로테아제(16)를 첨가할 때, 스트렙타비딘(14)이 방출되어, 제2 구역(12)으로 넘어가는데, 이 구역에는 막의 임피던스 변화를 통해 스트렙타비딘의 존재를 검출하는 바이오센서 막(17)이 포함되어 있다(칼럼 5, II. 25-30). 그러나 안타깝게도, 브라아크-막스비티스 등에 의해 기술된 것과 같은 기법은 특정 종류의 응용분야, 예컨대 환자에 의한 비교적 빠른 진단을 필요로 하는 경우(자가진단 또는 의료진의 보조 하에), 너무 복잡하고 비용이 너무 많이 든다.
이에 따라, 시험 시료 내 효소의 존재를 정확히 검출하기 위한 간단하고 저렴한 기법에 대한 필요성이 현재 존재한다.
<발명의 개요>
본 발명의 한 실시양태에 따라, 시험 시료 내의 효소 또는 그의 억제제를 검출하기 위한 방법이 개시된다. 방법은 시험 시료를 각각 리포터에 연결된 기질을 포함하는 다수의 기질 접합체와 접촉시켜 인큐베이션(incubation) 혼합물을 형성하는 것을 포함한다. 기질은 리포터에 연결되어 있으면서 효소 촉매화 반응을 수행하여 리포터에 연결된 생성물을 형성할 수 있다. 리포터는 검출 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 발생시킬 수 있다. 상기 방법은 인큐베이션 혼합물을 그 내부에 기질 접합체 또는 생성물 접합체가 우선적으로 결합하는 제1 검출 구역을 한정하는 크로마토그래피용 매체에 적용하는 것을 추가로 포함한다. 제1 검출 구역 내의 제1 검출 신호의 존재 또는 강도가 결정된다.
제1 검출 신호는 제1 검출 구역 내에서, 예컨대 그 안에 고정된 리포터에 의해 발생할 수 있다. 제1 검출 구역 내의 제1 검출 신호의 강도는 시험 시료 내 촉매 또는 촉매 억제제의 존재를 결정할 수 있다. 예를 들어, 생성물 접합체가 제1 검출 구역에서 포획될 경우, 제1 검출 구역 내의 제1 검출 신호의 강도는 시험 시료 내의 효소의 양에 정비례할 수 있고, 마찬가지로 시험 시료 내의 효소 억제제의 양에 반비례할 수 있다. 반대로, 기질 접합체가 제1 검출 구역에서 포획될 경우, 제1 검출 구역 내의 제1 검출 신호의 강도는 시험 시료 내의 효소의 양에 반비례할 수 있고, 마찬가지로 시험 시료 내의 효소 억제제의 양에 정비례할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 시험 시료 내의 효소 또는 그의 억제제를 검출하기 위한 진단용 키트가 개시된다. 키트는 리포터에 연결된 기질을 각각 포함하는 다수의 기질 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서는, 예를 들어, 리포터는 검출가능한 물질로 표지된 입자를 포함한다. 기질 접합체의 기질은 효소에 의해 촉매화되어 생성물 접합체로서 리포터에 연결된 생성물을 형성하는 반응을 할 수 있다. 키트는 시험 시료와 교통하도록 위치될 수 있는 크로마토그래피용 매체(예를 들어, 다공성 막)를 추가로 포함한다. 크로마토그래피용 매체는 그 내부에 생성물 접합체 또는 기질 접합체가 우선적으로 결합하는 제1 검출 구역을 한정한다. 예를 들어, 수용 물질, 예를 들어 기질의 효소-촉매화 반응 동안 형성된 생성물에 대한 특이성을 가지는 단일클론 항체가, 리포터에 연결된 채 남아있는 반응 생성물에 대한 특이적 결합 친화성을 가지는 제1 검출 구역 내에 고정될 수 있다. 따라서, 생성물 접합체는 제1 수용 물질과 상기 생성물의 특이적 결합을 통해 제1 검출 구역 내에 고정될 수 있고, 생성물에 연결된 리포터로부터 제1 검출 구역에서 발생되는 검출 신호의 존재 또는 강도를 결정하여 시험 시료 중 효소 또는 효소 억제제의 존재 또는 양을 나타낼 수 있다.
특정 실시양태에서는, 크로마토그래피용 매체는 그 안에 기질 접합체 또는 생성물 접합체 중 어느 하나가 포획될 수 있으나, 둘다 포획될 수는 없는 제2 검출 구역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 검출 구역이 생성물 접합체를 포획하도록 설계되었을 경우, 제2 검출 구역은 기질 접합체를 포획하도록 설계될 수 있고, 그 반대도 가능하다. 제2 검출 구역 내에서 예컨대 그 안에 고정된 리포터에 의해 제2 검출 신호가 발생할 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 측면을 하기에 더욱 상세히 기술한다.
본 발명의 최상의 방식을 포함하여, 당업자를 상대로 하는 본 발명의 완전하고 가능하게 하는 개시내용이 명세서의 나머지 부분에서 보다 구체적으로 기술되며, 이는 하기와 같은 첨부된 도면을 참조로 한다.
도 1은 본 발명의 진단용 시험 키트에서 사용될 수 있는 분석 장치의 한 실시양태의 투시도이고;
도 2는 리포터가 기질에 공유결합된 한 실시양태를 그래프로 도시한 것이고;
도 3은 시험 시료 내 효소의 존재 또는 양을 검출하기 위한, 본 발명의 한 실시양태에서 사용될 수 있는 한 분석 기법을 개략적으로 도시한 것이고;
도 4는 시험 시료 내 효소의 존재 또는 양을 검출하기 위한, 본 발명의 또 다른 실시양태에서 사용될 수 있는 또 다른 분석 기법을 개략적으로 도시한 것이다.
본 명세서 및 도면의 참고 기호의 반복 사용은 발명의 동일하거나 유사한 특징 또는 구성요소를 나타내도록 의도된 것이다.
<서열 목록>
서열 1은 본원에 기재된 단백질 키나아제의 검출에서 기질로 이용할 수 있는 예시적인 펩티드 서열을 나타낸다.
<정의>
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "시험 시료"는 일반적으로 효소 및/또는 효소 억제제를 함유하는 것으로 의심되는 물질을 가리킨다. 예를 들어, 시험 시료는 혈액, 세포간 체액, 침, 안구 렌즈 체액, 뇌척수액, 땀, 소변, 모유, 복수액(ascites fluid), 점액, 윤활액(synovial fluid), 복막액(peritoneal fluid), 질액, 양수 등을 포함하는 생리학적 체액과 같은 생물학적 공급원으로부터 수득되거나 유도될 수 있다. 생리학적 체액 외에도, 환경 또는 식품 제조 분석의 수행을 위해 물, 식품 등과 같은 다른 액체 시료를 사용할 수도 있다. 또한, 고체 물질도 시험 시료로서 사용할 수 있다. 시험 시료는 공급원으로부터 수득된 채로 직접, 또는 시료의 특성을 변경시키는 전처리 후에 사용할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 전처리는 혈액으로부터 혈장을 제조하는 것, 점성 체액을 희석하는 것 등을 포함할 수 있다. 전처리 방법은 또한 여과, 침전, 희석, 증류, 혼합, 농축, 간섭 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수도 있다. 더욱이, 고체 시험 시료를 변형시켜 액상 매질을 형성하는 것, 효소 및/또는 효소 억제제를 방출하는 것 등이 유익할 수도 있다.
<상세한 설명>
이제 본 발명의 다양한 실시양태를 상세히 언급할 것이며, 그 중 하나 이상의 실시예를 하기에 기술한다. 각 실시예는 본 발명의 제한이 아닌, 본 발명을 설명의 방식으로 제공된다. 실제로 당업자에게는, 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 각종 변경예 및 변형예가 본 발명에서 이루어질 수 있음이 자명할 것이다. 예를 들어, 한 실시양태의 일부로서 예시되거나 기술되는 특징은 또 다른 실시양태에서 사용되어 또 다른 추가적 실시양태를 초래할 수도 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 그의 균등물의 범위 내에 속하는 이러한 변경 및 변형을 모두 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명은 일반적으로 효소 또는 효소 억제제의 존재 또는 양을 검출하기 위한 진단용 시험 키트에 관한 것이다. 진단용 키트는 기질을 효소-촉매화 반응에 이용하여 시험 시료 내의 효소 또는 효소 억제제의 검출을 용이하게 한다. 기질은 리포터에 연결된(예를 들어, 공유 결합, 물리적 흡착 등으로) 기질을 포함하는 기질 접합체의 형태로 존재한다. 한 실시양태에서는, 예를 들어, 펩티드, 단백질 또는 당단백질 기질이 착색된 라텍스 입자에 연결된다. 기질 접합체에 접촉시, 효소는 기질을 절단하고 생성물을 형성할 수 있다. 그러나, 효소에 의해 촉매화되는 반응은 리포터 또는 리포터에 대한 기질의 연결에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 반응 생성물은 리포터에 연결된 생성물을 포함하는 생성물 접합체의 형태일 것이다. 리포터에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 발생한 신호를 사용하여 시험 시료 내의 효소 또는 효소 억제제의 존재 또는 양을 나타낼 수 있다.
다양한 종류의 효소가 본 발명에 따라 검출될 수 있다. 예를 들어, 전이효소, 가수분해효소, 리아제 등이 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 관심 효소가 "가수분해효소" 또는 "가수분해성 효소"인데, 이는 가수분해 반응을 촉매화하는 효소를 가리킨다. 이러한 가수분해성 효소의 예에는 프로테아제, 펩티다아제, 리파아제, 뉴클레아제, 호모- 또는 헤테로-올리고사카리다아제, 호모- 또는 헤테로-폴리사카리다아제, 포스파타아제, 술파타아제, 뉴라미니다아제 및 에스테라아제가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서는, 예를 들어 펩티다아제가 검출될 수 있다. "펩티다아제"는 보다 짧은 펩티드에서 발견되는 펩티드 결합을 절단하는 가수분해성 효소이다. 펩티다아제의 예에는 메탈로펩티다아제; 디펩티딜펩티다아제 I, II 또는 IV 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서는, 프로테아제가 검출될 수 있다. "프로테아제"는 보다 긴 펩티드 및 단백질에서 발견되는 펩티드 결합을 절단하는 가수분해성 효소이다. 본 발명에 따라 검출될 수 있는 프로테아제의 예에는 세린 프로테아제(예를 들어, 키모트립신, 트립신, 엘라스타아제, PSA 등), 아스파르트산 프로테아제(예를 들어, 펩신), 티올 프로테아제(예를 들어, 프로호르몬 티올 프로테아제), 메탈로프로테아제, 산 프로테아제, 및 알칼리성 프로테아제가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 효소가 브론스타인( Bronstein ) 등에 허여된 미국 특허 제6,243,980호 및 예( Yue ) 등에 허여된 제2004/0081971호에 기재되어 있으며, 이들은 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용한다.
상기 기재된 것과 같은 기질을 절단하는 효소 이외에, 진단용 키트를 다르게는 기질 상에 결합의 형성을 촉매화하는 효소의 존재를 검출하기 위해 이용할 수 있다. 예를 들어, 기질에 관능기를 전달하는 전이효소, 제2 분자를 기질에 공유 결합시키는 리가아제, 또는 중합효소를 검출할 수 있다. 검출할 수 있는 예시적인 전이효소에는 키나아제 및 메틸라제가 포함된다. 예를 들어, 단백질 키나아제, 크레아틴 키나아제, 헥소키나아제 등을 포함하는 키나아제를 기질의 인산화의 검출을 통해 검출할 수 있다. 메틸라제, 예컨대 메틸라제 II는 하나 이상의 메틸기가 기질에 첨가되는 것을 통해 검출할 수 있다.
