ES2886600T3

ES2886600T3 - Procedimientos de identificación de células inmunitarias en tejido tumoral positivo para PD-L1

Info

Publication number: ES2886600T3
Application number: ES16800915T
Authority: ES
Inventors: Chandler Morgan Birch
Original assignee: Ventana Medical Systems Inc
Current assignee: Ventana Medical Systems Inc
Priority date: 2015-11-22
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2021-12-20
Anticipated expiration: 2036-11-21
Also published as: CA3005804C; JP6832930B2; WO2017085307A1; CA3005804A1; AU2016357478A1; JP2018536163A; EP3377530B1; US11899016B2; US20180372747A1; AU2016357478B2; EP3377530A1

Abstract

Un kit que comprende: (a) un primer anticuerpo primario específico para PD-L1; (b) un segundo anticuerpo primario específico para al menos un marcador de células inmunitarias; (c) un primer conjunto de reactivos de detección que comprende: (c1) una primera enzima; (c2) un conjunto de reactivos adaptados para depositar la primera enzima en una muestra de tejido cerca del primer anticuerpo primario mientras que el primer anticuerpo primario se une a la muestra de tejido; y (c3) un sustrato reactivo con la primera enzima para depositar un primer tinte en la muestra cerca de la primera enzima; y (d) un segundo conjunto de reactivos de detección que comprende: (d1) una segunda enzima; (d2) un conjunto de reactivos adaptados para depositar la segunda enzima en una muestra de tejido cerca del segundo anticuerpo primario mientras que el segundo anticuerpo primario se une a la muestra de tejido; y (d3) un sustrato reactivo con la segunda enzima para depositar un segundo tinte en la muestra cerca de la segunda enzima; en el que el primer tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple) y el segundo tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), o en el que el primer tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL) y el segundo tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple).

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos de identificación de células inmunitarias en tejido tumoral positivo para PD-L1

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Por el presente documento se reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.° 62/258.493, presentada el 22 de noviembre de 2015.

Antecedentes

PD-1 es un receptor inmunoinhibidor que pertenece a la familia de receptores CD28/CTLA4 que se expresa en linfocitos T activados, linfocitos B y monocitos. PD-1 también se expresa en linfocitos T reguladores donde interactúa con las células dendríticas y los linfocitos T NK, y se ha demostrado que está asociado con la anergia y el escape inmunitario tumoral. El papel de PD-1 como regulador negativo de la actividad de los linfocitos T está mediado a través de su interacción con sus ligandos PD-L1 y PD-L2 que se expresan en células inmunitarias y células tumorales.

PD-L1 y PD-L2 se expresan en muchos tumores humanos que incluyen melanoma, glioblastoma, carcinoma de pulmón no microcítico y carcinoma urotelial, ovárico, de mama, de cuello uterino, de colon, pancreático y gástrico. PD-L1 se ha implicado en el escape inmunitario tumoral del sistema inmunitario del huésped y en la mediación de la actividad antiapoptótica tumoral. Además, se ha demostrado que el ligando 1 y 2 de PD-1 (los PD-L) expresados en las células presentadoras de antígenos inducen indirectamente la anergia o el agotamiento de los linfocitos T por medio de PD-1 en los linfocitos T, mientras que PD-L1 expresado en los tejidos periféricos suprime directamente los linfocitos autorreactivos. Se cree que los PD-L expresados en tumores regulan la generación de linfocitos T reguladores adaptativos lo que da como resultado la inmunodepresión inducida por tumor, incluyendo la inhibición de la función efectora de los linfocitos T CD8+. Se cree que se ha demostrado que niveles de expresión mayores de PD-L1 en tumores se correlacionan con un mal pronóstico en varios tumores malignos, incluyendo melanoma, de esófago, de riñón, de pulmón y de cerebro, pancreático, ovárico y de cabeza y cuello.

La expresión de PD-L1 se mide lo más comúnmente por inmunohistoquímica (IHQ). Se cree que el estado de expresión de PD-L1 tumoral es pronóstico en múltiples tipos de tumores, incluyendo melanoma, carcinoma de células renales y carcinomas pulmonares no microcíticos. El uso de la inmunohistoquímica de PD-L1 como un biomarcador predictivo se ve frustrado por múltiples problemas no resueltos que incluyen anticuerpos de detección variable, diferentes valores de corte de IHQ, preparación de tejido, variabilidad del procesamiento, biopsias primarias frente a metastásicas, expresión de PD-L1 oncogénica frente a inducida y tinción de tumor frente a células inmunitarias.

El documento WO2014/194293 ("la publicación '293") divulga procedimientos para seleccionar pacientes que serían susceptibles de tratamientos dirigidos a las vías PD-L1 y B7-H4. La publicación '293 divulga la tinción conjunta de una muestra de tejido con una doble tinción de CD68/B70-H1, de modo que se pueden detectar macrófagos CD68+/B7-H1+. La publicación '293 también divulga la tinción de muestras de tejido individuales con uno de B7-H1, PD-1 o CD8, no divulga la tinción de una única muestra de tejido en un ensayo múltiple. La publicación '293 tampoco divulga poner en contacto una muestra de tejido con un primer reactivo de detección específico para PD-L1 y al menos un segundo reactivo de detección específico para un marcador de células inmunitarias.

El documento WO2015/088930 ("la publicación '930") divulga un ensayo IHQ múltiple que comprende poner en contacto un corte histológico con un anticuerpo específico para PD-1 (Ab anti-PD-1) y un anticuerpo específico para el ligando de PD deseado (Ab anti-ligando de PD). La publicación '930 también divulga que las células que expresan PD-1 se pueden detectar por tinción IHQ para la expresión de una molécula que se colocaliza ampliamente con PD-1 y, de forma similar, las células que expresan el ligando de PD de interés se pueden detectar por tinción IHQ para la expresión de una molécula que se colocaliza ampliamente con el ligando de PD. En dichos modos de realización, se usa un anticuerpo que se une específicamente a la molécula de colocalización como el anticuerpo primario en lugar del anticuerpo anti-PD-1 o anti-ligando de PD. La publicación '930 no divulga poner en contacto una muestra de tejido con un primer reactivo de detección específico para PD-L1 y al menos un segundo reactivo de detección específico para un marcador de células inmunitarias.

Fent et al. "Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor infiltrating lymphocytes from melanoma" J. ImmunoTherapy of Cancer, (2015) 3:47 ("Feng") describe un ensayo IHQ multiespectral cuantitativo de 7 colores para analizar el entorno inmunitario de tumores de pacientes con melanoma. En particular, el ensayo divulgado es un panel de inmunohistoquímica fluorescente multiespectral cuantitativa que incluye CD3, CD8, FoxP3, CD163, PD-L1. El estudio se dirigió a estudiar mecanismos inhibidores potenciales en el microentorno tumoral que pueden evitar la generación de linfocitos infiltrantes de tumor reactivos a tumor autólogos. Feng no divulga poner en contacto una muestra de tejido con un primer reactivo de detección específico para PD-L1 y al menos un segundo reactivo de detección específico para un marcador de células inmunitarias con el propósito de identificar las células inmunitarias que coexpresan PD-L1 y el al menos otro marcador de células inmunitarias con el propósito de predecir una respuesta al tratamiento dirigido a PD-L1. Feng tampoco divulga ningún ensayo múltiple que usa reactivos de detección. Además, Feng no divulga un ensayo que utiliza un anticuerpo específico para CD45.

Chen et al. (Clin Cancer Res (2013); 19(13):3462-73) divulga el uso de Vulcan Fast Red y DAB como tintes de tinción IHQ, que sin embargo presentan espectros de absorbancia que se superponen significativamente. Son conocidos protocolos de tinción IHQ doble en el instrumento Discovery Ultra de Ventana Medical Systems, Inc., que divulgan la tinción doble de PTEN y el receptor androgénico en cortes de cáncer de próstata y la tinción doble de MIT-F y Mart-1/Melan-A en la piel usando DISCOVERY Purple y DAB como cromógeno. Además, dichos protocolos no se refieren a la tinción doble de un marcador tumoral y un marcador de células inmunitarias en un único corte histológico.

Breve sumario de la invención

El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un kit que facilita la identificación y/o diferenciación de células tumorales positivas para PD-L1, células inmunitarias positivas para PD-L1, células tumorales negativas para PD-L1 y/o células inmunitarias negativas para PD-L1 en una muestra de tejido. El kit comprende un primer anticuerpo primario específico para PD-L1; un segundo anticuerpo primario específico para al menos un marcador de células inmunitarias; primeros reactivos de detección para detectar el primer anticuerpo primario; y segundos reactivos de detección para detectar el segundo anticuerpo primario. En algunos modos de realización, el al menos un marcador de células inmunitarias se selecciona del grupo que consiste en CD8, CD4, CD3, CD25, CD163 y CD45LCA. En algunos modos de realización, el marcador de células inmunitarias es CD45LC. En algunos modos de realización, el primer anticuerpo primario es un anticuerpo anti-PD-L1 (SP142) o un anticuerpo anti-PD-L1 (SP263). En algunos modos de realización, el segundo anticuerpo primario es un anticuerpo anti-CD45LCA (RP2/18). Cada uno de los primer y segundo reactivos de detección comprende (i) una enzima; (ii) reactivos para depositar la enzima cerca del anticuerpo primario cuando el anticuerpo primario está unido a una muestra de tejido, y (iii) un sustrato enzimático reactivo con la enzima para depositar un tinte cerca de la enzima depositada en la muestra, en los que los primer y segundo reactivos de detección comprenden sustratos que depositan diferentes tintes. En el presente documento, el primer tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple) y el segundo tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), o el primer tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL) y el segundo tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple).

También se divulga que los diferentes tintes se seleccionan del grupo que consiste en diaminobencidina (DAB), 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple), N,N'-biscarboxipentil-5,5'-disulfonato-indo-dicarbocianina (Cy5) y rodamina 110 (rodamina). También se divulga que un primer sustrato deposita uno de DISCOVERY Purple o DAB, y un segundo sustrato deposita el otro de DISCOVERY Purple o DAB. También se divulga que un primer sustrato deposita uno de DISCOVERY Purple o DABSYL, y un segundo sustrato deposita el otro de DISCOVERY Purple o DABSYL.

En algunos modos de realización, el kit comprende además al menos otra sonda de detección específica para un marcador tumoral distinto de PD-L1 y reactivos de detección para detectar la al menos otra sonda de detección. En algunos modos de realización, el kit comprende además al menos otra sonda de detección específica para EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4. En algunos modos de realización, el kit comprende además dos anticuerpos primarios específicos para al menos dos marcadores de células inmunitarias. En algunos modos de realización, el kit comprende además componentes para inactivar una enzima.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de tinción conjunta de células inmunitarias en una muestra de tejido que comprende poner en contacto la muestra de tejido con una primera sonda de detección específica para PD-L1; poner en contacto la muestra de tejido con una segunda sonda de detección específica para al menos un marcador de células inmunitarias; y poner en contacto la muestra de tejido con primer y segundo reactivos de detección, en el que los primer y segundo reactivos de detección comprenden sustratos que efectúan el depósito de diferentes tintes. En algunos modos de realización, la segunda sonda de detección es específica para CD45LCA.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de células tumorales positivas para PD-L1, células tumorales negativas para PD-L1, células inmunitarias positivas para PD-L1 y células inmunitarias negativas para PD-L1, que comprende poner en contacto la muestra de tejido con una primera sonda de detección específica para PD-L1; poner en contacto la muestra de tejido con una segunda sonda de detección específica para al menos un marcador de células inmunitarias; y poner en contacto la muestra de tejido con primer y segundo reactivos de detección, en el que los primer y segundo reactivos de detección comprenden diferentes sustratos que efectúan el depósito de diferentes tintes. En algunos modos de realización, los primer y segundo reactivos de detección son reactivos de detección. En algunos modos de realización, la segunda sonda de detección es específica para CD45LCA.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de diferenciación de células tumorales positivas para PD-L1 de células inmunitarias positivas para PD-L1 que comprende poner en contacto la muestra de tejido con una primera sonda de detección específica para PD-L1; poner en contacto la muestra de tejido con una segunda sonda de detección específica para al menos un marcador de células inmunitarias; y poner en contacto la muestra de tejido con primer y segundo reactivos de detección, en el que los primer y segundo reactivos de detección comprenden diferentes sustratos que efectúan el depósito de diferentes tintes. En algunos modos de realización, los primer y segundo reactivos de detección son reactivos de detección. En algunos modos de realización, la segunda sonda de detección es específica para CD45LCA.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor en tumores positivos para PD-L1 que comprende poner en contacto una muestra de tejido con un primer anticuerpo primario específico para PD-L1; poner en contacto la muestra de tejido con un segundo anticuerpo primario específico para al menos un marcador de células inmunitarias; y poner en contacto la muestra de tejido con primer y segundo reactivos de detección, en el que los primer y segundo reactivos de detección comprenden diferentes sustratos que efectúan el depósito de diferentes tintes. En algunos modos de realización, las células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor coexpresan PD-L1 y el al menos un marcador de células inmunitarias. En algunos modos de realización, el primer anticuerpo primario es el anticuerpo anti-PD-L1 SP142. En algunos modos de realización, el marcador de células inmunitarias se selecciona del grupo que consiste en CD8, CD4, CD3, CD25, CD163 y CD45LCA. En algunos modos de realización, el marcador de células inmunitarias es CD45LCA. En algunos modos de realización, el segundo anticuerpo es el anticuerpo anti-CD45LCA RP2/18. Cada uno de los primer y segundo reactivos de detección comprende (i) una enzima, (ii) reactivos para depositar la enzima cerca del anticuerpo primario cuando el anticuerpo primario se une a una muestra de tejido, y (iii) un sustrato reactivo con la enzima para depositar un tinte en la muestra, en los que los primer y segundo reactivos de detección comprenden diferentes sustratos. En el presente documento, el primer tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple) y el segundo tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), o el primer tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL) y el segundo tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple).

