CN101416057A - 酶检测技术 - Google Patents
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Abstract
提供了用于检测酶或酶抑制剂的存在或含量的诊断测试试剂盒。诊断试剂盒利用底物缀合物通过直接检测底物的酶催化反应中形成的底物和/或产物来帮助检测酶或酶抑制剂。底物缀合物包括连接(例如，共价键合、物理吸附等)报道分子的底物。在一个实施方案中，例如，将肽、蛋白质或糖蛋白底物连接报道分子(例如，染色的乳胶颗粒)。在这个实施方案中，底物提供了酶的分裂目标物。具体地，接触底物缀合物时，酶催化与底物的反应，并形成产物缀合物，该缀合物包括连接报道分子的酶催化反应的产物。通过报道分子呈现的信号然后可以用来表示测试样品中酶或酶抑制剂的存在或含量。
Description
发明背景
通常希望测定测试样品中特定酶的存在或含量。在一些情况中，只不过是酶的存在就可以表示例如组织或器官损伤的存在。同样，异常的酶浓度还可以表示其他病症，如细菌或病毒感染。例如，认为蛋白酶(例如，天冬氨酸蛋白酶)和金属肽酶能提高白色念珠菌(Candidaalibicans)的致病性，白色念珠菌是引起念珠菌阴道炎(“酵母感染”)的微生物。测试样品中酶的存在或浓度也可以作为一些类型的癌症和其他病症的诊断标记。例如，前列腺-特异性抗原(PSA)是公知的前列腺癌标记。诊断标记的其他实例包括组织蛋白酶B(癌症)、组织蛋白酶G(肺气肿、类风湿性关节炎、炎症)、血纤蛋白溶解酶原激活子(血栓形成、慢性炎症、癌症)和尿激酶(癌症)。
Braach-Maksvvtis等的U.S.专利No.6,348,319中描述了检测酶存在的一种常规技术。Braach-Maksvvtis等通过感知酶对底物的消化来进行。例如，Braach-Maksvvtis等的图1说明了包括第一区域11和第二区域12的装置10。第一区域11备有聚合物珠子13(载体)，其通过肽连接物15与链霉抗生物素蛋白14(报道分子)连接，该肽连接物15可通过蛋白酶16来分裂。加入蛋白酶时，链霉抗生物素蛋白被释放出来并传到第二区域12，其包括生物传感器膜17，其通过膜阻抗的变化来检测链霉抗生物素蛋白的存在(第5栏，II.25-30)。然而，不幸地，如Braach-Maksvvtis等描述的技术及其复杂并且对于一些类型的应用成本过高，如需要通过患者相对快速诊断的那些(自我诊断或借助医务人员)。
因此，目前存在对简单而便宜且能精确检测测试样品中酶存在的需要。
发明概述
根据本发明的一个实施方案，公开了检测测试样品中酶或其抑制剂的方法。该方法包括将测试样品与多种底物缀合物接触来形成孵育混合物，每种底物混合物包括连接报道分子的底物。底物与报道分子连接时，能够经历酶催化的反应来形成连接报道分子的产物。报道分子能够直接或间接产生检测信号。该方法进一步包括将孵育混合物施加于层析介质中，该层析介质限定第一检测区域，在该区域内优选结合底物缀合物或产物缀合物。测定第一检测区域内检测信号的存在和强度。
第一个检测信号能够在第一检测区域内产生，如通过固定于其中的报道分子。第一检测区域内第一个检测信号的强度一测定测试样品中酶或酶抑制剂的存在。例如，当第一检测区域中捕获产物缀合物时，第一检测区域中第一个检测信号的强度与测试样品内的酶含量成正比，并且另外可以与测试样品内的酶抑制剂含量成反比。相反，当第一检测区域中捕获底物缀合物时，第一检测区域中第一个检测信号的强度与测试样品内的酶含量成反比，并且另外可以与测试样品内的酶抑制含量成正比。
根据本发明的另一个实施方案，公开了用于检测测试样品中的酶或其抑制剂的诊断试剂盒。该试剂盒包括多个底物缀合物，每个都包括连接报道分子的底物。在一个实施方案中，例如，报道分子包括用可检测的物质标记的颗粒。底物缀合物的底物能够通过酶的催化来进行反应，以形成结合报道分子的产物，作为产物缀合物。该试剂盒进一步包括层析介质(例如，多孔膜)，可以将其放置与测试样品相联系。层析介质限定了第一检测区域，在该区域内优选结合底物缀合物或产物缀合物。例如，可以将接受物质固定于第一检测区域内，该区域对保持连接报道分子的反应产物具有特异性的结合亲和性，例如，底物的酶催化反应过程中形成的产物特异性的单克隆抗体。因此，通过该产物与第一个接受物质的特异性结合，产物缀合物可以在第一检测区域中变成固定的，并且可以从连接产物的报道分子测定第一检测区域中产生的检测信号的存在或强度，来表示测试样品中酶或酶抑制剂的存在或含量。
在特定的实施方案中，层析介质可以进一步包括第二检测区域，在该区域内能够捕获底物缀合物或产物缀合物，但不是同时捕获两者。例如，如果设计第一检测区域来捕获产物缀合物，那么设计第二检测区域来捕获底物缀合物，反之亦可。能够在第二检测区域内产生第二个检测信号，如通过其中固定的报道分子。
以下将更详细地讨论本发明的其他特征和方面。
附图简述
在说明书的剩余部分更具体地列出本领域技术人员关注的本发明的全部和能够公开的内容，包括其最佳方式，这将参照以下的附图，其中：
图1是可以用于本发明诊断试剂盒中的测试装置的一个实施方案的透视图；
图2是用于共价结合报道分子和底物的一个实施方案的图示；
图3是可以用于本发明的一个实施方案中来检测测试样品中酶的存在或含量的一个测试技术的示意图；
图4是可以用于本发明的另一个实施方案中来检测测试样品中酶的存在或含量的另一个测试技术的示意图。
本发明的说明书和附图中参照符号的重复使用用来表示本发明的相同或相似特征或要素。
序列表
SEQ ID NO：1描绘了可以用作蛋白激酶检测中底物的示例性肽序列，如在此所述的。
代表性实施方案的详述
定义
如在此所用的，术语“测试样品”通常指的是怀疑含有酶和/或酶抑制剂的材料。例如，可以从生物来源获得或产生测试样品，生物来源如生理性液体，包括，血液、组织液、唾液、泪液、脑脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、粘液、滑液、腹膜液、阴道液、羊水等。除生理性液体外，可以使用其他液体样品，如水、食品等，用于进行环境或食品生产测试。此外，固体材料可以用作测试样品。可以从来源获得后直接使用测试样品，或者在预处理改变样品特征后使用。例如，这样的预处理可以包括从血液制备血浆、稀释粘性流体等。预处理的方法还可以包括过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、灭活干扰成分、加入试剂等。此外，使固体测试样品变成液体介质、释放酶和/或酶抑制剂等也是有益的。
详述
现在更详细地参照本发明的各种实施方案，以下列出了其中的一个或多个实施例。为解释本发明而不是为限制本发明提供了各个实施例。事实上，本领域技术人员清楚可以在本发明中形成各种改变和变化，而没有脱离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方案的一部分说明或描述的特征，可以用于另一个实施方案中来产生更多的实施方案。因此，确定本发明涵盖这样的改变和变化，因为它们在所附权利要求及其的范围内。
本发明总地涉及用于检测酶或酶抑制剂的存在或含量的诊断试剂盒。该诊断试剂盒使用酶催化反应的底物来帮助检测测试样品中的酶或酶抑制剂。底物以底物缀合物的形式存在，该缀合物包括连接(例如，共价键合，物理吸附等)报道分子的底物。在一个实施方案中，例如，将肽、蛋白质或糖蛋白底物连接染色的乳胶颗粒。接触底物缀合物时，酶可以分裂底物并形成产物。然而，通过酶催化的反应不影响报道分子或底物与报道分子的连接。因此，本发明的产物将是产物缀合物的形式，该缀合物包括连接报道分子的产物。通过报道分子直接或间接产生的信号可以用来表示测试样品中的酶或酶抑制剂的存在或含量。