마찬가지로, 각종 공지된 효소 억제제 중 임의의 것이 본 발명에 따라 검출될 수 있다. 예를 들어, 가수분해성 효소의 공지된 억제제에는 프로테아제, 펩티다아제, 리파아제, 뉴클레아제, 호모- 또는 헤테로-올리고사카리다아제, 호모- 또는 헤테로-폴리사카리다아제, 포스파타아제, 술파타아제, 뉴라미니다아제 및 에스테라아제의 억제제가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 프로테아제 억제제에는 예를 들어 아스파르트산 프로테아제 억제제, 세린 프로테아제 억제제, 티올 프로테아제 억제제, 메탈로프로테아제 억제제, 산 또는 알칼리성 프로테아제 억제제 등이 포함될 수 있다. 프로테아제 억제제의 일부 구체예에는 벤즈아미드인, 인돌, 펩스타틴, 오보마크로글로불린, 할로페리돌, 전이 상태 모방체(transition state mimetic) 등이 포함된다. 전이효소 억제제의 일부 구체예에는 글루타티온 S-전이효소를 억제하는 에타크린산 및 벤조시클로헵타피리딜 파네실 전이효소 억제제(FTI)인 사라사(sarasar)®가 포함된다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 기질 접합체가 효소 또는 효소 억제제의 존재 또는 양을 검출하는데 사용된다. 기질 접합체는 리포터에 연결된 기질을 포함한다. 용어 "기질"은 일반적으로 효소의 존재하에 또는 효소에 의해 화학적으로 작용하여 생성물을 형성하게 되는 물질을 나타낸다. 기질은 천연적으로 발생하거나 합성일 수 있다. 기질의 구체적 종류에는, 예를 들어, 단백질 또는 당단백질, 펩티드, 핵산(예를 들어, DNA 및 RNA), 항원, 항체, 탄수화물, 지질, 에스테르, 이들의 유도체 등이 포함될 수 있다. 가수분해성 효소를 위한 일부 적합한 기질에는, 예를 들어 에스테르, 아미드, 펩티드, 에테르, 또는 기타 효소적으로 가수분해 가능한 결합을 갖는 화학적 화합물이 포함된다. 효소-촉매화 가수분해 반응은, 예를 들어, 히드록시 또는 아민 화합물을 한 생성물로서, 또한 유리 포스페이트, 아세테이트 등을 제2 생성물로서 산출한다. 펩티다아제 및/또는 프로테아제를 위한 일부 적합한 기질에는 펩티드, 단백질 및/또는 당단백질, 예컨대 카세인(예를 들어, β-카세인, 아조카세인 등), 알부민(예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)), 헤모글로빈, 미오글로빈, 케라틴, 젤라틴, 인슐린, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴 등이 포함될 수 있다. 키나아제 및/또는 메틸라제를 위한 일부 적합한 기질에는 오브알부민(ovalbumin), 펩티드, 크레아틴, 헥소즈, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 지질 등이 포함될 수 있다. 또 다른 적합한 기질이 시몬슨( Simonsson ) 등에 허여된 미국 특허 제4,748,116; 다이아몬드( Diamond ) 등에 허여된 제5,786,137호; 라오 ( Rao ) 등에 허여된 제6,197,537호; 및 헨더슨( Henderson ) 등에 허여된 제6,235,464호; 네모리( Nemori ) 등에 허여된 제6,485,926호에 기재되어 있으며, 이들은 모든 목적을 위해 전물을 본원에 참고로 인용한다.
리포터는 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 발생시킬 수 있는 임의 물질을 포함할 수 있다. 적합한 검출가능한 물질에는, 예를 들어, 색소원(chromogen); 발광성 화합물(예를 들어, 형광, 인광 등); 방사능 화합물; 시각적 화합물(예를 들어, 라텍스 또는 금속성 입자, 예컨대 금); 신호 발생 물질을 함유하는 리포좀 또는 기타 소포체; 효소 및/또는 기질 등이 포함될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 물질로서 사용하기에 적합한 일부 효소가 리트만( Litman ) 등에 허여된 미국 특허 제4,275,149호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용한다. 효소/기질 시스템의 한 예는 효소인 알칼리성 포스파타아제와 기질인 니트로 블루 테트라졸륨-5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 또는 그의 유도체 또는 유사체, 또는 기질인 4-메틸움벨리페릴-포스페이트이다. 기타 적합한 리포터가 주(Jou) 등에 허여된 미국 특허 제5,670,381호 및 타르차(Tarcha) 등에 허여된 제5,252,459호에 기재되어 있으며, 이들은 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용한다.
일부 실시양태에서는, 리포터가 광학적으로 검출가능한 신호를 생성하는 발광성 화합물을 함유할 수 있다. 발광성 화합물은 분자, 중합체, 덴드리머, 입자 등일 수 있다. 예를 들어, 적합한 형광 분자에는 플루오레세인(fluorescein), 유로퓸 킬레이트, 피코빌린 단백질(phycobiliprotein), 로다민 및 이들의 유도체 및 유사체가 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 기타 적합한 형광 화합물은 "양자점(quantum dot)"으로 흔히 불리는 반도체 나노결정이다. 예를 들어, 이러한 나노결정은 화학식 CdX(식 중, X는 Se, Te, S 등임)의 핵을 함유할 수 있다. 나노결정은 또한 화학식 YZ(식 중, Y는 Cd 또는 Zn이고, Z는 S 또는 Se임)의 상부 쉘로써 부동화(passivated)될 수도 있다. 적합한 반도체 나노결정의 다른 예가 또한 바버라-길렘( Barbera - Guillem ) 등에 허여된 미국 특허 제6,261,779호 및 다프리치( Dapprich )에 허여된 제6,585,939호에 기재되어 있을 수 있으며, 이들은 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용한다.
또한, 적합한 인광 화합물에는 하나 이상의 금속, 예컨대 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 백금, 인듐, 팔라듐, 몰리브덴, 테크네튬, 구리, 철, 크롬, 텅스텐, 아연 등의 금속 착체가 포함될 수 있다. 특히 바람직한 것은 루테늄, 레늄, 오스뮴, 백금 및 팔라듐이다. 금속 착체는 수성 또는 비수성 환경에서 착체의 가용성을 촉진하는 하나 이상의 리간드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 리간드의 일부 적합한 예에는 피리딘; 피라진; 이소니코틴아미드; 이미다졸; 비피리딘; 테르피리딘; 페난트롤린; 디피리도페나진; 포르피린, 포르핀 및 이들의 유도체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 리간드는 예를 들어 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, 카르복실레이트, 카르복스알데히드, 카르복스아미드, 시아노, 아미노, 히드록시, 이미노, 히드록시카르보닐, 아미노카르보닐, 아미딘, 구아니디늄, 우레이드, 황 함유 기, 인 함유 기, 및 N-히드록시-숙신이미드의 카르복실레이트 에스테르로 치환될 수 있다.
포르피린 및 포르핀 금속 착체는 메틸렌 다리와 함께 커플링되어 내부 공간에 금속이 킬레이트화되어 있는 고리형 구조물을 형성하는 피롤기들을 보유한다. 이 분자들 중 다수는 실온에서 적합한 용매(예를 들어, 물) 및 산소가 없는 환경에서 강한 인광 성질을 나타낸다. 인광 성질을 나타낼 수 있는 일부 적합한 포르피린 착체에는 백금(II) 코프로포르피린(coproporphyrin)-I 및 III, 팔라듐(II) 코프로포르피린, 루테늄 코프로포르피린, 아연(II)-코프로포르피린-I, 이들의 유도체 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 유사하게, 인광 성질을 나타낼 수 있는 일부 적합한 포르핀 착체에는 백금(II) 테트라-메조-플루오로페닐포르핀 및 팔라듐(II) 테트라-메조-플루오로페닐포르핀이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 적합한 포르피린 및/또는 포르핀 착체는 슈미트(Schmidt) 등에 허여된 미국 특허 제4,614,723호; 헨드릭스(Hendrix)에 허여된 제5,464,741호; 소이니(Soini)에 허여된 제5,518,883호; 이워트(Ewart) 등에 허여된 제5,922,537호; 새그너(Sagner) 등에 허여된 제6,004,530호; 및 포노마레브(Ponomarev) 등에 허여된 제6,582,930호에 기재되어 있으며, 이들은 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용한다.
비피리딘 금속 착체가 또한 인광 화합물로서 이용될 수 있다. 적합한 비피리딘 착체의 일부 예에는 비스[(4,4'-카르보메톡시)-2,2'-비피리딘] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)프로필]-1,3-디옥솔란 루테늄(II); 비스(2,2'-비피리딘)[4-(부탄-1-알)-4'-메틸-2,2'-비피리딘]루테늄(II); 비스(2,2'-비피리딘)[4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)-부티르산]루테늄(II); 트리스(2,2'-비피리딘)루테늄(II); (2,2'-비피리딘)[비스-비스(1,2-디페닐포스피노)에틸렌] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)프로필]-1,3-디옥솔란 오스뮴(II); 비스(2,2'-비피리딘)[4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘)-부틸아민]루테늄(II); 비스(2,2'-비피리딘)[1-브로모-4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)부탄]루테늄(II); 비스(2,2'-비피리딘)말레이미도헥산산, 4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-부틸아미드 루테늄(II) 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 인광 성질을 나타낼 수 있는 또 다른 적합한 금속 착체가 리히터( Richter ) 등에 허여된 미국 특허 제6,613,583호; 마세이 ( Massey ) 등에 허여된 제6,468,741호; 미드( Meade ) 등에 허여된 제6,444,423호; 마세이 에 허여된 제6,362,011호; 바드( Bard ) 등에 허여된 제5,731,147호; 및 마세이 에 허여된 제5,591,581호에 기재되어 있을 수 있으며, 이들은 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용한다.
일부 경우에는, "시간 분해(time-resolved)" 발광 검출 기법이 이용된다. 시간 분해 검출은 하나 이상의 짧은 광 펄스로 발광성 화합물을 여기한 후, 통상 여기 후에 일정 시간(예를 들어, 대략 1 내지 100 마이크로초) 동안 기다린 후, 잔류 발광 신호를 측정하는 것을 포함한다. 이러한 방식으로, 임의의 단수명 인광 또는 형광 배경 신호 및 산란된 여기 방사선이 제거된다. 다량의 배경 신호를 제거할 수 있는 이러한 능력은 통상의 형광 또는 인광에 비해 2 내지 4배 더 우수한 민감도를 초래할 수 있다. 따라서, 시간 분해 검출은, 특정 발광성 물질의 특징을 활용하여, 발광원으로부터 또는 산란 공정(여기 방사선의 산란에서 비롯됨)으로부터 배경 신호를 감소시키도록 설계된다.