También se divulga que los diferentes sustratos se seleccionan para depositar un tinte seleccionado del grupo que consiste en DAB, DABSYL, DISCOVERY Purple, Cy5 y rodamina. También se divulga que un primer sustrato deposita uno de DISCOVERY Purple o DAB, y un segundo sustrato deposita el otro de DISCOVERY Purple o dA b . También se divulga que un primer sustrato deposita uno de DISCOVERY Purple o DABSYL, y un segundo sustrato deposita el otro de DISCOVERY Purple o DABSYL. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además poner en contacto la muestra de tejido con al menos otra sonda de detección específica para un marcador tumoral distinto de PD-L1. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además poner en contacto la muestra de tejido con al menos otra sonda de detección específica para uno de EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de predicción de una respuesta a un tratamiento dirigido a PD-L1 analizando una muestra de tejido tumoral positivo para PD-L1 para detectar la presencia o ausencia de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor, que comprende identificar células inmunitarias que coexpresan PD-L1 y al menos un marcador CD, en el que la identificación de las células inmunitarias que coexpresan PD-L1 y el al menos un marcador CD comprende poner en contacto la muestra de tejido tumoral con un primer anticuerpo primario específico para PD-L1 y poner en contacto la muestra de tejido tumoral con un segundo anticuerpo primario específico para el al menos un marcador CD. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además cuantificar una serie de células tumorales positivas para PD-L1 y cuantificar una serie de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor y, opcionalmente, comparar los valores cuantificados, o cualquier valor derivado de los mismos, para controlar los valores o los valores de corte predeterminados como se describe en el presente documento. En algunos modos de realización, el marcador Cd se selecciona del grupo que consiste en CD8, CD4, CD3 y CD45LCA. En algunos modos de realización, el marcador CD es CD45LCA.

En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además poner en contacto la muestra de tejido con primer y segundo reactivos de detección, en el que los primer y segundo reactivos de detección comprenden diferentes sustratos que efectúan el depósito de diferentes tintes. En algunos modos de realización, cada uno de los primer y segundo reactivos de detección comprende (i) una enzima, (ii) reactivos para depositar la enzima cerca del anticuerpo primario cuando el anticuerpo primario se une a una muestra de tejido, y (iii) un sustrato reactivo con la enzima para depositar un tinte, en los que los primer y segundo reactivos de detección comprenden sustratos que depositan diferentes tintes. En el presente documento, el primer tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple) y el segundo tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), o el primer tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL) y el segundo tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple).

También se divulga que los diferentes sustratos se seleccionan para depositar un tinte seleccionado del grupo que consiste en DAB, DABSYL, DISCOVERY Purple, Cy5 y rodamina. También se divulga que un primer sustrato deposita uno de DISCOVERY Purple o DAB, y un segundo sustrato deposita el otro de DISCOVERY Purple o dA b . También se divulga que un primer sustrato deposita uno de DISCOVERY Purple o DABSYL, y un segundo sustrato deposita el otro de DISCOVERY Purple o DABSYL.

En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además poner en contacto la muestra de tejido con al menos otra sonda de detección específica para un marcador tumoral distinto de PD-L1 y reactivos de detección para detectar la al menos otra sonda de detección. En otros modos de realización, el procedimiento comprende introducir al menos otra sonda de detección específica para EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4.

En otro aspecto de la presente divulgación, se incluye un procedimiento de tratamiento de cáncer a un paciente que comprende solicitar una prueba que proporciona los resultados de un análisis para determinar si una muestra de tejido tumoral positivo para PD-L1 del paciente comprende linfocitos positivos para PD-L1 infiltrantes de tumor y administrar un tratamiento dirigido a PD-L1 al paciente si la muestra de tejido tumoral del paciente expresa células tumorales positivas para PD-L1 y linfocitos positivos para PD-L1 infiltrantes de tumor, en el que la prueba comprende un ensayo múltiple en el que la muestra de tejido tumoral se pone en contacto con un primer anticuerpo primario específico para PD-L1 y un segundo anticuerpo primario específico para al menos un marcador de células inmunitarias, en el que los linfocitos positivos para PD-L1 infiltrantes de tumor coexpresan PD-L1 y el al menos un marcador de células inmunitarias. También se divulga que el procedimiento comprende además cuantificar una serie de células tumorales positivas para PD-L1 y una serie de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor y, opcionalmente, comparar los valores cuantificados, o cualquier valor derivado de los mismos, con los valores de control. También se divulga que el marcador de células inmunitarias se selecciona del grupo que consiste en CD8, CD4, CD3 y CD45LCA. También se divulga que el marcador de células inmunitarias es CD45LCA.

También se divulga que el procedimiento comprende además poner en contacto la muestra de tejido con primer y segundo reactivos de detección, en el que los primer y segundo reactivos de detección comprenden diferentes sustratos que efectúan el depósito de diferentes tintes. También se divulga que cada uno de los primer y segundo reactivos de detección comprende (i) una enzima, (ii) reactivos para depositar la enzima cerca del anticuerpo primario cuando el anticuerpo primario se une a una muestra de tejido, y (iii) un sustrato reactivo con la enzima para depositar un tinte en la muestra, en los que los primer y segundo reactivos de detección comprenden combinaciones de sustrato/enzima que dan como resultado el depósito de diferentes tintes. También se divulga que los diferentes sustratos se seleccionan para depositar un tinte seleccionado del grupo que consiste en DAB, DABSYL, DISCOVERY Purple, Cy5 y rodamina. También se divulga que un primer sustrato deposita uno de DISCOVERY Purple o DAB, y un segundo sustrato deposita el otro de DISCOVERY Purple o dA b . También se divulga que un primer sustrato deposita uno de DISCOVERY Purple o DABSYL, y un segundo sustrato deposita el otro de DISCOVERY Purple o DABSYL.

También se divulga que el procedimiento comprende además poner en contacto la muestra de tejido con al menos otra sonda de detección específica para un marcador tumoral distinto de PD-L1 y reactivos de detección para detectar la al menos otra sonda de detección. También se divulga que el procedimiento comprende introducir al menos otra sonda de detección específica para EGFR, HER2, PVH, A l K, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4. En algunos modos de realización, el tratamiento dirigido a PD-L1 es atezolizumab.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de diferenciación de células tumorales positivas para PD-L1 de células inmunitarias positivas para PD-L1 que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica con una primera sonda de detección específica para PD-L1; (b) poner en contacto la muestra biológica con un primer conjugado de marcaje que se une específicamente a la primera sonda de detección, en el que el primer conjugado de marcaje comprende una primera enzima; (c) poner en contacto la muestra biológica con un primer conjugado de señalización que comprende un primer resto reactivo latente y un primer resto detectable; (d) inactivar la primera enzima y, si los dos anticuerpos primarios son reactivos con el mismo anticuerpo secundario, desnaturalizar y/o eluir el anticuerpo primario; (e) poner en contacto la muestra biológica con una segunda sonda de detección, donde la segunda sonda de detección es específica para al menos un marcador de células inmunitarias; (f) poner en contacto la muestra biológica con un segundo conjugado de marcaje que se une específicamente a la segunda sonda de detección, en el que el segundo conjugado de marcaje comprende una segunda enzima; (g) poner en contacto la muestra biológica con un segundo conjugado de señalización que comprende un segundo resto reactivo latente y un segundo resto detectable; (h) detectar señales de los primer y segundo restos detectables, en los que cada uno de los primer y segundo restos detectables son diferentes cada uno, y en el que las células inmunitarias positivas para PD-L1 coexpresan PD-L1 y el al menos un marcador de células inmunitarias. En algunos modos de realización, la primera sonda de detección es un anticuerpo anti-PD-L1; y la segunda sonda de detección es un anticuerpo anti-CD45LCA. También se divulga que el primer resto detectable es uno de diaminobencidina o DISCOVERY Purple; y el segundo resto detectable es el otro de diaminobencidina o DISCOVERY Purple. También se divulga que el procedimiento comprende además inactivar la segunda enzima, poner en contacto la muestra biológica con una tercera sonda de detección específica para un marcador tumoral distinto de PD-L1, poner en contacto la muestra con un tercer conjugado de marcaje que se une específicamente a la tercera sonda de detección, en el que el tercer conjugado de marcaje comprende una tercera enzima; y poner en contacto la muestra biológica con un tercer conjugado de señalización que comprende un tercer resto reactivo latente y un tercer resto detectable, en el que el tercer resto detectable es diferente del primer o bien segundo restos detectables.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de células tumorales positivas para PD-L1, células tumorales negativas para PD-L1, células inmunitarias positivas para PD-L1 y/o células inmunitarias negativas para PD-L1, que comprende (a) poner en contacto una muestra biológica con una primera sonda de detección, comprendiendo la primera sonda de detección un primer anticuerpo primario específico para uno de PD-L1 o un marcador de células inmunitarias; (b) poner en contacto la muestra biológica con primeros reactivos de detección que comprenden una primera enzima; (c) inactivar la primera enzima; (d) poner en contacto la muestra biológica con una segunda sonda de detección, comprendiendo la segunda sonda de detección un segundo anticuerpo primario seleccionado de otro de un anticuerpo específico para otro de PD-L1 o un marcador de células inmunitarias; (e) poner en contacto la muestra biológica con segundos reactivos de detección que comprenden una segunda enzima; (f) detectar señales de los primeros y segundos reactivos de detección, en los que cada uno de los primeros y segundos reactivos de detección comprende un resto detectable diferente, y el que las células inmunitarias positivas para PD-L1 coexpresan PD-L1 y el marcador de células inmunitarias. También se divulga que la segunda sonda de detección es específica para linfocitos. También se divulga que la primera sonda de detección es un anticuerpo anti-PD-L1; y la segunda sonda de detección es un anticuerpo anti-CD45LCA. También se divulga que el primer resto detectable es uno de diaminobencidina o DISCOVERY Purple; y el segundo resto detectable es el otro de diaminobencidina o DISCOVERY Purple. También se divulga que el procedimiento comprende además inactivar la segunda enzima, poner en contacto la muestra biológica con una tercera sonda de detección específica para un marcador tumoral distinto de PD-L1 y poner en contacto la muestra con un tercer reactivo de detección.

Los solicitantes han desarrollado un ensayo múltiple y procedimiento para teñir conjuntamente una muestra de tejido con una primera sonda de detección específica para PD-L1 y al menos una segunda sonda de detección específica para un marcador de células inmunitarias. En comparación con los procedimientos de la técnica anterior, el ensayo múltiple y procedimiento desarrollados por los solicitantes permite una identificación mejorada de las células inmunitarias positivas para PD-L1, tales como las que se infiltran en los tejidos tumorales positivos para PD-L1, y la diferenciación de las células inmunitarias positivas para PD-L1 de las células tumorales positivas para PD-L1. Nuevamente, y en comparación con los procedimientos de la técnica anterior, los solicitantes han demostrado que los procedimientos divulgados en el presente documento son superiores y permiten con exactitud la identificación de células inmunitarias positivas para PD-L1 con rendimiento potenciado. Además, los procedimientos divulgados en el presente documento, en comparación con los procedimientos de la técnica anterior, son más rápidos, más exactos y no se basan en el reconocimiento de diferencias morfológicas sutiles entre las células inmunitarias de células positivas para PD-L1 y las células tumorales positivas para PD-L1. De hecho, se cree que los procedimientos divulgados en el presente documento eliminan parte de la subjetividad asociada con la lectura y la diferenciación entre los diferentes tipos de células positivas para PD-L1, lo que permite una puntuación y un diagnóstico clínico mejorados.

Breve descripción de los dibujos

Se describen modos de realización no limitantes y no exhaustivos con referencia a los siguientes dibujos.

Las figuras 1A, 1B y 1C proporcionan ejemplos de una muestra de tejido donde las células tumorales positivas para PD-L1 se tiñen con Da BsYL (amarillo en las figuras 1A y 1B; anotado con "a" en la figura 1C), los linfocitos infiltrantes de tumor se tiñen con DISCOVERY Purple (fucsia en las figuras 1A y 1B; anotado con "b" en la figura 1C), donde los linfocitos que coexpresan PD-L1 aparecen de color naranja/rojo en las figuras 1A y 1B, y anotado con "c" en la figura 1C.

Las figuras 2A, 2B y 2C proporcionan ejemplos de una muestra de tejido donde las células tumorales positivas para PD-L1 se tiñen con Cy5 (cian/azul en las figuras 2A y 2B; anotado con "a" en la figura 2C), los linfocitos infiltrantes de tumor se tiñen con DISCOVERY Purple (fucsia en las figuras 2A y 2B; anotado con "b" en la figura 2C), donde los linfocitos que coexpresan PD-L1 aparecen en morado oscuro/azul marino en las figuras 2A y 2B, y anotado con "c" en la figura 2C.

Las figuras 3A, 3B y 3C proporcionan ejemplos de una muestra de tejido donde las células tumorales positivas para PD-L1 se tiñen con rodamina (rosa en las figuras 3A y 3B; anotado con "a" en la figura 3C), los linfocitos infiltrantes de tumor se tiñen con DISCOVERY Purple (fucsia en las figuras 3A y 3B; anotado con "b" en la figura 3C), donde los linfocitos que coexpresan PD-L1 aparecen en rojo/azul marino en las figuras 3 A y 3B, y anotado con "c" en la figura 31C.

Las figuras 4A, 4B y 4C proporcionan ejemplos de una muestra de tejido donde las células tumorales positivas para PD-L1 se tiñen con DAB (marrón en las figuras 4A y 4B; anotado con "a" en la figura 4C), los linfocitos infiltrantes de tumor se tiñen con DISCOVERY Purple (fucsia en las figuras 4A y 4B; anotado con "b" en la figura 4C), donde los linfocitos que coexpresan PD-L1 aparecen como puntos de morado y marrón en las figuras 4A y 4B, y anotado con "c" en la figura 4C.

Las figuras 5A y 5B proporcionan gráficos que ilustran los espectros de absorción de varios cromógenos.

Las figuras 6 y 7 son diagramas de flujo que ilustran procedimientos para realizar un ensayo múltiple de acuerdo con modos de realización no limitantes de la presente divulgación.

Descripción detallada

En general, la presente divulgación está dirigida a ensayos múltiples, kits y procedimientos que incluyen procedimientos automatizados, para identificar células inmunitarias positivas para PD-L1 y células tumorales positivas para PD-L1 en una muestra de tejido. Los ensayos múltiples, kits y procedimientos descritos en el presente documento pueden permitir que un profesional médico distinga entre células tumorales positivas para PD-L1, células inmunitarias positivas para PD-L1 y células inmunitarias negativas para PD-L1. Los ensayos múltiples, kits y procedimientos descritos en el presente documento pueden permitir que un profesional médico evalúe si un paciente se puede beneficiar del tratamiento con un tratamiento dirigido a PD-L1, tal como detectando la presencia y/o cantidad de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor dentro de una muestra de tejido tumoral positivo para PD-L1. En algunos modos de realización, los ensayos múltiples, kits y procedimientos permiten que el experto en la técnica identifique claramente (i) una respuesta inmunitaria linfocítica y (ii) un estado de expresión de PD-L1 del tumor y las células inmunitarias infiltrantes.