根据本发明可以检测各种类型的酶。例如，可以检测转移酶、水解酶、裂合酶等。在一些实施方案中，目标酶是“水解酶”或“水解作用酶”，其指的是催化水解反应的酶。这样的水解作用酶的实例包括，但不限于，蛋白酶、肽酶、脂酶、核酸酶、同-或杂-寡糖酶、同-或杂-多糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神经氨酸酶和酯酶。在一个实施方案中，例如，可以检测肽酶。“肽酶”是分裂短肽中存在的肽键的水解作用酶。肽酶的实例包括，但不限于，金属肽酶；二肽酰肽酶I、II或IV；等等。在另一个实施方案中，可以检测蛋白酶。“蛋白酶”是分裂长肽和蛋白质中存在的肽键的水解作用酶。根据本发明可以检测的蛋白酶实例包括，但不限于，丝氨酸蛋白酶(例如，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、PSA等)、天冬氨酸蛋白酶(例如，胃蛋白酶)、巯基蛋白酶(例如，促激素巯基蛋白酶)、金属蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶。还有其他的酶描述于Bronstein等的U.S.专利No.6,243,980和Yue等的2004/0081971中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
除了分裂底物的酶，如上述的那些，在替换的方案中，诊断试剂盒可以用来检测催化底物上键形成的酶的存在。例如，可以检测将官能团转移至底物的转移酶、将第二个分子与底物共价键合的连接酶，或聚合酶。可以检测的示例性转移酶包括激酶和甲基化酶。例如，通过检测底物的磷酸化可以检测包括蛋白激酶、肌酸激酶、己糖激酶等的激酶。通过底物上一个或多个甲基的添加可以检测甲基化酶，如甲基化酶II。
同样，根据本发明，还可以检测各种已知的酶抑制剂中的任一种。例如，已知的水解酶抑制剂包括，但不限于，蛋白酶、肽酶、脂酶、核酸酶、同-或杂-寡糖酶、同-或杂-多糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神经氨酸酶和酯酶的抑制剂。蛋白酶抑制剂可以包括，例如，天冬氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、酸性或碱性蛋白酶抑制剂等。蛋白酶抑制剂的一些特定实例包括苯甲脒、吲哚、抑胃肽、卵巨球蛋白、氟哌啶醇、过渡态模拟物等。转移酶抑制剂的一些特定实例包括利尿酸，其抑制谷胱甘肽S-转移酶，和
，其是苯并环七吡啶基法呢基转移酶抑制剂(FTI)。
如上所述，本发明中使用底物缀合物来检测酶或酶抑制剂的存在或含量。底物缀合物包括连接报道分子的底物。术语“底物”通常指的是通过酶或在酶存在下的化学作用而形成产物的物质。底物可以是天然产生的或是合成的。底物的特定类型包括，例如，蛋白质或糖蛋白、肽、核酸(例如，DNA和RNA)、抗原、抗体、碳水化合物、脂质、酯、其衍生物等。水解酶的一些合适底物包括，例如，酯、酰胺、肽、醚，或具有酶可水解键的其他化合物。酶催化的水解反应可以，例如，形成羟基或酰胺化合物作为一个产物，和游离磷酸盐、醋酸盐等作为第二个产物。肽酶和/或蛋白酶的一些合适底物可以包括肽、蛋白质，和/或糖蛋白，如酪蛋白(例如，β-酪蛋白、偶氮酪蛋白等)、白蛋白(例如，牛血清白蛋白(BSA)、血红蛋白、肌红蛋白、角蛋白、明胶、胰岛素、蛋白多糖、fibronectin、昆布氨酸、胶原蛋白、弹性蛋白等。激酶和/或甲基化酶的一些合适底物可以包括卵清蛋白、肽、肌氨酸、己糖、核苷酸、核苷、脂质等。其他合适的底物描述于Simonsson 等的U.S.专利No.4,748,116；Diamond等的5,786,137；Rao等的6,197,537；和Henderson等的6,235,464；Nemori等的6,485,926中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
报道分子可以包括能够直接或间接产生可检测信号的任何物质。合适的可检测物质可以包括，例如，发色团；发光化合物(例如，荧光的、磷光的等)；放射性化合物；视觉化合物(例如，乳胶或金属颗粒，如金)；脂质体或其他含有信号产生物质的泡囊；酶和/或底物等。例如，适宜用作可检测物质的一些酶描述于Litman等的U.S.专利No.4,275,149中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。酶/底物体系的一个实例是碱性磷酸酯酶和底物硝基蓝四唑鎓-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯，或其衍生物或类似物，或底物甲基
形基(umbelliferyl)-磷酸酯。其他合适的报道分子描述于Jou等的U.S.专利No.5,670,381和Tarcha等的5,252,459中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
在一些实施方案中，报道分子可以含有产生光学可检测信号的发光化合物。发光化合物可以是分子、聚合物、树状聚合物、颗粒等。例如，合适的荧光分子可以包括，但不限于，荧光素、铕螯合物、藻胆蛋白、若丹明及其衍生物和类似物。其他合适的荧光化合物是通常称为“量子点”的半导体纳米晶体。例如，这样的纳米晶体可以含有通式CdX的核心，其中X是Se、Te、S等。还可以用通式YZ的叠加层钝化纳米晶体，其中Y是Cd或Zn，并且Z是S或Se。合适的半导体纳米晶体的其他实例描述于Barbera-Guillem等的U.S.专利No.6,261,779和Dapprich的6,585,939中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
此外，合适的磷光化合物可以包括一种或多种金属的复合物，如钌、锇、铼、铱、铑、铂、铟、钯、钼、锝、铜、铁、铬、钨、锌等。特别优选的是钌、铼、锇、铂和钯。金属复合物可以含有一种或多种促进复合物在含水或非含水环境中的溶解度的配体。例如，配体的一些合适实例包括，但不限于，吡啶；吡嗪；异烟酰胺；咪唑；联吡啶；三吡啶；菲咯啉；联吡啶并吩嗪；卟啉、卟吩，及其衍生物。例如，可以用烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、羧酸酯、醛、羧酰胺、氰基、氨基、羟基、亚氨基、羟羰基、氨羰基、脒、胍盐、酰脲、含硫基团、含磷基团和N-羟基-琥珀酰亚胺的羧酸酯来取代这样的配体。
卟啉和卟吩金属复合物具有与亚甲桥偶联的吡咯基团以形成带有金属螯合内腔的环状结构。这些分子中有许多分子都在室温下在合适的溶剂中(例如，水)和无氧环境下呈现出强烈的磷光性质。一些合适的能呈现出磷光性质的卟啉复合物包括，但不限于铂(II)粪卟啉-I和III、钯(II)粪卟啉、钌粪卟啉、锌(II)-粪卟啉-I，其衍生物等。相似地，一些合适的能呈现出磷光性质的卟吩复合物包括，但不限于，铂(II)四-中-氟苯基卟吩和钯(II)四-中-氟苯基卟吩。还有其他合适的卟啉和/或卟吩复合物描述于Schmidt等的U.S.专利No.4,614,723；Hendrix的No.5,464,741；Soini等的No.5,518,883；Ewart等的No.5,923,537；Sagner 等的No.6,004,530；和Ponomarev等的No.6,582,930中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
