CN103534359A - 分析染色体易位的方法及其系统 - Google Patents

Abstract

本发明内容涉及用于分析染色体易位的系统和方法，并且具体地涉及通过原位杂交对染色体易位的分析。所述方法采用5’探针、3’探针和在断裂点附近结合，任选地，与该断裂点重叠的探针。所述探针经不同标记。具体地，描述了在检测牵涉ALK基因的易位中的用途。

Description

分析染色体易位的方法及其系统

发明领域

本公开内容涉及用于分析染色体易位的系统和方法，并且具体地涉及通过原位杂交对染色体易位的分析。

发明背景

基于对取自患病生物体的组织或细胞样品的判读来对疾病进行诊断、预后和确定治疗已在过去数年中急剧扩张。除了传统的组织学染色技术和免疫组化测定法外，现在还使用原位技术如原位杂交和原位聚合酶链式反应来帮助诊断人的疾病状态。如此，存在多种不仅能评估细胞形态学而且能评估细胞和组织内特定大分子存在的技术。

分子细胞遗传技术如生色原位杂交（CISH）将染色体的视觉评估（染色体组型分析）与分子技术组合。分子细胞遗传学方法基于核酸探针与其在细胞内的互补核酸的杂交。针对特定染色体区域的探针会识别中期染色体上或分裂间期细胞核内（例如组织样品中）的其互补序列并与之杂交。已开发出用于多种诊断和研究目的的探针。

序列探针与特定染色体区域或基因中的单拷贝DNA序列杂交。这些是用于鉴定与感兴趣的综合征或状况有关的染色体关键区域或基因的探针。在分裂中期染色体上，这类探针与每条染色单体杂交，每条染色体通常给出两个较小的离散信号。

序列探针如重复消减探针或独特序列探针（参见例如U.S.2011/0160076）的杂交已使得与大量疾病和综合征有关的染色体异常的检测成为可能，所述疾病和综合征包括组成性遗传异常，如微缺失综合征（microdeletionsyndrome）、染色体易位、基因扩增和非整倍性综合征、新生性疾病以及病原体感染。最通常地，将这些技术应用于显微镜载玻片上的标准细胞遗传制备物。另外，这些规程可以对经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织的载玻片、血液或骨髓涂片以及直接固定的细胞或其它核分离物使用。

可以将从这些测定法获得的信息用于诊断患者中的疾病，确定患有疾病的患者的预后，还有用于确定患有疾病的患者的治疗过程。在许多情况中，可以将特定标志物的存在与预测的药物功效相关联。

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种在肺组织中形成恶性（癌）细胞的疾病。NSCLC实际上是一组肺癌，其以在癌症中发现的细胞种类以及该细胞在显微镜下看上去如何命名。三种主要类型的非小细胞肺癌是鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌。NSCLC是最常见的肺癌种类。

鳞状细胞癌是一种在鳞状细胞中开始的癌症，所述鳞状细胞是看上去像鱼鳞的薄的、平坦的细胞。这也称作表皮样癌。大细胞癌是可以在数种类型的大细胞中开始的癌症。腺癌是一种在作为肺泡衬里并生成如粘液等物质的细胞中开始的癌症。其它不太常见的非小细胞肺癌类型为：多形性、类癌肿瘤、唾液腺癌和未分类的癌。

吸香烟、烟斗或雪茄是NSCLC的最常见起因。人在生命中开始吸烟越早，人吸得越频繁和人吸得年数越长，则风险越大。如果人停止吸烟，则风险随着岁月流逝而变低。

经常同时进行检测、诊断并分期非小细胞肺癌的测试和规程。一般使用下列测试和规程：胸部x射线；CBC；寻找癌细胞的痰测试；骨扫描；胸的CT扫描；胸的MRI；正电子发射断层摄影术（PET）扫描；和胸腔穿刺术。在一些情况中，采用活组织检查并分析。如果活组织检查揭示肺癌的存在，那么将进行更多的成像测试来确定癌症阶段。阶段指肿瘤的大小和其已扩散的程度。非小细胞肺癌被分成5个阶段：0期-癌症尚未扩散超出肺的内部衬里；I期-癌症较小且还未扩散到淋巴结；II期-癌症已扩散到初始肿瘤附近的一些淋巴结；III期-癌症已扩散到附近组织或扩散到远处的淋巴结；IV期-癌症已扩散到身体的其它器官如另一个肺、脑或肝。

有许多用于非小细胞肺癌的不同类型的治疗。治疗依赖于癌症阶段。外科手术经常是对患有尚未扩散到超出附近淋巴结的非小细胞肺癌的患者的一线治疗。外科医生可以除去：肺叶之一（叶切除术）；仅肺的小部分（楔形（wedge）或段(segment)切除）；完整的肺（全肺切除术）。一些患者需要化疗。化疗使用药物来杀死癌细胞并使新的癌细胞停止生长。当癌症扩散时（IV期），经常使用单独的化疗。

在一些情况中，进行遗传分析来确定NSCLC的最佳治疗过程。例如，在EGFR基因中具有特定突变的一些患者响应EGFR酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼（gefitinib）。另一个例子是，7%的具有EML4-ALK易位的NSCLC可以受益于在临床试验中的ALK抑制剂。

已将分离(break-apart)探针系统用于分析来自NSCLC患者的组织。然而，由于在NSCLC中发生的染色体重排的性质，可以有假阳性结果的问题，特别是在重排在同一染色体内的情况下，如倒位。在这些情况中，可以不可能正确解析来自每组分离探针的信号。即使尚未发生重排，该信号也可以作为两个分开的信号出现。这由于获得不正确的结果和活组织检查材料的缺乏两者而可以是个一个真正的问题。已将三色系统用于染色体分析。参见例如Makretsov等,Genes,Chromosomes and Cancer,40:152-57(2004);Martin-Subero,等,Cancer Res.,66(21):10332-38(2006);Yoshimoto等,Neoplasia8(6):465-69(2006);Renne等,J.Mol.Diagnost.,7(3):352-56(2005)。然而，这些系统无一已经应用于解决与分离探针系统中的假阳性结果有关的问题。解决假阳性结果问题的分离探针系统会为受癌症折磨的患者提供益处。

发明概述

本公开内容涉及用于分析染色体易位的系统和方法，并且具体地涉及通过原位杂交分析染色体易位。

在例示性实施方案中，用于对样品分析与断裂点关联的染色体易位的方法包括使所述样品与下列探针接触：包含配置为与位于所述断裂点5’的基因组DNA杂交的第一序列的第一核酸探针、包含配置为与位于所述断裂点3’的基因组DNA杂交的第二序列的第二核酸探针、和包含配置为与所述断裂点附近的基因组DNA杂交的第三序列的第三核酸探针。所述方法进一步包括建立适合于所述探针与样品中的基因组DNA杂交的条件，并检测所述探针的杂交，其通过检测与第一核酸探针关联的第一信号、与第二核酸探针关联的第二信号、以及与第三核酸探针关联的第三信号进行。在一个实施方案中，所述方法进一步包括鉴定样品次序和取向，所述样品次序和取向为沿染色体纵向排布的第一信号、第二信号和第三信号的顺序。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括将样品次序和取向与对照次序和取向比较。在另一个实施方案中，所述对照次序和取向为沿染色体纵向排布的第一信号、第二信号和第三信号的顺序，其中已知所述染色体没有与断裂点关联的染色体易位。

在例示性实施方案中，所述第三序列配置为与在所述断裂点5’且附近的基因组DNA杂交，并且将所述样品次序和取向与对照次序和取向比较包括确立与对照次序和取向相比所述样品次序和取向是否包括所述第一信号和第三信号的倒置。在一个实施方案中，所述第三序列配置为与在所述断裂点3’且附近的基因组DNA杂交，并且将所述样品次序和取向与对照次序和取向比较包括确立与对照次序和取向相比所述样品次序和取向是否包括所述第二信号和第三信号的倒置。在另一个实施方案中，所述第三序列配置为与在所述断裂点附近且位于所述断裂点5’和3’两者的基因组DNA杂交，并且将所述样品次序和取向与对照次序和取向比较包括确立与对照次序和取向相比所述样品次序和取向是否包括所述第一信号或第二信号与第三信号的倒置。

在例示性实施方案中，所述方法包括通过分析已知没有与所述断裂点关联的染色体易位的对照来测定对照次序和取向，其中测定包括使对照与下列探针接触：包含配置为与位于所述断裂点5’的基因组DNA杂交的第一序列的第一核酸探针、包含配置为与位于所述断裂点3’的基因组DNA杂交的第二序列的第二核酸探针、和包含配置为与所述断裂点附近的基因组DNA杂交的第三序列的第三核酸探针。所述方法进一步包括建立适合于所述探针与所述对照中的基因组DNA杂交的条件，并检测所述探针的杂交，其通过检测与第一核酸探针关联的第一信号、与第二核酸探针关联的第二信号、以及与第三核酸探针关联的第三信号进行。

在例示性实施方案中，所述核酸探针包含选自下组的核酸：用可检测模块标记的RNA、DNA、PNA、LNA及其组合。在一个实施方案中，所述可检测模块选自下组：半抗原、酶、荧光分子、发光分子和放射性分子。在另一个实施方案中，所述可检测模块是半抗原，且所述第一、第二和第三核酸探针分别用不同的第一、第二和第三半抗原标记。在一些实施方案中，半抗原选自下组：生物素、2,4-二硝基苯基(DNP)、荧光素衍生物、洋地黄毒苷(DIG)、5-硝基-3-吡唑碳酰胺(pyrozolecarbamide)(硝基吡唑，NP)、4,5,-二甲氧基-2-硝基肉桂酰胺(硝基肉桂酰胺，NCA)、2-(3,4-二甲氧基苯基)-喹啉-4-碳酰胺(苯基喹诺酮，DPQ)、2,1,3-苯并

二唑(benzoxadiazole)-5-碳酰胺(苯并呋咱，BF)、3-羟基-2-喹喔啉碳酰胺(羟基喹喔啉，HQ)、4-(二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL)、鱼藤酮异

唑啉(Rot)、(E)-2-(2-(2-氧-2,3-二氢-1H-苯[b][1,4]二氮杂卓(diazepin)-4-基)苯氧基(phenozy))乙酰胺(苯并二氮杂卓(benzodiazepine)，BD)、7-(二乙基氨基)-2-氧-2H-色烯-3-羧酸(香豆素343，CDO)、2-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑磺酰胺(噻唑磺酰胺，TS)和对甲氧基苯基吡唑鬼臼酰胺(methoxyphenylpyrazopodophyllamide)(Podo)。

在其它例示性实施方案中，所述方法包括检测，该检测包括使所述样品与对所述标记物半抗原特异性的抗体接触，例如分别与对所述第一、第二和第三半抗原特异性的第一、第二和/或第三抗体接触。在一个实施方案中，检测进一步包括利用抗半抗原识别和酶促信号放大来检测半抗原（例如第一、第二和第三半抗原）。

在例示性实施方案中，用于对样品分析与断裂点关联的染色体易位的试剂盒包含具有配置为与基因组DNA中位于所述断裂点5’的一部分杂交的序列的第一核酸探针、具有配置为与基因组DNA中位于所述断裂点3’的一部分杂交的序列的第二核酸探针、和具有配置为与DNA中在所述断裂点附近的一部分杂交的序列的第三核酸探针。在一个实施方案中，所述第三核酸探针具有配置为与DNA中在所述断裂点的5’和3’两侧接近且跨越所述断裂点的一部分杂交的序列。在另一个实施方案中，所述第一、第二和第三核酸探针用第一、第二和第三半抗原半抗原化，所述试剂盒还包含配置为使所述第一、第二和第三半抗原能够显现的检测试剂。在另一个实施方案中，所述检测试剂是配置为使所述第一、第二和第三半抗原能够明视野显现的生色检测试剂。

在例示性实施方案中，用于诊断患者样品中与断裂点关联的染色体易位有关的疾病的方法包括使所述患者样品与核酸探针系列接触，该系列选择为使得在缺乏与所述断裂点关联的染色体易位的情况下，该系列依照第一次序和取向与所述患者样品杂交，且选择为使得在存在与所述断裂点关联的染色体易位的情况下，该系列依照不同的次序和取向与所述患者样品杂交，并检测该核酸探针系列是否依照第一次序和取向与所述患者样品杂交，其中检测第一次序和取向提供所述患者样品没有与患者样品中断裂点关联的染色体易位的诊断。在一个实施方案中，所述第一次序和取向是沿染色体纵向排布的3种信号的预先确定的顺序。在另一个实施方案中，检测包括使用利用明视野成像显现的生色检测试剂。