효과적으로 기능하기 위해서는, 시간 분해 기법은 일반적으로 발광성 화합물의 비교적 긴 방출 수명을 필요로 한다. 이는, 화합물이 임의의 단수명 배경 신호가 방산된 후에 신호를 잘 방출하기 위해 요망된다. 또한, 긴 발광 수명은 시간-게이트된(time-gated) 측정에 저렴한 회로를 사용할 수 있게 한다. 예를 들어, 검출가능한 화합물은 발광 수명이 약 1 마이크로초 초과일 수 있으며, 일부 실시양태에서는 약 10 마이크로초 초과, 일부 실시양태에서는 약 50 마이크로초 초과, 일부 실시양태에서는 약 100 마이크로초 내지 약 1000 마이크로초일 수 있다. 또한 화합물은 비교적 큰 "스톡스 이동(Stokes shift)"을 할 수도 있다. 용어 "스톡스 이동"은 일반적으로 발광성 방사선의 스펙트럼 선 또는 밴드가 여기 선 또는 밴드에 비해 더 긴 방출 파장으로 이동하는 것으로 정의된다. 비교적 큰 스톡스 이동은 발광성 화합물의 여기 파장이 방출 파장으로부터 멀리 떨어지게 하며, 여기와 방출 파장간의 큰 차이는 방출된 신호로부터 반사된 여기 방사선을 더욱 쉽게 제거할 수 있게 하므로 바람직하다. 또한, 큰 스톡스 이동은 또한 시료 내 발광성 분자로부터의 간섭 및/또는 일부 체액(예를 들어, 혈액)에 존재하는 단백질 또는 콜로이드로 인한 광산란을 최소화시킨다. 또한, 큰 스톡스 이동은 또한 배경 간섭을 제거하기 위한 고가의 고정밀도 필터의 필요성을 최소화시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는 발광성 화합물이 약 50 나노미터 초과, 일부 실시양태에서는 약 100 나노미터 초과, 일부 실시양태에서는 약 100 내지 약 350 나노미터의 스톡스 이동을 나타낸다.
예를 들어, 시간 분해 검출 기법에 사용하기 위한 형광 화합물의 한 적합한 종류에는 사마륨(Sm(III)), 디스프로슘(Dy(III)), 유로퓸(Eu(III)) 및 테르븀(Tb(III))의 란탄계 원소 킬레이트가 포함된다. 이와 같은 킬레이트는 킬레이트가 실질적으로 더 짧은 파장에서 여기된 후에 강하게 적색-이동된(red-shifted), 좁은 밴드 및 긴 수명의 방출을 나타낼 수 있다. 전형적으로 킬레이트는 분자 내 란탄계 원소에 근접하게 위치한 발색단(chromophore)으로 인해 강한 자외선 여기 밴드를 가진다. 발색단에 의한 여기에 이어서, 여기 에너지가 여기된 발색단으로부터 란탄계 원소로 전이될 수 있다. 그 후, 란탄계 원소의 특징적인 형광 방출이 이어진다. 예를 들어 유로퓸 킬레이트는 플루오레세인의 겨우 약 28 나노미터에 비해, 약 250 내지 약 350 나노미터의 예외적으로 큰 스톡스 이동을 나타낸다. 또한 유로퓸 킬레이트의 형광은 수명이 약 100 내지 약 1000 마이크로초로, 다른 형광 화합물의 약 1 내지 약 100 나노초에 비해 수명이 길다. 게다가, 이들 킬레이트는 통상 약 50% 방출에서 밴드폭이 약 10 나노미터 미만인 좁은 방출 스펙트럼을 가진다. 한 적합한 유로퓸 킬레이트는 N-(p-이소티오시아네이토벤질)-디에틸렌 트리아민 테트라아세트산-Eu+3이다.
또한, 불활성이고, 안정하며, 수성 용액 또는 현탁액 중에서 본질적으로 형광성인 란탄계 원소 킬레이트는 본 발명에 있어서 수성 용액 또는 현탁액 중에서 제한된 용해도 및 소광 문제가 있는 킬레이트를 보호하기 위해 종종 사용되는 마이셀-형성 시약에 대한 필요를 제거하는데 사용될 수도 있다. 이러한 킬레이트의 한 예는 4-[2-(4-이소티오시아네이토페닐)에티닐]-2,6-비스([N,N-비스(카르복시메틸)아미노]메틸)-피리딘이다[참조: Lovgren, T. 등; Clin. Chem. 42, 1196-1201(1996)]. 몇몇 란탄계 원소 킬레이트는 또한 예외적으로 높은 신호-대-노이즈 비를 나타낸다. 예를 들어, 이러한 킬레이트의 하나가 테트라덴테이트 β-디케토네이트-유로퓸 킬레이트이다[참조: Yuan, J. 및 Matsumoto, K.; Anal. Chem. 70, 596-601(1998)]. 상술한 형광 화합물 외에도, 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 화합물들이 뮬리낵스( Mullinax ) 등에 허여된 미국 특허 제6,030,840호; 데이빗슨( Davidson )에 허여된 제5,585,279호; 싱어 ( Singer ) 등에 허여된 제5,573,909호; 비더( Wieder ) 등에 허여된 제6,242,268호; 및 헤밀라( Hemmila ) 등에 허여된 제5,637,509호에 기재되어 있을 수 있으며, 이들은 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용한다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 일부 실시양태에서는 리포터는 검출가능한 신호를 간접적으로 발생시킬 수 있다. 이러한 경우에는, 리포터가 특별히 검출가능한 물질을 함유하지 않아도 되지만, 대신 검출가능한 물질과 상호작용하여 검출 신호를 발생할 수 있어야 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는 리포터는 본원에서 추가로 기재한 바와 같은 특이적 결합쌍의 구성원이거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합쌍의 구성원이거나 이를 포함하는 리포터는 특이적 결합쌍의 또 다른 구성원에 접합된 검출가능한 물질과 접촉될 수 있다. 이에 따라, 생성물 접합체 또는 기질 접합체의 구성원인 리포터는 검출가능한 물질에 결합될 것이고, 이제 검출가능한 물질에 결합된 리포터를 포함하는 접합체는 당업자에게 잘 알려진 기법을 사용하여 용이하게(직접적으로 또는 간접적으로) 검출될 수 있다. 하기에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 리포터가 특이적 결합 구성원을 함유하는 경우, 특이적 결합 구성원은 장치에 고정될 수 있는 것과 같은 다른 특이적 결합 구성원과는 상이하고 이 다른 구성원에 대해 특이적 결합 친화력이 없는 것이 일반적으로 바람직하다.
리포터가 직접 또는 간접적으로 신호를 발생시키는 것과는 상관없이, 리포터는 입자(경우에 따라 "비드" 또는 "마이크로비드"라고 칭해짐)를 함유할 수 있다. 무엇보다도, 입자는 하기에 설명하는 바와 같이, 크로마토그래피용 매체를 통과해 이동하고 검출 구역 내에 고정화되는 리포터의 능력을 향상시킨다. 예를 들어, 천연 발생 입자, 예컨대 핵, 마이코플라스마, 플라스미드, 플라스티드, 포유류 세포(예를 들어, 적혈구 허깨비(erythrocyte ghost)), 단세포 미생물(예를 들어, 박테리아), 다당류(예를 들어, 아가로오스) 등이 사용될 수 있다. 또한 합성 입자도 이용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는 라텍스 입자가 형광 또는 착색 염료로 표지된다. 임의의 라텍스 입자가 사용될 수 있지만, 라텍스 입자는 통상 폴리스티렌, 부타디엔 스티렌, 스티렌아크릴-비닐 삼원공중합체, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐피리딘, 폴리디비닐벤젠, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 아크릴로니트릴, 비닐클로라이드-아크릴레이트 등, 또는 이들의 알데히드, 카르복실, 아미노, 히드록실 또는 히드라지드 유도체로부터 형성된다. 기타 적합한 입자는 주 등에 허여된 미국 특허 제5,670,381호 및 타르차 등에 허여된 제5,252,459호에 기재되어 있을 수 있다. 적합한 형광 입자의 시판되는 예에는 미국 오레곤주 유진 소재의 몰레큘라 프로브스, 인코퍼레이티드(Molecular Probes, Inc.)에서 "플루오스피어(FluoSphere)"(적색 580/605) 및 "트랜스플루오스피어(TransfluoSphere)"(543/620)이란 상표명 하에 판매하는 형광 카르복실화 미소구체, 및 역시 몰레큘라 프로브스, 인코퍼레이티드에서 판매하는 "텍사스 레드(Texas Red)" 및 5- 및 6-카르복시테트라메틸로다민이 포함된다. 또한, 적합한 착색 라텍스 미세입자의 시판되는 예에는 인디아나주 피셔 소재의 뱅스 래버러토리즈, 인코퍼레이티드(Bangs Laboratories, Inc.)에서 판매하는 카르복실화 라텍스 비드가 포함된다.
이용시에는, 입자의 형상은 일반적으로 다양할 수 있다. 한 특정 실시양태에서는, 예를 들어 입자가 구체 형상을 가진다. 그러나 다른 형상, 예컨대 판, 봉, 원판, 막대, 튜브, 불규칙한 모양 등도 본 발명에 의해 고려된다는 것을 이해하여야 한다. 또한 입자의 크기도 또한 다양할 수 있다. 예를 들어, 입자의 평균 크기(예를 들어, 직경)는 약 0.1 나노미터 내지 약 1,000 마이크론, 일부 실시양태에서는 약 0.1 나노미터 내지 약 100 마이크론, 일부 실시양태에서는 약 1 나노미터 내지 약 10 마이크론의 범위일 수 있다. 예를 들어, "마이크론-규모" 입자가 종종 바람직하다. 이용시에는, 이러한 "마이크론-규모" 입자는 평균 크기가 약 1 마이크론 내지 약 1,000 마이크론, 일부 실시양태에서는 약 1 마이크론 내지 약 100 마이크론, 일부 실시양태에서는 약 1 마이크론 내지 약 10 마이크론일수 있다. 마찬가지로, "나노-규모" 입자도 이용될 수 있다. 이러한 "나노-규모" 입자는 평균 크기가 약 0.1 내지 약 10 나노미터, 일부 실시양태에서는 약 0.1 내지 약 5 나노미터, 일부 실시양태에서는 약 1 내지 약 5 나노미터일 수 있다.
리포터는 일반적으로 각종 공지된 기법 중 임의의 기법을 사용하여 기질에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 리포터의 기질에 대한 공유 부착은 카르복실, 아미노, 알데히드, 브로모아세틸, 요오도아세틸, 티올, 에폭시 및 기타 반응성 작용기, 및 커플링 반응을 달성할 수 있는 잔류 자유 라디칼 및 라디칼 양이온을 사용하여 이루어질 수 있다. 표면 작용기 또한 작용기화(functionalized) 공단량체로서 혼입될 수 있는데, 그 이유는 리포터의 표면이 극성기를 비교적 높은 표면 농도로 함유할 수 있기 때문이다. 특정 경우에는, 리포터가 추가적 변형의 필요성 없이 기질에 직접 공유결합될 수 있다. 공유결합 이외에 다른 부착 기법, 예컨대 물리적 흡착도 또한 본 발명에서 이용될 수 있음을 이해하여야 한다. 또 다른 비-공유 연결 기법은 이차 항체(예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 및/또는 비오틴)와 같은 항체 및/또는 항원을 이용할 수 있다.
이제, 리포터를 기질에 공유결합하기 위한 한 특정 기법을 보다 상세히 설명할 것이다. 이 특정 실시양태에서, 기질은 β-카세인이고, 리포터는 착색된 입자이다. 예를 들어, 리포터는 몰레큘라 프로브스 인코퍼레이티드에서 "플루오스피어"란 이름으로 입수가능한 적색 카르복실화 라텍스 입자일 수 있다.