联吡啶金属复合物也可以用作磷光化合物。一些合适的联吡啶复合物的实例包括，但不限于，双[(4，4’-甲氧甲酰基)-2，2’-联吡啶]2-[3-(4-甲基-2，2’-联吡啶-4-基)丙基]-1，3-二氧戊环钌(II)；双(2，2’-联吡啶)[4-(丁-1-醛)-4’-甲基-2，2’-联吡啶]钌(II)；双(2，2’-联吡啶)[4-(4’-甲基-2，2’-联吡啶)-4’-基]-丁酸]钌(II)；三(2，2’-联吡啶)钌(II)；(2，2’-联吡啶)[双-双(1，2-二苯基膦基)亚乙基]2-[3-(4-甲基-2，2’-联吡啶-4’-基)丙基]-1，3-二氧戊环锇(II)；双(2，2’-联吡啶)[4-(4’-甲基-2，2’-联吡啶)-丁胺]钌(II)；双(2，2’-联吡啶)[1-溴-4(4’-甲基-2，2’-联吡啶-4-基)丁烷]钌(II)；双(2，2’-联吡啶)马来酰亚胺基己酸，4-甲基-2，2’-联吡啶-4’-丁酰胺钌(II)，等等。还有其他合适的可以呈现出磷光性质的金属复合物描述于Richter等的U.S.专利No.6,613,583；Massey等的No.6,468,741；Meade等的No.6,444,423；Massey等的No.6,362,011；Bard等的No.5,731,147；和Massey等的No.5,591,581中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
在一些情况中，使用“时间-分辨”发光检测技术。时间-分辨检测包括用一个或多个光的短脉冲激发发光化合物，然后在测量剩余发光信号前的激发之后通常等待一定的时间(例如，大约1至100微秒)。用这样的方式除去任何短暂的磷光或荧光背景信号以及分散的激发辐射。这种去除多种背景信号的能力可以使得灵敏度比常规的荧光或磷光高出2至4个数量级。因此，通过利用特定发光材料的特征，设计时间-分辨检测来减少来自发射源或来自散射作用(由激发辐射的散射所产生)的背景信号。
为了有效地作用，时间-分辨技术通常需要相对长的发射持续时间用于发光化合物。这就期望所述化合物在任何短暂的背景信号消散后发射它的信号。此外，长的荧光持续时间使得采用廉价的电路用于时间门测量成为可能。例如，可检测的化合物可以具有大于约1微秒的荧光持续时间，在一些实施方案中，大于约10微秒，在一些实施方案中，大于约50微秒，以及在一些实施方案中，为约100微秒至约1000微秒。此外，所述化合物还可以具有相对大的“斯托克斯频移”。术语“斯托克斯频移”通常定义为与激发线或带相比，发光辐射到比较长的发射波长的谱线或带的位移。相对大的斯托克斯频移使发光化合物的激发波长保持远离它的发射波长，并且这是合乎需要的，因为激发和发射波长之间的巨大差异使得除去来自发射信号的反射激发辐射变得容易。此外，大的斯托克斯频移还能最小化来自样品中的发光分子和/或由于蛋白质或胶体的光散射的干扰，所述蛋白质或胶体与一些体液(例如，血液)一起存在。另外，大的斯托克斯频移还能将为除去背景干扰的昂贵、高精度的过滤器的需求最小化。例如，在一些实施方案中，所述发光化合物具有大于约50纳米的斯托克斯频移，在一些实施方案中大于约100纳米，以及在一些实施方案中，为约100至约350纳米。
例如，一种合适类型的用于时间-分辨检测技术中的荧光化合物包括钐(Sm(III))、镝(Dy(III))、铕(Eu(III))和铽(Tb(III))的镧系元素螯合物。这样的螯合物在基本上较短的波长的激发后，可以呈现出强烈的红移、窄带、长期的发射。通常，由于位于分子中镧系元素附近的发色团，螯合物具有强烈的紫外激发带。在通过所述发色团的激发之后，激发能量可以从激发的发色团转移到镧系元素。这遵循镧系元素荧光发射特性。例如，与荧光素仅有的约28纳米相比，铕螯合物具有约250至约350纳米的特别大的斯托克斯频移。并且，与其他荧光化合物的约1至约100毫微秒相比，铕螯合物的荧光是长期的，具有约100至约1000微秒的持续时间。此外，这些螯合物具有窄的发射光谱，通常在约50％发射时具有小于约10纳米的带宽。一种合适的铕螯合物是N-(对-异硫氰酸根合苄基)-二亚乙基三胺四乙酸-Eu+3。
此外，还可以将在水溶液或悬浮液中惰性、稳定和固有地荧光的镧系元素螯合物用于本发明中以取消对胶束-形成试剂的需要，胶束-形成试剂常常用于保护具有有限溶解度并在水溶液或悬浮液中有猝灭问题的螯合物。此类螯合物的一个实例是4-[2-(4-异硫氰酰苯基)乙炔基]-2，6-双{[N，N-双(羧甲基)氨基]甲基}-吡啶[参考：Lovgren，T.等；Clin.Chem.42，1196-1201(1996)]。几种镧系元素螯合物还显示出特别高的信噪比。例如，一种此类的螯合物是四配位基的β-二酮酯-铕螯合物[参考：Yuan，J.和Matsumoto，K.；Anal.Chem.70，596-601(1998)]。除了上述的荧光化合物之外，其他适用于本发明中的化合物描述于Mullinax等的U.S.专利No.6,030,840；Davidson的No.5,585,279；Singer 等的No.5,573,909；Wieder等的No.6,242,268；和Hemmila等的No.5,637,509中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
如所述的，在本发明的一些实施方案中，报道分子可以间接地产生可检测的信号。在这种情况中，报道分子可以不必特意含有可检测的物质，替代的是能够与可检测的物质相互作用来产生检测信号。例如，在一些实施方案中，报道分子可以是特异性结合对的一个成员或包括特异性结合对的一个成员，如在此将进一步描述的。例如，可以使作为特异性结合对一个成员的报道分子或包括特异性结合对一个成员的报道分子与缀合特异性结合对另一个成员的探针接触。因此，报道分子，其是产物缀合物或底物缀合物的成员，将结合可检测的物质，并且现在缀合物将包括结合可检测物质的报道分子，然后可以使用本领域技术人员公知的技术容易地检测(直接或间接地)。在下文中将更详细地解释，当报道分子含有特异性结合成员时，通常期望特异性结合成员不同于其他特异性结合成员(如可以固定于装置上)并且对其他特异性结合成员不具有特异性的结合亲和性。
不管报道分子是直接或间接地产生信号，它可以含有颗粒(有时候称为“珠子”或“微珠”。尤其是，颗粒提高了报道分子穿过层析介质并且固定在检测区域内的能力，如以下所述的。例如，可以使用天然存在的颗粒，如核、支原体、质粒、质体、哺乳动物细胞(例如，红细胞外壳)、单细胞微生物(例如，细菌)、多糖(例如，琼脂糖)，等等。此外，也可以使用合成的颗粒。例如，在一个实施方案中，用荧光或有色染料标记乳胶颗粒。尽管可以使用任何的乳胶颗粒，但是乳胶颗粒通常是由聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、丙烯腈、乙烯氯-丙烯酸酯等，或其醛、羧基、氨基、羟基或酰胼衍生物形成。其他合适的颗粒描述于Jou等的U.S.专利No.5,670,381和Tarcha等的No.5,252,459中。可购得的合适荧光颗粒的实例包括由Molecular Probes，Inc.以商品名“FluoSphere”(Red580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)销售的荧光羧酸化微球，以及也是由Eugene，Oregon.的Molecular Probes，Inc.销售的“Texas Red”以及5-和6-羧基四甲基若丹明。此外，可购得的合适的染色乳胶微粒的实例包括由Indiana，Bangs Laboratories，Inc.of Fishers出售的羧基酸化乳胶珠。