附图简述

图1是染色体的示意图，其显示断裂点区域和配置为与其杂交的探针；

图2（A-D）显示例示性检测方案的示意图；

图3是染色体的示意图，其显示可以发生倒位染色体易位的两个断裂点位置和配置为与其杂交的探针；

图4是显示倒位染色体易位后图3的染色体和所得探针定位的示意图；

图5（A-B）是放大的俯视图，其显示对（A）野生型ALK和（B）重排的ALK报告的信号，如使用三重比色检测和明视野成像会看到的；

图6（A-B）是分别对应于图5（A-B）的照相图像；

图7是显示可以发生重排染色体易位的两个断裂点位置的两条染色体的示意图；

图8是显示重排染色体易位后的图7的染色体和所得探针定位的示意图；和

图9（A-B）是放大的俯视图，其显示对（A）野生型ALK和（B）重排的ALK报告的信号，如使用三重比色检测和明视野成像会看到的。

定义

除非另外解释，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域中普通技术人员的理解具有相同的意义。分子生物学中常见术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V，由Oxford University Press出版,1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew等(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9);和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。

除非上下文另外清楚地指示，单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。类似地，除非上下文另外清楚地指示，文字“或”意图包括“和”。术语“多个/多种”与短语“超过一个/种”同义使用，即为两个/种或更多个/种。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有的分子量或分子质量值均为近似值，并且提供用于描述。术语“包含”意为“包括”。缩写“例如（e.g.）”自拉丁文exempli gratia衍生，并且用于本文指示非限制性例子。如此，缩写“例如（e.g.）”与术语“例如（for example）”同义。尽管在实施或测试本公开内容中可以使用与本文中描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但在下文描述了合适的方法和材料。

抗体：“抗体”统指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子（包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其组合，和在任何脊椎动物例如哺乳动物（如人、山羊、家兔和小鼠）中的免疫应答期间生成的类似的分子）和特异性结合感兴趣的分子（或一组高度类似的感兴趣的分子）至实质性排除对其它分子结合的抗体片段（例如，比针对生物学样品中其它分子的结合常数具有至少大103M-1、至少大104M-1、至少大105M-1的针对感兴趣分子的结合常数的抗体和抗体片段）。

更具体地，“抗体”指至少包含特异性识别并结合抗原表位的轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成，所述重链和轻链各自具有可变区，称作可变重（VH）区和可变轻（VL）区。VH区和VL区一起负责结合由抗体识别的抗原。

这包括完整的免疫球蛋白以及本领域中公知的其变体和部分。抗体片段包括蛋白水解抗体片段[如F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab’-SH片段和Fab片段，如本领域中已知的]、重组抗体片段（如sFv片段、dsFv片段、双特异性sFv片段、双特异性dsFv片段、F(ab)’2片段、单链Fv蛋白质（“scFv”）、二硫化物稳定化的Fv蛋白质（"dsFv"）、双抗体和三抗体（如本领域中已知的），以及骆驼抗体（参见例如美国专利No.6,015,695;6,005,079-5,874,541;5,840,526;5,800,988;和5,759,808）。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区由接头结合，而在dsFv中，所述链已被突变以引入二硫键来使链联合稳定化。该术语还包括经遗传工程化改造的形式如嵌合抗体（例如人源化鼠抗体）、异缀合抗体（如双特异性抗体）。亦参见PierceCatalog and Handbook,1994-1995（Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.）;Kuby,J.,Immunology,3.sup.rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

通常，天然存在的免疫球蛋白具有由二硫键互连的重（H）链和轻（L）链。有两种类型的轻链，拉姆达（λ）和卡帕（k）。有5种决定抗体分子的功能活性的主要重链种类（或同种型）：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

每条重链和轻链含有恒定区和可变区（所述区也称为“域”）。组合地，重链和轻链可变区特异性结合抗原。轻链和重链可变区含有被3个高变区（也称作“互补性决定区”或“CDR”）中断的“框架”区。已限定框架区和CDR的范围（参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991）。Kabat数据库现在联机维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区（其是组成性轻链和重链的组合框架区）用来在三维空间中定位和排列CDR。

CDR主要负责结合抗原的表位。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始连续编号，并且通常还通过定位特定CDR的链鉴定。如此，VH CDR3位于发现其的抗体重链的可变域中，而VL CDR1是来自发现其的抗体轻链的可变域的CDR1。结合RET的抗体会具有特定的VH区和VL区序列，以及如此特定的CDR序列。具有不同特异性（即针对不同抗原的不同组合位点）的抗体具有不同的CDR。尽管从抗体到抗体变化的正是CDR，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接牵涉抗原结合。CDR内的这些位置称作特异性决定残基（SDR）。

“结合或稳定结合”指两种物质或分子之间的联合，如一个核酸分子（例如结合区）与另一个（或其自身）（例如靶核酸分子）的杂交。如果充足量的核酸分子与其靶核酸分子形成碱基对或与其杂交以允许检测所述结合，那么该核酸分子结合或稳定结合靶核酸分子。

如果两个核酸分子共有充足数目的互补核苷酸，从而在链彼此结合（杂交）时（例如通过形成Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen碱基对）形成稳定的双链体或三链体，那么核酸分子与另一核酸分子是“互补”的。当在需要的条件下核酸分子保持与靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）可检测结合时，发生稳定的结合。

互补性是一个核酸分子（例如靶核酸探针）中的碱基与第二核酸分子（例如基因组靶核酸序列）中的碱基碱基配对的程度。互补性由百分数方便地描述，该百分数即在两种分子之间或在两种分子的特定区或域内形成碱基对的核苷酸的比例。

在本公开内容中，“充分的互补性”意指在一个核酸分子或其区域与靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）之间存在充足数目的碱基对以实现可检测的结合。对涉及建立结合条件的定性和定量考虑的彻底处理由Beltz等Methods Enzymol.100:266-285,1983，以及由Sambrook等（ed.）,MolecularCloning.A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989提供。

“计算机执行的算法”是由计算装置在用户命令下实施或执行的算法或程序（计算机可读介质中的可执行代码集）。在本公开内容的上下文中，计算机执行的算法可用于促进（例如自动化）选择具有特定特征的多核苷酸序列，如鉴定靶核酸序列的重复（或其它不想要的，例如背景生成性）核酸序列或独特结合区。典型地，用户通过向计算机中输入命令、并设定一个或多个选择标准启动算法的执行，该计算机能够进入序列数据库。序列数据库能包含在计算机的存储介质内或能远程存储并经由计算机和在近程或远程位置的存储介质之间的连接（经由内联网或因特网）进入。在启动算法后，该算法或程序由计算机执行，例如以选出一个或多个满足选择标准的多核苷酸序列。最普遍地，随后显示（例如在屏幕上）或输出（例如以打印的形式或到计算机可读介质上）选定的多核苷酸序列。

术语“缀合、联合、键合或连接”指将一个分子共价连接到另一个分子以制备更大的分子。例如，将两个多肽制备成一个连续的多肽分子，或将半抗原或其它分子共价附接到多肽如scFv抗体。在特定背景中，该术语包括指代将一种特异性结合分子如抗体联合到信号生成模块如半导体纳米晶体。该连接可以是通过化学或重组手段进行。“化学手段”指抗体模块和效应器分子之间的反应从而使得在两分子之间形成共价键以形成一个分子。

术语“偶联的”在应用于与第二原子或分子“偶联”的第一原子或分子时可以是直接偶联和间接偶联的两者。二抗提供间接偶联的例子。一种间接偶联的特定的例子是由小鼠抗家兔IgG抗体结合的家兔抗-半抗原一抗，该小鼠抗家兔IgG抗体继而由与可检测标记共价连接的山羊抗小鼠IgG抗体结合。

术语“对应”在述及第一和第二核酸（例如，结合区和靶核酸序列）中指第一和第二核酸在第一和/或第二核酸的总序列的至少一部分内共有实质性序列同一性或互补性。如此，如果结合区与靶核酸序列的至少一部分具有实质性序列同一性或互补性（例如反向互补性）（例如如果它与该至少一部分是至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或甚至100%相同或互补的），则该结合区对应于靶核酸序列。例如，如果结合区与双链靶核酸序列（例如基因组靶DNA序列）的一条链具有实质性序列同一性或如果该结合区与单链靶核酸序列（例如RNA或RNA病毒基因组）实质性互补，则该结合区可以对应于靶核酸序列。

“基因组”是生物体的总遗传组成。在真核生物体的情况中，基因组包含在细胞染色体的单倍体组中。在原核生物体的情况中，基因组包含在单个染色体中，且在一些情况中包含在一个或多个染色体外遗传元件如附加体（例如质粒）中。根据具体的病毒，病毒基因组可以采取一种或多种单链或双链DNA或RNA分子的形式。

术语“半抗原”指可以与抗体特异性组合但除与载体分子组合外通常基本不能为免疫原性的分子（通常为小分子）。

术语“分离的”就生物学组分（如核酸分子、蛋白质或细胞）而言指已基本从该组分天然存在的生物体的细胞中的其它生物学组分如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质、细胞和细胞器或生物体自身分开或纯化的生物学组分。已“分离的”核酸分子包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子。该术语还涵盖通过扩增或克隆制备的核酸以及化学合成的核酸。

“标记物”是直接或间接缀合于另一分子以促进对该分子的检测的可检测化合物或组合物。标记物的特定的非限制性例子包括荧光模块和荧光产生(fluorogenic)模块、生色模块、半抗原、亲和标签和放射性同位素。标记物可以是直接可检测（例如光学可检测的）或间接可检测（例如，经由与继而可检测的一种或多种别的分子的相互作用）的。下文描述了在本文中公开的探针的背景中的例示性标记物。用于标记核酸的方法，和在选择可用各种目的的标记物的指南在例如Sambrook和Russell,于Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）和Ausubel等,in Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley-Intersciences（1987,and including updates）中论述。

术语“多重”指在期望时允许使用复数个不同缀合物基本同时或序贯检测样品中多种靶物的实施方案。多重化可包括个别和以任何和所有组合两者方式鉴定和/或量化核酸（一般情况）、DNA、RNA、肽、蛋白质。多重化还可包括在细胞中在其解剖背景中检测基因、信使和蛋白质中的两种或更多种。

“核酸”是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，涵盖以与天然存在的核苷酸类似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的类似物。术语“核苷酸”包括但不限于包含与糖（如核糖、脱氧核糖或其合成类似物）连接的碱基（如嘧啶、嘌呤或其合成类似物）或与氨基酸连接的碱基（如在肽核酸（PNA）中）的单体。核苷酸是多核苷酸中的一个单体。核苷酸序列指多核苷酸中的碱基序列。

核酸“区段”是靶核酸分子的子部分或子序列。核酸区段可以以多种方式自靶核酸分子假定地或实际地衍生。例如，靶核酸分子（如基因组靶核酸分子）的区段可通过用一种或多种限制酶消化以生成作为限制性片段的核酸区段获得。核酸区段也可以通过扩增从靶核酸分子生成、通过杂交（例如扣除杂交）、通过人工合成、或任何其它生成在序列中对应于靶核酸分子的一种或多种核酸的规程生成。核酸区段的一个具体的例子是结合区。

“探针”或“核酸探针”是能够与靶核酸分子（例如基因组靶核酸分子）杂交，且在与靶物杂交时能被直接或间接检测出来的核酸分子或核酸分子集。如此，探针允许检测且在一些实施例中量化靶核酸分子。在具体的实施例中，探针包括多个核酸分子，该核酸分子包含自靶核酸分子衍生的且如此能够与靶核酸分子的至少一部分特异性杂交的结合区。探针可以称为“经标记的核酸探针”，其指示探针直接或间接与使探针可检测的可检测模块或“标记物”偶联。

术语“半导体纳米晶体”指由于量子限制而展现出大小依赖性电子和光学特性的纳米级颗粒。半导体纳米晶体例如由半导体材料（例如硒化镉或硫化铅）构建并且来自微晶（经由分子束外延生长）等。具有各种表面化学和荧光特征的多种半导体纳米晶体可购自Life Technologies（参见例如美国专利No.6,815,064、6,682596和6,649,138）。半导体纳米晶体还可购自eBiosciencesand Evident Technologies。其它半导体纳米晶体包括合金半导体纳米颗粒如ZnSSe、ZnSeTe、ZnSTe、CdSSe、CdSeTe、ScSTe、HgSSe、HgSeTe、HgSTe、ZnCdS、ZnCdSe、ZnCdTe、ZnHgS、ZnHgSe、ZnHgTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、ZnCdSSe、ZnHgSSe、ZnCdSeTe、ZnHgSeTe、CdHgSSe、CdHgSeTe、InGaAs、GaAlAs和InGaN半导体纳米颗粒（合金半导体纳米颗粒及其制备方法披露于例如美国申请公开文本No.2005/0012182和PCT公开文本WO2005/001889）。