착색 입자를 β-카세인과 공유 접합시키기 위해서는, 도 2에 나타낸 바와 같이 입자 표면상의 카르복실기를 먼저 카르보디이미드(예를 들어, 에틸카르보디이미드 염산염(EDC))로 활성화시킨다. 단백질 및 당단백질 기질(예를 들어, β-카세인)은 전형적으로 리신(K) 잔기의 측쇄 및/또는 각 폴리펩티드의 N-말단 상에 있는 것과 같은 일차 아민기(NH2)를 보유하므로, 활성화 카르복실기는 이어서 기질의 일차 아민(-NH2)기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 이 반응은 완충액, 예컨대 포스페이트-완충 식염수(PBS)(예를 들어, pH 7.2), 2-(N-모르폴리노)에탄 술폰산(MES)(예를 들어, pH 5.3), 또는 보레이트 완충액(예를 들어, pH 8.5) 중에서 일어날 수 있다. 원하는 경우, 생성되는 기질 접합체는 그 후 예를 들어 에탄올아민으로 차단하여 임의의 잔존하는 활성 부위를 차단할 수 있다.
일단 형성되면, 사용자는 시험 시료 및 임의의 다른 필수 성분을 기질 접합체와 함께 일정 시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 효소-촉매화 반응을 위한 인큐베이션 시간이 관심 효소의 활성에 의존하며, 이는 다시 부분적으로 온도, pH, 기질 농도, 억제제의 존재(경쟁적(기질에 결합), 무경쟁적(효소-기질 착체에 결합), 또는 비경쟁적(효소 및/또는 효소-기질 착체에 결합)) 등에 의존한다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 이러한 인자는 원하는 대로 인큐베이션 시간을 증가시키거나 감소시키도록 선택적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 인큐베이션 시간은 약 1분 초과, 일부 실시양태에서는 약 5 내지 약 50분, 일부 실시양태에서는 약 10 내지 약 25분일 수 있다. 마찬가지로, pH는 효소 활성을 촉진시키도록 선택적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 시험 시료 내 높은 수준의 염기성 물질은 일부 효소의 최적 활성에 있어 너무 높은 pH, 예를 들어 8 초과의 pH를 초래할 수 있다. 구체적으로, 효소는 약 3 내지 약 8, 일부 실시양태에서는 약 4 내지 약 7의 pH 수준에서 최적 활성을 보유할 수 있다. 따라서, 원하는 경우, 목적하는 pH를 유지하도록 완충액 또는 기타 pH-변경 화합물을 이용할 수 있다.
인큐베이션 후에는, 시험 시료 내에 존재하는 임의의 효소는 통상 기질 접합체의 적어도 일부의 기질과 반응할 것이다. 그 결과, 생성물 접합체(리포터-생성물), 부분적으로 반응한 착체(예를 들어, 리포터-기질-효소), 미반응 기질 접합체(리포터-기질), 및 이차 반응물질 및 효소-촉매화 반응의 생성물을 포함하는 다양한 화학종을 형성할 수 있다. 예를 들어, 가수분해성 효소의 경우, 효소-촉매화 절단 반응 동안 기질 접합체로부터 절단된 물질이 인큐베이션 혼합물에 포함될 것이다. 기질 상에 새로운 결합을 형성하는 효소-촉매화 반응을 고려할 때에는, 인큐베이션 혼합물에 포함된 물질에는 반응에 포함되는 다른 반응물질(예를 들어, ATP, 메틸-공여 반응물질, 아미노산과 같은 단량체 및 중합효소 또는 리가아제에 의해 기질에 첨가될 수 있는 뉴클레오티드 등) 및 효소-촉매화 반응에서 형성되는 이차 생성물(예를 들어, ADP)이 포함될 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간 및 더 큰 효소 농도는 생성된 인큐베이션 혼합물 중 생성물 접합체의 더 큰 농도를 초래할 수 있다.
본 발명에 따르면, 진단용 시험 키트는 또한 인큐베이션 혼합물 내에 존재하는 다른 화학종으로부터 기질 접합체 및/또는 생성물 접합체를 화학적으로 분리하기 위한 크로마토그래피용 매체를 이용하는 분석 장치를 함유한다. 원심분리와 같은 다른 분리 기법과는 반대로, 크로마토그래피용 매체는, 일회용 키트가 바람직한 경우를 포함하는 다수의 소비자 응용분야에 있어서, 생성되는 진단용 시험 키트를 단순화시키고, 가격을 낮출 수 있다.
이제, 도 1을 참조하여, 예를 들어 본 발명에 따른 효소의 존재 또는 양을 나타내는데 사용될 수 있는 분석 장치(20)의 한 실시양태를 보다 상세히 설명할 것이다. 나타난 바와 같이, 분석 장치(20)는 임의적으로 지지체(21)에 의해 운반되는 크로마토그래피용 매체(23)를 함유한다. 크로마토그래피용 매체(23)는 유체 채널, 다공성 막 등과 같이 유체가 통과할 수 있는 각종 물질 중 임의의 것으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피용 매체(23)는 천연, 합성, 또는 합성적으로 변형된 천연 발생 물질, 예컨대 다당류(예를 들어, 종이와 같은 셀룰로오스 물질 및 셀룰로오스 유도체, 예컨대 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 불활성화 알루미나, 규조토, MgSO4, 또는 기타 미분된 무기 물질이 염화비닐, 염화비닐-프로필렌 공중합체, 및 염화비닐-초산비닐 공중합체와 같은 중합체를 갖는 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 것; 천, 천연 발생(예를 들어, 면) 및 합성(예를 들어, 나일론 또는 레이온) 모두; 다공성 젤, 예컨대 실리카 젤, 아가로오스, 덱스트란, 및 젤라틴; 중합체 필름, 예컨대 폴리아크릴아미드 등으로부터 형성된 다공성 막일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 한 특정 실시양태에서는, 크로마토그래피용 매체가 니트로셀룰로오스 및/또는 폴리에테르 술폰 물질로부터 형성된다. 용어 "니트로셀룰로오스"는 셀룰로오스의 질산 에스테르를 가리키며, 이는 니트로셀룰로오스 단독 또는 질산과 탄소수 1 내지 7의 지방족 카르복실산과 같은 다른 산의 혼합 에스테르일 수 있음을 이해하여야 한다.
지지체(21)는 크로마토그래피용 매체(23)를 운반할 수 있는 임의의 물질로부터 형성될 수 있다. 필수적이지는 않지만, 지지체(21)는 빛이 용이하게 투과될 수 있도록 투명할 수 있다. 또한, 매체를 통과하여 흐르는 유체가 지지체(21)를 통해 누출되지 않도록, 지지체(21)는 액체-비투과성인 것이 또한 일반적으로 바람직하다. 지지체에 적합한 물질의 예에는 유리; 중합체 물질, 예컨대 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르(예를 들어, 마일라(Mylar)® 필름), 폴리부타디엔, 폴리염화비닐, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭사이드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 크로마토그래피용 매체(23)는 지지체(21)위에 주조(cast)될 수 있고, 여기에서 생성되는 적층물은 목적하는 크기 및 형상으로 다이-절단될 수 있다. 대안적으로는, 크로마토그래피용 매체(23)는 단순히 지지체(21)에 예를 들어 접착제로써 적층될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 다공성 막이 마일라® 필름에 접착된다. 감압성 접착제와 같은 접착제를 사용하여 다공성 막을 마일라® 필름에 결합시킨다. 이러한 종류의 적층 구조는 미국 매사추세츠주의 베드포드 소재의 밀리포어 코퍼레이션(Millipore Corp.)로부터 시판되는 것으로 여겨진다. 적합한 적층 구조의 또 다른 예는 덜리(Durley), 3세 등에 허여된 미국 특허 제5,075,077호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 전문을 참고로 분원에 인용한다.
분석 장치(20)는 또한 흡수제 물질(28)을 이용할 수도 있다. 흡수제 물질(28)은 일반적으로 크로마토그래피용 매체(23) 전체를 통해 이동한 유체를 수용한다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 흡수제 물질(28)은 모세관 작용 및 매체(23)을 통한 유체 흐름을 촉진하는데 도움이 될 것이다.
상술한 인큐베이션 공정은 시험 시료를 크로마토그래피용 매체(23)에 적용하기 전에 수행될 수도 있고, 또는 분석 절차의 일부로서(즉, 인큐베이션은 시험 시료가 적용된 후에, 예컨대 인큐베이션 웰 내에서 일어난다) 포함될 수도 있다. 예를 들어, 인큐베이션 혼합물은 크로마토그래피용 매체(23)의 일부에 직접 적용될 수 있으며, 이 매체를 통해 도 1에서 화살표 "L"로 나타낸 방향으로 이동할 수 있다. 대안적으로는, 혼합물이 먼저 시료 패드(22) 또는 크로마토그래피용 매체(23)와 유체 교통하는 다른 물질에 적용될 수 있다. 시료 패드(22)를 형성하는데 사용될 수 있는 일부 적합한 물질에는 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 다공성 폴리에틸렌 패드, 및 유리섬유 여과지가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 원하는 경우, 시료 패드(22)는 패드에 확산적으로 또는 비-확산적으로 부착된, 하나 이상의 분석 전처리 시약을 함유할 수도 있다.
아무튼, 크로마토그래피용 매체(23)는 그 안에서 효소-촉매화 반응의 생성물 접합체 또는 기질 접합체가 포획 및 검출(예를 들어, 간접적으로)될 수 있는 제1 검출 구역(31)을 한정한다. 보다 구체적으로, 제1 검출 구역(31) 내에서 접합체를 포획하는데 이용되는 방법은 생성물 접합체와 기질 접합체 중 하나만이 제1 검출 구역(31) 내에서 포획되도록 생성물 접합체와 기질 접합체를 차별화한다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 크로마토그래피용 매체(23)는 그 안에서 생성물 접합체가 포획되고 검출될 수 있는 제1 검출 구역(31)을 한정한다. 생성물 접합체가 포획되는 방식은 효소-촉매화 반응의 생성물의 특성 및 이용되는 리포터의 특성에 의존할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 생성물 접합체를 포획하기 위해 제1 수용 물질이 제1 검출 구역(31) 내에 고정될 수 있다. 특히, 제1 수용 물질은 기질의 효소 촉매화 반응에서 형성되는 생성물에 대한 특이적 결합 친화력을 나타낼 수 있다. 따라서, 제1 수용 물질이 특이적 결합쌍, 즉, 2개의 상이한 분자 중 하나가 제2 분자에 화학적 및/또는 물리적으로 결합하는 2개의 상이한 분자의 제1 구성원일 수 있고, 특이적 결합쌍의 제2 구성원은 리포터에 연결된 채 남아있는 기질/효소 반응 동안 형성된 생성물일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 특이적 결합 구성원에는 재조합 DNA 방법 또는 펩티드 합성에 의해 형성된 것들을 포함하여 항원, 햅텐, 항체(일차 또는 이차), 및 이들의 착체가 포함될 수 있다. 항체는 단일클론 또는 다클론 항체, 재조합 단백질 또는 그의 혼합물(들) 또는 단편(들), 및 항체와 다른 특이적 결합 구성원의 혼합물일 수 있다. 다른 통상의 특이적 결합 구성원에는 비오틴과 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 캡타비딘 또는 항-비오틴 항체; 단백질 A와 G; 탄수화물과 렉틴, 상보 뉴클레오타이드 서열(표적 핵산 서열을 검출하기 위한 DNA 교잡 분석에서 사용되는 프로브 및 포획 핵산 서열 포함); 재조합 방법으로 형성된 것들을 포함하는 상보 펩티드 서열; 작용자(effector)와 수용체 분자; 호르몬과 호르몬 결합 단백질; 효소 보조인자와 효소, 효소 억제제와 효소; 이들의 유도체 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 특이적 결합쌍에는 본래의 특이적 결합 구성원의 유사체, 유도체 및/또는 단편인 구성원들이 포함될 수 있다. 이와 같은 항체의 제조 및 그의 특이적 결합 구성원으로서의 용도에 대한 적합성의 자세한 사항은 당업자에게 잘 알려져 있다.