使用时，颗粒的形状常常可以变化。例如，在一个特定的实施方案中，颗粒是球形的。然而，应当理解本发明也考虑其他形状，如板状、棒状、圆片、条状、管状、不规则的形状，等等。此外，颗粒的大小也可以变化。例如，颗粒的平均大小(例如，直径)可以从约0.1纳米至约1000微米，在一些实施方案中，从约0.1纳米至约100微米，以及在一些实施方案中，从约1纳米至约10微米。例如，“微米级”的颗粒是通常所期望的。使用时，这样的“微米级”颗粒可以具有约1微米至约1000微米的平均大小，在一些实施方案中，从约1微米至约100微米，以及在一些实施方案中，从约1微米至约10微米。同样地，也可以使用“纳米级”的颗粒。这样的“纳米级”颗粒可以具有约0.1纳米至约10纳米的平均大小，在一些实施方案中，从约0.1纳米至约5纳米，以及在一些实施方案中，从约1纳米至约5纳米。
通常使用任何各种公知的技术将报道分子连接底物。例如，可以使用羧基、氨基、醛、溴乙酰基、碘乙酰基、巯基、环氧和其他活性官能团，以及残余的自由基和自由基阳离子来实现报道分子与底物的共价连接，通过这可以实现偶联反应。也可以作为官能化的共同单体引入表面官能团，因为报道分子的表面可以含有相对高的极性基团表面浓度。在特定的情况下，报道分子能够直接共价键合底物，而不需要进一步的修饰。同样应该理解，除了共价键和以外，其他的连接技术，如物理吸附，也可以用于本发明中。还有其他的非共价键合技术可以使用抗体和/或抗原，如二抗(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和/或生物素)。
现在将更详细地描述一种共价键合报道分子和底物的特定技术。在这个特定的实施方案中，底物是β-酪蛋白，报道分子是染色颗粒。例如，报道分子可以是从Molecular Probes，Inc.中以商品名“FiuoSphere”获得的红色羧基化乳胶颗粒。
为了共价结合染色颗粒和β-酪蛋白，首先用碳化二亚胺(例如，乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC))活化颗粒表面上的羧基，如图2所示。因为蛋白和糖蛋白底物(例如，β-酪蛋白)通常具有伯胺基(NH2)，如在赖氨酸(K)残余物的侧链上和/或在各个多肽的N-端，然后活化的羧基可以与底物的伯胺(-NH2)基团反应以形成酰胺键。这个反应可以在缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如，pH值7.2)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)(例如，pH值5.3)或硼酸盐缓冲液(例如，pH值8.5)中发生。如果需要，然后可以用乙醇胺阻断所得到的底物缀合物，例如，来阻断任何剩余的活化位点。
一旦形成，使用者可以使测试样品和任何其他需要的成分与底物缀合物一起培养一段时间。例如，本领域的技术人员根据目标酶的活性能够容易地确定用于酶-催化反应的培养时间，其依次部分地取决于温度、pH值、底物浓度、抑制剂(竞争性的(与酶结合)、未竞争性的(与酶-底物复合物结合)或非竞争性的(与酶和/或酶-底物复合物结合))的存在，等等。可以根据需要有选择性地控制这些因素以增加或减少培养时间。例如，培养时间可以大于约1分钟，在一些实施方案中，从约5分钟至约50分钟，在一些实施方案中，从约10分钟至约25分钟。同样地，可以有选择性地控制pH值以促进酶活性。例如，测试样品中的高水平碱性物质会导致pH值对于一些酶的最佳活性而言过高，例如大于8。具体地，酶可以在pH值从约3至约8的水平具有最佳活性，以及在一些实施方案中，从约4至约7。因此，如果需要，可以使用缓冲液或其他的改变pH值的化合物来保持所需的pH值。
培养后，测试样品中存在的任何酶通常将与底物缀合物的至少一部分的底物反应。因此，可以形成各种物质，包括产物缀合物(报道分子-产物)、部分反应的复合物(例如，报道分子-底物-酶)、未反应的底物缀合物(报道分子-底物)以及酶-催化反应的次级反应物和产物。例如，在水解酶的情况中，酶催化分裂反应过程从底物缀合物分裂出来的物质将包括于培养混合物中。在考虑其中底物上形成新键的酶催化反应中，培养混合物中包括的物质可以包括反应中涉及的其他反应物(例如，可以通过聚合酶和连接酶等将ATP，甲基-提供反应物，单体，如氨基酸和核苷酸添加至底物)，以及酶催化反应中形成的次级产物(例如，ADP)。较长的反应时间和较大的酶浓度将导致所得到的培养混合物中较大浓度的产物缀合物。
根据本发明，诊断测试试剂盒还含有测试装置，该装置使用层析介质，用于在化学上从培养混合物中存在的其他物质中分离出底物缀合物和/或产物缀合物。与其他分离技术如离心相反，层析介质可以简化和降低所得到的诊断测试试剂盒的成本，该测试试剂盒用于许多消费者应用，包括其中需要一次性试剂盒的那些。
参照图1，例如，现在将更详细地描述根据本发明的用来表示酶的存在或含量的测定装置20的一个实施方案。如所示的，测定装置20包含任选地由支持物21支持的层析介质23。层析介质23可以由任何种类的液体能够通过的材料制成，如流体性通道、多孔膜，等等。例如，层析介质23可以是由以下材料形成的多孔膜，所述材料如，但不限于天然的、合成的或合成修饰的天然存在的材料，如多糖(例如，纤维素材料，如纸，和纤维素衍生物，如醋酸纤维素和硝化纤维素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；硅石；无机材料，例如减活矾土、硅藻土、MgSO4或其他与聚合物如氟乙烯、氟乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯基酯共聚物一起均匀地分散在多孔聚合物基质中的无机精细粉碎材料；布，天然存在的(例如，棉)和合成的(例如，尼龙或人造丝)；多孔的凝胶，如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；聚合膜，如聚丙烯酰胺；等等。在一个特定的实施方案中，层析介质由硝化纤维素和/或聚醚砜材料形成。应该理解术语“硝化纤维素”指的是纤维素的硝酸酯，其可以是单独的硝化纤维素，或硝酸和其他酸的混合酯，如具有1至7个碳原子的脂肪族羧酸。
支持物21可以由任何能够携带层析介质23的材料形成。尽管没有要求，但是支持物21可以是透明的，使得光容易地从中穿过。此外，通常期望支持物21是液体不能透过的，使得流过介质的液体不会通过支持物21渗漏。用于支持物的合适材料的实例包括，但不限于玻璃；聚合材料，如聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯(例如，
膜)、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、环氧化物、甲基丙烯酸酯和聚三聚氰胺；等等。如本领域公知的，可以将层析介质23浇注到支持物21上，将其中产生的薄片模切成所需的大小和形状。或者，可以将层析介质23简单地用例如粘合剂层压到支持物21上。在一些实施方案中，将硝化纤维素或尼龙多孔膜粘附于
膜。粘合剂用于粘合多孔膜膜上，例如是压敏粘合剂。认为这种类型的片状结构可从Millipore Corp(Bedford，Massachusetts)购得。其他合适的片状结构的实例描述于Durley，III等的U.S.专利No.5,075,077中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
测定装置20还可以利用吸收性材料28。吸收性材料28通常接受通过整个层析介质23移动的液体。如本领域公知的，吸收性材料28可以帮助促进毛细管作用和液体流过介质23。