Como se usa en el presente documento, los términos en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes al plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. De forma similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

Los términos "que comprende", "que incluye", "que tiene" y similares se usan de manera intercambiable y tienen el mismo significado. De forma similar, se usan de manera intercambiable "comprende", "incluye", "tiene" y similares y tienen el mismo significado. Específicamente, cada uno de los términos se define consecuente con la definición común del derecho de patentes de Estados Unidos de "que comprende" y, por lo tanto, se interpreta como que es un término abierto que significa "al menos lo siguiente" y también se interpreta como que no excluye rasgos característicos, limitaciones, aspectos, etc., adicionales. Por tanto, por ejemplo, "un dispositivo que tiene los componentes a, b y c" significa que el dispositivo incluye al menos los componentes a, b y c. De forma similar, la frase: "un procedimiento que implica las etapas a, b y c" significa que el procedimiento incluye al menos las etapas a, b y c. Además, si bien las etapas y procedimientos se puedan esbozar en el presente documento en un orden particular, el experto en la técnica reconocerá que el orden de las etapas y procedimientos puede variar.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas o moléculas similares a las inmunoglobulinas que incluyen a modo de ejemplo y sin limitación, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, combinaciones de las mismas y moléculas similares producidas durante una respuesta inmunitaria en cualquier vertebrado (por ejemplo, en mamíferos tales como seres humanos, cabras, conejos y ratones) y fragmentos de anticuerpo (tales como fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, fragmentos Fab'-SH y fragmentos Fab como son conocidos en la técnica, fragmentos de anticuerpo recombinantes (tales como fragmentos sFv, fragmentos dsFv, fragmentos sFv biespecíficos, fragmentos dsFv biespecíficos, fragmentos F(ab)'2, proteínas de Fv monocatenarios ("scFv"), proteínas de Fv estabilizados con disulfuro ("dsFv"), diacuerpos y triacuerpos (como son conocidos en la técnica) y anticuerpos de camélidos) que se unen específicamente a una molécula de interés (o un grupo de moléculas de interés altamente similares) con la exclusión sustancial de la unión a otras moléculas. Un anticuerpo se refiere además a un ligando polipeptídico que comprende al menos una región variable de inmunoglobulina de la cadena ligera o la cadena pesada que reconoce y se une específicamente a un epítopo de un antígeno. Los anticuerpos se pueden componer de una cadena pesada y una ligera, de las que cada una tiene una región variable, denominadas la región variable pesada (VH) y la región variable ligera (VL). Conjuntamente, la región VH y la región VL son responsables de la unión al antígeno reconocido por el anticuerpo. El término anticuerpo también incluye inmunoglobulinas intactas y las variantes y porciones de las mismas bien conocidas en la técnica.

Un "antígeno" se refiere a un compuesto, composición o sustancia que se puede unir específicamente por los productos de inmunidad humoral o celular específica, tales como una molécula de anticuerpo o receptor de linfocitos T. Los antígenos pueden ser cualquier tipo de molécula incluyendo, por ejemplo, haptenos, metabolitos intermedios simples, glúcidos (por ejemplo, oligosacáridos), lípidos y hormonas, así como macromoléculas tales como carbohidratos complejos (por ejemplo, polisacáridos), fosfolípidos, ácidos nucleicos y proteínas.

Los "haptenos" son moléculas pequeñas que se pueden combinar específicamente con un anticuerpo, pero típicamente, sustancialmente no pueden ser inmunógenas excepto en combinación con una molécula portadora. En algunos modos de realización, los haptenos incluyen pirazoles (por ejemplo, nitropirazoles); compuestos de nitrofenilo; benzofurazanos; triterpenos; ureas (por ejemplo, fenilureas); tioureas (por ejemplo, feniltioureas); rotenona y derivados de rotenona; oxazol (por ejemplo, oxazolsulfonamidas); tiazoles (por ejemplo, tiazolsulfonamidas); cumarina y derivados de cumarina; y ciclolignanos. Los ejemplos no limitantes adicionales de haptenos incluyen tiazoles; nitroarilos; benzofuranos; triterpenos; y ciclolignanos. Los ejemplos específicos de haptenos incluyen di-nitrofenilo, biotina, digoxigenina y fluoresceína, y cualquier derivado o análogo de los mismos. Otros haptenos se describen en las patentes de Estados Unidos n.os 8.846.320; 8.618.265; 7.695.929; 8.481.270; y 9.017.954. Los propios haptenos pueden ser adecuados para la detección directa, es decir, pueden emitir una señal adecuada para la detección.

Como se usa en el presente documento, los términos "muestra" y "muestra biológica" se referirán a cualquier composición que contenga o se presuma que contiene un biomarcador. El término incluye componentes purificados o separados de células, tejidos o sangre, por ejemplo, ADN, ARN, proteínas, porciones sin células o lisados celulares. La muestra puede ser una muestra celular fijada con formol e incluida en parafina (FFPE), por ejemplo, de un tumor o una metástasis cancerosa. La muestra también puede ser de tejido congelado o fresco, o de una muestra líquida, por ejemplo, sangre o un componente sanguíneo (plasma o suero), orina, semen, saliva, esputo, moco, semen, lágrima, linfa, líquido cefalorraquídeo, material lavado de un hisopo, etc. Las muestras también pueden incluir constituyentes y componentes de cultivos in vitro de células obtenidas de un individuo, incluyendo líneas celulares. La muestra también se puede procesar parcialmente a partir de una muestra obtenida directamente de un individuo, por ejemplo, lisado celular o sangre deficitaria en eritrocitos.

Como se usa en el presente documento, el término "muestra celular" se refiere a cualquier muestra que contiene células intactas, tales como cultivos celulares, muestras de líquidos corporales o piezas quirúrgicas tomadas para interpretación patológica, histológica o citológica.

Como se usa en el presente documento, el término "muestra de tejido" se referirá a una muestra celular que conserva la relación espacial transversal entre las células como existían dentro del sujeto del que se obtuvo la muestra. La "muestra de tejido" englobará tanto muestras de tejido primario (es decir, células y tejidos producidos por el sujeto) como xenoinjertos (es decir, muestras de células exógenas implantadas en un sujeto).

Como se usa en el presente documento, el término "muestra citológica" se refiere a una muestra celular en la que las células de la muestra se han desagregado parcial o completamente, de modo que la muestra ya no refleja la relación espacial de las células como existían en el sujeto del que se obtuvo la muestra celular. Los ejemplos de muestras citológicas incluyen raspados de tejido (tales como un raspado cervical), aspirados con aguja fina, muestras obtenidas por lavado de un sujeto, etcétera.

Como se usa en el presente documento, "detección histoquímica" se refiere a un procedimiento que implica marcar un biomarcador u otras estructuras en una muestra de tejido con reactivos de detección de una manera que permite la detección microscópica del biomarcador u otras estructuras en el contexto de la relación transversal entre las estructuras de la muestra de tejido. Los ejemplos incluyen inmunohistoquímica (IHQ), hibridación in situ cromogénica (CISH), hibridación in situ con fluorescencia (FISH), hibridación in situ con plata (SISH) y tinción con hematoxilina y eosina (H y E) de cortes histológicos fijados con formol e incluidos en parafina.

Como se usa en el presente documento, "detección citoquímica" se refiere a un procedimiento que implica marcar un biomarcador u otras estructuras en una muestra citológica con reactivos de detección de una manera que permite la detección microscópica del biomarcador u otras estructuras en el contexto de las células de la muestra citológica.

Como se usa en el presente documento, el término "corte" se referirá a un corte fino de una muestra de tejido adecuado para análisis microscópico, típicamente cortado usando un micrótomo.

Como se usa en el presente documento, el término "corte seriado" se referirá a uno cualquiera de una serie de cortes cortados en secuencia a partir de una muestra de tejido. Para que dos cortes se consideren "cortes seriados" uno de otro, no necesariamente necesitan ser cortes consecutivos del tejido, sino que en general deben contener las mismas estructuras de tejido en la misma relación de sección transversal, de modo que las estructuras pueden coincidir entre sí después de la tinción histológica.

Como se usa en el presente documento, la frase "unión específica", "se une específicamente a" o "específico para" se refiere a interacciones mensurables y reproducibles, tales como la unión entre una diana y un agente específico de biomarcadores, que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas que incluyen moléculas biológicas. Por ejemplo, una entidad de unión que se une específicamente a una diana es un anticuerpo que se une a esta diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otras dianas. En un modo de realización, el grado de unión de una entidad de unión a una diana no relacionada es menor que aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a la diana como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, una entidad de unión que se une específicamente a una diana tiene una constante de disociación (Kd) de <1 |jM, <100 nM, <10 nM, <1 nM o <0,1 nM. En otro modo de realización, la unión específica puede incluir, pero no requiere, una unión exclusiva.

Como se usa en el presente documento, "sonda de detección" se referirá a cualquier compuesto o composición que se une a una estructura específica dentro de una muestra de una manera que permite la detección de la estructura en la muestra. Los ejemplos incluyen:

• sondas de ácido nucleico que se pueden hibridar específicamente a secuencias de nucleótidos particulares;

• conjuntos de cebadores de ácido nucleico que pueden amplificar una secuencia de nucleótidos específica o conjunto de secuencias cuando se emparejan con reactivos de amplificación apropiados;

• anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos; y

• estructuras de unión específicas genomanipuladas, incluyendo ADNECTINA (andamio basado en la 10.a fibronectina FN3; Bristol-Myers-Squibb Co.), AFFlBODY (andamio basado en el dominio Z de la proteína A de S. aureus; Affibody AB, Solna, Suecia), AVÍMEROS (andamio basado en el receptor del dominio A/LDL; Amgen, Thousand Oaks, CA), dAb (andamio basado en el dominio de anticuerpo VH o VL; GlaxoSmithKline PLC, Cambridge, R.U.), DARPin (andamio basado en proteínas de repetición de anquirina; Molecular Partners AG, Zúrich, CH), ANTICALIN (andamio basado en lipocalinas; Pieris Ag , Frisinga, DE), NANOBODY (andamio basado en VHH (Ig de camélido); Ablynx N/V, Gante, BE), TRANS-BODY (andamio basado en transferrina; Pfizer Inc., Nueva York, NY), SMIP (Emergent Biosolutions, Inc., Rockville, MD) y TETRANECTINAS (andamio basado en el dominio de lectina de tipo C (CTLD), tetranectina; Borean Pharma A/S, Aarhus, DK) (las descripciones de dichas estructuras de unión específicas genomanipuladas se revisan por Wurch et al., Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging and Therapy: Status on Discovery Research and Clinical Validation, Current Pharmaceutical Biotechnology, vol. 9, pp. 502-509 (2008).

Las sondas de detección pueden incluir un marcador para la detección directa, tales como isótopos radioactivos, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes o fluorescentes, haptenos (incluyendo DNP) y enzimas. De forma alternativa, las sondas de detección pueden no contener ningún marcador o marca y se pueden detectar indirectamente (por ejemplo, con un anticuerpo secundario u otras moléculas que asocian específicamente la sonda de detección con un marcador o marca).

"Múltiple", "multiplexado" o "multiplexación" se refiere a la detección de múltiples dianas en una muestra de forma concurrente, sustancialmente de forma simultánea o de forma secuencial. La multiplexación puede incluir identificar y/o cuantificar múltiples ácidos nucleicos distintos (por ejemplo, ADN, ARN, ARNm, miARN) y polipéptidos (por ejemplo, proteínas) tanto individualmente como en cualquiera y todas las combinaciones.

El término "sonda de detección primaria" o "anticuerpo primario" se refiere a una sonda de detección o un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de proteína diana en una muestra de tejido. Una sonda de detección primaria es en general la primera detección usada en un procedimiento histoquímico.

El término "sonda de detección secundaria" o "anticuerpo secundario" en el presente documento se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a una sonda de detección o porción de la misma (por ejemplo, un hapteno o un anticuerpo primario), formando de este modo un puente entre la sonda de detección y un reactivo posterior (por ejemplo, un marcador, una enzima, etc.), si lo hubiera. Se puede usar un anticuerpo secundario para detectar indirectamente las sondas de detección.

"Células tumorales PD-L1" significa las células tumorales, incluyendo las células metastásicas, que expresan o sobreexpresan PD-L1.

"Diana" significa cualquier molécula para la que se determina o se puede determinar la presencia, localización y/o concentración. Los ejemplos de dianas incluyen secuencias de ácido nucleico y proteínas, tales como las divulgadas en el presente documento y, en particular, incluyen PD-L1 y marcadores de células inmunitarias (marcadores de grupo de diferenciación ("CD")).

Los linfocitos infiltrantes de tumor ("LIT") son un tipo de célula inmunitaria que se encuentra en los tumores y están implicados en la "destrucción" de las células tumorales.

Sondas de detección primarias

Los ensayos múltiples, kits y procedimientos de la presente divulgación comprenden al menos dos sondas de detección, a saber, sondas de detección que posibilitan la detección de al menos (i) células tumorales positivas para PD-L1 y (ii) células inmunitarias. Por supuesto, el experto en la técnica reconocerá que se pueden combinar sondas de detección adicionales con las al menos dos sondas de detección para efectuar la detección de otras dianas, incluyendo otros marcadores tumorales. Si bien determinados modos de realización en el presente documento se refieren a anticuerpos primarios como sondas de detección para su uso en IHQ, también se pueden utilizar igualmente otras sondas de detección específicas de proteínas para su uso en ensayos histoquímicos y sondas de ácido nucleico para su uso en ensayos de hibridación in situ.