한 특정 실시양태에서는, 기질(예를 들어, 오브알부민과 같은 자유 디카르복실산 잔류물을 포함하는 단백질)은 적합한 메틸 공급원, 예컨대 S-아데노실-L-메틸 메티오닌의 존재하에 메틸라제에 의해 메틸화될 수 있다. 메틸화 생성물 접합체는 메틸화 단백질과 메틸화 단백질에 대한 특이적 결합 친화력을 나타내는 수용 물질 사이의 특이적 결합을 통해 제1 검출 구역(31) 내에 고정될 수 있다. 예를 들어, 제1 수용 물질은 메틸화 단백질에 특이적인 단일클론 항체일 수 있다. 생성물 접합체의 고정시에는, 검출가능한 물질(예를 들어, 리포터)에 의해 발생하는 신호를 검출할 수 있다.
또 다른 실시양태에서는, 키나아제를 검출할 수 있다. 예를 들어, 단백질 키나아제, 예컨대 AbI 단백질 키나아제는 리포터에 연결된 펩티드 서열, 예컨대 서열 1을 포함하는 기질 접합체와 인큐베이션할 수 있다. 키나아제 및 포스페이트 공급원, 예를 들어, APT의 존재하에, 펩티드를 인산화할 수 있다. 따라서, 제1 수용 물질은 인산화 반응 후에 서열 1에 특이적인 결합 구성원, 예를 들어, 단일클론 항체 등일 수 있다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 진단용 키트는 제2 검출 구역(35)을 함유할 수 있다. 제1 검출 구역(31)의 하류로 예시되었지만, 이는 본 발명의 요건은 아니고, 제2 검출 구역(35)은 제1 검출 구역(31)의 상류 또는 하류일 수 있다. 제2 검출 구역(35) 내에서, 기질 접합체 또는 생성물 접합체를 포획 및 검출할 수 있다. 예를 들어, 제1 검출 구역(31)이 우선적으로 생성물 접합체를 결합시키는 실시양태를 고려할 경우, 제2 검출 구역(35)은 기질 접합체의 포획을 위해 설계될 수 있고, 그 반대일 수도 있다. 따라서, 제2 검출 구역(35) 내에서, 기질 접합체 및/또는 검출 구역(31)에서 제1 수용 물질에 결합하지 않는 부분적으로 반응한 착체가 포획 및 검출될 수 있다.
예를 들어, 제2 수용 물질이 미반응 기질 접합체, 효소-촉매화 절단 반응 동안 리포터로부터 방출된 기질의 일부, 및/또는 부분적으로 반응한 착체(예를 들어, 리포터-기질-효소 착체)를 위한 고정된 결합 부위의 역할을 할 수 있는 제2 검출 구역(35) 내에 고정될 수 있다. 제2 수용 물질은 효소-촉매화 반응의 생성물에 비해 기질과의 차별적인 결합을 나타내어 이 둘을 구별할 임의의 적합한 결합제일 수 있다. 예를 들어, 제2 수용 물질은 상기 기재된 것과 같은 결합 구성원을 포함할 수 있다. 제2 수용 물질은 바람직하게는 기질 접합체에 특이적으로 결합하기 때문에, 제1 수용 물질과는 상이할 것이다. 예를 들어, 두 물질이 모두 유사한 종류, 예를 들어, 단일클론 항체일 수 있으나, 제1 수용 물질은 기질에 결합하지 않고, 제2 수용 물질은 리포터에 연결된 채 남아있는 효소-촉매화 반응의 생성물에 결합하지 않을 것이다.
상기 기재된 실시예에서, 기질은 메틸라제에 의해 목표로 삼을 수 있는 자유 디카르복실산 잔류물을 포함하는 단백질일 수 있고, 제2 수용 물질은 단백질 기질에 대한 특이적 결합 구성원(예를 들어, 단백질 기질에 대항해 키운 단일클론 항체)일 수 있다. 유사하게, 서열 1과 같은 기질을 고려할 경우, 제2 수용 물질은 서열 1에 특이적으로 결합하는 결합 구성원, 예를 들어 폴리펩티드에 대항해 키운 단일클론 항체일 수 있다.
제1 검출 구역(31) 및 임의의 제2 검출 구역(35)은 일반적으로 사용자가 시험 시료 내 효소의 농도를 더 양호하게 결정할 수 있도록 임의의 수의 구별된 검출 영역을 제공할 수 있다. 검출 구역(31, 35)의 각 영역은 동일하거나 상이한 수용 물질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 검출 구역(31)은 둘 이상의 구별된 검출 영역(예를 들어, 선, 점 등)을 포함할 수 있다. 둘 이상의 구별된 검출 영역의 사용은, 반-정량화(semi-quantification)를 촉진하고/하거나, 기질 접합체 또는 다른 물질의 범람으로 인한 잠재적 양성 오류(false positive)를 억제하는 것과 같은 특정한 이점을 제공할 수 있다. 구역의 검출 영역은 크로마토그래피용 매체(23)를 통한 시험 시료의 흐름에 실질적으로 수직인 방향으로 선 형태로 배치될 수 있다. 마찬가지로, 일부 실시양태에서는, 검출 영역이 매체(23)를 통한 시험 시료의 흐름에 실질적으로 평행인 방향으로 선 형태로 배치될 수 있다.
제1 검출 영역(31)이 생성물 접합체를 포획하기 위해 설계된 실시양태에서는, 시험 시료 중 효소 농도가 증가하기 시작함에 따라, 제1 검출 구역(31)에서 수용 물질에 대한 특이적 결합 친화력을 가지는 더 많은 생성물 접합체가 형성된다. 따라서 제1 검출 구역(31)에서 리포터의 증가된 양은 신호 강도의 증가를 야기한다. 이러한 신호 강도의 증가로부터, 효소의 존재 또는 농도를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 효소의 양이 제1 검출 구역(31)에서의 신호 강도 I1에 정비례한다. 원하는 경우, 신호 강도 I1를 기지의 효소 농도 범위에서 효소 농도에 대해 플로팅하여 강도 곡선을 생성할 수 있다. 그 후, 미지의 시험 시료 내 효소의 양을 결정하기 위해, 신호 강도를 강도 곡선에 따른 효소 농도로 전환할 수 있다.
제1 검출 구역(31)의 하나 이상의 구별된 영역은 신호 강도와 효소 농도간의 상술한 관계를 나타낼 수 있으나, 각각의 구별된 영역이 이러한 관계를 나타낼 필요는 없다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는, 다수의 구별된 영역 중 단 하나가 효소의 농도에 정비례하는 신호 강도를 나타낼 수 있다. 다른 구별된 영역, 예컨대 양성 오류를 감소시키는데 사용되는 영역의 신호 강도는 다르게는 일정하게 유지되거나 신호 강도의 증가 및/또는 감소를 나타낼 수 있다. 검출 구역(31)의 하나 이상의 구별된 영역이 정비례 관계를 만족시키는 한, 제1 검출 구역(31)에 의해 나타내어지는 신호 강도는 효소 농도에 정비례하는 것으로 간주된다.
본 발명에 따라, 관심 효소에 대한 검출 민감도 수준은 목적하는 응용분야에 따라 선택적으로 조절될 수 있다. 검출 민감도를 조절하는 한 특정 기법은 제1 검출 구역(31)에서 사용되는 제1 수용 물질의 양을 조작하는 것을 포함한다. 예를 들어, 분석 시료가 높은 농도의 효소를 함유한다고 의심되는 경우, 제1 수용 물질의 양은 효소-촉매화 반응에 의해 형성될 수 있는 생성물 접합체의 총량을 포획하는데 필요한 최소량과 동일하거나 더 클 수 있다. 따라서, 시험 시료 내에 특정량의 효소가 존재한다면, 매우 높은 백분율의 기질 접합체가 효소와 반응하여 검출 구역(31)에 고정될 수 있는 생성물 접합체를 형성할 것이고, 본질적으로 모든 리포터가 제1 검출 구역(31) 내에 존재할 것이다. 높은 백분율의 생성물 접합체를 포획하는데 필요한 최소량은 실험적으로 결정할 수 있으며, 일반적으로 기질과 효소의 반응성에 의존한다.
향상된 검출 민감도가 바람직한 응용분야(예를 들어, 의심되는 효소의 낮은 농도 또는 짧은 인큐베이션 시간)에서는, 제1 수용 물질의 양이 이용되는 생성물 접합체의 총량을 포획하는데 필요한 최소량보다 많을 수 있다. 이러한 다량의 제1 수용 물질의 사용은 여러 가지 이점을 제공할 수 있는데, 임의의 부분적으로 반응한 착체가 제1 검출 구역(31)에서 포획될 만한 가능성의 증가가 이에 포함되며, 아니면 효소 농도가 실제 농도보다 약간 더 낮게 측정될 것이다. 즉, 부분적으로 반응한 착체는 완전히 반응한 생성물 접합체와 비교하여 입체 장애 등으로 인해 일반적으로 수용 물질에 보다 덜 결합할 것이다. 이는 부분적으로 반응한 착체가 제1 검출 구역(31)에 결합할 기회를 통계적으로 감소시킨다.
기질 접합체가 제2 반응 구역(35)에서 직접 검출가능할 경우, 효소 농도의 감소는 기질 접합체 및/또는 부분적으로 반응한 착체의 존재로 인해 제2 검출 구역(35)에서 신호 강도 I2의 증가를 야기한다. 상기 신호 강도의 증가로부터, 효소의 존재 또는 농도를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 효소의 양은 제2 검출 구역(35)에서의 신호 강도 I2에 반비례한다. 원하는 경우, 신호 강도 I2를 기지의 효소 농도 범위에서 효소 농도에 대해 플로팅하여 강도 곡선을 생성할 수 있다. 그 후, 미지의 시험 시료 내 효소의 양을 결정하기 위해서는, 신호 강도를 강도 곡선에 따른 효소 농도로 전환할 수 있다. 제1 검출 구역(31)에 대해 상기 논의한 바와 같이, 제2 검출 구역(35)의 한 구별된 영역이 역 관계를 만족시키는 한, 제2 검출 구역(35)에 의해 나타나는 신호 강도는 효소 농도에 반비례하는 것으로 간주된다는 것을 이해하여야 한다.