上述的培养方法可以在将测试样品施加到层析介质23之前进行，或作为测定程序的一部分引入(即，在施加测试样品之后进行培养，如在培养孔内)。例如，可以将培养混合物直接施加到部分层析介质23上，培养混合物通过层析介质可以沿着图1中箭头“L”说明的方向移动。或者，可以将混合物首先施加到样品衬垫22或与层析介质23液体连通的其它材料上。可以用于形成样品衬垫22的一些合适的材料包括，但不限于，硝基纤维素、纤维素、多孔聚乙烯衬垫和玻璃纤维滤纸。如果需要，样品衬垫22还可以含有一种或多种扩散或非扩散地附于其上的测定预处理试剂。
不管怎样，层析介质23限定第一检测区域31，在其内可以俘获和检测(例如，间接地)酶催化反应的产物缀合物或底物缀合物。更具体地，用于在第一检测区域31内捕获缀合物的方法区分产物缀合物和底物缀合物，使得在第一检测区域内只捕获两个之中的一个。例如，在一个实施方案中，层析介质23限定第一检测区域31，在其内可以俘获和检测产物缀合物。其中捕获产物缀合物的方式取决于酶催化反应的产物的性质以及所用报道分子的性质。在一些实施方案中，将第一接受物质固定于第一检测区域31内，用于捕获产物缀合物。特别地，第一接受物质可以对酶催化的底物反应中形成的产物呈现出特异性结合亲和性。因此，第一接受物质可以特异性结合对的第一个成员，特异性结合对即两个不同的分子，其中的一个分子在化学上和/或物理上特异性结合第二个分子，而特异性结合对的第二个成员可以是底物/酶反应过程中形成的仍然连接报道分子的产物。例如，免疫反应特异性结合对可以包括抗原、半抗原、抗体(一抗或二抗)，及其复合物，包括通过重组DNA方法或肽合成形成的那些。抗体可以是单克隆或多克隆抗体、重组蛋白或其混合物或片段，以及抗体和其他特异性结合成员的混合物。其他常见的特异性结合成员包括，但不限于，生物素和抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性链霉抗生物素蛋白、captavidin，或抗-生物素抗体；蛋白质A和G；碳水化合物和凝集素，互补核苷酸序列(包括DNA杂交测试中用来检测目标核酸序列的探针和捕获核酸序列)；互补肽序列，包括通过重组方法形成的那些；效应物和受体分子；激素和激素结合蛋白；酶辅因子和酶，酶抑制剂和酶；其衍生物等。此外，特异性结合对可以它包括为最初特异性结合成员的类似物、衍生物和/或片段的成员。这样的抗体的制备及其用作特异性结合成员的合适性是本领域技术人员公知的。
在一个特定的实施方案中，可以在合适的甲基源如S腺苷-L-甲基甲硫氨酸的存在下通过甲基化酶将底物(例如，包括游离的二羧酸残基的蛋白质，如卵白蛋白)甲基化。通过甲基化蛋白与对甲基化蛋白呈现出特异性结合亲和性的接受物质之间的特异性结合，使甲基化产物缀合物固定于第一检测区域31内。例如，第一接受物质可以是甲基化蛋白特异性的单克隆抗体。在产物缀合物固定时，可以检测由可检测物质(例如，报道分子)产生的信号。
在另一个实施方案中，可以检测激酶。例如，可以将蛋白激酶，如Abl蛋白激酶，与包括连接报道分子的肽序列如SEQ ID NO：1的底物缀合物一起培养。在激酶和磷酸盐来源如ATP存在下，可以将肽磷酸化。因此，第一接受物质可以是磷酸化反应后SEQ ID NO：1特异性的结合成员，例如，单克隆抗体等。
参照图1，本发明的诊断试剂盒可以含有第二检测区域35。尽管作为第一检测区域31的下游来说明，但这不是本发明的必要条件，并且第二检测区域35可以是第一检测区域的上游或下游。在第二检测区域35内，可以捕获和检测底物缀合物或产物缀合物。例如，考虑其中第一检测区域31优先结合产物缀合物的实施方案时，可以设计第二检测区域35用于捕获底物缀合物，反之亦可。因此，在第二检测区域35内，可以捕获和检测在检测区域31没有结合第一接受物质的底物缀合物和/或部分反应的复合物。
例如，可以将第二接受物质固定于第二检测区域35内，其可以作为静止的结合位点，用于未反应的底物缀合物、酶催化分裂反应过程中从报道分子释放出来的一部分底物和/或部分反应的复合物(例如，报道分子-底物-酶复合物)。第二接受物质可以是与酶催化反应的产物相比较呈现出不同底物结合的任何合适结合剂，使得能区分两者。例如，第二接受物质可以包括如上述那些的成员。因为第二接受物质理想地是特异性地结合底物缀合物，这将不同于第一接受物质。例如，尽管两个物质可以是相似的类型，例如，单克隆抗体，第一接受物质将不结合底物，而第二接受物质将不结合仍然连接报道分子的酶催化反应的产物。
在上述的实施例中，底物可以是包括由甲基化酶靶向的游离二羧酸残基的蛋白质，而第二接受物质可以是用于蛋白质底物的特异性结合成员(例如，对抗蛋白质底物引发的单克隆抗体)。相似地，考虑底物如SEQ ID NO：1时，第二接受物质可以是特异性结合SEQ ID NO：1的结合成员，例如，对抗多肽引发的单克隆抗体。
第一检测区域31和任选的第二检测区域35通常提供各种不同的检测范围，使得使用者可以更好地测定测试样品中的酶浓度。检测区域31、35的每个范围可以含有相同或不同的接受材料。例如，检测区域31可以包括两个或多个不同的检测范围(例如，线，点等)。使用两个或多个不同的检测范围可以提供特定的益处，如有助于半定量和/或抑制由于底物缀合物或其他材料的超出范围引起的潜在假阳性。可以以基本上垂直于测试样品流过层析介质23的方向以线的形式来安置区域的检测范围。同样，在一些实施方案中，可以以基本上平行于测试样品流过介质23的方向以线的形式来安置检测范围。
在其中设计第一检测区域31用于捕获产物缀合物的那些实施方案中，随着测试样品中酶浓度开始提高，形成更多的产物缀合物，这些缀合物对第一检测区域31中的接受物质具有特异性结合亲和性。因此第一检测区域31中提高的报道分子含量使得信号强度提高。从这种信号强度的提高，可以容易地测定酶的存在或浓度。例如，在一个实施方案中，酶含量与第一检测区域31中的信号强度I1成正比，如果需要，可以将信号强度I1对已知酶浓度范围中的酶浓度作图来产生强度曲线。为了测定未知测试样品中的酶含量，然后可以根据强度曲线将信号强度转化成酶浓度。
应当理解第一检测区域31的一个或多个不同的范围可以呈现出上述信号强度和酶浓度之间的关系；然而，每个不同的范围不必定呈现出这样的关系。例如，在一些实施方案中，多个不同的范围中只有一个可能呈现出与酶浓度成正比的信号强度。其他不同范围(如用于降低假阳性的那些)的信号强度可以另外保持恒定，或呈现出信号强度的提高和/或降低。只要检测区域31的至少一个不同的范围满足正比关系，就认为第一检测区域31呈现的信号强度与酶浓度成正比。
根据本发明，根据所需的应用选择性地控制目标酶的检测灵敏度水平。一种用于控制检测灵敏度的特别技术包括监控第一检测区域31中所用的第一接受物质的含量。例如，测试怀疑含有大浓度酶的样品时，第一接受材料的含量可以等于或高于捕获产物缀合物的总量需要的最小值，产物缀合物可以是通过酶催化反应形成的。因此，如果测试样品中存在特定含量的酶，非常高百分比的底物缀合物将与酶反应来形成可以固定于检测区域31中的产物缀合物，并且基本上所有报道分子将存在于第一检测区域31内。可以通过实验测定捕获高百分比产物缀合物需要的最小量，并且通常取决于底物与酶的反应性。
在其中需要提高的检测灵敏度的应用中(例如，低的可疑的酶浓度或短的培养时间)，第一接受物质的含量可以高于捕获所用产物缀合物总量需要的最小量。使用大量第一接受物质可以提供各种益处，包括提高在第一检测区域31中捕获任何部分反应的复合物的可能性，这将同样导致测量的酶浓度略低于实际的浓度。即，由于空间障碍等，与完全反应的产物缀合物相比较，部分反应的复合物通常将不太可能结合接受物质。这在统计上降低了部分反应的复合物结合第一检测区域31的机会。