“样品”是从受试者获得的含有基因组DNA、RNA（包括mRNA）、蛋白质及其组合的生物学标本。例子包括但不限于染色体制备物、外周血、尿液、唾液、组织活组织检查、手术标本、骨髓、羊膜穿刺样品和尸检材料。在一个例子中，样品包括基因组DNA或RNA。在一些例子中，样品是细胞遗传制备物，例如其可置于显微镜载玻片上。在具体的例子中，直接使用样品，或在使用前通过例如通过固定（例如使用福尔马林）操作样品。

术语“信号生成模块”指生成通过测定法可检测的信号的组合物或分子。

术语“特异性结合模块”指结合对的成员。特异性结合对是分子对，其特征在于它们实质性排除对其它分子的结合彼此结合（例如，特异性结合对可以具有比结合对两成员任一个与生物学样品中其它分子的结合常数至少大103M-1、大104M-1或大105M-1的结合常数）。特异性结合模块的具体的例子包括特异性结合蛋白质（例如抗体、凝集素、亲合素如链霉亲合素和蛋白A）、核酸序列和蛋白-核酸。特异性结合模块还可包括由这类特异性结合蛋白特异性结合的分子（或其部分）。

术语“特异性结合剂”指包含缀合于信号生成模块的特异性结合模块的分子。

“受试者”包括任何多细胞脊椎动物生物体，如人和非人哺乳动物（例如兽医受试者）。

“靶核酸序列或分子”是核酸分子例如基因组（如含有感兴趣基因的哺乳动物基因组DNA的基因或区域）或RNA序列的限定区域或特定序列。在靶核酸序列是靶基因组序列的一个例子中，这类靶物可通过其在染色体（例如在正常细胞中）上的位置限定，例如依照细胞遗传命名通过参照在染色体上的具体位置；通过参照其在遗传图谱上的位置；通过参照假定或装配的重叠群；通过其特定序列或功能；通过其基因或蛋白质名称，或通过任何其它独特将其从基因组的其它遗传序列中鉴定出来的手段。在一些例子中，所述靶核酸序列式哺乳动物或病毒基因组序列。在其它例子中，所述靶核酸序列是RNA序列。

在一些例子中，靶核酸序列（例如基因组核酸序列）的变化与疾病或状况“有关”。也就是说，靶核酸序列的检测可用于推断就疾病或状况而言的样品状态。例如，靶核酸序列可以以两种（或更多种）可区分形式存在，从而第一种形式与疾病或状况的缺失关联，而第二种（或不同）形式与该疾病或状况的存在关联。两种不同形式可以是定性可区分的(如通过多核苷酸多态性实现)，和/或两种不同形式可以是定量可区分的（如通过存在于细胞中的靶核酸序列的拷贝数实现）。

“载体”是充当其它（“外来”）对于载体而言非天然的核酸序列的载体的任何核酸。当导入适宜的宿主细胞中时，载体可以自身复制（及由此复制外来核酸序列）或表达该外来核酸序列的至少一部分。在一个背景中，载体是线性或环状核酸，对其中导入（例如克隆）感兴趣的靶核酸序列以用于复制（例如生产）和/或使用标准重组核酸技术（例如限制性消化）进行操作的目的。载体可包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可包含一个或多个选择标志物基因和其它本领域中已知的遗传元件。常用载体包括例如质粒、粘粒、噬菌体、噬菌粒、人工染色体（例如BAC、PAC、HAC、YAC）和掺入超过一种这些类型的载体的特征的杂合体。载体通常包含一个或多个独特限制性位点（且在一些情况中为多克隆位点）以便于插入靶核酸序列。

发明详述

本公开内容涉及用于分析染色体重排的系统和方法，并且具体地涉及通过原位杂交对染色体重排的分析。染色体重排将基因置于新的连锁关系中并生成没有正常配对配偶的染色体。本公开内容不限于分析任何特定类型的染色体重排。在一些实施方案中，染色体重排发生在同一染色体内。此类型重排的一个例子是倒位。在一些实施方案中，所述重排是易位。在易位中，来自一条染色体的区段转移至一条非同源染色体或转移至同一染色体上的新位点。非交互易位是单向易位，其中染色体区段转移至非同源染色体。在另一方面，交互易位牵涉来自两条非同源染色体的区段的交换。当重排将两个在其它情况下分开的基因连接时，可以创建基因融合，其发生在癌症中是普遍的。染色体断裂点是染色体上的一个区域，在该处正常排列的染色体的双链断裂从而发生重排。易位需要两条双链断裂。

本公开内容提供用于检测生物学样品中的靶基因序列的探针和探针系统。在优选的实施方案中，靶序列是基因和倾向于重排的周围序列（5’和3’）。根据染色体断裂点，重排能导致正常基因功能的破坏或误调节。在许多情况中，这些分子重排被视为各种癌症的最初起因。事实上，在过去的数十年中，临床细胞遗传学家已能将特定的染色体断裂点与临床限定的癌症（包括白血病、淋巴瘤和肉瘤的亚型）关联起来。几乎所有在肿瘤中观察到的重排经由体细胞突变发生，因此这些不是在家族中遗传的。

对许多这些重排断裂点周围DNA序列的分析提供对癌症的重要机械了解。在一些情况中，重排将第一基因的编码序列置于第二基因的调节序列附近。要描述的此种类的第一重排是牵涉患有伯基特（Burkitt）氏淋巴瘤的患者中的染色体8和14的重排。此具体重排将来自染色体8的MYC原癌基因置于染色体14上的有力的免疫球蛋白重链基因（IGH）启动子的控制下。正常地，MYC蛋白触发用于细胞增殖的信号，且此重排引起淋巴样细胞（其中IGH启动子通常是有活性的）中高水平的MYC过表达。

在其它癌症中，重排将两基因的编码序列融合在一起以生成有力的癌基因。有历史兴趣的一个例子是费城（Philadelphia）染色体，其最初在患有慢性骨髓性白血病（CML）的患者中被鉴定为一条微小的或小得异乎寻常的染色体。费城染色体实际是交互易位的产物，该交互易位牵涉染色体9和22的q臂末端处的小区段。牵涉多个实验室的后续分子分析揭示，易位将染色体22上BCR（断裂点簇区）基因的编码序列与染色体9上的ABL基因的编码序列融合。由该嵌合基因编码的BCR-ABL融合蛋白是蛋白质酪氨酸激酶，其组成性激活牵涉细胞生长和增殖的信号传导途径。此特定断裂点的知识已导致对CML的成功治疗，因为研究者能利用序列信息来过表达BCR-ABL蛋白并使其结晶，这继而导致开发出抑制此蛋白活性的药物。

在一些优选的实施方案中，将所述探针和探针系统用于原位杂交规程，例如荧光原位杂交（FISH）、比色原位杂交（CISH）和银原位杂交（SISH）。在一些实施方案中，生物学样品包括组织切片（如通过活组织检查获得）或细胞学样品（如巴氏涂片（Pap smear）或血液涂片）。可以使用公开的所述探针和探针系统的其它类型的测定法对于本领域技术人员是容易显而易见的，且在下文论述了具体的例子。

在一些优选的实施方案中，所述探针系统包含至少3种探针，用于分析包含染色体断裂点的特定靶序列。在优选的实施方案中，每种探针优选包含与基因组DNA的限定区域杂交的多个探针。在优选的实施方案中，用生物信息学工具如人基因组浏览器（Human Genome Browser）和重复掩体（RepeatMasker）设计探针集。在优选的实施方案中，从探针设计消除重复元件。在一些优选的实施方案中，通过聚合酶链式反应（PCR）过程来合成探针。例如，在一些实施方案中，使用Primer3程序（在万维网上primer3.sourceforge.net）来设计针对穿过染色体限定区域的独有序列的引物。在一些实施方案中，对设计的PCR片段和引物分析与人基因组和转录物的相似性，例如用人BLAT和Blastnt程序（在万维网上genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat）进行。排除与其它区域（即染色体中对其设计其它探针的其它限定区域）展现出高度相似性的片段，并且通过测序验证所有PCR片段。在一些优选的实施方案中，连接PCR片段、随机扩增、并使用缀合于半抗原的核苷酸（例如dUTP或dCTP）通过切口平移标记（在下文以更为详细描述）。

现参照图1，显示了具有断裂点区120的染色体100的示意图。穿过断裂点区120，第一核酸探针121、第二核酸探针123和第三核酸探针122可以配置为与断裂点区120杂交。箭头（124、125、126）是3种例示性探针配置中断裂点的例示性断裂点位置。在一个实施方案中，探针（121、122、123）配置为将断裂点置于探针121的5’端和探针122的3’端，如箭头124显示的。类似地，将断裂点置于探针123的3’端和探针122的5’端的探针配置由箭头126显示。在另一个实施方案中，将断裂点置于探针122的跨度内的探针配置由箭头125显示。探针可配置为将断裂点置于探针背景中的数个不同位置中。由箭头（124、125、126）显示的断裂点位置仅为目前理解为有用的例示性位置。断裂点在探针121或探针123内的定位也是合理的，尽管它可能不是优选的实施方案。在例示性实施方案中，探针配置为产生独特信号。因而，图1显示具有独特阴影的探针（例如探针121用垂直条纹绘出，探针122绘制为实心黑色，而探针123绘成水平条纹）。在一些实施方案中，这些探针将配置为包含标记物，从而在视觉上将它们彼此区别开来。不限于具体的检测办法，图2（A-D）显示在与样品的遗传DNA杂交后检测独特标记物的例示性办法。

现参照图2（A-D），显示了对样品分析与断裂点关联的染色体易位的例示性办法的示意图。断裂点区27绘为被第一核酸探针21、第二核酸探针23和第三核酸探针22跨越。核酸探针是标记的，第一标记物显示为菱形221、第二标记物显示为三角形222，而第三标记物223显示为五边形。当探针显示为具有单一标记物时，此表示仅为象征性的。每种探针实际上会用多个标记物标记。例如，第一核酸探针21可以包含缺口平移到多个更小的半抗原化寡核苷酸探针种类的700kb核酸序列。断裂点的例示性位置显示为箭头24、25和26。图2（A-D）显示用于分析样品的例示性方法，其包括（A）使所述样品与至少3种探针接触并建立适合于那些探针与样品中找到的遗传DNA杂交的条件，（B）使所述样品与针对经标记探针之一的抗体28接触，（C）使所述样品与同多种酶分子缀合的二抗29接触，并（D）使样品与检测试剂接触，该检测试剂利用酶促沉积导致可检测种类29沉积到探针附近。

再次参照图2A，在例示性实施方案中，使样品与第一核酸探针接触包括具有配置为与位于断裂点5’的基因组DNA杂交的第一序列的第一核酸探针21。三种潜在的断裂点由箭头24、25和26显示。不管选择哪个断裂点位置，探针21保持在断裂点5’。类似地，具有配置为与位于断裂点3’的基因组DNA杂交的第二序列的第二核酸探针23显示在每个断裂点位置的3’位置。用于分析样品的方法包括使样品与第三核酸探针接触，该第三核酸探针包含配置为与邻近断裂点的基因组DNA杂交的第三序列。配置为与邻近断裂点的基因组DNA杂交的例示性序列显示为探针22。如由例示性断裂点24、25和26指示的，探针22根据其直接相对于一侧或另一侧的位置（例如由箭头24或26显示），或由于跨越断裂点（箭头25）而临近该断裂点。

现参照图2B，显示了使样品与针对经标记探针之一的抗体28接触的例示性步骤的示图。例如，经半抗原标记的探针可通过使样品与抗半抗原抗体接触来检测。图2（A-D）显示3种探针的例示性杂交和对那些探针之一的后续检测。可以使用序贯或同时的检测策略来检测其它探针的杂交。也就是说，可以使特异于标记物222和标记物223的别的抗体与同抗体28同时或序贯地与样品接触。此外，由图2C代表的使样品与与多种酶分子缀合的二抗29接触的步骤可以同时或序贯伴有类似步骤以检测标记物222和标记物223。以同样的方式，由图2D代表的检测步骤可以同时或序贯伴有类似的步骤以沉积对应于标记物222和标记物223的别的可检测种类。例示性地，用于标记每种标记物的可检测种类是独特的。

参照图1，用不同的模式显示探针121、122和123。类似地，参照图2A-2D，用不同形状显示标记物221、222和223。使用不同的模式和形状意图指示可将各种检测策略用于检测这些各种探针。因此，可以选择允许区别各种探针位置的检测化学。在例示性实施方案中，检测探针的杂交包括检测与第一核酸探针关联的第一信号、与第二核酸探针关联的第二信号、和与第三核酸探针关联的第三信号。在一个实施方案中，信号是独特的。在一些优选的实施方案中，用不同的可检测模块如半抗原来标记第一、第二和第三探针，该不同的可检测模块允许分辨3种探针中每一种的杂交。