또한, 제1 검출 구역(31)에서의 신호 강도(I1)와 제2 검출 구역(35)에서의 신호 강도(I2) 사이에 역 관계가 존재할 수 있다. 예를 들어, 소정량의 리포터가 존재하므로, 제2 검출 구역(35)에서 포획되는 양은 제1 검출 구역(31)에서 포획되는 양에 반비례한다. 이러한 역 관계로 인해, 일부 경우에는 두 검출 구역 모두에서의 신호 강도를 비교하여 연장된 범위에 걸쳐 효소의 농도를 보다 효과적으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 효소의 양은 신호 강도 "I2"에 대한 신호 강도 "I1"의 비에 정비례한다. 상기 비가 속하는 범위를 근거로, 효소에 대한 일반적인 농도 범위를 결정할 수 있다. 원하는 경우, I2에 대한 I1의 비율을 기지의 효소 농도 범위에서 효소 농도에 대해 플로팅하여 강도 곡선을 생성할 수 있다. 그 후, 미지의 시험 시료 내 효소의 양을 결정하기 위해, 신호 강도 비를 강도 곡선에 따른 효소 농도로 전환할 수 있다. I1과 I2 사이의 다른 수학적 관계식을 효소 농도에 대해 플로팅하여 강도 곡선을 생성할 수도 있다는 것을 인지하여야 한다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, I1 / (I1 + I2)의 값을 효소 농도에 대해 플로팅하여 강도 곡선을 생성할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 특정 실시양태에서는 직접적으로 검출가능하지 않은 리포터가 이용될 수 있다. 따라서, 방출시에는, 일반적으로 후속 검출을 위해 리포터가 검출가능한 물질과 일부 방식으로 상호작용하는 것이 요구된다. 예를 들어, 리포터를 포함하는 생성물 접합체 및/또는 기질 접합체에 결합되도록 구성된 검출가능 신호를 생성할 수 있는 프로브(probe)를 이용할 수 있다. 예를 들어, 프로브는 검출가능한 물질로 표지되거나 다르게는 도포된 입자를 함유할 수 있다. 일부 경우에서는, 프로브를 일부 방식으로 변형하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 프로브는 특이적 결합 구성원으로 변형되어 생성물 접합체에 대해 특이적 친화력을 갖는 접합 프로브를 형성할 수 있다. 특이적 결합 구성원은 일반적으로 다양한 잘 알려진 기법 중 임의의 것을 사용하여, 예컨대 상술한 것과 같은 방식의 공유 결합 및/또는 물리적 흡착을 통해 프로브에 접합될 수 있다. 한 특정 실시양태에서는, 프로브 표면상의 카르복실기가 활성화되고 특이적 결합 구성원의 아미노기와 반응하여 아미드 결합을 형성한다. 이용시에는, 프로브 및 리포터에 사용되는 특이적 결합쌍이 제1 수용 물질 및 제2 수용 물질에 사용되는 특이적 결합쌍과는 상이한 것이 일반적으로 요구된다. 이는, 프로브와 리포터가 상술한 결합 기전으로 실질적으로 간섭하지 않는 것을 보장하도록 돕는다.
프로브는 효소 검출 공정 중 임의 단계에서 생성물 접합체 및/또는 기질 접합체와 접촉할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는, 프로브가 검출이 요구되는 영역으로부터 상류의 한 지점에서 분석 장치(20)에 적용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 프로브가 검출 구역(31 및 35)으로부터 상류이지만 시료 패드(22)로부터는 하류에 위치하는 접합 패드(도시되지 않음)에 적용될 수 있다.
이러한 실시양태에서는, 생성물 접합체를 검출하는데 다양한 분석 형식이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서는, 예를 들어 "샌드위치" 분석 형식이 이용되는데, 여기에서는 생성물 접합체가 접합 프로브의 특이적 결합 구성원 및 제2 수용 물질에 대한 친화력을 가진다. 예를 들어, 항체, 항원 등을 포함하는 생성물 접합체는 전형적으로 둘 이상의 결합 부위(예를 들어, 에피토프)를 가진다. 이들 결합 부위 중 하나는 접합 프로브의 특이적 결합 구성원이 차지하게 된다. 그러나 생성물 접합체의 자유 결합 부위는 이어서 제1 검출 구역(31) 내에 고정된 수용 물질에 결합하여, 새로운 삼원 샌드위치 착체를 형성할 수 있다. 대안적으로는, 생성물 접합체를 직접 또는 간접 "경쟁적" 분석 형식을 사용하여 검출할 수도 있다. 이러한 경우에는, 접합 프로브의 특이적 결합 구성원이 생성물 접합체와 동일하거나 유사체일 수 있다. 따라서, 제1 검출 구역(31)에 도달할 때에는, 접합 검출 프로브 및 생성물 접합체가 고정화 수용 물질의 이용가능한 결합 부위를 위해 경쟁한다. 물론 임의의 다른 분석 형식 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다.
생성물 접합체를 간접적으로 검출가능한 상술한 실시양태에 대해서는, 시험 시료 내 효소 농도의 증가가 더 많은 수의 생성물 접합체가 형성되게 한다. 따라서, 샌드위치 분석 형식이 사용되는 경우, 더 많은 생성물 접합체가 접합 프로브에 결합하여 효소의 양이 제1 검출 구역(31)에서의 신호 강도에 정비례한다. 한편, 경쟁적 분석 형식이 사용되는 경우, 효소의 양은 제1 검출 구역(31)에서의 신호 강도에 반비례한다. 임의의 경우에서도, 신호 강도는 기지의 효소 농도 범위에서 효소 농도에 대해 플로팅하여 강도 곡선을 생성할 수 있다. 그 후, 미지의 시험 시료에서의 효소의 양을 결정하기 위해, 신호 강도가 강도 곡선에 따라 효소 농도로 전환될 수 있다.
이제, 도 3을 참조하여, 형광을 이용한 프로테아제의 존재를 검출하는 방법의 한 실시양태를 보다 상세히 설명할 것이다. 먼저, 프로테아제 P를 함유하는 시험 시료를, 기질(47)(예를 들어, 단백질 또는 당단백질)에 연결된 형광 입자(43)를 각각 포함하는 기질 접합체 SC와 혼합한다. 기질 접합체 SC를 충분한 시간 동안 프로테아제 P와 인큐베이션하여, 효소-촉매화 반응을 통해 기질(42)로부터 절단된 폴리펩티드, 미반응 기질 접합체 SC, 프로테아제 P, 및 효소-촉매화 반응을 통해 생성된 생성물(48)에 연결된 형광 입자(43)를 각각 포함하는 효소-촉매화 반응에 의해 생성된 생성물 접합체 PC를 포함하는 인큐베이션 혼합물(도 3에서 번호 65으로 명명됨)을 형성한다. 인큐베이션 혼합물(65)은, 도시된 방향 화살표에 의해 나타내는 바와 같이 시료 패드(22)에 적용된 후, 제1 검출 구역(31)으로 이동한다. 효소-촉매화 반응에 의해 생성된 생성물(48)에 특이적인 제1 수용 물질(90)이 제1 검출 구역(31) 내에 고정된다. 따라서, 제1 검출 구역(31) 내의 이용가능한 결합 부위는 생성물 접합체 PC가 차지할 수 있다. 그러나, 기질 접합체 SC는 제2 검출 구역(35)으로 이동하고, 여기에 함유된, 미반응 기질(47)에 대해 특이적인 결합 구성원인 제2 수용 물질(92)에 결합한다. 따라서 기질(47)에 연결된 형광 입자(43)는 또한 제2 검출 구역(35)로 이동하고 제2 수용 물질에 결합한다.
일단 포획되면, 형광 입자(43)의 신호 강도는 제1 검출 구역(31) 및/또는 제2 검출 구역(35)에서 측정될 수 있다. 형광 검출은 일반적으로 여기 광자로부터 방출 광자를 분리하는 파장 여과, 및 방출 광자를 기록하고 기록가능한 출력신호를 보통 전기 신호 또는 사진 영상으로서 생성하는 검출기를 이용한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 한 형광 검출기는 뉴저지주 에디슨 소재의 스펙스 인더스트리즈, 인코퍼레이티드(SPEX Industries, Inc.)에 의해 판매되는 플루오로로그 III(FluoroLog III) 분광형광계이다. 적합한 형광 검출기의 또 다른 예는 송(Song) 등에 허여된 미국 특허출원공보 제2004/0043502호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용한다. 이 특정 실시양태에서는 형광의 사용이 이용되지만, 임의의 다른 공지된 검출 기법 또한 본 발명에서 이용될 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 다른 적합한 광학 검출 기법에는 인광, 회절, 반사, 투과 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 광학 기록기는 빛을 방출하고 또 검출 신호(예를 들어, 투과되거나 반사된 빛, 방출된 형광 또는 인광 등)를 기록할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 반사율 분광광도계 또는 기록기를 이용하여 시각적 색상을 나타내는 리포터(예를 들어, 착색된 라텍스 미세입자)의 존재를 검출할 수 있다. 한 적합한 반사율 기록기가, 예를 들어 케일러(Kaylor) 등에 허여된 미국 특허출원공보 제2003/0119202호에 기재되어 있고, 이는 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용한다.
신호 강도를 측정하는데 사용된 기법에 관계없이, 프로테아제 P의 절대량은 제1 검출 구역(31)에서의 신호 강도를 제2 검출 구역(35)에서의 신호 강도와 비교함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 상기한 바와 같이, 프로테아제 P의 양은 비 I2/I1에 의해, 이 비를 앞서 확정된 강도 곡선을 사용하여 효소 농도로 전환시킴으로써 결정할 수 있다. 대안적으로는, 신호 강도 I1 또는 I2는 또한 효소의 존재 또는 농도를 나타내는데 독립적으로 사용될 수 있다. 물론, 본 발명은 또한 실제 효소 농도에 대한 특정한 상관관계 없이 단순히 효소의 존재가 신호 강도에 의해 확인되는 정성적 실시양태도 고려한다.
이제, 도 4를 참조하여, 형광을 이용한 전이효소의 존재를 검출하는 방법의 한 실시양태를 보다 상세히 설명할 것이다. 먼저, 전이효소 T를 함유하는 시험 시료를, 기질(67)(예를 들어, 폴리펩티드)에 연결된 형광 입자(43)를 각각 포함하는 기질 접합체 SC와 혼합한다. 기질 접합체 SC를 충분한 시간 동안 전이효소와 인큐베이션하여, 전이효소에 의해 목표된 잔기를 제공할 수 있는 성분(64)(예를 들어, ATP), 미반응 기질 접합체 SC, 전이효소 T, 및 효소-촉매화 반응을 통해 생성된 생성물(68)(예를 들어, 인산화 폴리펩티드)에 연결된 형광 입자(43)를 각각 포함하는 효소-촉매화 반응에 의해 생성된 생성물 접합체 PC를 포함하는 인큐베이션 혼합물(도 4에서 번호 65으로 명명됨)을 형성한다. 인큐베이션 혼합물(65)은, 도시된 방향 화살표에 의해 나타내는 바와 같이 시료 패드(22)에 적용된 후, 제1 검출 구역(31)으로 이동한다. 효소-촉매화 반응에 의해 생성된 생성물(68)에 특이적인 제1 수용 물질(91)이 제1 검출 구역(31) 내에 고정된다. 따라서, 제1 검출 구역(31) 내 이용가능한 결합 부위는 생성물 접합체 PC가 차지할 수 있다. 그러나, 미반응 기질 접합체 SC는 제2 검출 구역(35)으로 이동하고, 여기에 함유된, 미반응 기질(67)에 대해 특이적인 결합 구성원인 제2 수용 물질(93)에 결합한다. 따라서 기질(67)에 연결된 형광 입자(43)는 또한 제2 검출 구역(35)로 이동하고 제2 수용 물질에 결합한다. 일단 포획되면, 본원에 기재된 다른 실시양태에 대해 기재한 바와 같이 신호 강도를 측정하고 분석할 수 있다.