En algunos modos de realización, las sondas de detección utilizadas son anticuerpos primarios, a saber, anticuerpos primarios que posibilitan la detección de células tumorales positivas para PD-L1 y células inmunitarias. En algunos modos de realización, las sondas de detección incluyen anticuerpos primarios específicos para PD-L1 (por ejemplo, anticuerpos anti-PD-L1). En un modo de realización, los anticuerpos frente a PD-L1 son inmunoespecíficos para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 1. En otros modos de realización, las sondas de detección son anticuerpos primarios que son específicos para al menos células tumorales que expresan PD-L1. Aún en otros modos de realización, las sondas de detección son anticuerpos primarios que son específicos para PD-1. Los anticuerpos anti-PD-L1 están disponibles, por ejemplo, en Ventana Medical Systems, Tucson AZ, e incluyen SP142 (un anticuerpo IHQ monoclonal de conejo) y SP263 (un anticuerpo IHQ monoclonal de conejo). Otros anticuerpos anti-PD-L1 están disponibles en Dako North America (Carpintería, CA) e incluyen IHQ para PD-L1 con 22C3 pharmDx e IHQ para PD-L1 con 28-8 pharmDx. SP142 se describe en detalle en el documento US20160009805A1 y SP263 se describe en detalle en el documento US20150346208A1. SP142 y SP263 incluyen las siguientes secuencias de la cadena pesada y la ligera:

Tabla 1

En algunos modos de realización, las sondas de detección utilizadas son específicas para marcadores de células inmunitarias. En algunos modos de realización, las sondas de detección se seleccionan de anticuerpos primarios que son específicos para marcadores de linfocitos, incluyendo linfocitos T y linfocitos B. En otros modos de realización, las sondas de detección se seleccionan de anticuerpos primarios que son específicos para marcadores de leucocitos, linfocitos T cooperadores, linfocitos T reguladores y/o linfocitos T citotóxicos. Aún en otros modos de realización, las sondas de detección se seleccionan de anticuerpos primarios que son específicos para un biomarcador secundario de linfocitos de amplio espectro.

En algunos modos de realización, las sondas de detección se seleccionan de anticuerpos primarios que son específicos para determinados receptores y/o ligandos, incluyendo CD45, CD45LCA (donde 'LCA' se refiere al antígeno común leucocitario) CD3, Cd 4, c D8, CD20, CD25, Cd 19 y CD163 (por ejemplo, anticuerpos anti-CD). En otros modos de realización, la sonda de detección es un anticuerpo primario que es específico para CD45LCA. En algunos modos de realización, la sonda de detección es un anticuerpo primario anti-CD45LCA, tal como el disponible en Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, y disponible con el nombre comercial CONFIRM anti-CD45, LCA (RP2/18) (un anticuerpo monoclonal de ratón (IgG1) que se une específicamente a antígenos localizados en las membranas de los leucocitos).

Reactivos de detección

Los reactivos de detección se seleccionan para efectuar el depósito de un resto detectable cerca de los reactivos de detección cuando se unen a una muestra de tejido. Un "resto detectable" es una molécula o material que puede producir una señal detectable (tal como visual, electrónica o de otro modo) que indica la presencia (es decir, análisis cualitativo) y/o concentración (es decir, análisis cuantitativo) de las dianas en una muestra. Una señal detectable se puede generar por cualquier mecanismo conocido o aún por descubrir, incluyendo absorción, emisión y/o dispersión de un fotón (incluyendo fotones de radiofrecuencia, frecuencia de microondas, frecuencia infrarroja, frecuencia visible y frecuencia ultravioleta). En algunos modos de realización, el resto detectable incluye moléculas y materiales cromogénicos, fluorescentes, fosforescentes y luminiscentes, catalizadores ('tales como enzimas) que convierten una sustancia en otra sustancia para proporcionar una diferencia detectable (tal como convirtiendo una sustancia incolora en una sustancia coloreada o viceversa, o produciendo un precipitado o incrementando la turbidez de la muestra). En algunos ejemplos, el resto detectable es un fluoróforo, que pertenece a varias clases químicas comunes que incluyen cumarinas, fluoresceínas (o derivados y análogos de fluoresceína), rodaminas, resorufinas, luminóforos y cianinas. Los ejemplos adicionales de moléculas fluorescentes se pueden encontrar en Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR, TheroFisher Scientific, 11.a edición. En otros modos de realización, el resto detectable es detectable por medio de microscopía de campo brillante. En un modo de realización específico, el resto detectable comprende un tinte elegido del grupo que consiste en diaminobencidina (DAB), 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple), N,N'-biscarboxipentil-5,5'-disulfonato-indo-dicarbocianina (Cy5) y rodamina 110 (rodamina).

En algunos modos de realización, el resto detectable se conjuga directamente con la sonda de detección y, por tanto, se deposita en la muestra tras la unión de la sonda de detección a su diana. En otros casos, el depósito del resto detectable se efectúa por una reacción enzimática. En algunos modos de realización, las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, glucosa oxidasa, P-galactosidasa, p-glucuronidasa o p-lactamasa. En otros modos de realización, las enzimas incluyen oxidorreductasas, hidrolasa o peroxidasas (por ejemplo, HRP o AP). La enzima se puede conjugar directamente con la sonda de detección o se puede asociar indirectamente con la sonda de detección por medio de un conjugado de marcaje. Como se usa en el presente documento, un "conjugado de marcaje" comprende: (a) una entidad de unión específica que es específica para una entidad de unión específica primaria o para otra entidad que se enlaza a o se asocia con el anticuerpo primario (tal como un anticuerpo secundario unido al anticuerpo primario o un hapteno enlazado al anticuerpo primario o similar); y (b) una enzima enlazada a la entidad de unión específica, en la que la enzima es reactiva con el sustrato cromogénico, conjugado de señalización o tinte reactivo con enzima en condiciones de reacción apropiadas para efectuar la generación in situ del tinte y/o el depósito del tinte en la muestra de tejido.

En algunos casos, la enzima reacciona con un compuesto/sustrato cromogénico. Los ejemplos no limitantes particulares de compuestos/sustratos cromogénicos incluyen 4-nitrofenilfosfato (pNPP), rojo rápido, fosfato de bromocloroindolilo (BCIP), nitroazul de tetrazolio (NBT), BCIP/NBT, rojo rápido, naranja AP, azul AP, tetrametilbencidina (TMB), 2,2'-azino-di-[3-etilbenzotiazolina-sulfonato] (ABTS), o-dianisidina, 4-cloronaftol (4-CN), nitrofenil-p-D-galactopiranósido (ONPG), o-fenilendiamina (OPD), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-galactopiranósido (X-Gal), metilumbeliferil-p-D-galactopiranósido (MU-Gal), p-nitrofenil-a-D-galactopiranósido (PNP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucurónido (X-Gluc), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), fucsina, yodonitrotetrazolio (INT), azul de tetrazolio o violeta de tetrazolio.

En algunos modos de realización, la enzima se puede usar en un esquema de detección metalográfica. Los procedimientos de detección metalográfica incluyen el uso de una enzima, tal como fosfatasa alcalina, en combinación con un ion metálico hidrosoluble y un sustrato inactivo de oxidorreducción de la enzima. En algunos modos de realización, el sustrato se convierte en un agente activo de oxidorreducción por la enzima, y el agente activo de oxidorreducción reduce el ion metálico, provocando que forme un precipitado detectable. (Véanse, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. n.° 11/015.646, presentada el 20 de diciembre de 2004, publicación Pc T n.° 2005/003777 y publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0265922). Los procedimientos de detección metalográfica incluyen el uso de una enzima oxidorreductasa (tal como la peroxidasa de rábano picante) junto con un ion metálico hidrosoluble, un agente oxidante y un agente reductor, nuevamente para formar un precipitado detectable. (Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.670.113).

En algunos modos de realización, la acción enzimática se produce entre la enzima y el propio tinte, en la que la reacción convierte el tinte de una especie no de unión a una especie depositada en la muestra. Por ejemplo, la reacción de DAB con una peroxidasa (tal como la peroxidasa de rábano picante) oxida la DAB, provocando que precipite.

Aún en otros modos de realización, el tinte se deposita por medio de un conjugado de señalización que comprende un resto reactivo latente configurado para reaccionar con la enzima para formar una especie reactiva que se puede unir a la muestra o a otros componentes de detección. Estas especies reactivas pueden reaccionar con la muestra proximales a su generación, es decir, cerca de la enzima, pero se convierten rápidamente en una especie no reactiva de modo que el conjugado de señalización no se deposita en sitios distantes del sitio en el que se deposita la enzima. Los ejemplos de restos reactivos latentes incluyen: análogos de metida de quinona (QM), tales como los descritos en el documento WO2015124703A1, y conjugados de tiramida, tales como los descritos en el documento WO2012003476A2. En algunos ejemplos, el conjugado de señalización incluye un resto reactivo latente conjugado directamente con un tinte, tal como N,N'-biscarboxipentil-5,5'-disulfonato-indo-dicarbocianina (Cy5), 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), tetrametilrrodamina (DISCO Purple) y rodamina 110 (rodamina). En otros ejemplos, el resto reactivo latente se enlaza a un miembro de un par de unión específico y el tinte se enlaza al otro miembro del par de unión específico. En otros ejemplos, el resto reactivo latente se enlaza a un miembro de un par de unión específico y una enzima se enlaza al otro miembro del par de unión específico, en la que la enzima es (a) reactiva con un sustrato cromogénico para efectuar la generación del tinte, o (b) reactiva con un tinte para efectuar el depósito del tinte (tal como DAB). Los ejemplos de pares de unión específicos incluyen:

(1) una biotina o un derivado de biotina (tal como destiobiotina) enlazado al resto reactivo latente y una entidad de unión a biotina (tal como avidina, estreptavidina, avidina desglucosilada (tal como NEUTRAVIDIN) o una proteína de unión a biotina que tiene una tirosina nitrada en su sitio de unión a biotina (tal como CAPTAVIDIN)) enlazada a un tinte o a una enzima reactiva con un sustrato cromogénico o reactiva con un tinte (por ejemplo, una peroxidasa enlazada a la proteína de unión a biotina cuando el tinte es DAB); y

(2) un hapteno enlazado al resto reactivo latente y un anticuerpo antihapteno enlazado a un tinte o a una enzima reactiva con un sustrato cromogénico o reactiva con un tinte (por ejemplo, una peroxidasa enlazada a la proteína de unión a biotina cuando el tinte es DAB).

En algunos modos de realización, los reactivos de detección utilizados en los ensayos múltiples, kits y procedimientos incluyen tintes y reactivos útiles para el depósito del tinte sobre la muestra de tejido. Como tal, en algunos modos de realización, los reactivos de detección comprenden un conjugado de marcaje y además comprenden uno de un sustrato cromogénico, un conjugado de señalización o un tinte reactivo con enzima. En otros modos de realización, los reactivos de detección comprenden un conjugado de marcaje y además comprenden uno de un sustrato cromogénico, un conjugado de señalización o un tinte reactivo con enzima.

Las disposiciones específicas de las sondas de detección primarias y los reactivos de detección incluyen las expuestas en la tabla 2. Como se apreciaría por un experto en la técnica medio, la detección de cada uno de los anticuerpos primarios puede ser la misma o puede ser diferente.

Tabla 2

En un modo de realización específico, las sondas de detección expuestas en la tabla 2 son anticuerpos.

Los ejemplos no limitantes de reactivos o kits de detección disponibles comercialmente que comprenden reactivos de detección adecuados para su uso con los procedimientos presentes incluyen: sistemas de detección VENTANA ultraView (anticuerpos secundarios conjugados con enzimas, incluyendo HRP y AP); sistemas de detección VENTANA iVIEW (anticuerpos secundarios antiespecies biotinilados y enzimas conjugadas con estreptavidina); sistemas de detección VENTANA OptiView (OptiView) (anticuerpo secundario antiespecie conjugado con un hapteno y un anticuerpo terciario antihapteno conjugado con un multímero enzimático); kit de amplificación VENTANA (anticuerpos secundarios no conjugados, que se pueden usar con cualquiera de los sistemas de detección VENTANA anteriores para amplificar el número de enzimas depositadas en el sitio de unión del anticuerpo primario); sistema de amplificación VENTANA OptiView (anticuerpo secundario antiespecie conjugado con un hapteno, un anticuerpo terciario antihapteno conjugado con un multímero enzimático y una tiramida conjugada con el mismo hapteno. En uso, el anticuerpo secundario se pone en contacto con la muestra para efectuar la unión al anticuerpo primario. A continuación, la muestra se incuba con el anticuerpo antihapteno para efectuar la asociación de la enzima al anticuerpo secundario. A continuación, la muestra se incuba con la tiramida para efectuar el depósito de moléculas de hapteno adicionales. A continuación, la muestra se incuba nuevamente con el anticuerpo antihapteno para efectuar el depósito de moléculas enzimáticas adicionales. A continuación, la muestra se incuba con el resto detectable para efectuar el depósito del tinte); anticuerpo antihapteno, anticuerpo secundario, cromógeno, fluoróforo y kits de tinción VENTANA DISCOVERY, DISCOVERY OmniMap, DISCOVERY UltraMap, de los que cada uno está disponible en Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, Arizona); sistemas de detección IHQ PowerVision y PowerVision+ (anticuerpos secundarios polimerizados directamente con HRP o AP para producir polímeros compactos que tienen una alta proporción de enzimas con respecto a anticuerpos); y el sistema DAKO EnVision™+ (polímero marcado con enzima que se conjuga con anticuerpos secundarios).

Aún en otros modos de realización, los reactivos de detección se seleccionan de modo que los restos detectables, cuando se introducen en la muestra de tejido, proporcionan diferentes colores (por ejemplo, amarillo, azul, fucsia). En algunos modos de realización, los restos detectables se seleccionan de modo que proporcionan un buen contraste entre sí, es decir, una separación de colores que sean ópticamente reconocibles y/o que ayuden a facilitar la detección (manual o por medio de procedimientos automatizados) de las dianas teñidas de forma diferente (por ejemplo, marrón y morado). Por ejemplo, la figura 5 proporciona un gráfico que ilustra los espectros de absorbancia de varios cromógenos. Como se ilustra, se cree que DISCOVERY Purple es superior a los otros cromógenos enumerados en la figura 5 cuando se usa junto con DAB en un ensayo múltiple, debido al pico de absorbancia estrecho de DISCOVERY Purple en comparación con los picos de absorbancia de los otros cromógenos. Como se muestra en las figuras 4A a 4C, una combinación de colores de este tipo proporciona un buen contraste y una identificación clara de las células inmunitarias positivas para PD-L1, y permite diferenciar las células inmunitarias positivas para PD-L1 de las células tumorales positivas para PD-L1.

En otros modos de realización, los sustratos o conjugados de señalización se seleccionan de modo que las longitudes de onda detectables de pico de cualquier resto detectable no se superpongan entre sí y sean fácilmente detectables por un anatomopatólogo o un detector óptico (por ejemplo, un digitalizador). En algunos modos de realización, los restos detectables se seleccionan de modo que las longitudes de onda de pico de los diferentes restos detectables estén separadas en al menos aproximadamente 50 nm. En otros modos de realización, los restos detectables se seleccionan de modo que las longitudes de onda de pico de los diferentes restos detectables estén separadas en al menos aproximadamente 70 nm. Aún en otros modos de realización, los restos detectables se seleccionan de modo que las longitudes de onda de pico de los diferentes restos detectables estén separadas en al menos aproximadamente 100 nm.