在第二检测区域35中可以直接检测底物缀合物时，由于底物缀合物和/或部分反应的复合物的存在，酶浓度的降低导致第二检测区域中的信号强度I2提高。从这种信号强度的提高，可以容易地测定酶的存在或浓度。例如，在一个实施方案中，酶含量与第二检测区域35中的信号强度I2成反比。如果需要，可以将信号强度I2对已知酶浓度范围中的酶浓度作图来产生强度曲线。为了测定未知测试样品中的酶含量，然后可以根据强度曲线将信号强度转化成酶浓度。应当理解，以上关于第一检测区域31所述的，只要第二检测区域35的一个不同范围满足反比关系，就认为由第二检测区域35呈现的信号强度与酶浓度成反比。
此外，第一检测区域31(I1)和第二检测区域35(I2)的信号强度之间可以存在反比关系。例如，因为存在预定量的报道分子，第二检测区域35中捕获的含量与第一检测区域31中捕获的含量成反比。作为该反比关系的结果，在一些情况中，通过比较两个检测区域中的信号强度可以更有效地测量扩展范围中的酶浓度。例如，在一个实施方案中，酶含量与信号强度“I1”对信号强度“I2”的比例成正比。基于其中该比例下降的范围，可以测定酶的一般浓度范围。如果需要，可以将I1对I2的比例对已知酶浓度范围中的酶浓度作图来产生强度曲线。为了测定未知测试样品中的酶含量，然后可以根据强度曲线将信号强度转化成酶浓度。应当注意到可以将I1和I2之间的可替换数学关系对酶浓度作图来产生强度曲线。例如，在一个实施方案中，可以将I1/(I1+I2)的值对酶浓度作图来产生强度曲线。
如上所述，本发明的特定实施方案可以使用不是可以直接检测的报道分子。因此，释放时，通常希望报道分子以一些方式与可检测的物质相互作用，用于随后的检测。例如，可以使用能够产生可检测信号的探针，将其设定来结合包括报道分子的产物缀合物和/或底物缀合物。例如，探针可以含有标记的颗粒或另外与可检测物质一起使用。在一些情况中，希望以一定的方式来修饰探针。例如，可以用特异性的结合成员来修饰探针以形成对产物缀合物具有特异性结合性的缀合探针。通常可以使用各种公知技术将特异性结合成员缀合探针，如通过上述方式的共价键合和/或物理吸附。在一个特定的实施方案中，激活探针表面上的羧基并与特异性结合成员的氨基反应来形成酰胺键。使用时，通常希望用于探针和报道分子的特异性结合对不同于用于第一接受物质和第二接受物质的特异性结合对。这有助于确保探针和报道分子基本上不影响上述的结合机制。
可以在酶检测过程的任何阶段将探针接触产物缀合物和/或底物缀合物。例如，在一些实施方案中，可以在其中需要检测的范围的上游位置将探针施加于测试装置20中。例如，在一个实施方案中，可以将探针施加于位于检测区域31和35上游的缀合物衬垫上(未显示)，但是在样品衬垫22的下游。
在这样的实施方案中，可以使用各种测试形式来检测产物缀合物。在一个实施方案中，例如，使用“夹层”测试形式，其中产物缀合物对缀合探针的特异性结合成员以及对于第二接受物质具有亲和性。产物缀合物，包括例如抗体、抗原等，通常具有两个或多个结合位点(例如，抗原决定部位)。这些结合位点之一由缀合探针的特异性结合成员占据。然而，产物缀合物的自由结合位点随后将结合固定于第一检测区域31内的接受物质来形成新的三元夹层复合物。或者，可以使用直接或间接“竞争性”测试形式来检测产物缀合物。在这样的情况中，缀合探针的特异性结合成员可以与产物缀合物相同或是产物缀合物的类似物。因此，到达第一检测区域31时，缀合的检测探针和产物缀合物竞争固定化接受物质的可用结合位点。当然，任何其他测试形式也适用于本发明。
对于上述其中产物缀合物是间接可检测的实施方案中，测试样品中酶浓度提高导致形成更高数量的产物缀合物。因此，如果使用夹层测试形式，更多产物缀合物结合缀合探针，使得酶含量与第一检测区域31中的信号强度成正比。另一方面，。如果使用竞争性测试形式，酶含量与第一检测区域31中的信号强度成反比。在任何情况下，可以将信号强度对已知酶浓度范围的酶浓度作图来产生强度曲线。为了测定未知测试样品中的酶含量，然后可以根据强度曲线将信号强度转化成酶浓度。
参照图3，现在将更详细地描述使用荧光检测蛋白酶存在的方法的一个实施方案。最初，将含有蛋白酶P的测试样品与底物缀合物SC混合，这些底物缀合物各自包括连接底物47(例如，蛋白质或糖蛋白)的荧光颗粒43。将底物缀合物SC与蛋白酶P一起培养足够的时间段来形成培养混合物(图3中指定编号65)，该混合物包括通过酶催化反应从底物42分裂出来的多肽、未反应的底物缀合物SC、蛋白酶P和通过酶催化反应产生的产物缀合物PC，这些产物缀合物各自包括连接通过酶催化反应产生的产物48的荧光颗粒43。将培养混合物65施加于样品衬垫22中，如由指向箭头所示的，然后移动至第一检测区域31。第一检测区域31内固定的是第一接受物质90，其对于通过酶催化反应产生的产物48是特异性的。因此，第一检测区域31中的可用结合位点可以由产物缀合物PC占据。然而，底物缀合物SC移动至第二检测区域35并结合其中所含的第二接受物质92，其对于未反应的底物47是特异性的结合成员。因此结合底物47的荧光颗粒43也移动至第二检测区域35并结合第二接受物质。
一旦捕获，可以测量第一检测区域31和/或第二检测区域35中的荧光颗粒43的信号强度。荧光检测通常使用过滤以从激发光子分离发射光子的波长和记录发射光子并产生可记录结果的检测仪，可记录结果通常为电子信号或摄影图像。一种可以和本发明一起使用的合适荧光检测仪是FluoroLog III分光荧光计，其由SPEX Indusries，Inc.ofEdison，New Jersey销售。合适的荧光检测仪的另一个实例描述于Song 等的U.S.专利申请公开No.2004/0043502中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。尽管该特定的实施方案中使用了荧光，应当理解，本发明中还可以使用任何其他已知的检测技术。例如，其他合适的光学检测技术可以包括，但不限于，磷光、衍射、反射、透射等。光学阅读器能够发射光并且还可以记录检测信号(例如，透射或反射的光、发射的荧光或磷光等)。例如，在一个实施方案中，可以使用反射分光光度计或阅读器来检测呈现出可见颜色的报道分子(例如，染色的乳胶微粒)的存在。一种合适的反射阅读器描述于，例如Kaylor等的U.S.专利申请公开No.2003/0119202中，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
与用来测量信号强度的技术无关，可以通过比较第一检测区域31的信号强度与第二检测区域35的信号强度来确定蛋白质酶P的绝对含量。例如，如上所示，可以通过比例I1/I2并使用之前确定的强度曲线将该比例转化成酶浓度来测定蛋白质酶P的含量。或者，还可以独立使用信号强度I1或I2来表示酶的存在或浓度。当然，本发明还考虑了定性实施方案，其中通过信号强度只证实酶的存在，而不需要与实际的酶浓度有特定的相关性。
参照图4，现在将更详细地描述使用荧光检测转移酶存在的方法的一个实施方案。最初，将含有转移酶T的测试样品与底物缀合物SC混合，这些底物缀合物各自包括连接底物67(例如，多肽)的荧光颗粒43。将底物缀合物SC与转移酶一起培养足够的时间段来形成培养混合物(图4中指定编号65)，该培养混合物包括可以提供由转移酶靶向的部分的成分64(例如，ATP)、未反应的底物缀合物SC、转移酶T和通过酶催化反应产生的产物缀合物PC(例如，磷酸化多肽)，这些产物缀合物各自包括连接通过酶催化反应产生的产物68的荧光颗粒43。将培养混合物65施加于样品衬垫22中，如由指向箭头所示的，然后移动至第一检测区域31。第一检测区域31内固定的是第一接受物质91，其对于通过酶催化反应产生的产物68是特异性的。因此，第一检测区域31中的可用结合位点可以由产物缀合物PC占据。然而，底物缀合物SC移动至第二检测区域35并结合其中所含的第二接受物质93，其对于未反应的底物67是特异性的结合成员。因此结合底物67的荧光颗粒43也移动至第二检测区域35并结合第二接受物质。一旦捕获，可以按照在此所述的其他实施方案中所述的来测量和分析信号强度。