在本公开内容的一些实施方案中，所述系统包含与基因组DNA中在染色体断裂点5’的一部分（即基因组DNA的第一限定区域）杂交的第一核酸探针集、与在基因组DNA中染色体断裂点3’的一部分（即基因组DNA的第二限定区域）杂交的第二核酸探针集、和第三核酸探针集，其包含5’部分和3’部分，且与染色体断裂点区附近的5’和3’序列杂交，从而第三核酸探针在缺乏重排的情况下跨越染色体断裂点区（即基因组DNA的第三限定区域）（即与跨越染色体断裂点区的限定区域杂交）。会领会针对断裂点区的探针集包含各探针中与在断裂点5’的基因组DNA杂交的部分（即5’杂交部分）和各探针中与在断裂点3’的基因组DNA杂交的部分（即3’杂交部分）。在断裂点在基因内的实施方案中，所述系统可以包含与靶序列的5’非编码区杂交的第一核酸探针，与靶序列的3’非编码区杂交的第二核酸探针，以及第三核酸探针，其包含5’部分和3’部分，且其与临近靶序列断裂点的5’和3’序列杂交，从而第三核酸探针在靶序列未重排时跨越靶序列的断裂点（即与跨越靶序列断裂点的限定区域杂交）。

在例示性实施方案中，分析样品的方法包括易位的检测。现参照图3，显示了发生在同一染色体上的易位（例如EML4-ALK融合基因）。现参照图7，其显示在不同染色体之间发生的易位（例如KIF5B-ALK融合或TFG-ALK融合）。再参照图3，显示了用于对样品分析与断裂点有关的染色体易位的例示性方法和系统应用。显示的是染色体210，与ALK基因20有关的断裂点区，和与EML4基因30有关的断裂点区的表示。对于EML4和ALK基因，基因之间的距离11为约12Mb，ALK位于2p23，而EML4位于2p21。跨越与ALK基因20有关的断裂点区，3种探针已配置为具有与ALK基因的独有区域互补的序列。第一探针321与断裂点3’的序列互补，第二探针323与断裂点5’的序列互补，而第三探针322与跨越断裂点的序列互补。染色体210以其无易位的野生型显示于图3。图4显示染色体2410，其包含与ALK-EML4融合基因有关的倒位。倒位对探针定位的影响由探针321、322和323的定位指示。也即，染色体易位可通过探针与遗传DNA杂交的独特方式鉴定。现参照图5（A-B），显示了示意图，其显示依照本文中描述的方法，具有野生型基因配置（图5A）的染色体伸展500可以与具有ALK-EML4融合基因（图5B）的染色体伸展501区分的方式。具体地，图5A对应于图3中显示的示意图；标记的顺序以321、322和323的次序。现参照图6A，显示了一个实施方案，其中用红色色原体检测探针321，用蓝色色原体检测探针322，以及用黄色色原体检测探针323。因而，如图6A中绘图显示和图5A中示意性显示的，探针的次序和取向生成具有沿染色体长度纵向排布的红色、蓝色和黄色次序和取向的信号。在图6A中，红色、蓝色和黄色信号用标记为“R”（红色信号）、“B”（蓝色信号）或“Y”（黄色信号）的箭头指示。类似地，图5B对应于图4中显示的示意图；标记的顺序是321、322、323的次序，且322以两个分开的簇排布。现参照图6B，显示了一个实施方案，其中用红色色原体检测探针321，用蓝色色原体检测探针322，以及用黄色色原体检测探针323。因而，如图6B中绘图显示和图5B中示意性显示的，探针的次序生成具有红色、蓝色、黄色的次序和取向的信号，且蓝色以两个信号簇排布，一个包含红色和蓝色，另一个包含黄色和蓝色。在图6B中，红色、蓝色和黄色信号用标记为“R”（红色信号）、“B”（蓝色信号）或“Y”（黄色信号）的箭头指示。在图5B中，可以看到一个基因拷贝保持为野生型配置，但第二基因拷贝显示倒位ISH信号。该倒位ISH信号包含跨越断裂点的探针322的两分，因此有两个信号（在图6B和5B中分别显示为蓝色或黑色点）。由于相同长度的探针在两个地方定位的实情，来自两分探针的信号可能具有减小的强度。在野生型染色体中，探针配置为彼此在染色体上紧密接近，从而得到紧密成簇的ISH信号。这可以在图5A中清楚看到。对于包含易位的染色体，ISH信号展现出伸展，如在图5B中显示为双箭头510的。

在一个实施方案中，分析样品的方法包括易位的检测。现参照图7，显示了在不同染色体之间发生的易位（例如KIF5B-ALK融合或TFG-ALK融合）。显示染色体210（与ALK基因20有关的断裂点区）的图示，以及染色体1050和与KIF5B基因52有关的断裂点的图示。依照此易位，染色体210的区域12与依照箭头55的染色体1050的区域512易位。此易位导致图8中显示的经修饰的染色体，经修饰的染色体2810和经修饰的染色体10850。穿过与ALK基因20有关的断裂点区，设计3种具有与ALK基因的独特区域互补的序列的探针。第一探针321与断裂点3’的序列互补，第二探针323与断裂点5’的序列互补，而第三探针322与跨越断裂点的序列互补。这些跨越与ALK基因20有关的断裂点区的探针显示于图3。现参照图9（A-B），该示意图代表如下的方式，其中依照本文中描述的方法，具有野生型基因配置（图9A）的染色体伸展900可以与具有KIF5B-ALK融合基因（图9B）的染色体伸展901区分开来。具体地，图9A对应于图7中显示的示意图；标记的次序是以沿染色体长度纵向排布的处于紧密分布的簇中的321、322和323的次序和取向。如图9A中示意性显示的，探针的次序生成具有第一次序的信号（例如红色、黑色和蓝色）。类似地，图9B对应于在图8中显示的示意图；标记的顺序是以321、322和323的次序和取向，且322（例如与蓝色-黑色分开的红色-黑色）。在图9B中，可以看到一个基因拷贝保持为野生型配置，但第二基因拷贝显示易位的ISH信号。该易位ISH信号包含跨越断裂点的探针322的两分，因此两个信号（在图9B中显示为黑色点）以实质性距离分开（由双箭头910代表）。由于相同长度的探针在两个地方中定位的事实，来自两分探针的信号可能具有减小的强度。在与图9A中显示的成簇信号对比时，图9B中显示的信号之间的距离提供了融合基因存在的证据。

在例示性实施方案中，依照本公开内容的方法包括检测探针的杂交，其通过检测与第一核酸探针关联的第一信号、与第二核酸探针关联的第二信号和与第三核酸探针关联的第三信号进行。如图5（A-B）和9（A-B）中显示的，当发生染色体重排时，生成信号，其中来自第三核酸探针的信号（例如，来自合适标记物的比色信号、荧光测定信号或发光信号，如下文更为详细描述的）与来自第一和第二核酸探针的每种信号分开共定位。如可以看到的，存在包含来自第一核酸探针的信号和来自第三核酸探针的信号的独特的第一信号，以及包含来自第二核酸探针的信号和来自第三核酸探针的信号的独特的第二信号。根据重排，第一和第二独特信号可位于属于相同或不同染色体（取决于重排）的基因组DNA上。在已发生重排的样品中，对应于断裂点区的探针集是两分的，其中探针集的分开部分与断裂点侧翼的5’和3’区杂交，即探针集的5’杂交部分与重排的靶序列的5’端杂交，而探针集的3’杂交部分与重排的靶序列的3’部分杂交。此杂交模式导致第三探针的两分（即两个分开的信号）。当用与前两种探针不同的颜色标记第三种探针时，极大增强测定法的分辨率和区分假阳性信号的能力。

如还在图5（A-B）和9（A-B）中显示的，当未发生染色体易位时，生成信号，其中来自第三核酸探针的信号（例如，来自合适标记物的比色信号、荧光测定信号或发光信号，如下文更为详细描述的）与来自第一和第二核酸探针的每种信号共定位。如可以看到的，存在包含来自第一、第二和第三核酸的信号的单一信号。在此情况下，第一和第二探针与靶序列的5’和3’区杂交，而第三探针与靶序列杂交从而其跨越假定的断裂点（即与跨越假定断裂点的区域杂交）。

在本公开内容的一些实施方案中，所述系统包含与基因组DNA中在染色体断裂点5’的一部分（即基因组DNA的第一限定区域）杂交的第一核酸探针集、与基因组DNA中在染色体断裂点3’的一部分（即基因组DNA的第二限定区域）杂交的第二核酸探针集、和第三核酸探针集，所述第三核酸探针集在缺乏重排的情况下与紧邻染色体断裂点区5’的基因组区域（即基因组DNA的第三限定区域）杂交，而且在优选的实施方案中与靶重排基因（例如如图3中绘出的ALK）杂交。在备选的实施方案中，第三核酸探针集在缺乏重排的情况下与紧邻染色体断裂点区3’的基因组区域（即基因组DNA的第三限定区域）杂交，而且在优选的实施方案中与靶重排基因杂交。在一些优选的实施方案中，用不同的可检测模块如半抗原标记第一、第二和第三探针，所述可检测模块允许解析3种探针中每一种的杂交。例如，当发生染色体重排时，生成信号，其中相比于未重排的基因组DNA，来自第三核酸探针的信号（例如，来自合适标记物的比色信号、荧光测定信号或发光信号，如下文更为详细描述的）以改变的取向与来自5’探针的信号分开共定位。在优选的实施方案中，改变的取向是倒置的取向，例如如在图5B中绘出的。如本文中使用的，术语倒置在用于提述探针杂交模式时指与在野生型样品中观察到的取向相反的取向。在备选的实施方案中，当第三探针集在缺乏重排的情况下与紧接染色体断裂点区3’的基因组区域杂交时，来自第三探针集的信号与3’探针共定位。

在一些实施方案中，第一、第二和第三核酸探针包含可检测模块。在一些实施方案中，所述可检测模块选自下组：半抗原、酶、荧光分子、发光分子和放射性分子。在一些实施方案中，所述可检测模块是半抗原，且第一、第二和第三核酸探针分别用不同的第一、第二和第三半抗原标记。在一些实施方案中，不同的第一、第二和第三半抗原选自下组：生物素、2,4-二硝基苯基(DNP)、荧光素衍生物、洋地黄毒苷(DIG)、5-硝基-3-吡唑碳酰胺(pyrozolecarbamide)(硝基吡唑，NP)、4,5,-二甲氧基-2-硝基肉桂酰胺(硝基肉桂酰胺，NCA)、2-(3,4-二甲氧基苯基)-喹啉-4-碳酰胺(苯基喹诺酮，DPQ)、2,1,3-苯并

二唑(benzoxadiazole)-5-碳酰胺(苯并呋咱，BF)、3-羟基-2-喹喔啉碳酰胺(羟基喹喔啉，HQ)、4-(二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL)、鱼藤酮异唑啉(Rot)、(E)-2-(2-(2-氧-2,3-二氢-1H-苯[b][1,4]二氮杂卓(diazepin)-4-基)苯氧基)乙酰胺(苯并二氮杂卓(benzodiazepine)，BD)、7-(二乙基氨基)-2-氧-2H-色烯-3-羧酸(香豆素343，CDO)、2-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑磺酰胺(噻唑磺酰胺，TS)和对甲氧基苯基吡唑鬼臼酰胺(methoxyphenylpyrazopodophyllamide)(Podo)。在一些实施方案中，所述检测进一步包括使所述样品与分别对所述第一、第二和第三半抗原特异性的第一、第二和/或第三抗体接触。在一些实施方案中，所述第一、第二和第三抗体与酶缀合。在一些实施方案中，所述酶选自下组：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和β-内酰胺酶。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与结合第一、第二和/或第三抗体的抗体接触。在一些实施方案中，结合第一、第二和/或第三抗体的抗体与酶缀合。在一些实施方案中，所述酶选自下组：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和β-内酰胺酶。在一些实施方案中，结合第一、第二和/或第三抗体的抗体与不同荧光分子缀合。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括使样品与比色检测试剂接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使样品与比色检测试剂接触。在一些实施方案中，所述检测包括选自下组的方法：比色检测、荧光测定检测和放射性测量检测。在一些实施方案中，染色体易位的存在由第一核酸探针部分与位于断裂点5’的基因组DNA的杂交、第二核酸探针部分与位于断裂点3’的基因组DNA的杂交、以及第三核酸探针5’部分与邻近断裂点的5’序列和第三核酸探针3’部分对邻近断裂点的3’序列的分开杂交指示。在一些实施方案中，染色体易位的缺失由第一核酸探针部分与位于断裂点5’的基因组DNA的杂交、第二核酸探针部分与位于断裂点3’的基因组DNA的杂交、以及第三核酸探针5’部分与邻近断裂点的5’序列和第三核酸探针3’部分与邻近断裂点的3’序列的杂交（从而第三探针与跨越断裂点的基因组DNA的区域杂交）指示。