En algunos modos de realización, el orden de aplicación de los sustratos en cualquier ensayo múltiple es importante. Por ejemplo, un sustrato particular puede no ser tan sensible cuando se usa para detectar una diana particular en comparación con otro. Además, se cree que un orden apropiado puede evitar el enmascaramiento de señales muy cerca entre sí. En algunos modos de realización, el primer reactivo de detección que se va a aplicar es específico para PD-L1 y el segundo reactivo de detección que se va a aplicar es específico para el al menos un marcador de células inmunitarias.

Procedimientos de detección múltiple

En algunos modos de realización, la presente divulgación proporciona procedimientos para la detección múltiple de dianas (por ejemplo, células tumorales positivas para PD-L1 y células inmunitarias) dentro de una muestra de tejido.

En comparación con los procedimientos de la técnica anterior, los ensayos múltiples y procedimientos de la presente divulgación permiten una exactitud de detección mejorada de células inmunitarias positivas para PD-L1 y un flujo de trabajo más eficaz. De hecho, los ensayos múltiples y procedimientos actualmente divulgados permiten la identificación de células inmunitarias positivas para PD-L1 en un único portaobjetos de una muestra de tejido y sin necesidad de intercambiar los portaobjetos teñidos con una tinción primaria (por ejemplo, tinción con hematoxilina y eosina ("H y E")) y los portaobjetos teñidos en un ensayo IHQ para el biomarcador PD-L1. Contrariamente a los procedimientos divulgados en el presente documento, los procedimientos de la técnica anterior utilizaban una única sonda de detección para teñir tanto las células tumorales positivas para PD-L1 como las células inmunitarias positivas para PD-L1, y el análisis y la puntuación de la muestra de tejido teñido requería que un anatomopatólogo alternara entre los portaobjetos teñidos con una tinción primaria y los teñidos con IHQ. Por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos de la técnica anterior, un anatomopatólogo identificaría en primer lugar el tejido tumoral en un portaobjetos teñido con H y E, a continuación cambiaría a un portaobjetos teñido con IHQ para identificar las células tumorales positivas para PD-L1. Posteriormente, el anatomopatólogo volvería a cambiar al portaobjetos teñido con H y E para identificar las células inmunitarias dentro del área positiva, seguido de volver a cambiar nuevamente al portaobjetos teñido con IHQ para evaluar la positividad para PD-L1 de las células inmunitarias. Los procedimientos divulgados, por otra parte, requieren solo dos etapas, a saber, identificar un tumor con una tinción de H y E primaria, seguido de la identificación de células tumorales y células inmunitarias de tinción positiva que coexpresan PD-L1 y al menos un marcador de células inmunitarias en un único portaobjetos. Es a través de la incorporación de un biomarcador secundario que los solicitantes han logrado resultados superiores.

En algunos modos de realización, el procedimiento de detección múltiple comprende poner en contacto la muestra de tejido con al menos dos sondas de detección diferentes (por ejemplo, anticuerpos primarios) de modo que se pueden detectar (i) las células tumorales positivas para PD-L1 y (ii) las células inmunitarias (por ejemplo, las células inmunitarias que son positivas para PD-L1 y las células inmunitarias que son negativas para PD-L1). En algunos modos de realización, la aplicación de las sondas de detección a una muestra de tejido permite diferenciar las células tumorales positivas para PD-L1 de las células inmunitarias positivas para PD-L1 (especialmente las células inmunitarias positivas para PD-L1 que se infiltran en el tejido tumoral positivo para PD-L1). En otros modos de realización, la introducción de las sondas de detección en una muestra de tejido permite identificar y/o cuantificar células tumorales positivas para PD-L1, células inmunitarias positivas para PD-L1, células tumorales negativas para PD-L1 y/o células inmunitarias negativas para PD-L1. En otros modos de realización, la aplicación de las sondas de detección y los reactivos de detección a una muestra de tejido posibilita identificar las células tumorales positivas para PD-L1 con un primer color (un primer cromógeno), identificar las células inmunitarias con un segundo color (un segundo cromógeno) e identificar las células inmunitarias positivas para PD-L1 como coexpresoras de los primer y segundo colores (los primer y segundo cromógenos). Por ejemplo, como se muestra en la figura 4, las células tumorales PD-L1 se identifican con un color marrón (DAB), las células inmunitarias se identifican con un color fucsia (DISCOVERY Purple) y las células inmunitarias que son positivas para PD-L1, es decir, las células inmunitarias que coexpresan PD-L1 y un marcador de células inmunitarias comprenden o coexpresan tanto el color marrón como el color fucsia.

En algunos modos de realización, los ensayos múltiples y procedimientos de la presente divulgación comprenden introducir una sonda de detección específica para PD-L1 y al menos una sonda de detección específica para al menos un marcador de células inmunitarias. En algunos modos de realización, la al menos una sonda de detección específica para al menos un marcador de células inmunitarias es un anticuerpo primario. En el contexto de los anticuerpos primarios para detectar el al menos un marcador de células inmunitarias, el experto en la técnica reconocerá que se pueden utilizar múltiples anticuerpos primarios, donde cada anticuerpo primario es específico para un marcador de células inmunitarias diferente. Por ejemplo, se puede introducir un anticuerpo anti-CD4 (simultánea o secuencialmente) junto con un anticuerpo anti-CD8, donde cada uno de los anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 se puede detectar indirectamente con el mismo o diferentes cromógenos (u otros reactivos de detección). En otros modos de realización, se puede introducir un anticuerpo anti-CD45LCA (simultánea o secuencialmente) junto con un anticuerpo primario seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD4 y un anticuerpo anti-CD8 donde nuevamente, cada de los anticuerpos específicos para los marcadores de células inmunitarias se puede detectar con el mismo o diferentes cromógenos (u otros reactivos de detección). En otros modos de realización, solo se utiliza una única sonda de detección específica para al menos un marcador de células inmunitarias (por ejemplo, un anticuerpo primario anti-CD45LCA).

Las figs. 6 y 7 proporcionan diagramas de flujo que delinean las etapas de determinados modos de realización de los procedimientos de la presente divulgación. En particular, el procedimiento expone un esquema de detección múltiple donde, en la etapa 1, la muestra se pone en contacto con una sonda de detección (por ejemplo, un anticuerpo primario específico para PD-L1). Cuando la sonda de detección se introduce en la muestra, formará un complejo sonda de detección-diana (por ejemplo, un complejo anticuerpo primario-diana). Una etapa 2 posterior incluye poner en contacto la muestra con reactivos de detección. Los reactivos de detección pueden incluir (i) conjugados de marcaje y (ii) sustratos cromogénicos o conjugados de señalización, como se ilustra en las etapas 3a y 3b de la FIG. 7. Otra etapa posterior 4 comprende poner en contacto la muestra con una composición de inhibición enzimática (o una etapa donde se inhibe o desnaturaliza un apilamiento de enzimas y/o anticuerpos que comprenden los reactivos de detección). Una línea discontinua indica que el procedimiento de las etapas 1 a 4 se puede repetir una o más veces para proporcionar la detección múltiple secuencial de múltiples dianas diferentes dentro de la muestra de tejido (por ejemplo, marcas de células inmunitarias; otros marcadores tumorales). El procedimiento también comprende una etapa 5 de iluminar la muestra con luz y detectar las dianas en la etapa 6. La detección puede ser manual o automatizada y, opcionalmente, se puede vincular a un sistema informático y/o un sistema de formación de imágenes.

Como alternativa a los modos de realización proporcionados en las figuras 6 y 7, cada una de las diferentes sondas de detección se puede añadir simultánea o secuencialmente, y antes de añadir cualquier reactivo de detección. Por ejemplo, se puede añadir una primera sonda de detección seguido de la introducción de una segunda sonda de detección (y, por supuesto, "n" sondas de detección adicionales, si así lo requiere el ensayo). Posteriormente, se pueden añadir primeros reactivos de detección, seguido de desnaturalización, inhibición y/o elución de cualquier enzima y/o anticuerpos asociados incluidos con los primeros reactivos de detección. Después de esa etapa, se pueden añadir segundos reactivos de detección y cualquier número "n" adicional de reactivos de dirección, en base al número "n" de sondas de detección proporcionadas. En ese punto, los primeros y segundos reactivos de detección se pueden detectar simultáneamente.

Como otro ejemplo de un ensayo múltiple de acuerdo con la presente divulgación, se introduce un primer anticuerpo primario específico para una primera diana (por ejemplo, específico para uno de PD-L1 o un marcador de células inmunitarias) en una muestra de tejido. En algunos modos de realización, el primer anticuerpo primario forma un primer complejo conjugado de diana-anticuerpo detectable. Simultánea o bien posteriormente, se introduce en la muestra un segundo anticuerpo primario específico para una segunda diana (por ejemplo, el otro PD-L1 o el marcador de células inmunitarias) que comprende un segundo marcador para formar un segundo conjugado diana-anticuerpo. Se pueden introducir además tercera, cuarta y enésima sondas de detección adicionales específicas para otras dianas (que forman "n" complejos diana-sonda de detección), nuevamente secuencial o bien simultáneamente con el primer y/o segundo anticuerpos primarios. Después de que se depositan las sondas de detección, se pueden detectar, directa o bien indirectamente, dependiendo, por supuesto, de su configuración. En algunos modos de realización, se introducen reactivos de detección adicionales para posibilitar la detección de las dianas y los reactivos de detección adicionales incluyen los descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, se introducen los primeros, segundos y enésimos reactivos de detección, donde cada uno de los primeros, segundos y enésimos reactivos de detección comprende (i) un anticuerpo secundario específico para cada una de las sondas de detección, en el que el anticuerpo secundario se conjuga con un enzima; y (ii) un sustrato cromogénico; en los que cada uno de los primer, segundo y enésimo sustratos cromogénicos es diferente.

En algunos modos de realización, el procedimiento de detección múltiple comprende las etapas de (i) poner en contacto una muestra biológica con una primera sonda de detección (por ejemplo, uno de un anticuerpo primario específico para PD-L1 o CD45LCA) para formar un primer complejo anticuerpo-diana; (ii) poner en contacto la muestra biológica con un primer conjugado de marcaje en el que el primer conjugado de marcaje comprende una primera enzima (donde el primer conjugado de marcaje es un anticuerpo antiespecie que se une específicamente a la primera sonda de detección y se configura para marcar la diana con una enzima); (iii) poner en contacto la muestra biológica con un primer conjugado de señalización que comprende un primer resto reactivo latente y un primer resto detectable; (iv) inactivar la primera enzima, tal como poniendo en contacto la muestra con una primera composición de inactivación enzimática para inactivar sustancialmente o inactivar completamente la primera enzima contenida en la muestra biológica. En algunos modos de realización, la primera sonda de detección añadida es un anticuerpo primario específico para PD-L1, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1. En algunos modos de realización, el primer conjugado de señalización comprende un tinte enlazado a un resto químico que, cuando reacciona con una enzima apropiada y en condiciones adecuadas, deposita un tinte seleccionado del grupo que consiste en DISCOVERY Purple, Cy5, rodamina y DABSYL. En otros modos de realización, el primer conjugado de señalización incluye dAb como sustrato.

Después de que se inactiva la primera enzima (opcional), el procedimiento múltiple comprende además las etapas de (v) poner en contacto una muestra biológica con una segunda sonda de detección (por ejemplo, el otro del anticuerpo primario específico para PD-L1 o CD45LCA) para formar un segundo complejo anticuerpo-diana; (vi) poner en contacto la muestra biológica con un segundo conjugado de marcaje en el que el segundo conjugado de marcaje comprende una segunda enzima (donde el segundo conjugado de marcaje es un anticuerpo antiespecie que se une específicamente a la segunda sonda de detección y se configura para marcar la diana con una enzima); (vii) poner en contacto la muestra biológica con un segundo conjugado de señalización que comprende un segundo resto reactivo latente y un segundo resto detectable; (viii) inactivar la segunda enzima, tal como poniendo en contacto la muestra con una primera composición de inactivación enzimática para inactivar sustancialmente o inactivar completamente la primera enzima contenida en la muestra biológica. En algunos modos de realización, la segunda sonda de detección añadida es un anticuerpo primario específico para un marcador de células tumorales, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD45LC. En algunos modos de realización, el segundo conjugado de señalización comprende un resto detectable seleccionado del grupo que consiste en DAB, DISCOVERY Purple, Cy5, rodamina y DABSYL, donde el segundo resto detectable es diferente al primer resto detectable. En otros modos de realización, el segundo conjugado de señalización incluye QM-DISCOVERY Purple como sustrato.

Después de que se inactiva la segunda enzima, el procedimiento se puede repetir de modo que se pueden introducir sondas de detección adicionales (por ejemplo, anticuerpos primarios o sondas de ácido nucleico), junto con reactivos de detección adicionales, para efectuar la detección de otras dianas (por ejemplo, otros receptores de células inmunitarias, EGFR, HER2, HER2/neu, PVH, ALK, etc.). En algunos modos de realización, se introduce una tercera sonda de detección para detectar un marcador tumoral distinto de PD-L1. Seguidamente a la introducción de todos los anticuerpos primarios (y otras sondas de detección) y los respectivos reactivos o kits de detección, el procedimiento comprende además la etapa de detectar las señales (manualmente o por medio de un procedimiento automatizado) de los primer, segundo y enésimo restos detectables, en el que cada uno de los primer, segundo y enésimo restos detectables es diferente. De forma alternativa, y como se indica en el presente documento, cada una de las sondas de detección se puede añadir simultánea o secuencialmente, pero antes de añadir cualquier conjugado de marcaje. Como otro ejemplo, se pueden aplicar secuencialmente tres sondas de detección en la etapa 1, antes de la introducción de cualquier reactivo de detección.

En el contexto de un ensayo múltiple donde se detectan secuencialmente múltiples reactivos, es deseable inactivar sustancialmente (por ejemplo, más de un 90 % de inactivación) cualquier reactivo o enzima endógena entre etapas de detección sucesivas. Como resultado, se cree que las enzimas presentes en una etapa de detección cualquiera no interferirán con las de una etapa de detección posterior. Se cree que esto, a su vez, mejora tras la visualización y detección de los diferentes cromógenos usados en el ensayo múltiple. Se puede usar cualquier composición de inactivación enzimática conocida en la técnica para este propósito. En algunos modos de realización, se aplica una composición de inactivación enzimática para inactivar el reactivo o las enzimas endógenas después de cada etapa de detección. Las composiciones y procedimientos de inactivación enzimática ejemplares se divulgan en la solicitud en trámite junto con la presente US 62/159.297.