在一个示例性的应用中，诊断试剂盒可以用于测定RAS蛋白激活循环中涉及的酶的存在。RAS蛋白作为重要的分子开关用于多种信号途径中。这些途径控制包括细胞骨架完整性、细胞粘附和移动以及凋亡的过程。RAS蛋白在激活形式(RAS-GTP)和失活形式(RAS-GDP)之间循环。
RAS蛋白在癌症中通常被取消了管制，导致提高的入侵和转移以及降低的凋亡。因此，诊断试剂盒可以用于测定GTP酶激活蛋白(GAP)的存在，该酶提高了GTP水解的速率、RAS-GTP恢复成失活的RAS-GDP形式。例如，将含有GAP的测试样品与底物缀合物混合，这些底物缀合物各自包括连接RAS-GTP底物的荧光颗粒。使底物缀合物与测试样品培养足够的时间段来形成培养混合物，该培养混合物可以包括未反应的底物缀合物(RAS-GTP/颗粒)、GAP和通过酶催化反应产生的产物缀合物(RAS-GDP/颗粒)。将培养混合物施加于样品衬垫，如上所述，然后移动至检测区域。检测区域内固定的是接受材料，该材料对通过酶-催化的反应产生的产物RAS-GDP或任选对底物RAS-GTP是特异性的。例如，检测区域内可以固定由特定代谢途径中的RAS-GTP激活的MAP激酶。因此，检测区域中的可用结合位点可以由优先结合MAP激酶接受物质的底物缀合物(RAS-GTP/颗粒)占据。因此检测区域中还将结合连接底物的荧光颗粒。然而，产物缀合物(RAS-GDP/颗粒)没有优先结合MAP激酶接受物质并可以通过检测区域。一旦捕获，可以按照在此所述的其他实施方案中所述的来测量和分析信号强度以测定测试样品中GAP的存在。
在另一个实施方案中，诊断测试试剂盒可以用来测定RAS激活蛋白的存在。例如，诊断测试试剂盒可以用来测定G交换因子(GEF)(例如，CDC25、SOS1、SOS2)的存在，该因子催化RAS-GDP重新激活成活性形式RAS-GTP。根据该实施方案，底物缀合物可以包括连接荧光颗粒的蛋白质的失活形式RAS-GDP。将底物缀合物与含有激活GEF的测试样品一起培养时，可以将RAS-GDP激活成RAS-GTP形式。在这种情况下，可以通过固定于检测区域中的MAP激酶来捕获产物缀合物(RAS-GTP/颗粒)，以测定测试样品中GEF的存在或含量。
诊断测试试剂盒的另一个示例性应用是测定测试样品中血管紧张素-转化酶(ACE)的存在。ACE是催化血管紧张素I转化成血管紧张素II的外肽酶。尽管血管紧张素I似乎主要是作为血管紧张素II的前体存在的，血管紧张素II是有效的血管收缩剂并认为在如高血压、心脏病和糖尿病性肾病这样的病症中起着作用。根据该特定的实施方案，诊断测试试剂盒可以包括底物缀合物，该缀合物包括连接报道分子的血管紧张素II。将底物缀合物与含有ACE的测试样品一起培养时，血管紧张素I可以转化成血管紧张素II。诊断测试试剂盒的检测区域可以含有固定于其中的接受物质，该接受物质对血管紧张素II是特异性的，如AT1或AT2受体，例如。检测区域中产物缀合物(血管紧张素II/报道分子)的结合和检测可以表示测试样品中ACE的存在。
除了上述的检测区域31、35，本发明的诊断试剂盒可以含有其他区域。例如，测试装置可以任选包括校准区域。在该实施方案中，在膜23上形成校准区域(未显示)并置于检测区域31和任选检测区域35的下游。然而，或者，还可以将校准区域置于检测区域31和/或任选检测区域35的上游。校准区域配备了能够结合通过膜23长度的任何校准探针的接受物质。使用时，校准探针可以含有与用于底物缀合物和产物缀合物的可检测物质相同或不同的可检测物质。此外，校准探针还可以追合同特异性结合成员，如上所述。例如，在一个实施方案中，可以使用生物素化的校准探针。一般而言，以使其在检测区域31和检测区域35中不结合第一或第二接受物质的方式来选择校准探针。校准区域的接受物质可以与检测区域31或检测区域35中所用的接受物质相同或不同。例如，在一个实施方案中，校准区域的接受物质是生物接受物质，如抗原、半抗原、抗体-结合蛋白(例如，蛋白A、蛋白G或蛋白A/G)、中性链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、captavidin、一抗或二抗或其复合物。还希望使用各种非生物物质，用作校准区域的接受物质(例如，聚电解质)，如Song等的U.S.专利申请公开No.2003/0124739中所述的，在此以其全部内容引入作为参考，用于所有目的。
使用时，聚电解质可以具有净正电荷或负电荷，以及通常是中性的净电荷。例如，具有净负电荷的聚电解质的一些合适实例包括，但不限于，聚赖氨酸(从Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.of St.Louis，Missouri可购得)、聚乙烯亚胺；表氯醇-功能化的聚胺和/或聚酰胺胺，如聚(二甲胺-共-表氯醇)；聚双烯丙基二甲基-氯化铵；阳离子纤维素衍生物，如纤维素共聚物或嫁接季铵水溶性单体的纤维素衍生物；等等。在一个特定的实施方案中，可以使用
SC-230M或H-100(从National Starch & Chemical，Inc.获得)，这是含有季铵水溶性单体的纤维素衍生物。此外，具有净负电荷的聚电解质的一些合适实例包括，但不限于，聚丙烯酸，如聚(乙烯-共聚-甲基丙烯酸，钠盐)，等等。还应当理解也可以使用其他聚电解质，如两性聚电解质(即，具有极性和非极性部分)。例如，合适的两性聚电解质的一些实例包括，但不限于，聚(苯乙烯-b-N-甲基2-乙烯吡啶鎓碘化物)和聚(苯乙烯-b-丙烯酸)，这两者都可从Polymer Source，Inc.of Dorval，Canada获得。
尽管通常使用任何的聚电解质，但对于特定的应用而选择的聚电解质可以根据底物缀合物、产物缀合物、校准探针、膜等而改变。特别地，聚电解质分布的电荷使其结合具有相反电荷的物质。因此，例如，通常更好地装备具有净正电荷的聚电解质来结合负电荷的探针，而通常更好地装备具有净负电荷的聚电解质来结合正电荷的探针。因此，在这样的情况中，这些分子之间的离子相互作用使得在校准区域内产生所需的结合。无论如何，尽管离子相互作用主要是用来实现校准区域中所需的结合，但聚电解质也结合具有相似电荷的探针。
因为设计聚电解质来结合探针，因此通常希望聚电解质基本上是非扩散性地固定于膜23的表面上。同样，可以以使其基本上不扩散至膜23基质中的方式将聚电解质施加于膜23。特别地，聚电解质通常与膜23表面上存在的官能团形成离子和/或共价键，使得它们仍然固定于膜上。尽管不是所需的，期望聚电解质和膜23之间共价键的形成将聚电解质更持久地固定于膜上。例如，在一个实施方案中，首先将用于形成聚电解质的单体形成溶液，然后直接施加于膜23上。可以使用各种溶剂(例如，有机溶剂、水等)来形成溶液。一旦应用，使用加热、电子束辐射、自由基聚合等来启动单体的聚合。在一些情况中，如单体聚合，它们与膜23的特定官能团形成共价键，因此将所得到的聚电解质固定于膜上。例如，在一个实施方案中，乙撑亚胺单体可以与一些膜(例如，硝基纤维素)表面上存在的羧基形成共价键。
在另一个实施方案中，可以在施加于膜23之前形成聚电解质。如果需要，首先使用有机溶剂、水等将聚电解质形成溶液。此后，将聚电解质溶液直接施加于膜上，然后干燥。干燥时，聚电解质与膜23的表面上存在的特定官能团形成离子键，膜23具有与聚电解质相反的电荷。例如，在一个实施方案中，正电荷的聚乙撑亚胺可以与一些膜(例如，硝基纤维素)的表面上存在的负电荷羧基形成离子键。