在一些实施方案中，本公开内容提供用于分析怀疑具有与断裂点有关的染色体易位的样品的系统，其包含：与基因组DNA中位于所述断裂点5’的一部分杂交的第一核酸探针，与基因组DNA中位于所述断裂点3’的一部分杂交的第二核酸探针，和与DNA中断裂点附近的一部分杂交的第三核酸探针。在一些实施方案中，第三核酸探针还包含5’部分和3’部分，其中5’部分与基因组DNA中在断裂点5’且附近的一部分杂交，而3’部分与基因组DNA中在断裂点3’且附近的一部分杂交，从而第三核酸探针在缺乏重排的情况下与跨越断裂点的基因组DNA的区域杂交。在一些实施方案中，第三核酸探针与基因组DNA中在断裂点5’且附近的一部分杂交，从而相比于在缺乏重排的情况下对第一核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测信号的取向，在存在重排的情况下对第一核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测的信号具有倒置的取向。在一些实施方案中，第三核酸探针与基因组DNA中在断裂点3’且附近的一部分杂交，从而相比于在缺乏重排的情况下对第二核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测信号的取向，在存在重排的情况下对第二核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测的信号具有倒置的取向。

在一些实施方案中，本公开内容提供用于分析怀疑具有与断裂点关联的染色体易位的样品的试剂盒，其包含：与基因组DNA中位于所述断裂点5’的一部分杂交的第一核酸探针，与基因组DNA中位于所述断裂点3’的一部分杂交的第二核酸探针，和与DNA中所述断裂点附近的一部分杂交的第三核酸探针。在一些实施方案中，第三核酸探针还包含5’部分和3’部分，其中5’部分与基因组DNA中在断裂点5’且附近的一部分杂交，而3’部分与基因组DNA中在断裂点3’且附近的一部分杂交，从而使得第三核酸探针在缺乏重排的情况下与跨越断裂点的基因组DNA的区域杂交。在一些实施方案中，第三核酸探针与基因组DNA中在断裂点5’且附近的一部分杂交，从而相比于在缺乏重排的情况下对第一核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测信号的取向，在存在重排的情况下对第一核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测的信号具有倒置的取向。在一些实施方案中，第三核酸探针与基因组DNA中在断裂点3’且附近的一部分杂交，从而相比于在缺乏重排的情况下对第二核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测信号的取向，在存在重排的情况下对第二核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测的信号具有倒置的取向。

在一些实施方案中，本公开内容提供用于诊断与断裂点关联的染色体易位有关疾病的方法，其包括：

提供来自怀疑患有与断裂点关联的染色体易位有关疾病的患者的样品，并提供与基因组DNA中位于所述断裂点5’的一部分杂交的第一核酸探针，与基因组DNA中位于所述断裂点3’的一部分杂交的第二核酸探针，和与DNA中所述断裂点附近的一部分杂交的第三核酸探针；将探针与样品中的基因组DNA杂交；检测探针与样品中基因组DNA的杂交；利用来自该检测的结果来提供对该患者中疾病的诊断。

在一些实施方案中，本公开内容提供用于对患有与断裂点关联的染色体易位有关疾病的患者预测结果的方法，其包括：提供来自怀疑患有与断裂点关联的染色体易位有关疾病的患者的样品，并提供与基因组DNA中位于所述断裂点5’的一部分杂交的第一核酸探针，与基因组DNA中位于所述断裂点3’的一部分杂交的第二核酸探针，和与DNA中所述断裂点附近的一部分杂交的第三核酸探针；将探针与样品中的基因组DNA杂交；检测探针与样品中基因组DNA的杂交；利用来自该检测的结果来提供与该患者中疾病有关的预后。

在一些实施方案中，本公开内容提供为患有与断裂点关联的染色体易位有关疾病的患者确定疗法的方法，其包括：提供来自怀疑患有与断裂点关联的染色体易位有关疾病的患者的样品，并提供与基因组DNA中位于所述断裂点5’的一部分杂交的第一核酸探针，与基因组DNA中位于所述断裂点3’的一部分杂交的第二核酸探针，和与DNA中所述断裂点附近的一部分杂交的第三核酸探针；将探针与样品中的基因组DNA杂交；检测探针与样品中基因组DNA的杂交；利用来自该检测的结果来确定用于该患者的治疗性处理。

在先前描述的两色分离探针系统中，由于5’和3’分离探针之间的缺口而存在问题。依赖于5’和3’探针信号在细胞内成多少角度，即使尚未发生重排，5’和3’探针信号可以以2个分开的探针信号看到。这是假阳性信号。本系统通过引入第三探针解决了这些问题，该第三探针生成联合前两种探针的信号。此系统在重排以同一染色体发生的情况下（例如倒位）尤其有用，尽管该系统还具有当易位发生在染色体之间时生成容易阅读的信号的优点。各个实施方案在下文以更为详细描述。

A.靶核酸探针

本公开内容利用核酸探针。在优选的实施方案中，核酸探针是与样品中基因组DNA的限定区域（即靶核酸序列）结合或杂交的探针集，如上文描述的。优选地，所述核酸探针包含任何合适的核酸，如RNA（核糖核酸）、DNA（脱氧核糖核酸）、LNA（锁定核酸）、PNA（肽核酸）或其组合，并且可包含标准核苷酸（如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸）和核苷酸类似物两者。

在一些实施方案中，所述核酸探针集与期望的靶核酸序列是大于80%互补的，优选地与期望的靶核酸序列是大于90%互补的，更优选地与期望的靶核酸序列是大于99%互补的，且最优选地与期望的靶核酸序列是约100%互补的。一般而言，使用本领域中标准的实践来完成核酸探针设计。例如，一般避免如下的序列，其具有自身互补性，使得所得探针会自身折叠，或者以对靶核酸的结合为代价彼此杂交。

在选择靶探针部分的长度中的一个考虑是含有靶核酸的样品的复杂性。例如，人基因组长度为约3X10⁹个碱基对。任何10个核苷酸序列会在30亿个碱基对中以约2,861次的频度出现。此长度的靶探针部分会具有较差的与具有人基因组大小的序列的靶物内的10个核苷酸的区独特结合的机会。然而，如果靶序列在3kb质粒内，这类寡核苷酸可能具有非常合理的独特结合的机会。通过此相同的计算，可以看到具有16个核苷酸的寡核苷酸（即16聚体）是数学上可能在3X10⁹个碱基对中出现1次的序列的最小长度。此特异性水平还可由两种或更多种更短的核酸序列提供，如果它们配置为以协同性方式结合结合的话（即，使得它们仅在两者或全部结合至其意图的靶序列时才能生成意图复合物），其中所述短序列的组合提供期望的特异性。

在选择靶探针部分长度中的第二个考虑是预期靶探针部分会发挥功能的温度范围。平均碱基含量（50%G-C碱基）的16聚体会具有约41℃的计算Tm，其取决于探针及其靶物的浓度、反应的盐含量和核苷酸的精确次序等。作为一个实际问题，通常选择较长的靶探针部分以增强杂交的特异性。例如，可以使用长度从20至25个核苷酸的靶探针部分，因为它们在用于于接近其Tm（在Tm的约5℃内）的温度进行的反应中时极有可能为特异性的。

在优选的实施方案中，考虑这些考虑因素来设计核酸探针集，从而靶探针部分会在用户限定的合适条件下与靶核酸杂交。

可以手动选择核酸，或在计算机执行的算法的帮助下选择核酸，该计算机执行的算法基于期望的参数如温度、长度、GC含量等优化引物选择。经由因特网或在个人计算机上使用的大量计算机执行的算法或程序是可获得的。例如，为了生成来自靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）的多个结合区，鉴定没有重复（或其它不想要的，例如产生背景的）核酸序列的序列区域，例如手动或通过使用计算机算法进行。在跨越数个到数百个千碱基的靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）内，通常鉴定出大量基本上或完全没有重复（或其它不想要的，例如产生背景的）核酸序列的结合区。

可以通过任何已知的方法合成核酸探针。在一些实施方案中，将编码核酸探针的序列克隆到质粒表达载体中。优选地，用RNA聚合酶从该载体转录核酸探针以提供编码该核酸探针的RNA分子。在一些实施方案中，所述核酸探针是化学合成的，例如使用亚磷酰胺（phosphoramidite）类似物进行。在一些实施方案中，通过对质粒DNA的扩增、纯化和限制性消化来合成DNA探针以提供编码靶核酸探针的DNA分子。随后，可将双链DNA熔解成单链以用于杂交方案。在一些实施方案中，通过不对称PCR合成靶核酸探针。在一些实施方案中，一种引物可以是例如核酸类似物（例如LNA）。此过程生成如下的探针，其具有含有锁定核苷酸的靶物特异性部分和从标准的dNTP制备的检测靶物部分。在一些实施方案中，含LNA的引物含有生物素以便于纯化期望的链。

在一些实施方案中，所述核酸探针包含一个或多个可检测模块。在一些实施方案中，可检测模块是直接可检测的，而在其它实施方案中，可检测模块是间接可检测的。在一些实施方案中，将可检测模块掺入检测探针中。在一些实施方案中，可检测模块是生成可检测信号的信号生成模块。在一些实施方案中，所述可检测模块与在检测探针的合成中使用的核苷酸或核苷酸类似物缀合。例如，经由如本领域中已知的化学合成使用缀合于期望的可检测模块的核苷亚磷酰胺来合成检测探针。

在一些实施方案中，间接检测所述可检测模块。在一些实施方案中，可检测模块是结合分子系统的第一成员，该系统包含第一和第二或第一、第二和第三成员。在这些实施方案中，将与结合对第一成员缀合的核苷酸掺入检测探针中，优选地经由使用与结合对的第一成员缀合的核苷亚磷酰胺进行。然后，使样品与包含结合对的第二成员（即特异性结合模块）的特定结合剂接触。在一些实施方案中，结合对的第二成员与信号生成模块缀合并用于经由对结合对的第一成员的结合来检测该检测探针。在其它实施方案中，使样品与结合第二结合成员的第三结合成员接触。在这些实施方案中，第三结合成员与信号生成模块缀合。合适的结合分子系统的例子包括但不限于亲合素、生物素、半抗原、抗半抗原抗体和抗-抗体抗体及其组合。例如，在一些实施方案中，检测探针的可检测模块部分包含一个或多个半抗原化的核苷酸。通过使用抗半抗原抗体和与信号生成模块缀合的抗-（抗半抗原抗体）抗体来检测这些半抗原化的核苷酸。

因而，在一些实施方案中，本公开内容提供包含与结合分子系统的第一成员缀合的一个或多个核苷酸的核酸探针。在一些实施方案中，结合分子系统的第一成员是半抗原。在一些实施方案中，检测探针的可检测模块部分是核酸分子，其掺入共价附着半抗原分子（如硝基-芳香族化合物（例如二硝基苯基（DNP））、生物素、荧光素、洋地黄毒苷等）的dNTP。将半抗原和其它标记物与dNTP缀合（例如，以帮助掺入经标记的探针中）的方法是本领域中公知的。对于规程的例子，参见例如美国专利No.5,258,507、4,772,691、5,328,824和4,711,955。实际上，大量经标记的dNTP是可购自例如InvitrogenDetection Technologies（Molecular Probes,Eugene,Oreg.）。标记物可在dNTP上的任何位置如磷酸根（例如α、β或γ磷酸根）或糖处直接或间接附接dNTP。

多种半抗原可用在核酸探针中。这类半抗原包括但不限于吡唑，特别是硝基吡唑；硝基苯基化合物；苯并呋咱；三萜；尿素和硫脲，特别是苯基脲，且甚至更特别地是苯基硫脲；鱼藤酮和鱼藤酮衍生物，本文中也称为鱼藤酮类化合物（rotenoid）；

唑（oxazole）和噻唑，特别是唑和噻唑磺酰胺；香豆素和香豆素衍生物；环木脂体，其以鬼臼毒素（Podophyllotoxin）和鬼臼毒素衍生物例示；以及其组合。半抗原的特定例子包括但不限于2,4-二硝基苯基（DNP）、生物素、荧光素衍生物（FITC、TAMRA、Texas Red等）、洋地黄毒苷（DIG）、5-硝基-3-吡唑碳酰胺(pyrozolecarbamide)(硝基吡唑，NP)、4,5,-二甲氧基-2-硝基肉桂酰胺(硝基肉桂酰胺，NCA)、2-(3,4-二甲氧基苯基)-喹啉-4-碳酰胺(苯基喹诺酮，DPQ)、2,1,3-苯并

二唑(benzoxadiazole)-5-碳酰胺(苯并呋咱，BF)、3-羟基-2-喹喔啉碳酰胺(羟基喹喔啉，HQ)、4-(二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL)、鱼藤酮异