En algunos modos de realización, una etapa de desnaturalización evita que la enzima usada en un primer conjunto de reactivos de detección actúe sobre un segundo sustrato. En algunos modos de realización, el desnaturalizante es una sustancia que desnaturaliza la enzima en el primer conjunto de reactivos de detección. En algunos modos de realización, el desnaturalizante es, por ejemplo, formamida, una amida sustituida con alquilo, urea o un desnaturalizante basado en urea, tiourea, clorhidrato de guanidina o derivados de los mismos. Los ejemplos de amidas sustituidas con alquilo incluyen N-propilformamida, N-butilformamida, N-isobutilformamida y N,N-dipropilformamida. En algunos modos de realización, el desnaturalizante se proporciona en un tampón. En algunos modos de realización, la muestra se trata con el desnaturalizante durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para desnaturalizar la primera enzima de detección de sonda diana, por ejemplo fosfatasa alcalina. En algunos modos de realización, la muestra se trata con el desnaturalizante durante de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 minutos, preferentemente de aproximadamente 20 a 24 minutos a aproximadamente 37 °C. En algunos modos de realización, la muestra se trata con el desnaturalizante durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para desnaturalizar la enzima diana mientras se conserva la hibridación de la segunda sonda de ácido nucleico a la diana.

Se usan condiciones adecuadas para introducir los conjugados de señalización o sustratos con la muestra biológica, e incluyen típicamente proporcionar un tampón o solución de reacción que comprende un peróxido (por ejemplo, peróxido de hidrógeno), y que tiene una concentración de sal y un pH adecuados para permitir o facilitar que la enzima realice su función deseada. En general, esta etapa del procedimiento se realiza a temperaturas que varían de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 40 °C, aunque el experto en la técnica podrá seleccionar los intervalos de temperatura apropiados, apropiados para las enzimas y los conjugados de señalización seleccionados. Por ejemplo, se cree que estas condiciones permiten que la enzima y el peróxido reaccionen y promuevan la formación de radicales en el resto reactivo latente del conjugado de señalización. El resto reactivo latente y, por lo tanto, el conjugado de señalización como un todo, se depositarán covalentemente en la muestra biológica, en particular en uno o más residuos de tirosina proximales al conjugado enzimático inmovilizado, residuos de tirosina de la porción de enzima del conjugado enzimático y/o residuos de tirosina de la porción de anticuerpo del conjugado enzimático. A continuación, la muestra biológica se ilumina con luz y la diana se puede detectar a través de la absorbancia de la luz producida por el resto detectable del conjugado de señalización.

Los ensayos múltiples, procedimientos y sistemas pueden ser totalmente manuales o bien pueden incluir etapas automatizadas. En algunos modos de realización, se puede implementar un procedimiento automatizado en un teñidor de portaobjetos de IHQ/ISH automatizado. Los teñidores de portaobjetos de IHQ/ISH automatizados típicamente incluyen al menos una unidad teñidora para distribuir reactivo para implementar protocolos de tinción en un portaobjetos. Las unidades de tinción disponibles comercialmente típicamente funcionan según uno de los siguientes principios: (1) tinción de portaobjetos individuales abiertos, en la que los portaobjetos se sitúan horizontalmente y los reactivos se distribuyen como un charco en la superficie del portaobjetos que contiene una muestra de tejido (tal como la implementada en los teñidores dA k O AUTOSTAINER Link 48 (Agilent Technologies) e IntelliPATH (Biocare Medical)); (2) tecnología de superposición de líquidos, en la que los reactivos se cubren con o bien se distribuyen a través de una capa de fluido inerte depositada sobre la muestra (tal como la implementada en los teñidores VENTANA BenchMark y DISCOVERY); (3) tinción de espacio capilar, en la que la superficie del portaobjetos se coloca paralela cerca de otra superficie (que puede ser otro portaobjetos o una placa de recubrimiento) para crear un espacio estrecho, a través del que las fuerzas capilares atraen y mantienen los reactivos líquidos en contacto con las muestras (tal como los principios de tinción usados por los teñidores DAKO TECHMATE, Leica BOND y DAKO OMNIS). Algunas iteraciones de tinción de espacio capilar no mezclan los fluidos en el espacio (tal como en el DAKO TECHMATE y el Leica BOND). En otras variaciones de tinción de espacio capilar, los reactivos se mezclan en el espacio, tal como en la tecnología de espacio de traslación, en la que se crea un espacio entre el portaobjetos y una superficie curva y el movimiento de las superficies una con relación a la otra efectúa el mezclado (véase el documento US 7.820.381); y tinción de espacio dinámica, que usa fuerzas capilares similares a la tinción de espacio capilar para aplicar la muestra al portaobjetos, y a continuación traslada las superficies paralelas una con relación a la otra para agitar los reactivos durante la incubación para efectuar el mezclado de reactivos (tal como los principios de tinción implementados en los teñidores de portaobjetos DAKO OMNIS (Agilent)). Recientemente se ha propuesto usar tecnología de chorro de tinta para depositar reactivos en portaobjetos. Véase el documento w O 2016-170008 A1. Esta lista de principios de tinción no pretende ser exhaustiva, y los procedimientos y sistemas actuales están destinados a incluir cualquier tecnología de tinción (tanto conocida como desarrollada en el futuro) que se pueda usar para aplicar los reactivos apropiados a la muestra.

Si la muestra es una muestra incluida en parafina, la muestra se puede desparafinar manualmente o con el teñidor de portaobjetos de IHQ/ISH automatizado usando el/los fluido(s) de desparafinado apropiado(s). Después de que el eliminador de residuos retira el/los fluido(s) de desparafinado, se puede aplicar sucesivamente cualquier número de sustancias a la muestra. Las sustancias pueden ser para pretratamiento (por ejemplo, reticulación de proteínas, exposición a ácidos nucleicos, etc.), desnaturalización, hibridación, lavado (por ejemplo, lavado de restricción), detección (por ejemplo, enlazar una molécula visual o marcadora a una sonda), amplificación (por ejemplo, amplificación de proteínas, genes, etc.), contratinción, tapar con cubreobjetos o similares.

El teñidor de portaobjetos de IHQ/ISH automatizado puede aplicar una amplia gama de sustancias a la muestra. Las sustancias incluyen, sin limitación, colorantes, sondas, reactivos, enjuagues y/o acondicionadores. Las sustancias pueden ser fluidos (por ejemplo, gases, líquidos o mezclas de gas/líquido) o similares. Los fluidos pueden ser disolventes (por ejemplo, disolventes polares, disolventes no polares, etc.), soluciones (por ejemplo, soluciones acuosas u otros tipos de soluciones) o similares. Los reactivos pueden incluir, sin limitación, colorantes, agentes humectantes, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, etc.), fluidos de recuperación de antígenos (por ejemplo, soluciones de recuperación de antígenos en base acuosa o no acuosa, tampones de recuperación de antígenos, etc.) o similares. Las sondas pueden ser un ácido nucleico aislado o un oligonucleótido sintético aislado, fijado a un marcador detectable o molécula indicadora. Los marcadores pueden incluir isótopos radioactivos, sustratos enzimáticos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes o fluorescentes, haptenos y enzimas.

Los ejemplos específicos de teñidor de portaobjetos de IHQ/ISH automatizado, incluyendo los teñidores de portaobjetos automatizados itelliPATH (Biocare Medical), WAVE (Celerus Diagnostics), DAKO OMNIS y DAKO AUTOSTAINER LINK48 (Agilent Technologies), BENCHMARK (Ventana Medical Systems, Inc.), Leica BOND y Lab Vision Autostainer (Thermo Scientific) se describen por Prichard, OverView of Automated Immunohistochemistry, Arch Pathol Lab Med., vol. 138, pp. 1578-1582 (2014). Adicionalmente, Ventana Medical Systems, Inc. es el cesionario de una serie de patentes de los Estados Unidos que divulgan sistemas y procedimientos para realizar análisis automatizados, incluyendo las patentes de EE. UU. n.os 5.650.327, 5.654.200, 6.296.809, 6.352.861, 6.827.901 y 6.943.029, y las solicitudes de patente de EE. UU. publicadas n.os 20030211630 y 20040052685. De forma alternativa, las muestras se pueden procesar manualmente.

Después de teñir las muestras (manualmente o bien en un teñidor de portaobjetos automatizado), se pueden obtener imágenes de los portaobjetos teñidos en un digitalizador de portaobjetos de obtención de imágenes de campo brillante. En un nivel básico, los digitalizadores de portaobjetos generan una imagen digital representativa de la muestra teñida. El digitalizador de portaobjetos de campo brillante típico incluye al menos: (1) un microscopio con objetivos de lente, (2) una fuente de luz (tal como halógeno, diodo emisor de luz, luz blanca y/o fuentes de luz multiespectrales), (3) robótica para mover los portaobjetos de vidrio (o para mover la óptica alrededor del portaobjetos), (4) una o más cámaras digitales para la captura de imágenes, (5) un ordenador y su programa informático asociado para controlar la robótica y para manipular, gestionar y visualizar los portaobjetos digitales. Los datos digitales en una serie de localizaciones X-Y diferentes (y en algunos casos, en múltiples planos Z) en el portaobjetos se capturan por el dispositivo de carga acoplada (CCD) de la cámara, y las imágenes se unen para formar una imagen compuesta de toda la superficie explorada. Los procedimientos comunes para lograr incluyen:

(1) Exploración basada en mosaicos, en la que la platina del portaobjetos o la óptica se mueven en incrementos muy pequeños para capturar tramas de imagen cuadradas, que se superponen a los cuadrados contiguos en un grado leve. A continuación, los cuadrados capturados se emparejan automáticamente entre sí para construir la imagen compuesta; y

(2) Exploración basada en líneas, en la que la platina del portaobjetos se mueve en un único eje durante la adquisición para capturar una serie de "tiras" de imagen compuestas. A continuación, las tiras de imagen se pueden emparejar entre sí para formar la imagen compuesta más grande. En algunos casos,

Se puede encontrar una visión general detallada de diversos digitalizadores de campo brillante en Farahani et al., Whole slide imaging in pathology: advantages, limitations, and emerging perspectives, Pathology and Laboratory Medicine Int'l, vol. 7, pág. 23-33 (junio de 2015). Los ejemplos de digitalizadores de portaobjetos incluyen: 3DHistech PANNORAMIC SCAN II; DigiPath PATHSCOPE; Hamamatsu NANOZOOMER RS, HT y XR; Huron TISSUESCOPE 4000, 4000XT y HS; Leica SCANSCOPE AT, AT2, CS, FL y SCN400; Mikroscan D2; Olympus VS120-SL; Omnyx VL4 y VL120; PerkinElmer LAMINA; Philips ULTRA-FAST SCANNER; Sakura Finetek VISIONTEK; Unic PRECICE 500 y PRECICE 600x; VENTANA ISCAN COREO e ISCAN HT; y Zeiss AXIO SCAN.Z1. Se pueden encontrar otros sistemas y rasgos característicos ejemplares en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional n.°: PCT/US2010/002772 (publicación de patente n.°: WO/2011/049608) titulada IMAGING SYSTEM AND TECHNIQUES o divulgada en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 61/533.114, presentada el 9 de septiembre de 2011, titulada IMAGING SYSTEMS, CASSETTES, AND METHODS OF USING THE SAME.

Las imágenes digitales generadas por los digitalizadores de portaobjetos se pueden analizar además usando diversos paquetes de programa informático de patología digital. Estos programas informáticos típicamente funcionan midiendo la intensidad de señal del canal de señales en cada píxel de la imagen digital. A continuación, se pueden aplicar diversos algoritmos a los datos de señales generados a partir de los mismos para, por ejemplo, identificar el objeto, calcular diversas estadísticas sobre señales que se correlacionan con los diversos tintes, incluyendo la media de la intensidad de señal, el área de tinción en toda la imagen o en regiones específicas de interés, etc. Adicionalmente, estos paquetes de programa informático a menudo tienen funciones que permiten que el usuario manipule la imagen, incluyendo acercar y alejar, para identificar diversas regiones de interés, anotar objetos y/o regiones, etc. Los ejemplos de estos paquetes de programa informático incluyen VENTANA VIRTUOSO (Roche); Definiens TISSUE STUDIO, DEVELOPER XD e IMAGE MINER; y paquetes de programa informático Visopharm BIOTOPIX, ONCOTOPIX y STEREOTOPIX.

Kits de detección

También se divulgan sistemas y kits que comprenden (i) una sonda de detección específica para PD-L1 y (ii) al menos una sonda de detección específica para al menos un marcador de células inmunitarias. En algunos modos de realización, los kits se usan para teñir conjuntamente células inmunitarias que expresan PD-L1 y un marcador de células inmunitarias. En algunos modos de realización, los kits se usan para teñir muestras de tejido de modo que las células tumorales positivas para PD-L1, las células inmunitarias PD-L1, las células tumorales negativas para PD-L1 y las células inmunitarias negativas para PD-L1 se pueden identificar y/o diferenciar entre sí. En algunos modos de realización, los kits permiten detectar y/o cuantificar las células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor, donde los resultados de la detección y/o cuantificación de las células tumorales positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor se pueden usar solos o junto con otros datos (por ejemplo, resultados de la puntuación de muestras de tejido) para predecir la respuesta a los tratamientos dirigidos a PD-L1. Los resultados de la tinción de tejidos con los kits divulgados se pueden usar por profesionales médicos para determinar una tanda de tratamiento (por ejemplo, tratamiento anti-PD-L1 o tratamiento conjunto con un agente anti-PD-L1), tal como el tratamiento para el cáncer donde el cáncer comprende células tumorales que expresan o sobreexpresan PD-L1.

En algunos modos de realización, las sondas de detección usadas en los kits son anticuerpos primarios. En otros modos de realización, las sondas de detección usadas en los kits son sondas de ácido nucleico. En otros modos de realización, las sondas de detección usadas en los kits comprenden una combinación de anticuerpos primarios y sondas de ácido nucleico. En algunos modos de realización, la sonda de detección específica para PD-L1 es un anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1. En algunos modos de realización, la sonda de detección específica para al menos un marcador de células inmunitarias es un anticuerpo primario específico para al menos uno de CD3, CD4, CD8, CD45 y CD45LCA. En algunos modos de realización, el primer anticuerpo primario es un anticuerpo anti-PD-L1 (SP142). En algunos modos de realización, el segundo anticuerpo primario es un anticuerpo anti-CD45LCA (RP2/18).