此外，也可以使用各种公知的技术使聚电解质与膜23交联。例如，在一些实施方案中，表氯醇-官能化的聚胺和/或聚酰胺胺可以用作可交联的正电荷聚电解质。这些物质的实例描述于Keim的U.S.专利No.3,700,623和Keim的3,772,076，以及Keim的4,537,657中，在此将其全部内容引入作为参考，用于所有目的，并认为由Hercules，Inc.，Wilmington，Del.以KymeneTM商品名销售。例如，KymeneTM450和2064是表氯醇-官能化的聚胺和/或聚酰胺胺化合物，其含有可以与特定类型的膜(例如，硝基纤维素)上存在的羧基形成共价键的环氧化物环和季氨基团，并且在固化时与膜的聚合物主链交联。在一些实施方案中，交联温度为约50℃至约120℃，交联时间为约10至约600秒。
尽管以上描述了各种用于将聚电解质非扩散性地固定于膜23上的技术，但应当理解本发明中可以使用用于非扩散性地固定聚电解质化合物的任何其他技术。事实上，上述方法只是本发明中可用技术的示例。例如，在一些实施方案中，可以将特定的成分加入聚电解质溶液中，其可以基本上抑制这些聚电解质扩散至膜23的基质中。
在一些情况中，膜23还可以限定对照区域(未显示)，其将正确进行测试的信号给予使用者。例如，对照区域(未显示)可以含有通常能够与探针或与探针上固定的接受物质形成化学和/或物理键的固定化接受物质。这样的接受物质的一些实例包括，但不限于，抗原、半抗原、抗体、蛋白A或G、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、二抗及其复合物。此外，还期望使用各种非生物材料，用于对照区域的接受物质。例如，在一些实施方案中，对照区域接受物质还可以包括如上所述可以结合未捕获探针的聚电解质。因为对照区域中的接受物质只对探针是特异性的，因此信号形成与是否存在分析物无关。对照区域可以位于沿着膜23的任何位置，但优选位于检测区域31和检测区域35的下游。
在酶的内容中特异性地描述了上述的检测技术。然而，如所述的，本发明同样适用于检测测试样品中酶抑制剂的存在或含量。为了检测测试样品中酶抑制剂的存在，可以将预定含量的相应的酶与测试样品混合并将其培养。在特定含量的酶抑制剂的存在下，酶催化反应没有以可检测的速率来进行。因此，酶抑制剂浓度和信号强度之间的关系将与酶浓度和信号强度之间的关系相反。作为说明，在特定含量的抑制剂存在下不发生酶催化反应中。因此，在检测区域31中将没有产物缀合物可捕获，这产生了最小的信号强度。另一方面，随着酶抑制剂含量降低，酶使产物缀合物形成，如上所述。因此由于产物缀合物存在的相应提高，检测区域31中产生的信号强度开始提高，同样，在一些实施方案中，由于底物缀合物存在的相应降低，检测区域31中产生的信号强度开始降低。因此，在这个特定的实施方案中，测试样品中的酶抑制剂含量与检测区域31中的信号强度成反比，并与检测区域35中的信号强度成正比。
本发明的诊断测试试剂盒可以提供相对简单而成本效率的方法，来快速进行酶或其抑制剂的就地测试。测试试剂盒可以提供可见的测试结果，使得进行测试的人员可以容易地观察，测试人员以迅速的方式并且在有利于获得高度可靠而一致的测试结果的测试条件下进行测试。诊断测试试剂盒也可以是一次性的，如果需要，结束测试时，可以将其丢弃。
尽管关于特定的实施方案已经详细描述了本发明，但本领域技术人员将清楚实现上述内容的理解时，可以容易地设想这些实施方案的改变、变化和等价物。因此，应当确定本发明的范围为所附权利要求及其任何等价物所示的。
序列表
<110>Song，Xuedong
<120>酶检测技术
<130>KCX-1147(20477)
<140>
<141>
<160>1
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>1
Claims (22)
1.用于检测测试样品中的酶或其抑制剂的诊断试剂盒，该试剂盒包括：
多个底物缀合物，其各自包括连接报道分子的底物，其中底物缀合物的酶催化反应形成包括连接报道分子的酶催化反应产物的产物缀合物；和
限定第一检测区域的层析介质，在该区域内只优先结合所述底物缀合物和所述产物缀合物中的一个，其中所述第一检测区域内的底物缀合物或产物缀合物的结合产生第一检测信号，其中从所述第一检测信号测定酶或其抑制剂的存在或含量。
2.如权利要求1中限定的诊断测试试剂盒，其中所述报道分子包括能够直接产生所述第一检测信号的可检测物质。
3.如权利要求1或2中限定的诊断测试试剂盒，其中所述报道分子包括特异性结合成员。
4.如权利要求1-3任一项中限定的诊断测试试剂盒，进一步包括与特异性结合成员缀合的探针，所述探针进一步包括能够直接产生所述检测信号的可检测物质。
5.如权利要求4中限定的诊断测试试剂盒，其中所述探针的所述特异性结合成员对所述报道分子的所述特异性结合成员具有特异性结合亲和性。
6.如之前任一项权利要求中限定的诊断测试试剂盒，其中将接受物质固定于所述第一检测区域中，其中所述产物缀合物对所述接受物质呈现出特异性的结合亲和性。
7.如权利要求6中限定的诊断测试试剂盒，其中所述接受物质是单克隆抗体。
8.如之前任一项权利要求中限定的诊断测试试剂盒，其中所述层析介质进一步包括第二检测区域，在该区域内优先结合所述底物缀合物，其中所述底物缀合物在所述第二检测区域内的结合产生第二检测信号。
9.如权利要求8中限定的诊断测试试剂盒，其中将第二接受物质固定于所述第二检测区域中，其中所述底物缀合物对所述第二接受物质呈现出特异性的结合亲和性。
10.如权利要求8或9中限定的诊断测试试剂盒，其中测试样品中的酶含量与所述第二检测信号的强度成反比。
11.如权利要求8或9中限定的诊断测试试剂盒，其中测试样品中的酶含量与所述第一检测信号强度对所述第二检测信号强度的比例成正比。
12.如权利要求1-10任一项中限定的诊断测试试剂盒，其中测试样品中的酶含量与所述第一检测信号的强度成正比。
13.如权利要求1-10任一项中限定的诊断测试试剂盒，其中测试样品中的酶抑制剂含量与所述第一检测信号的强度成反比。
14.如之前任一项权利要求中限定的诊断测试试剂盒，层析介质进一步限定校准区域。
15.如之前任一项权利要求中限定的诊断测试试剂盒，层析介质进一步限定对照区域。
16.用于检测测试样品中酶或其抑制剂的方法，使用之前任一项权利要求的诊断测试试剂盒，该方法包括：
将测试样品接触多个底物缀合物来形成培养混合物；
将所述培养混合物施加于层析介质；和
测定所述第一检测区域内所述检测信号的存在或强度。
17.如权利要求16中限定的方法，所述方法进一步包括测定所述第二检测区域内所述检测信号的存在或强度。
18.如权利要求16中限定的方法，其中酶是水解酶。
19.如权利要求16中限定的方法，其中酶是转移酶、连接酶或聚合酶。
20.如权利要求19中限定的方法，其中转移酶是激酶或甲基化酶。
21.如权利要求16中限定的方法，其中所述底物是蛋白质、糖蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质、酯、抗体、抗原或其衍生物。
22.如权利要求16中限定的方法，其中所述底物是酪蛋白、白蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、角蛋白、明胶、胰岛素、蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白或其衍生物。
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