한 예시적인 응용분야에서는, 진단용 키트는 RAS 단백질 활성화 주기에 포함된 효소의 존재를 결정하기 위해 사용될 수 있다. RAS 단백질은 매우 다양한 신호 경로에 대한 중요한 분자 스위치로서 작용한다. 상기 경로는 세포골격(cytoskeleton) 보전, 세포 접착 및 이동, 및 아팝토시스(apoptosis)를 포함하는 공정을 제어한다. RAS 단백질은 활성화 형태(RAS-GTP)와 비활성화 형태(RAS-GDP) 사이를 순환한다.
RAS 단백질은 종종 암에서 탈조절되어 침입 및 전이의 증가 및 아팝토시스의 감소를 야기한다. 따라서, 진단용 키트는 GTP 가수분해 속도를 증가시켜 RAS-GTP를 그의 비활성 RAS-GDP 형태로 되돌리는 GTP아제-활성화 단백질(GAP)의 존재를 결정하기 위해 이용할 수 있다. 예를 들어, GAP 함유 시험 시료는 RAS-GTP 기질에 연결된 형광 입자를 각각 포함하는 기질 접합체와 혼합될 수 있다. 기질 접합체를 충분한 시간 동안 시험 시료와 인큐베이션하여 미반응 기질 접합체(RAS-GTP/입자), GAP, 및 효소-촉매화 반응에 의해 생성된 생성물 접합체(RAS-GDP/입자)를 포함할 수 있는 인큐베이션 혼합물을 형성할 수 있다. 인큐베이션 혼합물은 상기 기재된 바와 같이 시료 패드에 도포된 후, 검출 구역으로 이동한다. 효소-촉매화 반응에 의해 생성된 생성물 RAS-GDP 또는 임의로는 기질 RAS-GTP에 대해 특이적인 수용 물질이 검출 구역 내에 고정된다. 예를 들어, 특정 대사 경로에서 RAS-GTP에 의해 활성화되는 MAP 키나아제가 검출 구역 내에 고정될 수 있다. 따라서, 검출 구역 내에 이용가능한 결합 부위는 우선적으로 MAP 키나아제 수용 물질에 결합하는 기질 접합체(RAS-GTP/입자)가 차지할 수 있다. 따라서 기질에 연결된 형광 입자는 또한 검출 구역 내에 결합될 것이다. 그러나, 생성물 접합체(RAS-GDP/입자)는 우선적으로 MAP 키나아제 수용 물질에 결합하지 않고 검출 구역을 통과할 수 있다. 일단 포획되면, 본원에서 기재된 다른 실시양태를 위해 기재된 바와 같이 신호 강도를 측정하고 분석하여 시험 시료 내 GAP의 존재를 결정할 수 있다.
또 다른 실시양태에서는, 진단용 시험 키트를 이용하여 RAS 활성화 단백질의 존재를 결정할 수 있다. 예를 들어, 진단용 시험 키트를 이용하여 RAS-GDP를 그의 활성화 형태인 RAS-GTP로의 재활성화를 촉매화하는 G 교환 인자(GEF)(예를 들어, CDC25, SOS1, SOS2)의 존재를 결정할 수 있다. 상기 실시양태에 따라, 기질 접합체는 형광 입자에 연결된 단백질의 비활성화 형태인 RAS-GDP를 포함할 수 있다. 기질 접합체를 활성화 GEF 함유 시험 시료와 인큐베이션하면, RAS-GDP가 RAS-GTP 형태로 활성화될 수 있다. 이 경우, 생성물 접합체(RAS-GTP/입자)는 검출 구역 내에 고정된 MAP 키나아제에 의해 포획되어 시험 시료 중 GEF의 존재 또는 양을 결정할 수 있다.
진단용 시험 키트의 또 다른 예시적인 응용분야는 시험 시료 중 앤지오텐신(angiotensin)-전환 효소(ACE)의 존재의 결정일 수 있다. ACE는 앤지오텐신 I의 앤지오텐신 II로의 전환을 촉매화하는 엑소펩티다아제(exopeptidase)이다. 앤지오텐신 I은 주로 앤지오텐신 II에 대한 전구체로서 존재하는 것으로 나타나지만, 앤지오텐신 II는 효능 있는 혈관수축제이고 고혈압, 심장병 및 당뇨성 신장병과 같은 상태에서 역할을 한다고 여겨진다. 상기 특정 실시양태에 따라, 진단용 시험 키트는 리포터에 연결된 앤지오텐신 I을 포함하는 기질 접합체를 포함할 수 있다. 기질 접합체를 ACE 함유 시험 시료와 인큐베이션하면, 앤지오텐신 I이 앤지오텐신 II로 전환될 수 있다. 진단용 시험 키트의 검출 구역은 그 안에 고정된, 앤지오텐신 II에 대해 특이적인 수용 물질, 예컨대 AT1 또는 AT2 수용체를 함유할 수 있다. 검출 구역 내에서 생성물 접합체(앤지오텐신 II/리포터)의 결합 및 검출은 시험 시료 내 ACE의 존재를 나타낼 수 있다.
본 발명의 진단용 키트는 상기 기재된 검출 구역(31, 35) 이외에 다른 검출 구역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 분석 장치는 임의로 보정(calibration) 구역을 포함할 수 있다. 이 실시양태에서는, 보정 구역(나타내진 않음)은 막(23) 상에 형성되고 검출 구역(31) 및 임의의 검출 구역(35)으로부터의 하류에 놓인다. 그러나, 대안적으로, 보정 구역은 검출 구역(31) 및/또는 임의의 검출 구역(35)으로부터의 상류에 놓일 수도 있다. 보정 구역에는 막(23)의 길이를 통과하는 임의의 보정 프로브에 결합할 수 있는 수용 물질이 제공된다. 이용시에는, 보정 프로브는 기질 접합체 및 생성물 접합체를 위해 사용되는 검출가능한 물질과 동일하거나 상이한 검출가능한 물질을 함유할 수 있다. 더욱이, 보정 프로브는 상기 기재된 특이적 결합 구성원과도 접합할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 비오틴화 보정 프로브를 사용할 수 있다. 일반적으로, 보정 프로브는 검출 구역(31) 및 검출 구역(35)에서 제1 또는 제2 수용 물질과 결합하지 않도록 하는 방식으로 선택된다. 보정 구역의 수용 물질은 검출 구역(31) 또는 검출 구역(35)에서 사용되는 수용 물질과 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 검출 구역의 수용 물질은 생물학적 수용 물질, 예컨대 항원, 햅텐, 항체-결합 단백질(예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A/G), 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 캡타비딘, 일차 또는 이차 항체, 또는 이들의 착체이다. 모든 목적을 위해 그 전문을 본원에 참고로 인용하는 송(Song) 등에게 허여된 미국 특허출원공보 제2003/0124739호에 기재된 바와 같이 보정 구역의 수용 물질(예를 들어, 고분자 전해질)을 위해 다양한 비생물학적 물질을 이용하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
이용시에는, 고분자 전해질은 실(net) 양전하 또는 음전하, 및 일반적으로 중성인 실전하를 가질 수 있다. 예를 들어, 실 양전하를 가지는 고분자 전해질의 일부 적합한 예에는 폴리리신(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 케미컬 코퍼레이션(Sigma-Aldrich Chemical Co.)으로부터 시판됨), 폴리에틸렌이민; 에피클로로히드린-관능화 폴리아민 및/또는 폴리아미도아민, 예컨대 폴리(디메틸아민-co-에피클로로히드린); 폴리디알릴디메틸-암모늄 클로라이드; 양이온성 셀룰로오스 유도체, 예컨대 셀룰로오스 공중합체 또는 사차 암모늄 수용성 단량체로 그래프트된 셀룰로오스 유도체 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 한 특정 실시양태에서는, 사차 암모늄 수용성 단량체를 함유하는 셀룰로오스계 유도체인 셀쿼트(CelQuat)® SC-230M 또는 H-100(내셔날 스타치 앤 케미컬, 인코퍼레이티드(National Starch & Chemical, Inc.)로부터 이용가능함)을 이용할 수 있다. 또한, 실 음전하를 가지는 고분자 전해질의 일부 적합한 예에는 폴리아크릴산, 예컨대 폴리(에틸렌-co-메타크릴산, 나트륨 염) 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 다른 고분자 전해질, 예컨대 양쪽성 고분자 전해질(즉 극성 및 비극성 부분을 가짐)도 이용할 수 있음을 또한 이해하여야 한다. 예를 들어, 적합한 양쪽성 고분자 전해질의 일부 예에는 폴리(스티릴-b-N-메틸 2-비닐 피리디늄 요오다이드) 및 폴리(스티릴-b-아크릴산)이 포함되나, 이에 한정하지는 않으며, 이 둘 모두는 캐나다 도발 소재의 폴리머 소스, 인코퍼레이티드(Polymer Source, Inc.)로부터 시판된다.
임의의 고분자 전해질을 일반적으로 사용할 수 있지만, 특정 적용을 위해 선택된 고분자 전해질은 기질 접합체, 생성물 접합체, 보정 프로브, 막 등의 특성에 따라 다양할 수 있다. 특히, 고분자 전해질의 분포된 전하는 반대 전하를 가지는 물질에 결합하는 것을 허용한다. 따라서, 예를 들어, 실 양전하를 가지는 고분자 전해질은 종종 음성으로 대전된 프로브에 더 양호하게 결합될 수 있고, 실 음전하를 가지는 고분자 전해질은 종종 양성으로 대전된 프로브에 더 양호하게 결합될 수 있다. 따라서, 이러한 경우, 이들 분자 사이의 이온성 상호작용은 보정 구역 내에서 요구되는 결합이 일어나는 것을 허용한다. 그럼에도, 이온성 상호작용이 보정 구역에서 목적하는 결합을 달성하는데 주로 이용되지만, 고분자 전해질도 또한 유사한 전하를 가지는 프로브와 결합될 수 있다.
고분자 전해질이 프로브에 결합되도록 설계되기 때문에, 고분자 전해질이 실질적으로 막(23)의 표면상에 비확산적으로 고정되는 것이 전형적으로 바람직하다. 그렇지 않다면, 프로브는 사용자에 의해 용이하게 검출가능하지 않을 수 있다. 따라서, 고분자 전해질은 실질적으로 막(23)의 매트릭스에 확산되지 않도록 하는 방식으로 막(23)에 적용될 수 있다. 특히, 고분자 전해질은 막(23)의 표면 상에 존재하는 관능기와 이온 및/또는 공유 결합을 형성하여 그 위에 고정된 채 남는다. 필수적이진 않지만, 그 위에 고분자 전해질을 보다 영구적으로 고정시키기 위해 고분자 전해질과 막(23) 사이의 공유 결합의 형성이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 고분자 전해질을 형성하기 위해 사용되는 단량체를 먼저 용액으로 형성한 후 막(23)에 직접 도포한다. 다양한 용매(예를 들어, 유기 용매, 물 등)을 이용하여 용액을 형성할 수 있다. 일단 도포되면, 열, 전자빔 방사, 자유 라디칼 중합 등을 사용하여 단량체의 중합을 개시한다. 일부 경우, 단량체가 중합됨에 따라, 단량체는 막(23)의 특정 관능기와 공유 결합을 형성하여, 그 위에 생성된 고분자 전해질이 고정된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 에틸렌이민 단량체는 일부 막(예를 들어, 니트로셀룰로오스)의 표면 상에 존재하는 카르복실기와 공유 결합을 형성할 수 있다.