En algunos modos de realización, el kit comprende además uno o más reactivos de detección o kits de detección. En algunos modos de realización, el kit comprende además un primer conjugado de marcaje específico para el primer anticuerpo primario; y un segundo conjugado de marcaje específico para el segundo anticuerpo primario. En algunos modos de realización, el kit comprende además primer y segundo sustratos o primer y segundo conjugados de señalización, en los que los primer y segundo sustratos o conjugados de señalización son diferentes. Los conjugados de marcaje, conjugados de señalización, sustratos cromogénicos y/o cromógenos pueden incluir cualquiera de los enumerados en el presente documento o conocidos de otro modo por los expertos en la técnica. En algunos modos de realización, el kit comprende además una o más composiciones de inactivación enzimática específicas para las enzimas de los conjugados de marcaje.

En algunos modos de realización, los kits incluyen instrucciones para la detección múltiple de marcadores o instrucciones para predecir el resultado del tratamiento en base a la presencia de linfocitos infiltrantes de tumor positivos para PD-L1. En otros modos de realización, los kits incluyen instrucciones para la administración de ingredientes farmacéuticos activos apropiados en base a si se detectan linfocitos positivos para PD-L1 infiltrantes de tumor en una región de una muestra de tejido que comprende tejido tumoral positivo para PD-L1. En algunos modos de realización, los kits incluyen uno o más agentes terapéuticos. Los kits pueden comprender además instrucciones o protocolos para puntuar y/o instrucciones o protocolos para determinar una estadificación o un grado de un cáncer particular en base a la presencia y/o cantidad de células tumorales positivas para PD-L1, células inmunitarias positivas para PD-L1 (incluyendo los linfocitos positivos para PD-L1 que se infiltran en tejido tumoral positivo para PD-L1).

Los kits pueden incluir otros reactivos, por ejemplo, tampones, tinciones primarias, agentes de bloqueo, cubreobjetos de microscopio, etc.

En algunos modos de realización, los kits pueden comprender al menos otra sonda de detección específica para EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4.

Puntuación de muestras de tejido

En otro aspecto de la presente divulgación se encuentra un procedimiento de puntuación de una muestra de tumor para la expresión de PD-L1, comprendiendo el procedimiento identificar células tumorales y células inmunitarias en la muestra de tejido (tal como utilizando los procedimientos múltiples y kits descritos en el presente documento); determinar un número de células tumorales que expresan PD-L1 y un número de células inmunitarias que expresan PD-L1 y/o la intensidad relativa de la expresión de PD-L1 en las células; y clasificar un tumor de acuerdo con la expresión de PD-L1. En algunos modos de realización, para puntuar las células tumorales, la fracción de células tumorales positivas para PD-L1 se divide entre el número total de células tumorales (es decir, células tumorales positivas para PD-L1 y negativas para PD-L1). En algunos modos de realización, para puntuar las células inmunitarias, se mide el área en la imagen que contiene estas células y se puntúa una fracción del área tumoral que contiene linfocitos positivos para PD-L1 (células inmunitarias). En algunos modos de realización, la expresión de PD-L1 se determina detectando específicamente la proteína PD-L1 y/o el ARNm de PD-L1 en el tumor. En algunos modos de realización, se considera que las células expresan PD-L1 cuando la célula tiene una tinción de membrana al menos parcial de la proteína PD-L1 detectada por IHQ. En algunos modos de realización, el tumor se clasifica de acuerdo con una o ambas de una puntuación H modificada (MHS) o una puntuación de proporción modificada (MPS), ya que esos procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica.

Aún en otro aspecto de la presente divulgación se encuentra un procedimiento de puntuación de la expresión de PD-L1 en cortes de tejido tumoral que se han teñido con un anticuerpo anti-PD-L1 y se han teñido para detectar la presencia de al menos un marcador de células inmunitarias. Los resultados de los procedimientos de puntuación se pueden usar para seleccionar pacientes para su tratamiento con tratamientos anti-PD-L1, por ejemplo, como criterios de inclusión en un ensayo clínico, para predecir la respuesta de un sujeto a los tratamientos anti-PD-L1 y en procedimientos de tratamiento de un paciente con cáncer.

En otros modos de realización, las muestras se puntúan de acuerdo con lo siguiente:

Las células inmunitarias infiltrantes de tumor se pueden puntuar como el porcentaje de células inmunitarias positivas para PD-L1 que muestran algo de tinción de PD-L1 (SP142) distinguible de cualquier intensidad en el área tumoral total (véase la tabla 3). El área tumoral se define como el área ocupada por las células tumorales y el estroma intratumoral y peritumoral contiguo asociado que incluye linfocitos, macrófagos y células con morfología dendrítica o reticular.

Intensidad de tinción de células inmunitarias (CI): la intensidad de la tinción de PD-L1 (SP142) de las células inmunitarias infiltrantes de tumor se registra en hojas de puntuación (normalmente con propósitos informativos) usando los criterios descritos en la tabla 4.

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Intensidad de tinción de células tumorales (CT): la intensidad de la tinción de PD-L1 (SP142) de células tumorales (CT) se registra en hojas de puntuación (con propósitos informativos) usando los criterios descritos en la tabla 5.

Las células tumorales se puntúan como el porcentaje de células tumorales viables que muestran algo de tinción de membrana de PD-L1 (SP142) distinguible (tabla 6).

La tinción de fondo no específica es una tinción inesperada que difiere de un patrón de tinción típico. La tinción no específica se evalúa en portaobjetos de muestras de prueba de CPNM con anticuerpo frente a PD-L1 (SP142) teñido de acuerdo con los criterios de la tabla 7 y se registra como aceptable o inaceptable.

Procedimientos de predicción de una respuesta al tratamiento

Los ensayos múltiples, kits y procedimientos divulgados en el presente documento se pueden utilizar para predecir o ayudar a predecir una respuesta al tratamiento (por ejemplo, un tratamiento anti-PD-L1 o un tratamiento conjunto con un agente anti-PD-L1) o los resultados de cualquier ensayo o procedimiento divulgado en el presente documento se pueden usar para facilitar el tratamiento con un tratamiento anti-PD-L1 o tratamiento conjunto con un agente anti-PD-L1. Sin quedar vinculado a ninguna teoría particular, se cree que la presencia de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor, por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumor, dentro del tejido tumoral positivo para PD-L1 es una indicación de que un paciente puede responder bien al tratamiento con un tratamiento anti-PD-L1 o politerapia/tratamiento conjunto que incluye un agente anti-PD-L1. Nuevamente, se cree que se reclutan los linfocitos infiltrantes de tumor en el tumor en un intento de controlar el crecimiento del tumor. Por lo tanto, se cree que algunos pacientes pueden obtener un beneficio de los tratamientos anti-PD-L1 de acuerdo con la expresión de LIT en tejido tumoral positivo para PD-L1.

En consecuencia, en algunos modos de realización, se encuentra un procedimiento de predicción de una respuesta a un tratamiento dirigido a PD-L1 analizando una muestra de tejido tumoral positivo para PD-L1 para detectar la presencia o ausencia de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor que comprende identificar las células inmunitarias que coexpresan PD-L1 y al menos un marcador CD. En algunos modos de realización, la identificación de las células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor comprende poner en contacto la muestra de tejido tumoral con una primera sonda de detección específica para PD-L1 (para formar un primer complejo sonda de detección-diana) y poner en contacto la muestra de tejido tumoral con al menos una segunda sonda de detección específica para al menos un marcador CD (para formar un segundo complejo sonda de detección-diana). En algunos modos de realización, la sonda de detección específica para PD-L1 es un anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1. En algunos modos de realización, la sonda de detección específica para el al menos un marcador CD es un anticuerpo seleccionado del grupo seleccionado de un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD4, un anticuerpo anti-CD8 y un anticuerpo frente a CD45LCA. En algunos modos de realización, se introducen reactivos de detección que permiten la identificación de las células inmunitarias que coexpresan el marcador PD-L1 y el al menos un marcador CD. En algunos modos de realización, las células inmunitarias que coexpresan el marcador PD-L1 y el al menos un marcador de células inmunitarias se tiñen conjuntamente con DISCOVERY Purple y DAB. En algunos modos de realización, el tratamiento dirigido a PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en atezolizumab, nivolumab, pembrolizumab y pidilizumab y cualquier combinación de los mismos. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además introducir al menos otra sonda de detección específica para EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4.

Además, en algunos modos de realización se encuentra un procedimiento de tratamiento de cáncer en un paciente que comprende solicitar una prueba que proporciona los resultados de un análisis para determinar si una muestra de tejido tumoral positivo para PD-L1 del paciente comprende linfocitos positivos para PD-L1 infiltrantes de tumor y administrar un tratamiento dirigido a PD-L1 al paciente si la muestra de tejido tumoral del paciente expresa células tumorales positivas para PD-L1 y linfocitos positivos para PD-L1 infiltrantes de tumor. En algunos modos de realización, la prueba comprende un ensayo múltiple en el que la muestra de tejido tumoral se pone en contacto con un primer anticuerpo primario específico para PD-L1 (por ejemplo, SP142) y un segundo anticuerpo primario específico para al menos un marcador de células inmunitarias (por ejemplo, RP2/18), en el que los linfocitos positivos para PD-L1 infiltrantes de tumor coexpresan PD-L1 y el al menos un marcador de células inmunitarias. En algunos modos de realización, se introducen reactivos de detección que permiten la identificación de las células inmunitarias que coexpresan el marcador PD-L1 y el al menos un marcador de células inmunitarias. En algunos modos de realización, las células inmunitarias que coexpresan el marcador PD-L1 y el al menos un marcador de células inmunitarias se tiñen conjuntamente con DISCOVERY Purple y DAB. En algunos modos de realización, el tratamiento dirigido a PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en atezolizumab, nivolumab, pembrolizumab y pidilizumab, y cualquier combinación de los mismos. En otros modos de realización, un tratamiento dirigido a PD-L1 se combina con un tratamiento estimulante de linfocitos T o un ingrediente farmacéutico activo (incluyendo un agente biológico). En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además introducir al menos otra sonda de detección específica para EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4.

En algunos modos de realización, el nivel de expresión de PD-L1 en una muestra de tejido tumoral de un individuo/paciente se compara con un valor de corte predeterminado (por ejemplo, un valor de control), y este procedimiento de detección y comparación se puede automatizar (y, por supuesto, puede incluir un analizador de muestras y un sistema informático). En algunos modos de realización, se considera que un valor por encima del valor de corte representa la sobreexpresión de PD-L1 y un valor en o por debajo del valor de corte se considera expresión disminuida de PD-L1. En algunos modos de realización, se reconoce la sobreexpresión de PD-L1 si el nivel de expresión para PD-L1 está por encima de un valor de corte entre el percentil 50 y el percentil 75, como se establece en un grupo de control. En otros modos de realización, se reconoce la sobreexpresión de PD-L1 si el nivel de expresión para PD-L1 está por encima de un valor de corte entre el percentil 50 y el percentil 70 del grupo de control. Aún en otros modos de realización, se determina que los individuos/pacientes necesitan un tratamiento con PD-L1 o una politerapia que incluye un agente anti-PD-L1, si PD-L1 está sobreexpresado (es decir, el nivel de expresión de PD-L1 determinado está por encima del valor de corte para PD-L1). En algunos modos de realización, si una cantidad de células inmunitarias positivas para PD-L1 excede un determinado valor de corte predeterminado, entonces un paciente se puede beneficiar del tratamiento con un tratamiento dirigido a PD-L1.

En algunos modos de realización, los procedimientos comprenden introducir al menos otra sonda de detección específica para EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende introducir una sonda de detección como se proporciona en la tabla 8 y administrar un agente activo de la tabla 8 que corresponde a la sonda de detección introducida.

Tabla 8: tabla que proporciona marcadores y agentes activos correspondientes.

Protocolos

Las tablas 9 y 10 describen dos protocolos para la detección múltiple. El experto en la técnica apreciará que los protocolos descritos en las tablas 9 y 10 no son limitantes y se pueden adaptar de modo que se pueden sustituir diferentes sondas de detección y reactivos de detección.

Tabla 9

Tabla 9

Tabla 9

Tabla 9

Tabla 10

Tabla 10

Tabla 10

Tabla 10

Dianas y sondas de detección adicionales

En algunos modos de realización, los ensayos múltiples, kits y procedimientos divulgados en el presente documento comprenden detectar otras dianas además de PD-L1 y marcadores de células inmunitarias. Por lo tanto, en algunos modos de realización, los ensayos, kits y procedimientos en el presente documento comprenden sondas de detección adicionales (por ejemplo, sondas de ácido nucleico o anticuerpos primarios o cualquier combinación de los mismos) para detectar dianas adicionales, tales como las dianas adicionales que se describen a continuación. En algunos modos de realización, las otras dianas son marcadores tumorales distintos de PD-L1. En algunos modos de realización, los ensayos, kits y procedimientos pueden incluir una sonda de detección específica para uno o más de EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4. El experto en la técnica reconocerá que se puede incluir cualquier número de sondas de detección adicionales en cualquier ensayo múltiple, kit o procedimiento. El experto en la técnica también podrá seleccionar los reactivos de detección apropiados para detectar mejor las sondas de detección adicionales, tales como reactivos de detección que proporcionan un buen contraste (como se define en el presente documento) o utilizar cualquier combinación de cromógenos, fluoróforos, etc.

A lo largo de la presente divulgación, cuando se hace referencia a una proteína diana, se entiende que las secuencias de ácido nucleico asociadas con esa proteína también se pueden usar como diana. En algunos ejemplos, la diana es una proteína o una molécula de ácido nucleico de un patógeno, tal como un virus, bacteria o parásito intracelular, tal como de un genoma vírico. Por ejemplo, una proteína diana se puede producir a partir de una secuencia de ácido nucleico diana asociada con (por ejemplo, correlacionada con, causalmente implicada en, etc.) una enfermedad.

En algunos modos de realización, una proteína diana se produce por una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómica diana) asociada con una neoplasia (por ejemplo, un cáncer). Se han identificado numerosas anomalías cromosómicas (incluyendo translocaciones y otros reordenamientos, amplificación o deleción) en células neoplásicas, en especial en células cancerosas, tales como leucemia de linfocitos B y linfocitos T, linfomas, cáncer de mama, cáncer de colon, cánceres neurológicos y similares. Por lo tanto, en algunos modos de realización, al menos una porción de la molécula diana se produce por una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómica diana) amplificada o delecionada en al menos un subconjunto de células en una muestra.