唑啉(Rot)、(E)-2-(2-(2-氧-2,3-二氢-1H-苯[b][1,4]二氮杂卓-4-基)苯氧基)乙酰胺(苯并二氮杂卓(benzodiazepine)，BD)、7-(二乙基氨基)-2-氧-2H-色烯-3-羧酸(香豆素343，CDO)、2-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑磺酰胺(噻唑磺酰胺，TS)和对甲氧基苯基吡唑鬼臼酰胺(Podo)。这些半抗原及其在探针中的用途更详细记载于共同拥有的申请美国专利公开文本No.2008/0305497,2008/0268462和2008/0057513。

在核酸探针包含半抗原的实施方案中，优选地，结合分子系统的第二成员是结合半抗原如抗原结合分子的分子。合适的抗原结合分子的例子包括但不限于抗体、免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子（包括例如但不限于包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM）、抗体片段如F(ab')2片段、Fab'片段、Fab'-SH片段和Fab片段(如本领域中已知的)、重组抗体片段(如sFv片段、dsFv片段、双特异性sFv片段、双特异性dsFv片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白("scFv")、二硫化物稳定化的Fv蛋白("dsFv")、双抗体和三抗体(如本领域中已知的)、以及骆驼抗体（参见例如美国专利No.6,015,695;6,005,079-5,874,541;5,840,526;5,800,988和5,759,808）。在一些实施方案中，生成可检测信号的可检测模块共价地或通过其他方式附接于抗原结合分子。合适的第二结合对成员的例子包括但不限于与生成可检测信号的可检测模块缀合的抗-DNP、抗生物素、抗-FITC、抗-DIG、抗-NP、抗-NCA、抗-DPQ、抗-BF、抗-HQ、抗-DABSYL、抗-Rot、抗-BD、抗-CDO、抗-TS和抗-Podo抗体。在别的实施方案中，结合分子系统的第二成员是不包含可检测模块的抗半抗原一抗。在这些实施方案中，结合分子系统的第三成员是包含生成信号的可检测模块（用于生成可检测信号）的二抗抗-抗体（如山羊抗小鼠IgG抗体）。

如上文描述的，检测探针可以是直接可检测或间接可检测的。在一些直接检测实施方案中，检测探针包含生成可检测信号的可检测模块（例如信号生成模块），而在一些间接检测实施方案中，利用包含与信号生成模块缀合的结合分子系统成员（如二抗）的特异性结合剂，该信号生成模块生成利用的可检测信号。在这些实施方案中，可将多种生成可检测信号的信号生成模块掺入检测探针中或与结合对的成员缀合。

在优选的实施方案中，可以通过任何已知或尚未发现的机制来检测所述信号生成模块，所述机制包括光子（包括射频、微波频率、红外线频率、可见光频率和紫外线频率光子）的吸收、发射和/或散射。信号生成模块包括有色的、荧光、磷光和发光的分子和材料、将一种物质转化成另一种物质以提供可检测差异（如通过将无色物质转化成有色物质或反之亦然，或通过生成沉淀物或增加样品浊度）的催化剂（如酶）、以及顺磁性和磁性分子或材料。

信号生成模块的具体的例子包括荧光分子（或荧光染料）。大量荧光染料是本领域技术人员已知的，并且可以例如从Invitrogen选择（例如参见TheHandbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,Invitrogen Detection Technologies,Molecular Probes,Eugene,Oreg.）。可以附接（例如化学缀合）核酸分子或蛋白质如抗原结合分子的具体荧光团的例子包括但不限于4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪(isothiocyanatostilbene)-2,2'二磺酸、吖啶和衍生物如吖啶和吖啶异硫氰酸盐、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基(vinylsulfonyl)苯基]萘酰亚胺(naphthalimide)-3,5二磺酸盐/酯(Lucifer Yellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺(anthranilamide)、亮黄(Brilliant Yellow)、香豆素和衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(Coumaran151)；焰红染料(cyanosine)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5''-二溴连苯三酚(dibromopyrogallol)-砜酞(sulfonephthalein)(溴连苯三酚红(Bromopyrogallol Red))；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三氨基五乙酸盐(diethylenetriaminepentaacetate)；4,4'-二异硫氰酸二氢-芪(stilbene)-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯(dansyl chloride))；4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基(phenylazophenyl)-4'-异硫氰酸盐(DABITC)；曙红和衍生物如曙红和曙红异硫氰酸盐；赤藓红(erythrosin)和衍生物如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸盐；溴乙非啶(ethidium)；荧光素和衍生物如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪(dichlorotriazin)-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸盐(FITC)、和QFITC(XRITC)；2',7'-二氟荧光素(OREGON GREENTM)；荧胺；IR144；IR1446；孔雀石绿(Malachite Green)异硫氰酸盐；4-甲基伞形酮(umbelliferone)；邻甲酚酞(orthocresolphthalein)；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红(Phenol Red)；B-藻红蛋白；邻酞二醛(phthaldialdehyde)；芘(pyrene)和衍生物如芘、芘丁酸盐和琥珀酰亚氨基1-芘丁酸盐；反应性红(Reactive Red)4(CibacronTM Brilliant Red3B-A)；罗丹明和衍生物如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺(lissamine)罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸盐、罗丹明绿、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)；核黄素；玫红酸(rosolic acid)和铽螯合物衍生物。

其它合适的荧光团包括在约617nm处发射的硫醇反应性的铕螯合物（Heyduk和Heyduk,Analyt.Biochem.248:216-27,1997;J.Biol.Chem.274:3315-22,1999），以及GFP、丽丝胺.TM.、二乙基氨基香豆素、荧光素氯三嗪（chlorotriazinyl）、萘并荧光素、4,7-二氯罗丹明和呫吨（xanthene）（如记载于Lee等的美国专利No.5,800,996）及其衍生物。还可以使用本领域技术人员已知的其它荧光团，例如那些可购自Invitrogen Detection Technologies，Molecular Probes（Eugene,Oreg.）的，且包括ALEXA FLUORTM染料系列（例如，如记载于美国专利No.5,696,157,6,130,101和6,716,979的）、BODIPY染料系列（二吡咯亚甲基二氟化硼(dipyrrometheneborondifluoride)染料，例如如记载于美国专利No.4,774,339、5,187,288、5,248,782、5,274,113、5,338,854、5,451,663和5,433,896的）、级联蓝(Cascade Blue)（美国专利No.5,132,432中描述的磺化芘（sulfonated pyrene）的胺反应性衍生物）和Marina Blue（美国专利No.5,830,912）。

除了上文描述的荧光染料外，荧光标记物可以是荧光纳米颗粒，如半导体纳米晶体（例如QDOT NANOCRYSTALS,Life Technologies；亦参见美国专利Nos.6,815,064、6,682,596和6,649,138）。半导体纳米晶体是具有大小依赖性光学和/或电学特性的显微镜可见颗粒。当用主要能量来源照射半导体纳米晶体时，发生次级能量发射，其频率对应于在该半导体纳米晶体中使用的半导体材料的带隙。此发射可被检测为具有特定波长的有色光或荧光。具有不同光谱属性的半导体纳米晶体记载于例如，美国专利No.6,602,671。半导体纳米晶体可偶联至多种生物学分子（包括dNTP和/或核酸）或底物，其通过记载于例如Bruchez等(1998)Science281:2013-6,Chan等(1998)Science281:2016-8，和美国专利No.6,274,323的技术。

具有各种组成的半导体纳米晶体的形成披露于例如，美国专利No.6,927,069;6,914,256;6,855,202;6,709,929;6,689,338;6,500,622;6,306,736;6,225,198;6,207,392;6,114,038;6,048,616;5,990,479;5,690,807;5,571,018;5,505,928;5,262,357和美国专利公开No.2003/0165951以及PCT公开No.99/26299（1999年5月27日公开）。能够生成半导体纳米晶体的分别群体，可基于它们的不同光谱属性对其鉴定。例如，能够生成发射不同色的光（基于其组成、大小、或大小和组成）的半导体纳米晶体。例如，可从Invitrogen获得发射不同波长（565nm、655nm、705nm或800nm发射波长）的光的半导体纳米晶体，其适用作本文中公开的探针中的荧光标记物。

其它信号生成模块包括，例如放射性同位素（如3H、35S和32P）、金属螯合物如放射性或顺磁性金属离子如Gd3+的DOTA和DPTA螯合物，以及脂质体。

信号生成模块还包括酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-内酰胺酶。在可检测标记物包含酶的情况下，色原体、产荧光化合物或产光化合物可与酶组合使用以生成可检测信号（大量的此类化合物可购自Life Technologies）。发色化合物的具体例子包括二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸盐(pNPP)、快速红(fast red)、溴氯吲哚基磷酸盐(bromochloroindolyl phosphate)(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、快红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ethylbenzothiazolinesulphonate)](ABTS)、邻联二茴香胺(dianisidine)、4-氯萘酚(chloronaphthol)(4-CN)、硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(galactopyranoside)(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳吡喃糖苷(X-Gal)、甲基伞形基(methylumbelliferyl)-.β.-D-半乳吡喃糖苷(MU-Gal)、p-硝基苯基-α-D-半乳吡喃糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-.β.-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(carbazol)(AEC)、品红(fuchsin)、碘代硝基四唑(iodonitrotetrazolium)(INT)、四唑蓝和四唑紫。

或者，酶可用在金相学检测方案中。例如，SISH规程牵涉用于鉴定和定位杂交的基因组靶核酸序列的金相学检测方案。金相学检测方法包括与水溶性金属离子和酶的氧化还原非活性底物组合使用酶，如碱性磷酸酶。酶将底物转化成氧化还原活性剂，而氧化还原活性剂还原金属离子，导致其形成可检测沉淀物。（参见例如美国专利申请公开文本No.2005/0100976、PCT公开文本No.2005/003777和美国专利申请公开文本No.2004/0265922）。金相学检测方法包括使用酶氧化还原酶（如辣根过氧化物酶）以及水溶性金属离子、氧化剂和还原剂，以再次形成可检测沉淀物（参见例如美国专利No.6,670,113）。

在一些实施方案中，所述信号生成模块是荧光蛋白。荧光蛋白还可以用作载体，或可以与载体偶联以便于显现。例如，绿色荧光蛋白（GFP）最初从水母维多利亚水母（Aequorea victoria）的光发射器官中分离。可以通过将基因转移到细胞中来原位表达嵌合GFP融合，并且可通过适宜的靶向信号来定位到细胞内的特定位置。已从水母GFP成功生成具有蓝色、青色和微黄-绿色发射的光谱变体，但没有一种展现出长于529nm的发射最大值。已从珊瑚纲（Anthozoa）（珊瑚动物）分离出GFP样蛋白，其显著扩展了可用于生物学应用的颜色范围。存储在序列数据库中的GFP样蛋白的家族现包括约30种显著不同的成员。荧光蛋白指可以经由生色团的自身催化合成变为自发荧光性的蛋白质。已知在红色或远红外波长发荧光的蛋白（红色荧光蛋白或RFP）。RFP可与其它在更短波长发荧光的荧光蛋白组合用于多色标记和荧光共振能量转移（FRET）实验两者。商品化RFP自两种野生型GFP样蛋白衍生。DsRed（drFP583）具有分别在558nm和583nm的激发和发射最大值。远红外荧光蛋白通过对在571nm处吸收的色蛋白的诱变生成。HcRed1（Clontech）具有分别在588nm和618nm处的激发和发射最大值。以最长波长发射荧光的荧光蛋白（无任何引入的突变）是eqFP611，其从海葵拳头海葵（Entacmaeaquadricolor）克隆。该蛋白质在559nm吸收且在611nm发射。

B.探针和探针系统的使用

本公开内容提供使用所公开的探针和探针系统的方法。例如，所述探针可用于检测和分析靶核酸分子。在一个例子中，所述方法包括使一种或多种公开的靶核酸探针与包含核酸分子的样品在足以允许样品中的核酸分子与靶核酸探针杂交的条件下接触。然后，使该样品与检测探针在足以允许该检测探针与靶核酸探针之间杂交的条件下接触。接着，如上文描述的那样检测检测探针。

本公开内容的探针和探针系统可用于核酸检测，如原位杂交规程（例如，荧光原位杂交（FISH）、生色原位杂交（CISH）和银原位杂交（SISH））。互补核酸分子之间的杂交经由氢键键合介导，其包括互补核苷酸单元之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核碱基。如果在本公开内容的探针的某个位置处的核苷酸单元能与在DNA或RNA分子（例如靶核酸序列）同一位置处的核苷酸单元氢键键合，那么所述寡核苷酸在该位置处彼此互补。探针和DNA或RNA当每分子中充足数目的相应位置被能彼此氢键键合的核苷酸单元占据时是彼此互补的，如此生成可检测结合。探针与要特异性可杂交的其靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）不需要是100%互补的。然而，需要充足的互补性以使探针仅或基本上仅与靶核酸序列（当该序列存在于复杂混合物（例如总细胞DNA或RNA）中时）结合、形成双链体或杂交。