또 다른 실시양태에서는, 고분자 전해질은 막(23)에 도포되기 전에 형성될 수 있다. 원하는 경우, 고분자 전해질을 유기 용매, 물 등을 사용하여 먼저 용액으로 형성할 수 있다. 그 후, 고분자 전해질 용액을 막(23)에 직접 도포한 후 건조시킨다. 건조시에는, 고분자 전해질은 고분자 전해질과 반대의 전하를 가지는 막(23)의 표면상에 존재하는 특정 관능기와 이온 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 양으로 대전된 폴리에틸렌이민은 일부 막(예를 들어, 니트로셀룰로오스)의 표면상에 존재하는 음으로 대전된 카르복실기와 이온 결합을 형성할 수 있다.
또한, 다양한 널리 공지된 기법을 사용하여 고분자 전해질을 막(23)에 가교할 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는, 에피클로로히드린 관능화 폴리아민 및/또는 폴리아미도아민을 양으로 대전된 가교성 고분자 전해질로 사용할 수 있다. 이들 물질의 예는 케임(Keim)에게 허여된 미국 특허 제3,700,623호, 케임에게 허여된 제3,772,076호, 케임에게 허여된 제4,537,657호에 기재되어 있으며, 이들은 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참고로 인용하는 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재의 허큘레스, 인코퍼레이티드(Hercules, Inc.)에 의해 상품명 카이멘(Kymene)™하에 판매된다고 여겨진다. 예를 들어, 카이멘™ 450 및 2064는 특정 종류의 막(예를 들어, 니트로셀룰로오스)상에 존재하는 카르복실기와 공유 결합을 형성하고 경화시 막의 중합체 골격과 가교할 수 있는 사차 암모늄 기 및 에폭사이드 고리를 함유하는 에피클로로히드린-관능화 폴리아민 및/또는 폴리아미도아민 화합물이다. 일부 실시양태에서는, 가교 온도는 약 50℃ 내지 약 120℃의 범위일 수 있고 가교 시간은 약 10 내지 약 600초의 범위일 수 있다.
막(23)상에 고분자 전해질을 비확산적으로 고정시키기 위한 다양한 기법을 상기에 기재하였지만, 고분자 전해질 화합물을 비확산적으로 고정시키기 위한 임의의 다른 기법을 본 발명에 사용할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 사실상, 상술한 방법은 본 발명에 사용할 수 있는 기법을 오직 예시하고자 한 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는, 이러한 고분자 전해질의 막(23)의 매트릭스로의 확산을 실질적으로 억제할 수 있는 특정 성분을 고분자 전해질 용액에 첨가할 수 있다.
일부 경우, 막(23)은 분석이 적절히 수행되고 있다는 신호를 사용자에게 제공하는 제어 구역(나타내지 않음)도 한정할 수 있다. 예를 들어, 제어 구역(나타내지 않음)은 일반적으로 프로브와 또는 프로브 상에 고정된 수용 물질과 화학적 및/또는 물리적 결합을 형성할 수 있는 고정된 수용 물질을 함유할 수 있다. 이러한 수용 물질의 일부 예에는 항원, 햅텐, 항체, 단백질 A 또는 G, 아비딘, 스트렙타비딘, 이차 항체, 및 이들의 착체가 포함된다. 또한, 제어 구역 수용 물질을 위해 다양한 비생물학적 물질을 이용하는 것도 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는, 제어 구역 수용 물질은 비포획 프로브에 결합할 수 있는 상기 기재한 것과 같은 고분자 전해질을 또한 포함할 수 있다. 제어 구역에서의 수용 물질은 프로브에 대해서만 특이적이기 때문에, 분석물의 존재 여부에 관계없이 신호가 형성된다. 제어 구역은 막(23)을 따라 임의의 위치에 놓일 수 있지만, 바람직하게는 검출 구역(31) 및 검출 구역(35)으로부터의 하류에 배치된다.
상술한 검출 기법을 효소의 맥락에서 구체적으로 기재한다. 그러나 언급한 바와 같이, 본 발명은 시험 시료 내 효소 억제제의 존재 또는 양을 검출하는데 동등하게 적합하다. 시험 시료 내 효소 억제제의 존재를 검출하기 위해, 소정량의 상응하는 효소를 시험 시료와 혼합하고 인큐베이션할 수 있다. 일정량의 효소 억제제의 존재하에, 효소-촉매화 반응은 검출가능한 속도로 진행되지 않는다. 따라서, 효소 억제제 농도와 신호 강도간의 관계는 효소 농도와 신호 강도간의 관계와는 반대일 것이다. 설명하자면, 효소-촉매화 반응은 일정량의 억제제의 존재하에서 일어나지 않을 것이다. 따라서, 생성물 접합체가 검출 구역(31)에서 포획되지 않을 것이고, 이는 최소 신호 강도를 발생시킨다. 한편, 효소 억제제의 양이 감소되면, 효소는 상술한 바와 같이 생성물 접합체가 형성되는 것을 야기한다. 이에 따라 검출 구역(31)에서 발생된 신호 강도는 생성물 접합체 존재의 상응하는 증가로 인해 증가하기 시작한다. 마찬가지로, 검출 구역(35)에서 발생되는 신호 강도는, 일부 실시양태에서는, 기질 접합체 존재의 상응하는 감소로 인해 감소하기 시작할 수 있다. 따라서, 이 특정 실시양태에서는, 시험 시료 내의 효소 억제제의 양이 검출 구역(31)에서의 신호 강도에 반비례하고, 검출 구역(35)에서의 신호 강도에 정비례한다.
본 발명의 진단용 시험 키트는 효소 또는 그의 억제제의 현장 시험(on-site testing)을 신속히 수행하는, 비교적 단순하고 비용효율적인 방법을 제공할 수 있다. 시험 키트는, 시험을 수행하는 사람이 즉석 방식으로 매우 신뢰성 높고 일관된 시험 결과에 도움이 되는 시험 조건 하에서 쉽게 관찰할 수 있도록 가시적인 시험 결과를 제공할 수 있다. 진단용 시험 키트는 또한 일회용이어서, 원하는 경우 시험이 완료되면 폐기될 수 있다.
본 발명을 그의 구체적 실시양태와 관련하여 상세히 설명하였으나, 당업자라면 상기 내용을 이해함에 따라 이러한 실시양태의 변경예, 변형예 및 균등예를 용이하게 구상할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 균등물의 범위로 평가되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Song, Xuedong <120> Enzymatic Detection Techniques <130> KCX-1147(20477) <140> <141> <160> 1 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polypeptide <400> 1 Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Pro Phe Ala Lys Lys Lys 1 5 10

Claims (22)

  1. 리포터(reporter)에 연결된 기질을 각각 포함하며, 그의 효소-촉매화 반응이 리포터에 연결된 효소-촉매화 반응의 생성물을 포함하는 생성물 접합체를 형성하는 다수의 기질 접합체; 및
    상기 생성물 접합체가 우선적으로 결합하는 제1 검출 구역 및 상기 기질 접합체가 우선적으로 결합하는 제2 검출 구역을 내부에 한정하는 크로마토그래피용 매체
    를 포함하며, 생성물 접합체의 결합이 상기 제1 검출 구역 내에 제1 검출 신호를 발생시키고 기질 접합체의 결합이 상기 제2 검출 구역 내에 제2 검출 신호를 발생시키고, 효소 또는 그의 억제제의 존재 또는 양이 상기 제1 검출 신호 및 상기 제2 검출 신호로부터 결정될 수 있는, 시험 시료 내의 효소 또는 그의 억제제를 검출하기 위한 진단용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리포터가 상기 제1 검출 신호 및 상기 제2 검출 신호를 직접 발생시킬 수 있는 검출가능한 물질을 포함하는 것인 진단용 시험 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리포터가 기질에 제공되는 특이적 결합쌍의 또 다른 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합쌍의 구성원을 포함하는 것인 진단용 시험 키트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 기질에 제공되는 특이적 결합쌍의 또 다른 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합쌍의 구성원과 접합된 프로브(probe)를 더 포함하며, 상기 프로브가 상기 제1 검출 신호 및 상기 제2 검출 신호를 직접 발생시킬 수 있는 검출가능한 물질을 더 포함하는 것인 진단용 시험 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프로브의 상기 특이적 결합쌍의 구성원이 상기 리포터의 상기 특이적 결합쌍의 구성원에 대한 특이적 결합 친화력을 가지는 것인 진단용 시험 키트.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수용 물질이 상기 제1 검출 구역 내에 고정되고, 상기 생성물 접합체가 상기 수용 물질에 대한 특이적 결합 친화력을 나타내는 것인 진단용 시험 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 수용 물질이 단일클론 항체인 진단용 시험 키트.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 제2 수용 물질이 상기 제2 검출 구역 내에 고정되고, 상기 기질 접합체가 상기 제2 수용 물질에 대한 특이적 결합 친화력을 나타내는 것인 진단용 시험 키트.
  10. 제9항에 있어서, 시험 시료 내의 효소의 양이 상기 제2 검출 신호의 강도에 반비례하는 것인 진단용 시험 키트.
  11. 제9항에 있어서, 시험 시료 내의 효소의 양이 상기 제2 검출 신호의 강도에 대한 상기 제1 검출 구역 신호의 강도의 비에 정비례하는 것인 진단용 시험 키트.
  12. 제1항, 제2항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 시료 내의 효소의 양이 상기 제1 검출 신호의 강도에 정비례하는 것인 진단용 시험 키트.
  13. 제1항, 제2항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 시료 내의 효소 억제제의 양이 상기 제1 검출 신호의 강도에 반비례하는 것인 진단용 시험 키트.
  14. 제1항, 제2항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피용 매체가 보정(calibration) 구역을 추가로 한정하는 것인 진단용 시험 키트.
  15. 제1항, 제2항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피용 매체가 제어 구역을 추가로 한정하는 것인 진단용 시험 키트.
  16. 시험 시료를 다수의 기질 접합체와 접촉시켜 인큐베이션(incubation) 혼합물을 형성하는 단계;
    상기 인큐베이션 혼합물을 크로마토그래피용 매체에 적용하는 단계;
    제1 검출 구역 내의 제1 검출 신호의 존재 또는 강도를 결정하는 단계; 및
    제2 검출 구역 내의 제2 검출 신호의 존재 또는 강도를 결정하는 단계
    를 포함하는, 제1항, 제2항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 진단용 시험 키트를 이용하는 시험 시료 내의 효소 또는 그의 억제제의 검출 방법.
  17. 제16항에 있어서, 효소가 가수분해효소인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 효소가 전이효소, 리가아제, 또는 중합효소인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 전이효소가 키나아제 또는 메틸라제인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 기질이 단백질, 당단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 에스테르, 항체, 항원, 또는 이들의 유도체인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 기질이 카세인, 알부민, 헤모글로빈, 미오글로빈, 케라틴, 젤라틴, 인슐린, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴, 또는 이들의 유도체인 방법.
  22. 제1항, 제2항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 검출 구역은 제2 검출 구역의 상류인 진단용 시험 키트.
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