Es conocido que los oncogenes son responsables de varias neoplasias malignas humanas. Por ejemplo, los reordenamientos cromosómicos que implican el gen SYT localizado en la región de punto de ruptura del cromosoma 18q11.2 son comunes entre los tumores de tejidos blandos de sarcoma sinovial. La translocación t(l18q11.2) se puede identificar, por ejemplo, usando sondas con diferentes marcadores: la primera sonda incluye moléculas de ácido nucleico f Pc generadas a partir de una secuencia de ácido nucleico diana que se extiende distalmente desde el gen SYT y la segunda sonda incluye ácido nucleico FPC generado a partir de una secuencia de ácido nucleico diana que se extiende en dirección 3' o proximal al gen SYT. Cuando las sondas de detección que corresponden a estas secuencias de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico genómicas diana) se usan en un procedimiento de hibridación in situ, las células normales, que carecen de una t(18q11.2) en la región del gen SYT, presentan dos señales de fusión (generadas por los dos marcadores muy cercanos), lo que refleja las dos copias intactas de SYT. Las células anómalas con una t( 18q11.2) presentan una única señal de fusión.

En otros modos de realización, se selecciona una proteína diana producida a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómica diana) que es un gen supresor tumoral que está delecionado (se ha perdido) en las células malignas. Por ejemplo, la región p16 (que incluye D9S1749, D9S1747, p16(INK4A), p14(ARF), D9S1748, p15(INK4B) y D9S1752) localizada en el cromosoma 9p21 está delecionada en determinados cánceres de vejiga. Las deleciones cromosómicas que implican la región distal del brazo corto del cromosoma 1 (que engloba, por ejemplo, SHGC57243, TP73, EGFl3, ABL2, ANGPTL1 y SHGC-1322), y la región pericentromérica (por ejemplo, 19p13-19q13) del cromosoma 19 (que engloba, por ejemplo, MAn 2b 1, ZNF443, ZNF44, CRX, GlTs Cr 2 y GLTSCR1) son rasgos moleculares característicos de determinados tipos de tumores sólidos del sistema nervioso central.

Los ejemplos mencionados anteriormente se proporcionan únicamente con propósitos de ilustración y no pretenden ser limitantes. Otras numerosas anomalías citogénicas que se correlacionan con la transformación y/o crecimiento neoplásico son conocidas por los expertos en la técnica. Las proteínas diana que se producen por secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico genómicas diana) que se han correlacionado con la transformación neoplásica y que son útiles en los procedimientos divulgados también incluyen el gen de EGFR (7p12 por ejemplo, n.° de acceso en Ge NbANK™ NC-000007, nucleótidos 55054219-55242525), el gen de C-MYC (8q24.21; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000008, nucleótidos 128817498-128822856), D5S271 (5p15.2), gen de la lipoproteína lipasa (LPL) (8p22; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000008, nucleótidos 19841058-19869049), Rb 1 (13q14; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000013, nucleótidos 47775912-47954023), p53 (17p13.1; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000017, complemento, nucleótidos 7512464-7531642), N-MYC (2p24; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000002, complemento, nucleótidos 151835231-151854620), CHOP (12q13; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000012, complemento, nucleótidos 56196638-56200567), FUS (16p11.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000016, nucleótidos 31098954-31110601), FKHR (13p14; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000013, complemento, nucleótidos 40027817-40138734), así como, por ejemplo: ALK (2p23; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000002, complemento, nucleótidos 29269144-29997936), cadena pesada de Ig, CCND1 (11q13; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000011, nucleótidos 69165054-69178423), BCL2 (18q21.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000018, complemento, nucleótidos 58941559-59137593), BCL6 (3q27; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000003, complemento, nucleótidos 188921859-188946169), MALF1, AP1 (1p32-p31; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000001, complemento, nucleótidos 59019051-59022373), TOP2A (17q21-q22; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000017, complemento, nucleótidos 35798321-35827695), TMPRSS (21q22.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000021, complemento, nucleótidos 41758351-41801948), ERG (21 q22.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENbA n K™ NC-000021, complemento, nucleótidos 38675671-38955488); ETV1 (7p21.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000007, complemento, nucleótidos 13897379-13995289), EWS (22q12.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000022, nucleótidos 27994271-28026505); FLI1 (11q24.1-q24.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000011, nucleótidos 128069199-128187521), PAX3 (2q35-q37; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000002, complemento, nucleótidos 222772851-222871944), PAX7 (1p36.2-p36.12; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000001, nucleótidos 18830087-18935219), PTEN (10q23.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000010, nucleótidos 89613175-89716382), AKT2 (19q13.1-q13.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000019, complemento, nucleótidos 45431556-45483036), MYCL1 (1p34.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBAn K™ NC-000001, complemento, nucleótidos 40133685-40140274), REL (2p13-p12; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000002, nucleótidos 60962256-61003682) y CSF1R (5q33-q35; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC-000005, complemento, nucleótidos 149413051-149473128).

En otros ejemplos, se selecciona una proteína diana de un virus u otro microorganismo asociado con una enfermedad o afección. La detección de la secuencia de ácido nucleico diana derivada de virus o microorganismo (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómica diana) en una célula o muestra de tejido es indicativa de la presencia del organismo. Por ejemplo, el péptido, polipéptido o proteína diana se puede seleccionar del genoma de un virus oncogénico o patógeno, una bacteria o un parásito intracelular (tal como Plasmodium falciparum y otras especies de Plasmodium, Leishmania (sp.), Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, así como especies de Toxoplasma, Eimeria, Theileria y Babesia).

En algunos ejemplos, la proteína diana se produce a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómica diana) de un genoma vírico. Los virus ejemplares y las secuencias genómicas correspondientes (GENBANK™ RefSeq con n.° de acceso entre paréntesis) incluyen adenovirus humano A (NC-001460), adenovirus humano B (NC-004001), adenovirus humano C (NC-001405), adenovirus humano D (NC-002067), adenovirus humano E (NC-003266), adenovirus humano F (NC-001454), astrovirus humano (NC-001943), poliomavirus BK humano (V01109; GI:60851) bocavirus humano (NC-007455), coronavirus humano 229E (NC-002645), coronavirus humano HKU1 (NC-006577), coronavirus humano NL63 (NC-005831), coronavirus humano o C43 (NC-005147), enterovirus humano A (NC-001612), enterovirus humano B (Nc -001472), enterovirus humano C (NC-001428), enterovirus humano D (NC-001430), eritrovirus humano V9 (NC-004295), virus espumoso humano (NC-001736), herpesvirus humano 1 (virus del herpes simple de tipo 1) (NC-001806), herpesvirus humano 2 (virus del herpes simple de tipo 2) (NC-001798), herpesvirus humano 3 (virus de la varicela zóster) (NC-001348), herpesvirus humano 4 de tipo 1 (virus de Epstein-Barr de tipo 1) (NC-007605), herpesvirus humano 4 de tipo 2 (virus de Epstein-Barr de tipo 2) (Nc -009334), cepa AD 169 del herpesvirus humano 5 (NC-001347), cepa Merlin de la cepa del herpesvirus humano 5 (NC-006273), herpesvirus humano 6A (NC-001664), herpesvirus humano 6 B (NC-000898), herpesvirus humano 7 (NC-001716), herpesvirus humano 8 de tipo M (NC-003409), herpesvirus humano 8 de tipo P (NC-009333), virus de la inmunodeficiencia humana 1 (NC-001802), virus de la inmunodeficiencia humana 2 (NC-001722), metaneumovirus humano (NC-004148), papilomavirus humano-1 (NC-001356), papilomavirus humano-18 (NC-001357), papilomavirus humano-2 (NC-001352), papilomavirus humano-54 (NC-001676), papilomavirus humano-61 (NC-001694), papilomavirus humano-cand90 (NC-004104), papilomavirus humano RTRX7 (NC-004761), papilomavirus humano de tipo 10 (NC-001576), papilomavirus humano de tipo 101 (NC-008189), papilomavirus humano de tipo 103 (NC-008188), papilomavirus humano de tipo 107 (NC-009239), papilomavirus humano de tipo 16 (NC-001526), papilomavirus humano de tipo 24 (Nc -001683), papilomavirus humano de tipo 26 (NC-001583), papilomavirus humano de tipo 32 (NC-001586), papilomavirus humano de tipo 34 (NC-001587), papilomavirus humano de tipo 4 (NC-001457), papilomavirus humano de tipo 41 (NC-001354), papilomavirus humano de tipo 48 (NC-001690), papilomavirus humano de tipo 49 (NC-001591), papilomavirus humano de tipo 5 (NC-001531), papilomavirus humano de tipo 50 (Nc -001691), papilomavirus humano de tipo 53 (n C-001593), papilomavirus humano tipo 60 (NC-001693), papilomavirus humano de tipo 63 (NC-001458), papilomavirus humano de tipo 6 b (NC-001355), papilomavirus humano de tipo 7 (NC-001595), papilomavirus humano de tipo 71 (NC-002644), papilomavirus humano de tipo 9 (NC-001596), papilomavirus humano de tipo 92 (NC-004500), papilomavirus humano de tipo 96 (n C-005134), virus paragripal humano 1 (NC-003461), virus paragripal humano 2 (NC-003443), virus paragripal humano 3 (NC-001796), parechovirus humano (NC-001897), parvovirus humano 4 (NC-007018), parvovirus humano B19 (NC-000883), virus respiratorio sincicial humano (NC-001781), rinovirus humano A (NC-001617), rinovirus humano B (Nc -001490), spumarretrovirus humano (NC-001795), virus linfótropo T humano 1 (NC-001436), virus linfótropo T humano 2 (NC-001488).

En determinados ejemplos, la proteína diana se produce a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómica diana) de un virus oncogénico, tal como el virus de Epstein-Barr (VEB) o un papilomavirus humano (PVH, por ejemplo, PVH16, PVH18). En otros ejemplos, la proteína diana producida a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómica diana) es de un virus patógeno, tal como un virus respiratorio sincicial, un virus de la hepatitis (por ejemplo, virus de la hepatitis C), un coronavirus (por ejemplo, el virus del SRAG), un adenovirus, un poliomavirus, un citomegalovirus (CMV) o un virus del herpes simple (VHS).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un kit que comprende:

(a) un primer anticuerpo primario específico para PD-L1;

(b) un segundo anticuerpo primario específico para al menos un marcador de células inmunitarias;

(c) un primer conjunto de reactivos de detección que comprende:

(c1 ) una primera enzima;

(c2 ) un conjunto de reactivos adaptados para depositar la primera enzima en una muestra de tejido cerca del primer anticuerpo primario mientras que el primer anticuerpo primario se une a la muestra de tejido; y (c3) un sustrato reactivo con la primera enzima para depositar un primer tinte en la muestra cerca de la primera enzima; y

(d) un segundo conjunto de reactivos de detección que comprende:

(d1 ) una segunda enzima;

(d2 ) un conjunto de reactivos adaptados para depositar la segunda enzima en una muestra de tejido cerca del segundo anticuerpo primario mientras que el segundo anticuerpo primario se une a la muestra de tejido; y (d3) un sustrato reactivo con la segunda enzima para depositar un segundo tinte en la muestra cerca de la segunda enzima;

en el que el primer tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple) y el segundo tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), o

en el que el primer tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL) y el segundo tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVErY Purple).

2. El kit de la reivindicación 1, en el que el al menos un marcador de células inmunitarias se selecciona del grupo que consiste en CD8 , CD4, CD3, CD25, CD163 y CD45LCA.

3. El kit de la reivindicación 2, en el que el marcador de células inmunitarias es CD8 o CD45LCA.

4. El kit de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer anticuerpo primario específico para PD-L1 es SP142 o SP263.

5. El kit de la reivindicación 4, en el que el segundo anticuerpo primario es un anticuerpo anti-CD45LCA (RP2/18) o anti-CD8 (SP239).

6. El kit de la reivindicación 1, en el que el segundo anticuerpo primario es específico para CD8 , el primer tinte es tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple) y el segundo tinte es 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL).

7. El kit de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos otra sonda de detección específica para un marcador tumoral distinto de PD-L1 y reactivos de detección para detectar la al menos otra sonda de detección, en el que la al menos otra sonda de detección es específica para EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4.

8. El kit de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además componentes para inactivar la primera enzima y/o la segunda enzima.

9. Un procedimiento de identificación de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor en tumores positivos para PD-L1 que comprende:

poner en contacto una muestra de tejido con un primer anticuerpo primario específico para la proteína PD-L1 de manera que se efectúe la unión del anticuerpo a la muestra de tejido cerca de la proteína PD-L1 expresada por la muestra de tejido;

depositar una primera enzima cerca del primer anticuerpo primario unido a la muestra de tejido;

hacer reaccionar la primera enzima con un primer sustrato para efectuar el depósito de un primer tinte en la muestra de tejido cerca del primer anticuerpo primario;

poner en contacto la muestra de tejido con un segundo anticuerpo primario específico para al menos una proteína marcadora de células inmunitarias de manera que se efectúe la unión del anticuerpo a la muestra de tejido cerca de la proteína marcadora de células inmunitarias expresada por la muestra de tejido; depositar una segunda enzima cerca del segundo anticuerpo primario unido a la muestra de tejido; hacer reaccionar la segunda enzima con un segundo sustrato para efectuar el depósito de un segundo tinte en la muestra de tejido cerca del segundo anticuerpo primario;

en el que las células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor coexpresan PD-L1 y el al menos un marcador de células inmunitarias;

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el primer anticuerpo primario es SP142 o SP263.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el marcador de células inmunitarias se selecciona del grupo que consiste en CD8 , CD4, CD3, CD25, CD163 y CD45LCA.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el marcador de células inmunitarias es CD45LCA o CD8.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el segundo anticuerpo primario es un anticuerpo anti-CD45LCA (RP2/18).

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9-13, que comprende además poner en contacto la muestra de tejido con al menos otra sonda de detección específica para un marcador tumoral distinto de PD-L1, en el que la al menos otra sonda de detección es específica para EGFR, HER2, PVH, ALK, BRAF, OX-40, PD-1, IDO-1, FoxP3, CD163 y CTLA-4.

15. Un procedimiento de predicción de una respuesta a un tratamiento dirigido al eje PD-1: detectando células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9-14;

cuantificando el número de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor; y correlacionando el número de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor con la respuesta del tumor a un tratamiento dirigido al eje PD-1.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el procedimiento comprende además cuantificar un número de células tumorales positivas para PD-L1 y correlacionar el número de células tumorales positivas para PD-L1 y el número de células inmunitarias positivas para PD-L1 infiltrantes de tumor.