原位杂交牵涉使含有在分裂中期或间期染色体制备（如载玻片上安放的细胞或组织样品）背景中的靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）的样品与对该靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）特异性可杂交或特异性的探针（即上文描述的靶核酸探针）接触。任选地，预处理载玻片，例如以除去可以干扰一致杂交的石蜡或其它材料。同时处理染色体样品和探针，例如通过将双链核酸加热以变性进行。在一定条件下将探针（在合适的杂交缓冲液中配制）和样品组合足够的时间，所述条件和时间容许发生杂交（通常以达到平衡）。清洗染色体制备物以除去过量的靶核酸探针，并实施对染色体靶物的特定标记的检测。依照本公开内容的一些实施方案，通过使检测探针与靶核酸探针的杂交促进检测。可以通过直接检测或间接检测检测检测探针。

例如，在一些直接检测实施方案中，用一种或多种荧光化合物标记检测探针，并通过荧光显微术或成像来分析样品。在一些间接的检测实施方案中，检测探针包含一个或多个可检测模块，其包含结合系统的第一成员（即半抗原或生物素），所述第一成员通过使样品与如上文描述的结合系统的第二或第二和第三成员接触来检测。对于原位杂交规程的一般性描述，参见例如美国专利No.4,888,278。用于荧光原位杂交（FISH）、生色原位杂交（CISH）和银原位杂交（SISH）的大量规程是本领域中已知的。例如，用于实施FISH的规程记载于美国专利No.5,447,841、5,472,842、5,427,932和例如Pinkel等,Proc.Natl.Acad.Sci.83:2934-2938,1986;Pinkel等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9138-9142,1988和Lichter等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9664-9668,1988。CISH记载于例如，Tanner等,Am.J.Pathol.157:1467-1472,2000，和美国专利No.6,942,970。别的检测方法在美国专利No.6,280,929中提供。用于通过原位杂交检测病毒的例示性规程可见于Poddighe等,J.Clin.Pathol.49:M340-M344,1996。

大量试剂和检测方案可以与FISH、CISH和SISH规程一起使用以改进灵敏度、分辨率或其它期望的特性。在一些实施方案中，所述检测探针或特异性结合剂（如抗体，例如一抗、受体或其它结合剂）包含能够将荧光生成或生色组合物转化成可检测荧光的、有色的或以其它方式可检测的信号（例如，如在SISH中可检测金属颗粒的沉积中的）。如上文指示的，酶可以直接或经由接头间接附着相关探针或检测试剂。合适的试剂（例如结合试剂）和化学（例如接头和附接化学）的例子记载于美国专利申请公开文本No.2006/0246524;2006/0246523和2010/0136652。

在其它实施方案中，在实施FISH时可以直接光学检测出用荧光团（包括荧光染料和半导体纳米晶体）标记的检测探针。或者，可用非荧光分子如半抗原（如以下非限制性例子：生物素、洋地黄毒苷、DNP、和各种

唑、吡唑、噻唑、硝基芳基、苯并呋咱、三萜、尿素、硫脲、鱼藤酮、香豆素、基于香豆素的化合物、鬼臼毒素、基于鬼臼毒素的化合物及其组合）、配体或其它间接可检测模块标记检测探针。然后，可以通过使样品（例如探针结合的细胞或组织样品）与经标记的检测试剂如对所选半抗原或配体特异性的抗体（或受体，或其它特异性结合配偶）接触来检测用这类非荧光分子标记的检测探针（以及其结合的靶核酸序列）。检测试剂可用荧光团（例如半导体纳米晶体）或用另一种间接可检测模块标记，或者可与一种或多种别的特异性结合剂（例如二抗或特异性抗体）接触，所述别的特异性结合剂继而可用荧光团标记。任选地，可检测标记物直接附接于抗体、受体（或其它特异性结合剂）。或者，可检测标记物经由接头，如酰肼硫醇（hydrazidethiol）接头、聚乙二醇接头或任何其它具有可比反应性的柔性附接模块附接于结合剂。例如，特异性结合剂如抗体、受体（或其它抗-配体）、亲合素等可经由异双功能性聚亚烃基二醇接头如异双功能性聚乙二醇（PEG）接头用荧光团（或其它标记物）共价修饰。异双功能性接头组合选自例如下组的两种不同的反应性基团：羰基反应性基团、氨基反应性基团、硫醇反应性基团和光反应性基团，其中第一种附接标记物而第二种附接特异性结合剂。

本领域技术人员会领会，通过适宜地选择经标记的检测探针和/或经标记的结合对，可以产生多重检测方案以促进对单个测定法（例如在单一细胞或组织样品上或在超过一个细胞或组织样品上）中多个靶核酸序列或靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）的多个部分的检测。例如，在优选的实施方案中，对应于靶序列的第一部分的第一检测探针可用第一半抗原如DIG标记，对应于靶核酸序列的第二部分的第二检测探针可用第二半抗原如DNP标记，而对应于靶核酸序列的第三部分的第三检测探针可用第三半抗原如NP标记。在样品暴露于探针集后，结合的探针可由结合系统的第二或第二和第三成员检测。标准的光或荧光显微镜是用于检测掺入比色或荧光化合物的试剂和探针的便宜工具。

一个优选的实施方案是图3中所显示办法的一个例子，其显示用于检测ALK易位的检测方案。图3中的3种探针各自用不同的可检测模块，在此例子中为不同半抗原标记。针对靶物的5’非编码区的第一核酸探针用DIG标记。针对靶物3’非编码区的第二核酸探针用DNP标记。跨越假定断裂点的第三核酸探针用NP标记。杂交后，3种不同的探针可用不同的信号生成系统检测，例如用比色试剂、荧光剂、半导体纳米晶体或其它合适的信号生成模块检测。图6（A-B）显示使用比色试剂来生成对3种探针中每种特异性的信号。在例示性系统中，序贯地应用试剂。然而，用其它系统，在适当时可同时添加试剂。在一个例子中，使样品与小鼠抗NP抗体接触。然后，使该样品与与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体接触。然后，使样品与用于银检测的试剂接触。这生成第三核酸探针的信号。然后，使样品与小鼠抗DIG抗体接触。接着，使样品与与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠抗体接触。然后，使样品与用于快速蓝检测的试剂接触。这生成第一核酸探针的信号。然后，使样品与阻断碱性磷酸酶活性的试剂接触。接着，使样品与家兔抗DNP抗体接触，接着与同碱性磷酸酶缀合的山羊抗家兔抗体接触。然后，使样品与用于快速红检测的试剂接触。这生成第二核酸探针的信号。在这些检测步骤后，可以通过显微术对样品分析对上文描述的3种探针中每种特异性的信号的同时显现。可以使用此办法产生的所得图像在图6（A-B）中显示。

本领域技术人员会领会，可以用上文描述的检测系统和试剂，以及本领域中已知的其它试剂和检测系统替代这些例示性试剂。例如，备选的系统可使用直接标记的核酸探针、经标记的第一抗体、或第一和第二抗体的不同组合。用于标记探针或抗体的信号生成模块可选自例如其它比色试剂、荧光分子、发光分子和半导体纳米晶体。会领会有许多用于生成对所述探针系统中利用的3种探针中每一种特异性的可检测信号的不同方案。

C.靶物

依照本公开内容的靶核酸序列可以是包含涉及染色体易位事件的染色体断裂点的任何序列。在具体的实施方案中，所述靶序列是基因组靶序列或基因组子序列，例如来自真核基因组如人基因组。可以生成对应于基本上任何包含独特的非重复DNA的至少一部分的基因组靶序列的靶核酸探针。

在一些实施方案中，所述靶核酸分子可以是与疾病有关（例如关联、原因上牵涉等）的序列。在一些实施方案中，选择与疾病或状况有关的靶序列，从而杂交的检测可以用于推断涉及疾病或状况的信息（如获得样品的受试者的诊断或预后信息）。在某些实施方案中，所选靶核酸分子是与新生性疾病（或癌症）有关的靶核酸分子。在一些实施方案中，基因组靶序列是包含与癌症有关的染色体易位关联的染色体断裂点的序列。这类易位的例子包括那些在Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology（可在万维网上atlasgeneticsoncology.org//Anomalies/Anomliste获得）中鉴定的。

靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）可以跨越任何数目的碱基对。在一些实施方案中，所述靶核酸序列跨越至少1000个碱基对。在特定的实施例中，靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）长度为至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少150,000、至少250,000或至少500,000个碱基对（如100kb至600kb、200kb至500kb或300kb至500kb）。在靶核酸序列来自真核基因组（如哺乳动物基因组例如人基因组的例子中，靶序列通常代表生物体基因组的小部分（或单个染色体的小部分）（例如，生物体基因组DNA（或单个染色体）的小于20%、小于10%、小于5%、小于2%或小于1%）。

在一些实施方案中，将自分析探针与靶序列杂交得到的信息用于做出涉及癌症结果的诊断或预后。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌且重排是ALK重排。间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因的致瘤性重排发生在一些非小细胞肺癌（NSCLC）中。中断ALK基因并将其与另一基因融合的染色体重排导致致瘤性ALK融合基因的创建。继而，这些增强细胞增殖和存活。在一些实施方案中，ALK融合基因是ALK-EML4。

在一些实施方案中，当测定法指示ALK重排时，根据ALK重排的存在和类型将所述信息用于为患者选择治疗性处理。在一些实施方案中，所述治疗性性处理是施用ALK抑制剂。ALK抑制剂的例子包括但不限于PF02341066（Pfizer）。

D.试剂盒

在一些实施方案中，本公开内容提供至少包含第一、第二和第三核酸探针的试剂盒。在一些实施方案中，第一核酸探针与染色体中染色体断裂点5’的一部分杂交，第二核酸探针与染色体中染色体断裂点3’的一部分杂交，而第三核酸探针包含5’部分和3’部分，并且它们与染色体断裂点附近的5’和3’序列杂交，从而第三核酸探针在缺乏易位的情况中跨越染色体断裂点。在一些实施方案中，用于原位杂交规程如FISH、CISH和/或SISH的试剂盒至少包括如本文中描述的第一、第二和第三靶核酸探针。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于与至少一种靶核酸探针一起使用的一种或多种检测试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于与第一、第二和第三核酸探针一起使用的至少一种特异性结合剂。因而，试剂盒可包含一种或多种靶核酸探针、一种或多种检测探针、以及一种或多种特异性结合剂。

所述试剂盒还可包含一种或多种用于实施原位杂交测定法或用于生成探针的试剂。例如，试剂盒可包含至少一种核酸分子（或这类分子的群体），以及一种或多种缓冲液、经标记的dNTP、标记酶（如聚合酶）、引物、无核酸酶的水、以及用于生成经标记探针的用法说明书。

在一个实施例中，所述试剂盒包含第一、第二和第三核酸探针和一种或多种特异性结合剂以及用于实施原位杂交的缓冲液和其它试剂，如石蜡预处理缓冲液、蛋白酶和蛋白酶缓冲液、预杂交缓冲液、杂交缓冲液、清洗缓冲液、复染剂、封固介质或其组合。任选地，所述试剂盒还可包含用于评估探针的杂交和信号的对照载玻片。

E.自动化

本领域中普通技术人员会领会，本文中公开的用于使用半抗原缀合物的方法的实施方案可以是自动化的。Ventana Medical Systems,Inc.是许多披露用于实施自动化分析的系统和方法的美国专利的受让人，所述专利包括美国专利No.5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029，以及美国公开的申请No.20030211630和20040052685。可使用各种自动化方法进行聚合半抗原染色规程的具体实施方案。

关于例示性工作实施方案的更多详情在工作实施例中提供。

实施例

实施例1

材料和方法

ALK三重探针设计

分离原位杂交（ba-ISH）测定法设计为评估ALK基因基因座的重排（ALK-EML4融合）。生成3种探针以与ALK基因的相邻着丝粒区（770kb）和端粒区（683kb）以及ALK基因区（728Kb）杂交（图1）。用NP半抗原标记ALK基因探针，用DIG半抗原标记5’ALK探针，而用DNP半抗原标记3’ALK探针。

自动化明视野分离原位杂交方案

所有针对明视野原位杂交ALK基因ba-ISH测定法的优化和性能评估均用XT自动化载玻片处理系统（Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ）进行。创建ba-ISH仪软件，从而可以不中断进行从烘烤到复染色的所有步骤。将载玻片在仪器上于65℃烘烤20分钟以熔解石蜡，接着是液体盖玻片(Liquid Coverslip)（Ventana Medical Systems,Inc.）启动的EZ制备（Ventana Medical Systems,Inc.）去石蜡化步骤。通过用细胞条件化2（酸性pH柠檬酸盐缓冲液，Ventana Medical Systems,Inc.）的热处理与用ISH蛋白酶2或ISH蛋白酶3（Ventana Medical Systems,Inc.）的组织消化的组合来恢复DNA靶物。由于临床样品的不同组织固定和处理条件，对每份组织样品确定适宜的蛋白酶消化时间。将5’和3’ALK和ALK探针的混合物与Ventana杂交缓冲液中的人胎盘DNA（2mg/ml）一起配制。将探针和靶DNA在85℃共变性20分钟，并在44℃进行杂交达5小时。严格性清洗步骤在72℃用2X SSC（Ventana Medical Systems,Inc.）进行。ISH信号检测的顺序如下实施：即1）基于辣根过氧化物酶（HRP）的银检测；2）基于碱性磷酸酶（AP）的蓝色检测；和3）基于AP的红色检测。用小鼠抗NP抗体接着是缀合有HRP的山羊抗小鼠抗体检测NP半抗原。用乙酸银、氢醌和H2O2（ultraView SISH DetectionKit,Ventana Medical Systems,Inc.）着色HRP酶。用小鼠抗DIG抗体标记DIG半抗原，将抗DIG抗体与缀合有AP的山羊抗小鼠抗体起反应，并用快速蓝色检测着色AP酶。然后，将AP酶用杂交缓冲液在37℃变性30分钟。在用2X SSC清洗载玻片后，实施第三次ISH检测。用家兔抗DNP抗体标记DNP半抗原，将DNP抗体与缀合有AP的山羊抗家兔抗体起反应，并用快速红色检测（ultraView Red ISH Detection Kit,Ventana Medical Systems,Inc.）着色AP酶。所有载玻片均用苏木精II（Ventana Medical Systems,Inc.）和涂蓝试剂（BluingReagent）（Ventana Medical Systems,Inc.）复染色。将复染色后的载玻片用含

（Proctor&Gamble Company,Cincinnati,OH）的蒸馏水漂洗以清洁载玻片。最后，将风干的载玻片用

膜盖片机（Sakura Finetek Japan,Tokyo,Japan）盖上盖玻片。

实施例2

以下实施例描述了用于用三色分离探针系统来分析ALK重排的方法。将载玻片在仪器上于65℃烘烤20分钟以熔解石蜡，接着是液体盖玻片（VentanaMedical Systems,Inc.）启动的EZ制备（Ventana Medical Systems,Inc.）去石蜡化步骤。通过用基于柠檬酸盐缓冲液的靶物恢复溶液CC2（Ventana MedicalSystems,Inc.）的热处理与用ISH蛋白酶3（Ventana Medical Systems,Inc.）的组织消化的组合来恢复DNA靶物。由于临床样品的不同组织固定和处理条件，对每份组织样品确定适宜的蛋白酶消化时间。将3种ALK探针的混合物（经DNP标记的5’ALK探针、经荧光素标记的内部ALK探针和经DIG标记的3’ALK探针，各12μg/ml）与Ventana杂交缓冲液中的鱼DNA一起配制。将探针和靶DNA在85℃共变性20分钟，并在44℃进行杂交达5小时。严格性清洗步骤在72℃用2X SSC（Ventana Medical Systems,Inc.）进行。在与小鼠抗荧光素抗体，接着是缀合有HRP的山羊抗小鼠抗体一起温育后，用DAB检测显现经荧光素标记的内部ALK探针。5’ALK探针上的DNP半抗原用家兔抗DNP抗体标记，并将该抗DNP抗体与缀合有AP的山羊抗家兔抗体起反应，并用快速蓝色检测着色AP酶。然后，将AP酶用杂交缓冲液在37℃变性30分钟。在用2X SSC清洗载玻片后，实施第三次ISH检测。3’ALK探针上的DIG半抗原用小鼠抗DIG抗体标记，将DIG抗体与缀合有AP的山羊抗小鼠抗体起反应，并用快速红色检测着色AP酶。所有载玻片均用在水中以1:3稀释的苏木精II（Ventana Medical Systems,Inc.）和涂蓝试剂（Ventana Medical Systems,Inc.）复染色。将复染色后的载玻片用含

（Proctor&Gamble Company,Cincinnati,OH）的蒸馏水漂洗以清洁载玻片。最后，将风干的载玻片用

膜盖片机（Sakura Finetek Japan,Tokyo,Japan）盖上盖玻片。分析ba-ISH载玻片并用装备有Nikon数码照相机DS-Fi1（Nikon Instruments Inc.）的Nikon ECLPSE90i显微镜（Nikon Instruments Inc.,Melville,NY）照相。结果提供在图6（A-B）中。

依照前述实施例，本公开内容提供了用于分析怀疑具有与断裂点关联的染色体易位的样品的方法，其包括接触与基因组DNA中位于断裂点5’的一部分杂交的第一核酸探针、与基因组DNA中位于断裂点3’的一部分杂交的第二核酸探针、和与DNA中断裂点附近的一部分杂交的第三核酸探针；建立适合于探针与样品中基因组DNA杂交的条件；并检测探针与样品中基因组DNA的杂交。在一些实施方案中，第三核酸探针还包含5’部分和3’部分，其中5’部分与基因组DNA中在断裂点5’且附近的一部分杂交，而3’部分与基因组DNA中在断裂点3’且附近的一部分杂交，从而使得第三核酸探针在缺乏重排的情况下与基因组DNA中跨越断裂点的区域杂交。在一些实施方案中，第三核酸探针与基因组DNA中在断裂点5’且附近的一部分杂交，从而相比于在缺乏重排的情况下对第一核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测信号的取向，在存在重排的情况下，对第一核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测的信号具有倒置的取向。在一些实施方案中，第三核酸探针与基因组DNA中在断裂点3’且附近的一部分杂交，从而相比于在缺乏重排的情况下对第二核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测信号的取向，在存在重排的情况下，对第二核酸探针检测的信号和对第三核酸探针检测的信号具有倒置的取向。在一些实施方案中，所述核酸探针包含选自下组的核酸：RNA、DNA、PNA、LNA及其组合。

Claims (20)

1.一种用于对样品分析与断裂点关联的染色体易位的方法，其包括：

使所述样品与下列各项接触：

-第一核酸探针，其包含配置为与位于所述断裂点5’的基因组DNA杂交的第一序列，

-第二核酸探针，其包含配置为与位于所述断裂点3’的基因组DNA杂交的第二序列，和

-第三核酸探针，其包含配置为与所述断裂点附近的基因组DNA杂交的第三序列；

建立适合于所述探针与所述样品中的所述基因组DNA杂交的条件；并检测所述探针的杂交，其通过检测与所述第一核酸探针关联的第一信号、与所述第二核酸探针关联的第二信号、以及与所述第三核酸探针关联的第三信号进行。

2.权利要求1的方法，其进一步包括鉴定样品次序和取向，所述样品次序和取向为所述第一信号、所述第二信号和所述第三信号的排布。

3.权利要求2的方法，其进一步包括将所述样品次序和取向与对照次序和取向比较。

4.权利要求3的方法，其中所述第三序列配置为与在所述断裂点5’且附近的基因组DNA杂交，且将所述样品次序和取向与对照次序和取向比较包括确立与所述对照次序和取向相比所述样品次序和取向是否包括所述第一信号和所述第三信号的倒置。

5.权利要求3的方法，其中所述第三序列配置为与在所述断裂点3’且附近的基因组DNA杂交，且将所述样品次序和取向与对照次序和取向比较包括确立与所述对照次序和取向相比所述样品次序和取向是否包括所述第二信号和所述第三信号的倒置。

6.权利要求3的方法，其中所述第三序列配置为与在所述断裂点附近且位于所述断裂点5’和3’两者的基因组DNA杂交，且将所述样品次序和取向与对照次序和取向比较包括确立与所述对照次序和取向相比所述样品次序和取向是否包括所述第一信号或所述第二信号与所述第三信号的倒置。

7.权利要求3的方法，其进一步包括通过分析已知缺乏与所述断裂点关联的染色体易位的对照样品来测定所述对照次序和取向，包括：

使所述对照样品与下列各项接触：

-所述第一核酸探针，其包含所述配置为与位于所述断裂点5’的基因组DNA杂交的第一序列，

-所述第二核酸探针，其包含所述配置为与位于所述断裂点3’的基因组DNA杂交的第二序列，和

-所述第三核酸探针，其包含所述配置为与所述断裂点附近的基因组DNA杂交的第三序列；

建立适合于所述探针与所述对照中的所述基因组DNA杂交的条件；并检测所述探针的杂交，其通过检测与所述第一核酸探针关联的第一信号、与所述第二核酸探针关联的第二信号、以及与所述第三核酸探针关联的第三信号进行。

8.权利要求1的方法，其中核酸探针包含用可检测模块标记的选自下组的核酸：RNA、DNA、PNA、LNA及其组合。

9.权利要求8的方法，其中所述可检测模块选自下组：半抗原、酶、荧光分子、发光分子和放射性分子。

10.权利要求8的方法，其中所述可检测模块是半抗原，且所述第一、第二和第三核酸探针分别用不同的第一、第二和第三半抗原标记。

11.权利要求10的方法，其中所述不同的第一、第二和第三半抗原选自下组：生物素、2,4-二硝基苯基(2,4-dintropheyl)(DNP)、荧光素衍生物、洋地黄毒苷(digoxygenin)(DIG)、5-硝基-3-吡唑碳酰胺(5-nitro-3-pyrozolecarbamide)(硝基吡唑，NP)、4,5,-二甲氧基-2-硝基肉桂酰胺(4,5,-dimethoxy-2-nitrocinnamide)(硝基肉桂酰胺，NCA)、2-(3,4-二甲氧基苯基)-喹啉-4-碳酰胺(2-(3,4-dimethoxyphenyl)-quinoline-4-carbamide)(苯基喹诺酮，DPQ)、2,1,3-苯并

二唑-5-碳酰胺(2,1,3-benzoxadiazole-5-carbamide)(苯并呋咱，BF)、3-羟基-2-喹喔啉碳酰胺(3-hydroxy-2-quinoxalinecarbamide)(羟基喹喔啉，HQ)、4-(二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(4-(dimethylamino)azobenzene-4’-sulfonamide)(DABSYL)、鱼藤酮异

唑啉(rotenone isoxazoline)(Rot)、(E)-2-(2-(2-氧-2,3-二氢-1H-苯并[b][1,4]二氮杂卓-4-基)苯氧基)乙酰胺((E)-2-(2-(2-oxo-2,3-dihydro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-4-yl)phenozy)aceta mide)(苯并二氮杂卓，BD)、7-(二乙基氨基)-2-氧-2H-色烯-3-羧酸(7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid)(香豆素343，CDO)、2-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑磺酰胺(2-acetamido-4-methyl-5-thiazolesulfonamide)(噻唑磺酰胺，TS)和对甲氧基苯基吡唑鬼臼酰胺(p-methoxyphenylpyrazopodophyllamide)(Podo)。

12.权利要求10的方法，其中所述检测进一步包括使所述样品分别与对所述第一、第二和第三半抗原特异性的第一、第二和/或第三抗体接触。

13.权利要求10的方法，其中所述检测进一步包括利用抗半抗原识别和酶促信号放大来检测所述第一、第二和第三半抗原。

14.一种用于对样品分析与断裂点关联的染色体易位的试剂盒，其包含：第一核酸探针，其具有配置为与基因组DNA中位于所述断裂点5’的一部分杂交的序列，

第二核酸探针，其具有配置为与基因组DNA中位于所述断裂点3’的一部分杂交的序列，和

第三核酸探针，其具有配置为与DNA中所述断裂点附近的一部分杂交的序列。

15.权利要求14的试剂盒，其中所述第三核酸探针具有配置为与DNA中在所述断裂点的5’和3’两侧接近且跨越所述断裂点的一部分杂交的序列。

16.权利要求14的试剂盒，其中所述第一、第二和第三核酸探针用第一、第二和第三半抗原半抗原化，所述试剂盒还包含配置为使所述第一、第二和第三半抗原能够显现的检测试剂。

17.权利要求16的试剂盒，其中所述检测试剂是配置为使所述第一、第二和第三半抗原能够明视野显现的生色检测试剂。

18.一种用于在患者样品中诊断与断裂点关联的染色体易位有关的疾病的方法，其包括：

使所述患者样品与核酸探针系列在适合于所述探针与所述患者样品中的基因组DNA杂交的条件下接触，该系列选择为使得在缺乏与所述断裂点关联的所述染色体易位的情况下，该系列依照第一次序和取向与所述患者样品中的所述基因组DNA杂交，且使得在存在与所述断裂点关联的所述染色体易位的情况下，该系列依照不同次序和取向与所述患者样品杂交，并

检测与所述患者样品中的所述基因组DNA杂交的所述核酸探针系列的次序和取向，其中检测第一次序和取向提供所述患者样品没有与所述患者样品中所述断裂点关联的所述染色体易位的诊断。

19.权利要求18的方法，其中所述第一次序和取向是沿染色体纵向排布的3种信号的预先确定的顺序。

20.权利要求18的方法，其中检测包括使用利用明视野成像显现的生色检测试剂。

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